流感免疫原组合物的制作方法

专利名称：流感免疫原组合物的制作方法
流感免疫原组合物
背景技术：
现有应用于人类和畜牧业的稳定的获得许可的疫苗在对抗所谓的“一型”病原 体一般是成功的。一型病原体(如麻疹、腮腺炎和风疹病毒)是那些通常(1)感染 或在婴儿、幼儿、少年和青年引起大部分严重疾病；(2)携带有相对稳定微生物基因 组；(3)具有引起自然恢复的自然疾病史；以及(4)诱导持久性记忆，与多克隆和多 抗原决定簇抗原识别相关。与此相反，二型病原体，比如流感病毒、HIV-1、疟原虫、支原体，如引起肺 结核的，锥体虫、血吸虫、利什曼虫(Leishmania)、无形体属(Anaplasma)、肠道 病毒(Enteroviruses)、星状病毒(Astrovirases)、鼻病毒(Rhinovirases)、Norwalk
病毒、产毒素/病原性大肠杆菌、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、链霉属、不可分型 (nontypeable)嗜血杆菌属流感病毒、肝炎C病毒、癌细胞等在相当对立的特征上有明 显区别。例如，二型病原体(1)趋向于感染并在相当广泛的宿主年龄范围传播，从孩 童到老年期都有感染发生和再发生；(2)在其基因组的特定区域存在微生物遗传不稳定 性(这种病原体成功进化的标志)；(3)在一些情况下，包括疾病的频繁自然痊愈仍使宿 主保留对多种重复的年度传染的缺陷和/或慢性/活跃或慢性/潜伏感染阶段的建立； (4)包括寡克隆(oligoclonal)、针对极其有限的免疫抗原决定簇提供窄菌株特异性防护 早期免疫反应，或没有防护和/或增强感染；以及(5)在感染或接种后引起免疫失调，如 抗原决定簇阻断抗体、非典型初级免疫应答Ig亚型、记忆性交叉反应的恢复和不恰当的 THl和/或TH2细胞因子代谢。在免疫水平，观察到悬殊的病原具有不同的发病机理和疾病结果，例如， HIV-I相对于人类鼻病毒。已经跨宿主和微生物种进化出高度成功的免疫系统规避策 略，例如欺骗性印记(Deceptiveimprinting)，并被选中和维持。因此，有脊椎动物免疫 系统的运行缺陷，例如源自病原体欺骗性印记的提高，对是否感染上HIV-I或60年内平 均每年感染2-6次普通感冒病毒的基本原理是一样的。虽然一些与抗原传递和表达相关的进步提高了部分二型微生物致病体的免疫原 性，现有的疫苗技术并未能轻易地转化为新的、广泛有效和安全的，获得许可的用于人 类疫苗。这大部分可能是因为对支配有脊椎的宿主防御反应系统在相似或不同的环境下 的起始、潜能开发、维持、激活、衰老和共进化基本规律了解缺乏。现在在人类流感疫苗开发缺乏的是一种可以诱导免疫性和防护的组合物，该组 合物更少依赖于同型和亚型，因此不需要混合以及当前蛋基技术年复一年的生产操作的 多种亚型的生产。一种适合的新产品是可以在流感病毒的同亚型(intra-subtype)抗原 性变体和异亚型二者交叉中和，诱导免疫反应的流感重组体HA或NA亚基疫苗。在美国，流感是NIAID分类中的C型病原体，每年引起36000例死亡以及 220000例住院治疗。作为一种呼吸道疾病，流感通过来自感染者的咳嗽或喷嚏产生的雾 滴和/或被污染的带菌物传播。高风险组包括儿童和老年人，感染流感通常会导致与流 感相关的继发并发症，肺炎、上呼吸道疾病并发症(儿童中的中耳炎)及其他全身性疾
3病(如，心血管病等)。在历史上，流感是最坏的流行性病源；1918年的西班牙流感导 致全世界超过4000万人死亡。在美国，用于流感的年度直接医疗费(住院治疗、正式 观察、用药等)估计为46亿美元。此外，每年，因为流感失去高达1亿1100万个工作 日，美国商业一年内在有病的天数和失去的生产力中附带损失70亿美元。每年严重流感 流行的直接和间接成本(工作日损失、教学日损失等)至少为120亿美元。在伴随有次级细菌感染时，流感病毒是一种广为人知的过度病态和死亡的原 因。并发症包括肺炎、支气管炎、充血性心力衰竭、心肌炎、脑膜炎、脑炎和肌炎。高 危并发症人群是那些具有慢性肺或心血管紊乱、慢性护理处，包括疗养院的患者，以及 85 岁或更老的人。 (Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP) for Prevention and Control of Influenza. MMWR, 1996, Vol 45; and Thompson 等人， JAMA 2003; 289:179-186)。在1976和1999之间，美国的老年人口已经加倍了，并因为 二次世界大战后的婴儿潮，预期在随后的数年内增长到顶峰。在这一年龄阶段的人与65 至69岁的人相比，16倍更易死于流感相关疾病。在1990另一个提高流感相关死亡的重 要贡献因素是流感病毒ACH3N2)是一种优势病毒，一种更致命的形成最近流行的流感 病毒。流感是突变迅速以形成新的有毒菌株的单链核糖核酸(RNA)病毒。菌株一 般分为3组，流感A、B和C。病毒进一步根据2种表面糖蛋白，血凝素(HA)和神 经氨酸酶(NA)，进一步分为15种HA和9种NA亚型。最近由NIAID/NIH发起并 在1996-2004之间从纽约州收集的人类流感病毒的全染色体组分析显示，尽管共享相同 的HA，共传播在相同人群的多样性，保守性，系统进化学(phylogenetically)上的明确 谱系会导致重组以及抗原上新型进化枝(clade)的产生。在人类流感A病毒的进化， HA的抗原性差异的仍是主要的选择压力，发现通过保守病毒谱系重组而非通过抗原性漂 移获得抗原性的新型进化枝迄今在流感疫苗菌株筛选和生产年度方法依然具有重要的意 义(Holmes 等人，PLoS Biol. 2005 3 (9) :e300)。在年度全球病毒追踪计划和随后的“反制(reactionary)，，疫苗生产问题中的核 心，是抗原变异的问题。抗原变异一种进化机制，保证了编码单个蛋白抗原同族物的特 定病原体基因的迅速序列变化，一般包括多个、相关基因拷贝，引起病原体表面抗原结 构的改变。因此，宿主免疫系统在感染或再感染的过程中，不能很好的识别病原体，在 宿主可以继续对抗疾病前，必须产生新的抗体以识别变化的抗原。因此，宿主不能完全 免疫病毒性疾病。这种现象代表了现在现代疫苗开发挑战中的多个，如果不是，最难以 克服的问题中的一个。并不奇怪，感染或接种当前所有获得许可的疫苗后产生的免疫反应是高度亚 型和菌株特异性的。实际上，这意味着在天然的、试验性感染和接种中诱导的抗体仅 能中和同源病毒。亚型/菌株特异性的体液免疫反应似乎是因为多种基于血凝素分子 的球状头的抗原中心的相对免疫显性(immunodominance) (Wiley等人，Nature, 1981; 289:373-378)。更确切的，抗体反应对应于HA球状头内的5个主要抗原中心。5个HA 抗原决定簇(A-E)中，2个位点，A和B，是最有免疫显性的，并与最多数量的氨基酸 超变异性(hypervariability)相关，部分是因为点突变、缺失和N连接糖基化位点的偶然 插入的重现，已知统称为病毒的“抗原漂移”(Cox & Bender, Semin. Virol. 1995; 6:359-70;Busch 等人，Sci. 286:1921, 1999; Plotkin & Dushoff, PNAS 100:7152, 2003; and Munoz & Deem, Vaccine 23,1144, 2005)。原始抗原效应，首次由Francis在 1953 描述(Ann. Int. Med. ,1953,399:203)，是 一种初级免疫应答，当不是通过同源，而是通过交叉反应疫苗或引入病毒亚型/菌株加 强时，结果是新型抗体可以更好地与之前的抗原而非引入抗原反应。由偶然的回忆引起免疫专一性的丧失给宿主的免疫系统造成了一个实际问题， 以获得相等和有效的体液反应，对抗在感染和感染之间的病毒变化。因此，并不奇怪自 然感染和接种未能产生更多功能的交叉反应初级和记忆性免疫，因为所有对抗那些更小 免疫原性抗原决定簇的所有开发，这些可能是最为保守的并可获得跨菌株免疫性，在抗 原级别上更低。免疫显性抗原决定簇误导免疫反应远离抗原中更为保守的更低免疫原性 区域的免疫学现象最初被称为“克隆优势(clonal dominance) ”(Kohler等人，JAcquir. Immune Defic. Syndr. 1992; 5:1158—68), which later was renamed as "Deceptive Imprinting" (K hler 等人，Immunol. Today 1994 (10) :475_8)。欺骗性印记之后免疫显性的免疫机制并未完全被了解，且迄今未有一种机制可 以完全解释特定抗原决定簇是如何以及为何已经进化为免疫调节的和免疫显性的。在该 现象中观察到的免疫反应的范围包括高度菌株/专一特异性中和抗体的诱导在实验动物 模型-病毒挑战系统中可全程诱导非保护性/非中和性结合，封闭，以至在一些情况下 的病原体促进性抗体，防止宿主的免疫系统识别附近的相邻抗原决定簇以与CD4T助细 胞反应，引发被动保护。在与宿主助T细胞和细胞毒素细胞介导的免疫性中观察到通过 免疫显性的相同免疫反应诱骗导致更窄的，集中于一组抗原决定簇(Gzyl等人，Virology 2004; 318 (2) :493-506; Kiszka 等人，J. Virol. 2002 76 (9) :4222_32; and Goulder 等人，J. Virol. 2000; 74 (12) :5679_90)。接种是防止疾病的最佳方法，现在每年根据世界范围内对活跃病毒株的流行病 学监视开发三价灭活病毒和修饰的活(稀释的)流感疫苗。两种疫苗都含有流感A和流 感B亚型。许可的流感疫苗由非活化的整体或化学剪切开的，由两种流感A亚型(H1N1 和H3N2)制备的亚基和一个流感B亚型组成。流感疫苗的生产包括通过连续传代或与 其它高产率菌株重组，对选定的变种修饰以在蛋中获得高产率。选定的流感病毒在鸡蛋 中培养，并从尿囊液中纯化流感病毒粒子。整体或剪切开的病毒制剂然后通过失活剂， 如福尔马林处理而杀死。美国市场超过90%的疫苗由两家公司供应，Aventis Pasteur具 有超过50%的市场占有率，以及Chiron (PowderJect) (U.K.)。一种鼻腔疫苗， FluMist77,被批准并在2003首次出售。现有流感疫苗的局限包括
