专利名称：金属提取肽标签和相关方法
金属提取肽标签和相关方法相关申请的交叉引用本申请要求2008年5月13日提交的美国临时专利申请序列号61/052，918的优 先权，其通过引用并入本申请中。本发明得到美国国立卫生研究院的资助(资助号P20 RR-17708)而开发。美国政 府可以拥有本发明的某些权利。
背景技术：
目前，使用金属从组合物中提取多肽(如蛋白质或蛋白质片段)已成为常用技术。 这样的提取是基于金属能够与组合物中的特异性多肽络合，而不与组合物中的其它物质发 生络合。已知可使用两种不同的基于肽的金属结合标签从组合物中分离出肽。然而，这些 结合标签具有用于实现结合的特定类型氨基酸和特定数目或特定序列的氨基酸，这与本发 明所述的结合标签有显著不同。例如，这两种结合标签可能不结合相同类型的金属，或者与 本发明不使用同样的几何构造。有关所述第一种结合标签的其它信息可以从Haroon等的 美国专利US 7，208，138 B2获得，并涉及包含序列NXEQVSP的肽。有关所述第二种结合标 签的信息可以从Arbogast等的美国专利申请公开20040018974获得，并涉及似乎是其中所 述完整蛋白质的标签序