(1)在老年人中效力减弱。在老年人中，对疾病的防护率更低，特别是那些被 确诊的老年人(Gorse等人，J. Infec. Dis. 190:11-19, 2004)。在>65岁的目标中，观察对 三价亚病毒流感疫苗的明显抗体反应少于30% (Powers & Belshe, J. Infec. Dis. 167:584-592, 1993)；
(2)在蛋中生产。现有的生产过程依赖于鸡蛋。流感病毒菌株必须在蛋中复制 良好，并且每年需要提供大量的蛋。每年的生产存在风险，因为需要找到合适的病毒组 合物；
5(3)不能应答晚期出现的和漂移菌株，比如九十年代后期的A/Sydney/5/97，或 应答一种潜在的流行性菌株，如1997年出现在香港的H5N1病毒；
(4)现有整体或分裂流感疫苗的防护是一种短期存在的，并且效力降低，因为 在流感的流行株中由于抗原变异发生了遗传变化。理想状况下，疫苗株是与疾病的流感 病毒菌株相匹配的。与最初从感染个体分离得到的流感病毒相比，在蛋生产的流感病毒 的血凝素可能发生变化(Oxford等人，J. Gen. Virol .72:185-189,1989;以及Rocha等人， J. Gen. Virol .74:2513-2518,1993)，降低了疫苗的潜在效力；
(5)在蛋中生产的疫苗对蛋有过敏性反应的人而言有副作用；以及
(6)现有许可的生产系统中，每一个感染流感病毒的鸡蛋产生一份疫苗，且生 产周期大约是24周。因此，现有许可的流感疫苗未能(1)诱导可以中和普通的年度在流行病传播 过程中出现的再发抗原性变体，以及亚型和重组病毒；(2)在老年人中诱导强效的免疫 反应；以及(3)由于副作用适用范围有限，如，一些疫苗不能应用于儿童。

发明内容
本发明部分涉及具有增强的或新型免疫原性的新型流感抗原。一种可以作为改 善的疫苗的目标流感组合物，疫苗通过使用不同的种类的和/或新的可识别的抗原决定 簇对病毒或病毒亚基抗原修饰得到。更有效和快速的使用重组技术与新型免疫再聚焦(refocusing)技术相结合，通 过生成具有增强跨菌株有效性的流感疫苗，引起现行疫苗开发操作中亚基HA和/或组合 物的巨大改变，因此回避了现行的病毒全球年度追踪操作，这样节省数百万美元，释放 了医疗资源，包括每年递增的用于在蛋中生产和制造疫苗的时间和劳动力，同样挽救了 人类的生命。额外的特征和优点将在此描述，在以下的详细描述中将更为显而易见。
具体实施例方式在此定义的流感为A、B和C型病毒。在人类中，A型是最具有毒性的，可 以导致季节性流行病或少见和罕见的，更为致命的全球性流行病。类型由多种血清型确 定，血清型反应了宿主对表达在病毒颗粒表面的抗原的免疫反应。病毒表面的携带了大 多数与疫苗防护相关的抗原决定簇的两种结构是血凝素(HA或H)和神经氨酸酶(NA 或N)。已知至少有16种H亚型和至少9种N亚型。HA参与病毒的吸附和融合。NA 参与唾液酸酶活性。“野生型”意味着天然发生的生物体。这一术语同样与在天然发生的生物群体 中的天然发生的生物体中发现的自然发生的核酸和蛋白，自然发生这种情况可参见例如 从自然突变并通过遗传漂移维持获得的多态现象、自然选择等等，并不包括通过，如重 组法获得的具有序列的核酸或蛋白。“免疫原”和“抗原”在此可交换使用，是诱导抗体特异性免疫应答(体液介 导的)和/或T细胞源(细胞介导的)的分子，例如，含有结合到分子，或为CD4+或 CD8+T细胞所识别的病毒感染细胞表达的分子的抗体。该分子可以包含一个或多个特异
6性抗体或T细胞结合的位点。如本领域技术人员所知，这种位点称为抗原决定簇或决定 簇。抗原可以是多肽、多核苷酸、多糖、脂类等，同样可以是其结合，如糖蛋白或脂蛋 白。免疫原混合物或产品，或抗原性混合物或产品可以诱导特异性免疫应答，应答可以 是体液性、细胞性或两者。疫苗是用于产生免疫保护反应的免疫原或抗原，也就是说，在宿主中，反应， 如抗体，减少免疫原或抗原的负面影响，或实质表达相同。如本领域技术人员所知，剂 量源自、外推和/或确定自临床前和临床研究。如本领域技术人员所知，可以运用多个 剂量，并出于保证延长预防性的或非反应态的需要。就本发明的目的，疫苗应用的成功 终点是引起诱导的免疫反应(例如体液和/或T细胞介导的)的存在，例如引起血清抗体 的产生，或由宿主内任何组织或器官产生的，结合目的抗原或免疫原的抗体。在一些实 例中，诱导的抗体在一些情况下与携带同源抗原或免疫原的混合物、分子等相结合，或 引导宿主中和、降低、防止和/或消除病原体，免于感染和/或引起临床疾病。本发明的 目的免疫保护是这种抗病毒免疫反应(如结合免疫原或被感染细胞的抗体和/或T细胞) 存在于暴露的宿主中。这可以使用任何已知的免疫测定技术，如ELISA和/或血凝素抑 制试验确定。另外，可以使用病毒中和实验以确定例如流行中和抗病毒抗体的存在。就 本发明的目的，观察宿主中的免疫保护，也就是流行抗流感抗体的存在，至少7天，至 少14天，至少21天，至少30天或更多作为目的疫苗效力的证据。另外，一般来说，约 为1:40的抗同源单一流感菌株的血凝抑制反应(HI)滴定度被用于使疫苗可作为候选疫 苗获得的一个终点。在动物模型中，暴露后，任何在致命性的延迟都可以作为本发明目 的防护的证据。因此，在鼠暴露于病原性流感菌株的情况下，一般在暴露之后约10天出 现第一只鼠死亡。因此，如果暴露的鼠的首次死亡日延长了至少1天，至少2天，至少 3天或更多天，则被认为是本发明目的的保护。免疫保护的时间可至少为14天，至少21 天，至少28天，至少35天，至少45天，至少60天，至少3个月，至少4个月，至少5个 月，至少6个月，至少1年，至少2年或更长。优选的，免疫保护在非近亲系群体中观察 免疫保护，并针对病原体的不同形式、亚型、菌株、变种、等位基因等。目的组合物可 以含有病毒颗粒，病毒的失活或稀释(修饰的活体)或亚基，例如，NA或HA。组合物 还可以含有类病毒颗粒(VLP)，这对本领域技术人员来说是已知的，其表达病毒蛋白 质和抗原的结构如同发现的原始复制的病毒，但是在本发明中，表达免疫抑制的免疫显 性抗原决定簇。正常情况下，VLP缺乏的病毒核酸或其可防止核酸复制部分，因此使得 VLP不具有传染性。在另一个实例中，抗原、决定簇或其部分可以克隆进野生型病毒的 基因组中，替代同源的野生型基因。这样重组病毒与缺乏免疫抑制分子的野生型病毒相 同。因此，例如，在蛋中可以很好传代的病毒菌株可以被控制表达免疫抑制分子，而重组 病毒可使用现有的使用蛋的疫苗生产的材料和方法传代，以获得免疫抑制的疫苗。“免疫显性抗原决定簇”是在宿主选择性引起免疫反应以起效或功能消除的抗 原决定簇，可以是抗原上或抗原的其它抗原决定簇的部分或全部。“免疫抑制一抗原决定簇”是修饰抗原决定簇，以基本上防止宿主的免疫系统 产生对抗所述抗原决定簇的抗体、助或细胞毒素T细胞。但是，超声所述抗原决定簇或 抗原决定簇的反应性完全去除的免疫抑制并不是必须的。免疫再聚焦(IR)或免疫再聚焦技术(IRT)可被用于创造抗病原体表达免疫显性抗原决定簇的有效疫苗。该技术最适用于进化出称为欺骗性的印记以逃避宿主免疫 应答策略的生物，例如通过具有显示有高水平抗原性漂移的免疫显性抗原决定簇。这种 免疫显性抗原决定簇一般以可以在不影响病原体存活性的情况下改变的多氨基酸的形式 存在。抗原的免疫显性抗原决定簇的免疫抑制可引起宿主生物体高滴定度抗体或抗抗 原上非主要抗原决定簇的T细胞反应和/或新的抗体滴定度或针对其他相关免疫沉默抗原 决定簇的T细胞反应的产生。这种免疫抑制的抗原可以作为对抗具有稳定或高度变化和 /或保守的免疫显性抗原决定簇的抗原的生物的有效疫苗。免疫显性抗原决定簇可以通过检查从感染上病原体的宿主生物体的血清或T细 胞反应性确认。评价血清是为了了解结合识别的，可能在宿主生物体引起免疫反应的抗 原的抗体的情况。如果免疫显性抗原决定簇存在，基本上血清中的许多抗体将结合到免 疫显性抗原决定簇，很少或没有结合到其他存在的或在抗原的抗原决定簇。地识别免疫显性抗原决定簇后，作为一种设计选择，此所教导的使用本文所教 导的材料和方法如在和如本领域技术人员所知对免疫显性抗原决定簇进行免疫抑制。这 种操作可以在核酸水平、在蛋白水平、在碳水化合物水平等，或其组合进行，操作如本 文所教导和本领域已经的方法进行。例如，N连接的碳水化合物(CHO)的存在可以通过多肽的一级氨基酸序列确 定。由天冬酰胺组成三联体氨基酸序列，之后连接有任意氨基酸，且末端是丝氨酸或苏 氨酸(N-X-S/T)，其中X是除脯氨酸或天冬氨酸之外的任意氨基酸，是添加N连接 CHO的位点。可使用本领域技术人员的已知的操作方法和材料将N连接糖基化位点添加 到或从抗原决定簇去除。例如，显示有分子级引入的N连接序列肽段(NXT/S)的HIVgpl20重组体， 这引起了在免疫显性V3区添加了额外N连接多糖，获得了新型的抗原性特性，如不能与 识别野生型V3抗原决定簇的抗体相结合，但是可诱导针对其他先前沉默或更少免疫原抗 原决定簇的抗体反应。额外的碳水化合物部分的存在并未降低HIV-I重组病毒的感染活 性。接种了重组糖蛋白的试验动物在体外显示有中度到高滴定度的中和同源和异源野生 型HIV-I 二者感染的抗体。因此，gpl20/160V3区内的免疫显性抗原决定簇的免疫抑制 致使免疫反应重聚焦至其他位于同一抗原的中和抗原决定簇，参见美国专利5585250和 5853724。另外，免疫显性抗原决定簇的特定氨基酸可被置换、替换或去除以抑制免疫原 性。免疫抑制可通过置换、替代或去除，例如，通过编码抗原核酸的位点定向诱变免疫 显性抗原决定簇的一个氨基酸、二个氨基酸、三个氨基酸或更多个实现。改变核酸和/ 或多肽的方法如本文所提供，并为本领域技术人员所知。免疫抑制可通过多种技术影响，例如改变、置换或去除抗原决定簇的特定氨基 酸，或例如在抗原决定簇附近添加糖基化位点。如本文所教导，变化可在多肽水平或多 核苷酸水平影响，操作方法是本领域技术人员所知的。因此，可通过添加、删除或置换 抗原决定簇上或中目标区域的一个或多个分子、基团、混合等改变多肽。例如，特定的 氨基酸可化学合成或可被修饰以携带额外基团，比如多糖，比如聚乙二醇。在操作免疫原结构后，进行筛选分析以确定突变蛋白的结合，已知可结合流感的一个或多个免疫显性抗原决定簇的抗体可用于确定是否有免疫抑制发生。例如，多肽 可合成包括一个或多个针对免疫显性抗原决定簇的一级氨基酸序列的变化。另外，免疫 显性抗原决定簇的核酸序列可序列被修改，以表示免疫抑制抗原决定簇。因此，核酸序 列可通过，例如，位点定向诱变以表达氨基酸置换插入、缺失等修饰，其中一部分可在 或邻近免疫显性抗原决定簇进一步引入修饰，比如引入糖基化位点，比如在或邻近免疫 显性抗原决定簇引起N糖基化或O糖基化等。获得抗原决定簇突变蛋白(由野生型变异得到的突变抗原决定簇)等的一种 方法是“丙氨酸扫描突变”(Cunningham & Wells, Science 244:1081 1085 (1989);以及 Cunningham & Wells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6434-6437 (1991))。一个或多个基团 由丙氨酸(Ala)或聚丙氨酸基替代。那些置换被证明有功能灵敏性的然后可通过在或 对置换位点引入进一步或其他突变明晰。因此，在用于引入氨基酸序列变化的位点是预 定的情况下，突变本身的特性是不必预知的。类似的置换可以使用其他氨基酸进行，取 决于所需扫描基团的特性。一个更系统的用于识别氨基酸残基以修饰的方法包括与免疫系统刺激或免疫显 性抗体识别，以及极少或不参与免疫系统刺激或免疫显性抗体识别相关基团的识别。对 相关基团进行丙氨酸扫描，测试每一种Ala突变株针对免疫显性抗原决定簇或免疫显性 抗体识别的免疫系统刺激减弱情况。在另一个实例中，那些极少或不与免疫系统刺激相 关的基团被选择进行修饰。修饰可以包括一个或更多基团的删除、邻近目标基团的基团 置换或一个或更多基团的插入。但是，一般情况下修饰涉及使用另一个氨基酸置换基 团。保存性置换可以是第一置换。如果这种置换导致诱导免疫系统刺激或与已知的免 疫显性抗体的反应性增强，则另一个保存性置换可被用于确定是否可获得更多的实质变 化。更为实质性的修饰在于可以通过选择与位点正常基团特性在实质上更为不同的 氨基酸，影响免疫系统反应远离免疫显性抗原决定簇。因此，这种置换可以在保持(a) 置换区域内多肽骨架的结构，例如，板状或螺旋构象；(b)目标区域分子的电荷性或疏 水性，或(C)侧链的数量。例如，天然产生的氨基酸基于普通侧链的特性可被分组
(1)憎水的甲硫氨酸(M或Met)，丙氨酸(A或Ala)缬氨酸(V或Val)，亮氨酸 (L或Leu)和异亮氨酸(I或lie)；
(2)中性的，亲水性的半胱氨酸(C或Cys),丝氨酸(S或Ser),苏氨酸(T或Thr), 天冬酰胺(N或Asn)和谷氨酰胺(Q或Gln)；
(3)酸性天冬氨酸(D或Asp)和谷氨酸(E或Glu)；
(4)碱性组氨酸(H或His),赖氨酸(K或Lys)和精氨酸(R或Arg)；
(5)影响链取向的基团甘氨酸(G或Gly)和脯氨酸(P或Pro),以及
(6)芳香族色氨酸(W或Trp),酪氨酸(Y或Tyr)和苯丙氨酸(F或Phe)。非保存性置换必须使用来自另一组的氨基酸替代氨基酸。保存性置换必须使用 来自同一组的氨基酸替代另一个氨基酸。优选的氨基酸置换是那些抑制免疫显性抗原决定簇，但是同样可包括那些，例 如(1)降低对蛋白水解的敏感性，(2)降低对氧化的敏感性，(3)改变免疫系统刺激活
9性和/或(4)给其类似物带来或修饰其他物理化学或功能特性。类似物可以包括各种非 自然发生肽序列的突变蛋白序列。例如，可在自然发生的序列中进行单个或多外氨基酸 置换(优选为保守性氨基酸置换)。除非大量的改变，或改变R组或侧链的结构，保守 性氨基酸置换一般将不会根本改变亲本序列的结构特征(例如，氨基酸替换将不会趋向 于破坏出现在亲本序列的螺旋，或破坏其他类型的表征亲本序列的二级结构)(Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984) ； Introduction to Protein Structure, Branden & Tooze, eds., Garland Publishing, New York, NY (1991);以及 Thornton 等人 Nature 354:105 (1991))。一般的，生物学特性改变的抗原决定簇突变体的氨基酸序列将至少具有与亲本 分子的氨基酸序列75%，至少80%,至少85%,至少90%和经常至少95%的同一性或类似 度。与亲本氨基酸序列相关的同一性或类似度在此定义为候选序列与亲本分子基团相同
(即相同的基团)或类似的(即基于上述普通侧链特性，来自同一组的氨基酸基团)氨 基酸基团的百分比，如果需要，在矫正序列并引入缺口，以获得最大百分比的序列同一 性。目标分子的共价修饰包括在本发明的范围内。如果适用，这种修饰可以通过化 学合成或通过分子的酶或化学剪切完成。其他类型的分子共价修饰可以通过使用能与选 定的侧链或与N末端或C末端基团反应的有机衍生物与目标分子的氨基酸基团反应被引 入。同样，各种有机化学材料和方法可被应用于修饰抗原决定簇元件。例如，WO 05/35726教导多种用于在生物分子引入、修饰、改变、替代等等取代基。例如，半胱氨酰基基团可以与α -卤代乙酸酯(以及相应的胺)，比如氯乙酸或 氯乙酰胺反应，以获得羧甲基或羧氨基甲基(carboxyamidomethyl)衍生物。半胱氨酰 基基团同样可以通过，例如与溴三氟丙酮(bromotrifluoroacetone)、α-溴基-β-(5-咪 唑基)丙酸(α bromo- β - (5-imidozoyl) propionic acid)、磷酸氯乙酰基、N烷基马来酰 亚胺(alkylmaleimides)、3-硝基-2-氮苯基二硫化物、甲基2-氮苯基二硫化物、对氯 汞苯甲酸、2-氯汞苯酚-4-硝基苯酚(2 chloromercura-4-nitrophenol)或氯代_7_硝基 苯并-2-乙二酸-1,3- 二唑反应获得。组氨酰基团可以通过与焦碳酸二乙酯在pH5.5-7.0下反应得到。也可使用对溴 苯酰(bromophenacyl)溴化物，该反应优选在0.1M 二甲胂酸钠，pH6.0的条件下进行。 赖氨酰和α氨基末端基团可与琥珀酸或其他羧酸酐反应，以改变基团的电荷性。其他 用于获得含α-氨基基团的合适试剂包括亚氨酸酯，比如，甲基吡啶亚胺甲酯(methyl picolinimidate)、磷酸吡哆醛、吡哆醛、氯氢化硼(chloroborohydride)、三硝基苯磺酸
(trinitrobenzenesulfonic acid)、O-甲基异脲(methylisourea)禾Π 2,4-2,4-戊二酮，以及 可使用二羟乙酸被氨基移换酶催化的氨基酸。精氨酰基团可以通过与一个或数个常规试剂，比如苯甲酰甲醛、2,3-丁二酮、1,2 环已二酮和茚三酮反应修饰。精氨酸基团衍生通常需要碱性反应条件。进一步，试剂可 与赖氨酸以及精氨酸ε氨基反应。酪氨酰基团的特定修饰可使用芳香族重氮化合物或四硝基甲烷反应获得。例如 N乙酰基咪唑和四硝基甲烷可分别用于形成O-乙酰基酪氨酰类物和3-硝基衍生物。
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羧基侧基(天冬氨酰基或谷酰基)可通过与二亚胺碳(R-N=C=C-R')反应而被修 饰，其中R和R’可以是不同的烷基，比如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)二亚胺碳 或 1-乙基-3- (4-氮翁-4,4- 二甲基戊基)二亚胺碳(l-ethy:i-3- (4-azonia-4,4-dimethyl pentyDcarbodiimide)。进一步，天冬氨酰基和谷酰基基团可通过与铵离子反应转变为门 冬酰胺(asparaginyl)和谷酰胺基基团。谷酰胺基和门冬酰胺基团通常在中性或碱性条件下脱去酰胺基，以分别形成谷 酰基和天冬氨酰基基团。那些脱去酰胺基形成的基团落入本发明的范围内。其他修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟化，丝氨酰或苏氨酰基团的羟基的磷酸化， 赖氨酸、精氨酸和组氨酸的α -氨基的甲基化(Creighton ,Proteins !Structure and Molecular Properties ,W. H. Freeman Co. ,San Francisco ,pp. 79-86 (1983))，以及 N 末端胺的乙酰化和 任意C末端羧基的酰胺化。另一种共价修饰包括化学或酶化将糖苷连接到目标分子上。 根据使用的连接方式，糖可能是连接到(a)精氨酸和组氨酸；(b)自由羧基；(c)自由 巯基，比如半胱氨酸的自由巯基；(d)自由羟基，比如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的自由 羟基；(e)芳香族基团，比如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳香族基团；或(f)谷氨酰胺 的酰胺基。这种方法描述在 W087/05330 和 Aplin Wriston ,CRC Crit .Rev. Biochem. ,pp. 259-306(1981)中。糖基团同样可以使用酶法添加，例如，葡糖基转移酶、唾液酸转移 酶、半乳糖基转移酶等。存在于目标分子中的任意碳水化物部分的去除可通过化学法或酶法实现。化 学法去糖基化，例如，将需要将分子与化合物，如三氟甲基磺酸，或等同化合物充分接 触，引起除连接糖(N-乙酰氨基葡糖或N-乙酰半乳糖胺)外的大部分或所有糖的剪切， 同时保持分子的其余部分不受影响。化学法去糖基化描述在，例如Hakimuddin等人， Arch. Biochem. Biophys. 259:52 (1987)和 Edge 等人，Anal. Biochem. 118:131 (1981)中。 酶法剪切分子中的碳水化物部分可以通过任意种类的糖苷内切酶和糖苷外切酶实现，酶 法剪切描述在，例如Thotakura等人，Meth. Enzymol. 138:350 (1987)中。因此，可使用 甘露糖苷酶、岩藻糖苷酶、氨基葡萄糖苷酶(glucosaminosidase)、半乳糖苷酶等。简单分离编码流感的HA、NA等的RNA或DNA，并使用常规操作测序(例如， 通过使用可特异性结合相关基因的寡聚核苷酸探针探针，Innis等人in PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic (1990),以及 Sanger 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. 74:5463 (1977))。一旦分离，DNA可被植入表达载体中，然后再植入寄主细胞，比如E. coli细胞、NSO细胞、COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组寄 主细胞中获得目的蛋白的合成。RNA或DNA同样可被修饰，例如，通过置换碱基以优化 特定宿主中的密码子选择或通过将异源多肽共价连接到编码序列。习语和术语及其组合，流感病毒、抗原、元件、亚基、HA、NA等及其组合的 “功能性片断、部分、变体、衍生物或类似物”等及其组合，涉及具有与野生型或产生
变体、衍生物，类似物等的亲本元素相一致的定性生物活性。例如，HA的功能性部分、 片断或类似物可以如原始HA—样刺激免疫反应，尽管反应可能针对HA上不同抗原决定簇。因此，包括在本发明范围内的是病毒，或其部分或衍生物的目标功能等效体， 术语“功能等效体”包括病毒和其能够刺激对抗流感的免疫反应的部分。
目标流感病毒的部分，比如携带ΗΑ、ΝΑ、M2或组合的膜或非膜制剂，以及任 意其他流感抗原的制剂，可以通过本领域的已知操作方法获得。当一个或多个免疫显性 非保护性抗原决定簇(IDNPEs，这同样还包括刺激菌株特异性，但是范围更窄的免疫性 的抗原决定簇)被移除或抑制时，例如，通过分子内修饰(例如删除、电荷变化、添加一 个或多个N连接序列肽段等)并作为抗原提供给初始动物，针对IDNPE的变化可诱导新 的，对抗次要的或之前沉默的抗原决定簇的免疫反应级别，免疫反应水平为B和T细胞 水平中的一种或两种(Garrity等人，J. Immunol. (1997) 159 (1) :279_89)。在此描述的技 术称为“免疫再聚焦”。一旦改变造成，改变是否影响，比如，降低现已修饰的免疫显性抗原决定簇的 反应性，“抑制的抗原决定簇，抗原等”如在此或如本领域技术人员所知的确定。这例 如，可以在体外通过确定抑制抗原与确定的与主要抗原决定簇反应的抗血清的反应性而 测试，比如通过ELISA或蛋白质印迹。证明降低了与确定抗血清反应性的候选者被选择 在体外测试，以确定那些抑制的抗原是否具有免疫原性以及宿主是否会产生针对其免疫 反应。因此，例如，如本领域技术人员所知，针对抑制的抗原接种鼠，获取血清并在体 外试验中测试其与抗原的反应性。抗血清然后可以在野生型病毒上测试，以确定抗体是 否仍可识别野生型抗原决定簇或野生型抗原。这可以在，例如ELISA或蛋白质印迹中完 成。后者可以是富有意义的，揭示了特定免疫显性抗原决定簇是否是关联的，并且如果 抗血清仍可与流感反应，其大小也许和携带与鼠抗血清反应的抗原决定簇的分子具有同 一性。那些候选的免疫抑制抗原极少或不与已知的可与亲本免疫显性抗原的抗血清反 应，在宿主中仍保持有免疫原性的，被选为候选疫苗用于进一步测试。候选者同样可 刺激提高针对亲本免疫显性抗原的反应性，并结合免疫再聚焦用于免疫识别的抗原决定 簇。例如，在基于标准的抗病毒试验中，鼠抗血清可被用于与多种流感菌株反应性的测 试，以确定抗体的普遍性，亦即抑制抗原上新识别的抗原决定簇对宽范围的流感菌株是 否具有普遍性，以及抗体是否具有宽抗病毒活性。因此，重组HA(rHA)亚基蛋白疫苗可足够有效保护对抗流感病毒同源株的威 胁。rHA在老年人中同样可被用作免疫原。第二代，如本文所教导的免疫再聚焦HA 亚基疫苗同样可诱导针对异源株的保护性免疫(Treanor等人，J. Infectious Diseases 2006; 193:1223-8)。在一个实例中，流感的HA和NA作为用于免疫保护反应的新靶标，被选为再聚 焦针对其他在HA和NA上的非主要位点的宿主免疫应答靶标，优选那些在各种菌株等具 有宽范围和广谱活性的。例如，HA具有5个免疫显性位点或抗原决定簇，记为A-E。位点A包括HA 型菌株的140-146氨基酸，并具有序列KRRSNKS (SEQ ID NO. 1)。与香港菌株相比， 在Wyoming菌株中，位点已经有连接有三个糖基化位点。因此，一个去除由位点A确定 的环结构的方法是，例如，通过使用例如GG替换KRRSNKS (SEQ ID NO. 1)序列。位点B包括HA的189-197氨基酸，其序列为SDQISLYAQ (SEQ ID NO. 2)。这 形成了与具有序列KYKY (SEQ ID NO. 3)的158-161氨基酸作用的螺旋。可以B位点制 造多种可能的变化，比如用NAS取代QIS ；用NIT取代SLY ；用NST在158取代KYK ；以及用NTS在159取代YKY，所有这些变化都在这4个位点引入N糖基化序列。位点C包括具有序列KCN的氨基酸276-278。NCT可以替换KCN。位点D包括在氨基酸201-220的大逆平行环。整个环可以被去除。同样的， 糖基化位点NIT可在201-203位点替换RIT。位点E包括79-82氨基酸,FQNK(SEQ ID NO. 4)。糖基化位点NET可替换QNK。以上变化可结合，比如，在B位点的NST和NTS变化中的任何一个可与针对位 点C和/或E的建议的、示范性变化相结合。以上针对免疫显性位点的改变可以通过克隆、位点定向诱变、扩增等如本领域 技术人员所知的方法获得。因此，上述的A位点改变可以使用引物，A顶GGAACAAGCTCTGCTTGCggc ggtTTCTTTAGTAGATTGAATTGG (SEQ ID NO. 5)和 A 底CCAATTCAATCTACTAAAG AAaccgccGCAAGCAGAGCTTGTTCC (SEQ ID NO. 6)以获得包含上述删除并在删除位点 插入 GG 二肽的序列 GTSSACGGFFSRLN(SEQ ID NO. 7)。B位点变化可以通过使用引物获得，Bl顶CAAATCAGCCTATATGCTaatGC ATCAGGAAGAATCAC (SEQ ID NO. 8)和 Bl 底GTGATTCTTCCTGATGCattAGCAT ATAGGCTGATTTG(SEQ ID NO. 9)以获得序列 QISLYANASGRI (SEQ ID NO. 10)；引 物 B2 顶CACCACCCGGTTACGGACaatGACacAATCAGCCTATATGCTCAAGC (SEQ ID NO. 11) and B2 底 GCTTGAGCATATAGGCTGATTgtGTCattGTCCGTAACCGGGTGGTG (S EQ ID NO. 12)以获得序列 HHPVTDNDTISLYAQ(SEQ ID NO. 13)；弓丨物 B3 顶CGG ACAGTGACCAAATCAatCTAtcTGCTCAAGCATCAGGAAG(SEQ ID NO. 14)禾口 B3 底 CTTCCTGATGCTTGAGCAgaTAGatTGATTTGGTCACTGTCCG (SEQ ID NO. 15)以获得 序列 DSDQINLSAQASG(SEQ ID NO. 16)；引物 B4 顶GAATTGGTTGACCCACTTA AAtTACAcATACCCAGCATTGAACGTGAC (SEQ ID NO. 17)和 B4 底GTCACGTTCA ATGCTGGGTATgTGTAaTTTAAGTGGGTCAACCAATTC (SEQ ID NO. 18)以获得序列 NWLTHLNYTYPALNV(SEQ ID NO. 19)；和引物 B5 顶GAATTGGTTGACCCACTTA AAAaACAAAacCCCAGCATTGAACGTGACTATG (SEQ ID NO. 20)禾口 B5 底CATAGTC ACGTTCAATGCTGGGgtTTTGTtTTTTAAGTGGGTCAACCAATTC (SEQ ID NO. 21)以获 得序列 NWLTHLKNKTPALNVTM (SEQ ID NO. 22)。C 位点改变可以使用弓丨物 C1 顶GATCAGATGCACCCATTGGCAAtTGCAgTTC TGAATGCATCACTCC (SEQ ID NO. 23)禾口 Cl 底GGAGTGATGCATTCAGAAcTGCAaT TGCCAATGGGTGCATCTGATC (SEQ ID NO. 24)以获得序列 SDAPIGNCSSECIT (SEQ ID
NO. 25)。D 位点改变可以使用弓丨物 D1 顶CTATATGCTCAAGCATCAGGAAatATCACAG TCTCTACCAAAAG (SEQ ID NO. 26)和 Dl 底CTTTTGGTAGAGACTGTGATatTTCCTG ATGCTTGAGCATATAG (SEQ ID NO. 27)以获得序列 LYAQASGNITVSTKRS (SEQ ID NO.
28)。E 位点改变可以使用引物 El 顶GATGGCTTCCAAAATAAGAcATGGGACCTTT TTGTTGAAC (SEQ ID NO. 29)禾口 El 底GTTCAACAAAAAGGTCCCATgTCTTATTTTG GAAGCCATC (SEQ ID NO. 30)以获得序列 DGFQNKTWDLFVE (SEQ ID NO. 31)。
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HAS 1 CAGTCCTCATCAGATCCTTG (SEQ ID NO. 32)， HAS 2 GGTAAGGGATATCTCCAGCAG (SEQ ID NO. 33)引物可被用于测序，以 HAS 3 cgcgattgcgccaaatatgcc (SEQ ID NO. 34)作为阴性对照。许多抗原性位点是富电荷的氨基酸基团。另一个方法是使用丙氨酸基团那些带 电荷基团。这种变化的例子包括在A位点中KRR到AGA ； B位点中的KYKY (SEQ ID NO. 3)到 AYKY (SEQ ID NO. 35)和 SDQI 到 SAQI (SEQ ID NO. 36) ； C 位点中的 KCN 到ACN和D位点中的RIT到AIT。此外，在评价B位点中憎水酪氨酸基团的功能时，可以使用SLT替代SLY获得突变。除B细胞抗原决定簇之外,T细胞抗原决定簇同样可被免疫抑制。主要的CD4 抗原决定簇在基团177到199区域，含有在已结合的B位点外的MHC II型结合抗原 决定簇。在基团LYIWGVHHP(SEQ ID NO. 37)以抑制T细胞反应的突变包括使用 VYIW (SEQ ID NO. 38)或 VTIW (SEQ ID NO. 39)替代 LYIW ；以及使用 IHAG (SEQ ID NO. 40)替代 VHHP。为从管理机构，比如美国食品和药品管理局或欧洲药品管理局获得人用产品 批准，生物学制剂必须满足由相关管理机构确定的纯度、安全和效力标准。为生产 满足那些标准的疫苗，重组生物可培养在，例如被证明无传染性海绵脑病(在此称为
“TSE” )的培养基中。例如，质粒装载有携带非抗生素选择标记的疫苗编码序列，因为使用抗生素抗 性标记在细菌中进行为人类设计的质粒的选择及维持并不总是理想的，优选的方案涉及 重组亚单位疫苗的使用。在一个实例中，本发明提供一种选择策略，例如，通过使细 菌在含有所述分解酶的底物作为碳源的培养基中生长，分解酶被用作选择标记。这种 分解酶的例子包括，但不限于，IacYZ编码乳糖摄取和β-半乳糖苷酶(Genbank Nos. J01636, J01637, Κ01483或Κ01793)。其他在合成培养基中提供代谢优势的选择标记 包括，但不限于，用于利用半乳糖的galTK(GenBank No. Χ02306)、用于利用蔗糖的 sacPA(GenBank No. J03006)、用于利用海藻糖的 trePAR(GenBank No. Z54245)、用于利 用木糖的xylAB(GenBank No. CAB 13644和AAB 41094)等。此外，选择可以涉及运用 反义mRNA以遏制毒性等位基因，比如sacB等位基因(GenBankNo. NP_391325)。为测试，目标免疫原被施用于非人类哺乳动物，以获得例如，临床前数据。典 型的非人类哺乳动物包括非人类的灵长类动物、狗、猫、啮齿类动物及其他哺乳动物。 这种哺乳动物可建立使用制剂治疗疾病的动物模型，或被用于研究目标免疫原的毒性。 在那些实例中每一个，剂量增加研究可以哺乳动物中进行。在本文描述的用于制备新型疫苗和制剂的具体方法，对本发明而言并不是必须 的，或选自或可包括生理缓冲液(Feigner等人，美国专利5,589,466 (1996));磷酸铝或磷 酸羟基铝(aluminum hydroxyphosphate)(例如 Ulmer等人，Vaccine, I8:18 (2OOO)),单磷 酰脂 A (Monophosphoryl-Iipid A)(也称为 MPL 或 MPLA) (Schneerson 等人 J. Immunol., 147:2136-2140 (1991)；例如 Sasaki 等人 Inf. Immunol., 65:3520-3528 (1997)；以及 Lodmell 等人 Vaccine, 18:1059-1066 (2000)), QS-21 皂甙(e.g. Sasaki 等人，J. Virol., 72:4931 (1998))；地塞米松(例如，Malone 等人，J. Biol. Chem. 269:29903 (1994)) ； CpG DNA 序列(Davis 等人，J. Immunol., 15:870 (1998));干扰素-a (Mohanty 等人，J.Chemother. 14(2):194-197, (2002)),脂多糖(LPS)拮抗剂(Hone 等人，J. Human Virol., 1: 251-256 (1998))等。出于被治疗疾病的具体症状，制剂在此也可含有超过一种活性物质，优选那些 活性互补并且彼此之间无不利影响的。例如，进一步提供助剂也许更为合适。这种组 合物中的分子以足够有效实现预定目标的适当量存在。助剂可以在抗原施用前后相继施用。目标免疫原可与第二组分使用，比如，作为一种治疗方法，不同的治疗性组分 相结合或混合，结合、在组合分离、在使用前混合等方式施用(参见，例如，Levine等 人，eds., New Generation Vaccines. 2nd Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1997)。治疗齐Ll 可以是任何用于预定目的的药物、疫苗等。因此，治疗剂可以是生物制剂、小分子等。 目标免疫原可与例如，免疫抑制或不抑制的第二流感免疫原组合物同时或相继施用。因 此，免疫抑制的目标抗原可与现有疫苗相结合，但是，如果现有疫苗是在蛋中制造的， 该方案中将尽量少使用现有疫苗。术语“小分子”及类似术语包括，但不限于，肽、模拟肽 (peptidomimetics)、氨基酸、氨基酸类似物、多核苷酸、多核苷酸类似物、碳水化合
物、脂、核苷酸、核苷酸类似物，分子量小于约lOOOOg/mol的有机或无机化合物(即包 括异有机物(heterorganic)和/有机金属(organometallic)化合物)，分子量小于约 5000g/mol的有机或无机化合物，分子量小于约lOOOg/mol的有机或无机化合物，分子量 小于约500g/mol的有机或无机化合物，和盐、酯或其组合及其他药学可接受的，刺激免 疫反应或是免疫原性的，或具有所要求药学活性混合物的形式。因此，本发明的免疫原 可以单独施用或与其他类型的治疗相结合，包括第二免疫原或用于将治疗疾病的治疗方 法。第二组分可为免疫刺激原(immunostimulant)。此外，本发明的免疫原可与各种效应分子比如异源肽、药物、放射性核苷 酸(radionucleotides)等相结合，参见，例如 WO 92/08495 ； WO 91/14438 ； WO 89/12624 ；美国专利5314995 ；和EPO 396387。免疫原可与治疗性物质比如抗生素(例 如，治疗剂或放射性金属离子(例如，α发射体，比如，例如Bi 213))或助剂相结合。 本发明的治疗性混合物至少减轻一个与流感有关的症状。如本领域技术人员所知或如本 文所描述的，本发明的产品可以提供在药学可接受的组合物中。术语“生理学可接受 的”，“药理学可接受的”等意味着经联邦州政府管理机构或列于美国药典或其他一般 的，用于人类的认可药典中。目标产品可以任何可接受的方式施用到哺乳动物中。引入的方法包括，但不限 于，不经肠道、皮下、腹膜内、肺内、鼻内、硬膜外、吸入和口服，如果用于抑制免疫 力的疗法，病灶内施用。不经肠道的引入包括肌内、真皮内、静脉内、动脉内或腹膜内 施用。产品或组合物可以任何方便的方式施用，例如，通过输液或颗粒注射，通过透皮 或粘膜与皮肤层(例如，口腔粘膜、直肠肠粘膜等)吸收，并可与其他生物活性剂一起 施用。施药可以是全身性的或局部的。此外，通过任何合适的方式，包括心室内和脑脊 髓膜内注射，将本发明的治疗性产品或组合物引入中枢神经系统也许是理想的；心室内 注射可以通过心室内导管例如，连接到储液囊，如Ommaya储液囊而易化。此外，产品可与恰当地配合使用脉输液，特别是目标产品的剂量衰减时。优选的，制剂通过注射， 优选静脉或皮下注射给予，这部分取决于施用是否是短暂的或慢性的。已知有多种其他输送系统，并可用于施用本发明的产品，包括，例如，脂质体、 微粒或微胶囊包覆(参见 Langer, Science 249:1527 (1990)； Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein 等人，eds., (1989))。可包裹在微胶囊中活性成分的制备是，例如，通过传统技术，在胶质给药 系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或在巨乳液
(macroemulsions)中，例如，羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶 囊，分别应用界面聚合。这种技术公开在Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osal, Ed. (1980)。肺部施药可以，例如通过吸入器或雾化器的使用，及具有雾化剂的制剂而实 现。目标组合物还可以以干粉组合物的形式施用到患者的肺，参见，例如美国专利 6,514,496。在需要治疗的区域局部施用本发明的治疗性产品或组合物也许是理想的；这可 以通过，例如而不是作为限制，局部输液、表面施药、注射、导管法、栓剂法或植入体
(implant)法实现，所述植入体是渗透性、非渗透性或胶状材料，包括水凝胶或膜，比 如硅胶弹性体(sialastic)膜或纤维。优选的，在施用本发明产品时，需要注意到使用的 材料不会吸收或吸附蛋白。在另一实例中，产品可以在控释系统中输送。在另一实例中，可以使用泵(参 见 Langer, Science 249:1527 (1990); Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald 等人，Surgery 88:507 (1980)；和 Saudek 等人，NEJM 321:574 (1989))。在另一 实例中，可以使用聚合材料(参见 Medical Applications of Controlled Release, Langer 等人， eds., CRC Press (1974) ； Controlled Drug Bioavailability, Drag Product Design and Performance, Smolen 等人，eds., Wiley (1984) ； Ranger 等人，J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983); see also Levy 等人，Science 228:190 (1985); During 等人，Ann. Neurol. 25:351 (1989); and Howard 等人，J. Neurosurg. 71:105 (1989))。在另一实例，控释系统 可置于治疗目标附近。使用本目标产品时可以制备成缓释制剂。缓释制剂的合适例子包括含有免疫 原的固体憎水聚合物半渗透基质，其中基质可以具有一定的形状，例如，膜状或基片
(matrices)。这种缓释基片的合适例子包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-甲基丙烯酸羟 乙酯)、聚(乙烯-乙烯醇))、聚乳酸(美国专利3773919)、L-谷氨酸和乙基-L-谷氨 酸共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙酯、可降解的乳酸_乙二酸共聚物(比如由乳酸-乙二 酸共聚物构成的可注射微球体)和聚D-(_)-3-羟丁酸。聚合物比如乙烯乙酸乙酯和乳 酸-乙二酸允许释放分子超过100天，而一些水凝胶在短期内释放细胞、蛋白和产品。可 以根据涉及的机制设计合理的稳定策略。组合物可采用溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末、缓释制剂、 长效制剂等剂型。与常规的粘合剂和载体比如甘油三酸酯一起，组合物可配制成栓剂。 口服制剂可含有标准载体比如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖钠(sodium saccharine)、纤维素、碳酸镁等。适当载体的例子描述在"Remington's Pharmaceutical
16Sciences," Martin.这种组合物将含有有效量的，优选以纯化形式存在的免疫原，与适当量 的载体一起，以对患者提供恰当的用药方式。如本领域技术人员所知，制剂的构建要适 合施药方式。用于储存的产品的治疗性制剂可以制成如冻干制剂或水溶液，水溶液通过将具 有所需纯度的产品与本领域常用的任意药学可接受的载体，稀释剂，赋形剂或稳定剂， 即缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂(isotonifier)、非离子型表面活性剂、抗氧化剂及 其他各种添加剂混合得到，参见 Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Osol, ed.
(1980)。在应用的剂量和浓度下，这种添加剂对受体一般是无毒的，因此，赋形剂，稀 释剂，载体等是药学可接受的。免疫再聚焦多肽(包括抗原、部分抗原、抗原决定簇、决定簇等，可生产为基 本无污染蛋白，包括其他流感蛋白，与其他病毒或非病毒多肽相结合；作为可以在重组 病毒中表达或生产的目标IR多肽、VLP或与一种或多种病毒或细胞源蛋白相结合；作为 可作为纯化分子表达或生产的IR多肽与一种或多种病毒或细胞源蛋白相结合；等)可以 基本以纯态获得或制取。“分离的”或“纯化的”免疫原是基本上无源自获取免疫原的 培养基的污染蛋白，或基本上无化学前体或其他含有化学合成组分的培养基中使用的化 学品。用语“基本上无亚细胞材料”包括处理细胞，其中细胞被打破以形成可从细胞的 亚细胞元件分离的组分，包括死细胞和细胞部件，比如细胞膜、细胞鬼影等，免疫原可 以从中分离或重组生产。因此，基本上无亚细胞材料的免疫原包括制备的免疫原含有小 于约30%、25%、20%、15%、10%、5%、2.5%或1% (干重)的亚细胞污染物，或任何 其他与目标产品不同的成分。在本文，在液体制剂中的术语“稳定性”和“稳定的”指与免疫原抗性有关 的免疫原在制剂中对热和化学聚合、降解或断裂在给定的生产、配制、运输和储藏条件 下，比如，1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或更长时间。本发明的“稳 定”制剂在给定的生产、配制、运输和储藏条件下，保持相等或大于80%、85%、90%、 95%、98%、99%或99.5%的生物活性。所述免疫原制剂的稳定性可以由聚合、降解或 断裂的程度确认，本领域技术人员所熟知的方法包括，但不限于，物理观察，比如，使 用显微镜、粒子大小和数量的确定等，与参考相比较。术语“载体”，涉及与治疗剂一起施用的稀释剂、助剂、赋形剂或媒介。这种 生理学载体可以是灭菌的液体，比如水和油，包括那些石油、动物、植物或合成源的， 比如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等。当药用组合物是静脉施用时，水是一种合适的 载体。盐溶液和水性葡萄糖和甘油溶液也可用作液体载体，特别是可注射的溶液。合 适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、凝胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅 胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、乙醇等。 如果需要，组合物同样可含有少量润湿或乳化剂，或pH缓冲剂。载体可包括盐和/或缓 冲液。缓冲剂辅助维持pH在近生理条件范围内。缓冲液优选以约2mM到约50mM的 浓度存在。用于本发明的合适的缓冲剂包括有机和无机酸两者，及其盐，比如柠檬酸盐 缓冲液(例如,柠檬酸一钠_柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸钠混合物、柠檬酸-柠檬 酸一钠混合物等)、琥珀酸盐缓冲液(例如，琥珀酸_琥珀酸一钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸_琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸盐缓冲液(例如，酒石酸_酒石酸 钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、延胡索酸盐缓冲液 (例如，延胡索酸-延胡索酸一钠混合物、延胡索酸-延胡索酸二钠混合物、延胡索酸一 钠-延胡索酸二钠混合物等)、葡萄糖酸盐缓冲液(例如，葡糖酸-葡糖酸钠混合物、葡 糖酸-氢氧化钠混合物、葡糖酸-葡糖酸钾混合物等)、乙二酸盐缓冲液(例如，草酸-草 酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐缓冲液(例如， 乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)、和乙酸盐缓冲 液(例如，乙酸_乙酸钠混合物、乙酸_氢氧化钠混合物等)。也可使用磷酸盐缓冲液、 碳酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液、三甲胺盐，比如Tris、HEPES及其他这种已知的缓冲液。可添加防腐剂以抑制微生物生长，其添加量可在0.2%-l%(w/V)之间。用 于本发明的合适防腐剂包括苯酚、苯甲醇、间甲酚、十八烷基二甲基苄基溴化铵
(octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride)、苯甲烃铵(benzyaconium)商化物(M 如，氯化物、溴化物和碘化物)、氯化六烃季铵、烷基对羟苯甲酸比如甲基或丙基对羟苯 甲酸、儿茶酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。等渗剂的存在在于保证本发明液体组合物的生理等渗性，等渗剂包括多羟基糖 醇，优选三羟基或更多羟基糖醇，比如甘油、赤藻糖醇(erythritol)、阿拉伯糖醇、木 糖醇、山梨糖醇和甘露醇。按重量计，相对与其他组分的相对量，多元醇可以约0.1到约 25%的量存在，优选约1%到约5%。稳定剂是一种宽范的赋形剂，其功能可从填充剂到添加剂，可使治疗剂溶液化 或辅助防止降解或粘附到容器壁。典型的稳定剂可以是多羟基糖醇；氨基酸，比如精 氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、 2_苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，比如乳糖、海藻糖、木苏糖、阿拉 伯糖醇、赤藻糖醇、甘露醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇(myoinisitol)、半乳 糖醇、甘油等，包括环多醇比如肌醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，比如尿 素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙酸钠、硫甘油、α-硫代甘油、和硫代硫酸钠；低分子 量多肽(即< 10个基团)；蛋白，比如人血清白蛋白、牛血清清蛋白、明胶或免疫球蛋 白；亲水聚合物，比如聚乙烯吡咯烷酮、糖类、单糖，比如木糖、甘露糖、果糖或葡萄 糖；二糖，比如乳糖、麦芽糖和蔗糖；三糖，比如棉子糖；聚糖，比如右旋糖酐等。稳 定剂可以0.1到lOOOOw/w每份免疫原的范围存在。此外的杂项赋形剂包括填充剂，(例如淀粉)、螯合剂(例如EDTA)、抗氧化剂 (例如抗坏血酸、甲硫氨酸或维生素E)和助溶剂。在本文，术语“表面活性剂”是具有双亲结构的有机物，也就是由溶解性倾向 对立的基团构成，一般是油溶性烃链和水溶性离子基团。根据表面活性部分的电荷性， 表面活性剂可分为阴离子、阳离子和非离子型表面活性剂。在多种药用组合物和生物材 料制剂中，表面活性剂经常用作润湿、乳化、增溶和分散剂。可添加非离子型表面活性剂或去垢剂(又名“润湿剂”)以助于治疗剂的溶 液化，以及保护治疗性蛋白对抗搅动诱导的聚集，同样使制剂在不引起蛋白变性的情况 下承受剪切面应力。合适的非离子活性剂包括聚山梨酸酯(20、80等)、聚环氧乙烷
(polyoxamers)、Pluronic ？ 多元醇和聚山梨酯(TWEEN -20 , TWEEN -80 等)。非离子活性剂可以约0.05mg/ml到约1.0mg/ml的范围存在，优选约0.07mg/ml到约0.2mg/ ml ο在本文，术语“无机盐”为任何不含碳的，由金属或类似金属的基团替换部分 或所有酸式氢或酸得到的，在药用组合物和生物材料制剂中通常作为强度调节剂的化合 物。最觉的无机盐是NaCl、KCL NaH2P04等。本发明免疫原的液体制剂的pH在约5.0到7.0，或约5.5到约6.5，或约5.8到约 6.2，或约6.0，或约6.0到约7.5，或约6.5到约7.0之间。本发明涵盖的制剂，比如液体制剂在商用冷藏柜和医用或实验室用冷冻机可创 造的温度下，比如从约-20°C到约5°C具有储存稳定性，例如约60天、约120天、约180 天、约1年、约2年或以上，稳定性通过，例如显微观察确定。本发明的液体制剂也具 有应用稳定性，在室温下，使用前具有至少数小时，比如1小时、2小时或约3小时的稳 定性，稳定性通过，例如颗粒分析确定。稀释剂的例子包括磷酸缓冲盐、用于缓冲对抗胃囊中胃酸的缓冲液，比如含有 蔗糖的柠檬酸盐缓冲液(PH7.4)、单独的碳酸氢盐缓冲液(pH7.4)，或含有抗坏血酸、乳 糖或阿斯巴甜的碳酸氢盐缓冲液(pH7.4)。载体的例子包括蛋白，例如，在脱脂乳中发现 的蛋白，糖，例如蔗糖，或聚乙烯吡咯烷酮。一般的，载体将以约0.1-90%(w/v)的浓 度使用，但是优选的范围为1-10%(w/v)。在活体内使用的制剂必须无菌的。这可以通过，例如通过无菌过滤膜过滤实 现。例如，本发明的亚细胞制剂可通过过滤灭菌。免疫原组合物将按与GMP要求一致的方式进行配制、医治和施用。考虑因素包 括疾病的严重程度、被治疗的具体哺乳动物、具体患者的临床情况、扰乱的原因、用药 位点、施药方法、施药进程，及其他为医生所知的因素。要使用的免疫原的“治疗有效 量”受这种考虑支配，其最低用量应当足以防止、改善或治愈目标疾病、情况或紊乱。抗原的量是足以在目标宿主中诱导所需的体液和/或细胞介导的免疫反应的 量。本发明免疫原的施用量将有所变化，取决于目标的种类，宿主的物理特性，比如年 龄、体重等，优选的给药方式等。一般的，应用的剂量可以约10到约1500yg/次。作为 比较，现有的亚基制剂含有源自三种病毒亚型的组分。三价疫苗一般含有约7到约25 μ g 的来自3种选用菌株的HA。这可以作为目标疫苗组合物的滴定原点。在本文，术语“有效量”是足以降低目标疾病的严重程度和/或持续期、改 善其一个或多个症状、防止目标疾病的发展或引起的康复，或足以引起预防发展、再 发生、发作，或目标疾病或其一个或多个症状恶化的治疗量。例如，基于基准或正常 水平，治疗可以以至少以5%，优选至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少 30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、 至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%，或至少100%的程度 提高宿主的幸存率或降低疾病的严重程度。在另一实例，治疗性或预防性制剂的有效量 至少以5%，优选至少10%、至少15、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少 40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、 至少80%、至少85%、至少90%、至少95%，或至少100%的程度减轻目标疾病的症状， 比如流感症状或病程。在此实用是与术语“治疗有效量”相当的表述。
必要时，组合物还可以含有增溶剂和局部麻醉剂，比如利多卡因或其他“卡 因”麻醉剂以减轻注射位点的疼痛。一般的，在单位剂型中，组分是分离或共同混合供应的，例如，作为干燥冻干 粉末或无水浓缩物存在于密闭容器，比如安瓿或小袋并标明活化剂的量。当组合物通过 输液施药时，可在含有无菌药用级水或盐水的输液瓶中配制。当组合物是通过注射施药 的，可，例如在一套装提供一安瓿的灭菌注射用水或盐水，这样组分可以施用前混合。 此外，安瓿可含有具有目标活化剂的液体，例如，在使用前以需稀释的浓缩物或以用于 施药的形式存在。可提供含有对上述紊乱的治疗有用的材料的制品。制品可包括容器和标签。合 适的容器包括，例如瓶、小瓶、注射器和试管。容器可由各种材料比如玻璃或塑料制 成。容器容纳目标组合物，并可无菌入口(例如，容器可以是具有截止的静脉溶液袋或 小瓶，可由皮下注射针刺破)。在容器上或与容器有关的标签标明组合物是用于治疗流感 的。制品可进一步包括含有药学可接受缓冲液，比如磷酸缓冲盐、Ringer溶液或葡萄糖 溶液的第二容器。它可进一步包括对商业和患者来说是合理的其他材料，包括缓冲液、 稀释剂、过滤器、针、注射器和具有使用指南的包装说明书。本发明同样包括套装，例如，含有目标免疫原组合物、其同源物、衍生物等， 作为，例如疫苗，并用于相同用作的说明等。说明可包括用于制备组合物、衍生物等的 方法。组合物可以液态或固态，一般为干燥或冻干的形式存在。套装可包含合适的其 他试剂，比如缓冲液，再配制溶液及其他实现预期用途的必要组分。预期以预定的量包 装组合试剂，并说明其用途，例如用于治疗性用途。此外，可含有其他添加剂，比如稳 定剂、缓冲液等。各种试剂的相对量可改变，以提供试剂溶液的浓缩物，这将提供柔性 的、经济的空间，经济的试剂等。套装可包括给药装置，比如含有针的装置，比如注射 器，装置优选的可与目标组合物预装，在需要时给药。在上文论述的任何参考的引证，不应认为任何这种参考对本发明而言是在先技 术。在此的引用所有参考，在此作为参考全文引入。现在通过以下非限制性的例子示例性说明本发明。实施例1
8个免疫抑制的并再聚焦的源自Wyoming菌株(H3N2)的血凝素基因按上述的方法进 行设计并工程化。例如，核苷酸通过位点定向诱变被替换，以将引起复杂的碳水化合物 修饰，和/或氨基酸的缺失和/或电荷变化的N连接序列肽段引入5个含有IDNPE的主 要免疫原的并剧烈变化位点中。N连接序列肽段的引入被用于最大化由每一改变引起的，特别是在更大的抗原 性位点的免疫抑制的效果，同时减少要求抑制的野生型氨基酸变化的数量，并最小化任 何对糖蛋白构象复杂性和受体结合区的影响。在一些情况下，只需要3个氨基酸变化。 抗原性位点B (187-196)结合B细胞和CD4助T细胞的IDNPE 二者。为加快研究，制备DNA和蛋白质亚单位疫苗二者。对DNA免疫，全长的血凝 素基因被克隆入pTriEx载体(invitrogen)，位于巨细胞病毒(CMV)启动子之后。使用 pTriEx-HA结构瞬时转染哺乳动物细胞显示全长血凝素基因类似原始病毒蛋白质，表达 为三聚体并可从质膜提取物被溶剂化。
使用含有那8个突变的和一个未修饰的全长野生型HA糖蛋白的DNA结构免疫 9组远亲鼠。第10组使用空白pTriEx载体免疫作为阴性对照。除DNA表达载体之外，都产生了用于免疫的重组蛋白质。HA的膜外部分含有 用于三聚糖蛋白锚钉装配并结合宿主细胞受体的区域。此外，跨膜和细胞质区的去除引 起重组HA三聚体被释放到培养基表面。因此，HA基因的每一个变化都是在胞外域的尾 部进行的，并克隆到具有噬菌体T7启动子的载体中。将胞外域载体转染进入感染有表达 噬菌体T7 RNA聚合酶的重组牛痘病毒的细胞中，导致HA三聚体的产生，HA三聚体被 分泌到培养基质中。胞外域三聚体被纯化用于蛋白免疫原。鼠被预分类。一组鼠用作阴性对照，另一组使用未修饰的(野生型)抗原免 疫。在另一组实验，主群中的鼠通过将10微克突变的HA糖蛋白DNA(在0.1ml的 无菌水中)注射到四头肌中免疫。5周后，使用第二 DNA免疫强化鼠。又4-5周后， 鼠再次通过2次皮下注射10微克纯化的胞外域糖蛋白中的一个进行免疫强化。第一个蛋 白免疫原配制在完全弗氏助剂(Freund’ s Adjuvant)中，第二个在不完全弗氏助剂中。 在最终免疫2周后，鼠被安乐死并放血得到血清。测试血清以1)确定与突变株的反应性和野生型HA蛋白在蛋白质印迹和ELISA 中形式，2)通过肽ELISA识别线状抗原决定簇，3)保护构象抗原决定簇免受蛋白酶的降 解，和4)通过血凝抑制反应和同源和异源流感菌株的病毒中和进行功能测试。HA特异性ELISA测量表明，来自使用免疫再聚焦HA亚基工程化得到的抗原 免疫的鼠得到的血清导致高滴定度抗血清的产生。所有组的鼠对野生型HA的滴定度在 1:100-300000之间。各种突变HA糖蛋白的下游选择基于标准HI试验中抗血清对HI抗 体的跨亚型能力。H3N2 A/Wyoming/03/2003 的 A2、Bi、B2、B3、CE、CEB4、CEB 5，以及
Dl突变株具有相等或更高的针对用于试验的异源病毒亚型的跨亚型HI和/或病毒中和滴 定度。因此，在体外通过标准化和可接受的HI替代品和病毒中和试验的测量表明，免 疫抑制和再聚焦导致产生的HA糖蛋白亚单位候选疫苗可引起显著提高的跨亚型抗病毒防 护。突变株A2的突变在HA的抗原决定簇A中，其中KRRSNKS (SEQ ID NO. 1)被
GG替代。Bl突变发生在HA的抗原决定簇B，在氨基酸的197位(QIS到NAS)引入了糖 基化位点。B2突变发生在HA的抗原决定簇B中，在氨基酸189位点(SDQ到NVT)引 入了糖基化位点。B3突变发生在HA抗原决定簇B中，在氨基酸的193位点(SLYNIT) 引入了糖基化位点。CE含有两个突变，在抗原决定簇C的276位(KCN—NCT)引 入了糖基化位点，并在抗原决定簇E的83位(NKK —NKT)引入了糖基化位点。CEB 4是在抗原决定簇B具有额外突变的CE，糖基化位点添加在158位(KYK —NST)。 CEB 5是在抗原决定簇B具有额外突变的CE，糖基化位点添加在159位。Dl的突变在 HA的抗原决定簇D中，在氨基酸的201位(RIT到NIT)引入了糖基化位点。在另一组实验中，测试再聚焦多肽抗原的血球凝集素抑制滴定度和血清中和滴 定度，与不同的H3N2病毒菌株相比较。突变体来自A/Wyoming /2003菌株。M3具 有抗原决定簇B2 ； M5具有抗原决定簇CE ； M6具有上述的抗原决定簇B4CE。将鼠暴露于各种突变蛋白，A/Wyoming/2003菌株病毒作为野生型阳性对照，单独载体作为 阴性对照。然后测试鼠血清对3个菌株，Wyoming菌株的同源菌株、Panama /1999和 Wellington /2004菌株的血球凝集素抑制滴定度。测试其他鼠血清对Wyoming菌株的同 源菌株、Korea /2003、Brisbane /9/2006 和 Brisbane/10/2007 菌株的血清中和滴定度。 来自暴露于单独载体的鼠的对照血清未产生可与Wyoming、Panama和Wellington菌株反 应的特异性血球凝集素抑制抗体(滴定度=10)。暴露于野生型Wyoming病毒的鼠产生 了可与Wyoming和Wellington菌株反应的抗血清(滴定度=226)。与野生型相比，突 变株M5产生的抗血清与Wyoming和Wellington菌株的反应性是野生型的2倍多(滴定 度=2560)，与Panama菌株的反应性(滴定度=1920)仅略低。突变株M6产生的抗血 清与Panama和Wyoming菌株的反应性(滴定度分别为2560和1280)约为突变株M5水 平的一半。但是，当暴露于Wellington菌株时，突变株M6产生了高抑制性抗血清，具 有比所有其他滴定度高4倍的滴定度(滴定度=10240)。因此，当使用3处修饰的突变 蛋白时，除同源菌株外，免疫再聚焦引起针对其他2种菌株的更宽反应，并具有极高的 针对Wellington菌株的反应。在中和研究中，暴露于载体的鼠未产生特异性抗体。暴露 于Wyoming菌株的鼠产生的抗血清与Wyoming菌株反应强烈(滴定度=640)；对Korea 和Brisbane2006的滴定度是Wyoming的1/4 (滴定度=160)；与Brisbane2007基本没 有反应性(滴定度=20)。在鼠抗血清中产生的M3突变蛋白在Wyoming、Brisbane2006 和Brisbane2007中的反应性是野生型免疫原的4倍(滴定度=2560)。抗血清不与Korea 菌株反应(滴定度=3)。暴露于M5的鼠产生的抗血清与Wyoming菌株反应(滴定度 =80)，是与Brisbane2006菌株反应性的两倍(滴定度=160)，是与Korea菌株反应性的 30倍(滴定度=2560)。抗血清基本不与Brisbane2007菌株反应(滴定度=20)。因 此，通过目标抗原的免疫再聚焦实现了针对其他3个菌株的变宽的反应。实施例2
通过在21CFR610的规程评价重组免疫原的安全性、毒性和效力，规程包括(i ) 基本安全性试验，以及( )急性和慢性毒性试验。免疫原性数据来自可接受的，对人类流感疫苗反应良好的动物模型(例如豚 鼠、鼠、雪貂或棉鼠)。研究包括与剂量有关的和使用疫苗的不同剂量的免疫反应的评 价，疫苗含有用于最终产品的菌株。在相应动物模型的免疫原性研究被用于证明生产的 一致性，特别是在用于新型流感病毒制造过程的验证阶段。选定用于动物研究的合适的 非临床终点包括死亡、体重下降、病毒排泄率、临床症状比如发烧、眼鼻颁发物等。使用含有300 μ g目标免疫原的100 μ 1免疫原腹膜内接种雪貂组或其他合适的动 物组。使用合适的阴性和阳性对照。在感染后14天内监测动物的一般健康和体重。与接受安慰剂的动物类似，在观 察期中，接受免疫原的动物保持健康，并没有体重减轻或显示出明显的疾病症状。在更严格的安全性实验中，动物组被注射300 μ g的免疫原。在接种后一天，每一组中的3只动物被安乐死并分析脾、肺和肝组织均浆，以 确定免疫原的存在。在感染后第4、8、12和16周，每一组中的3只动物被安乐死，获 取并分析其脾、肺和肝组织均浆以确定免疫原的存在。与接种安慰剂作为内部对照的动物相比，如果没有观察到不利健康的因素且动物体重以正常速率增加，则免疫原被认为是安全的。为评价免疫原的急性和慢性毒性，雪貂组真皮内接种300 μ g量级剂量(graded dose)的免疫原或盐水。在接种3天后，每一组中的8只动物被安乐死以确定免疫原对动物的急性影响。 在接种28天后，每一组中剩余的8只动物被安乐死以评价对动物的任何慢性影响。在 两个时间点，获取每一只动物的体重。此外，宏观病理学和注射部位的表现都被观察。 在每一个时间点，取血用于血液化学分析，并进行内脏器官和注射部位的组织病理学分 析。其他动物在0、14和60天给予疫苗，总计3次，针对血凝素的免疫反应通过 ELISA测量，ELISA使用每隔10天从动物收集的血清。流感病毒的中和在收集的血清 中测量，例如，在首次接种80天后。应当清楚，在此优选实例中描述的各种变化和修饰，对本领域技术人员来说是 显而易见的。可在不脱离本发明构思和范围，并在不减少其预定优点的情况下，做出这 种变化和修饰。因此这种变化和修饰都将处于附加权利要求的范围内。参考文献
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权利要求
1.一种分离的组合物，含有在野生型病毒中不是免疫显性的流感免疫原抗原决定簇。
2.根据权利要求1所述的组合物，含有血凝素。
3.根据权利要求1所述的组合物，含有神经氨酸酶。
4.根据权利要求1所述的组合物，含有流感病毒颗粒。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述颗粒是灭活的。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包括糖基化位点的添加或去除。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包括氨基酸的添加、置换或去除。
8.根据权利要求1所述的组合物，含有类病毒颗粒。
9.根据权利要求1所述的组合物，表达在流感病毒的表面。
10.根据权利要求1所述的组合物，还包括药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
全文摘要
本发明提供了用作流感免疫原的新型组合物。组合物可使宿主对正常不为宿主所识别的免疫原位点反应。
文档编号A61P31/16GK102014953SQ200980113283
公开日2011年4月13日 申请日期2009年2月20日 优先权日2008年2月21日
发明者G·J·托宾, G·林, P·L·奈良 申请人:生物模仿公司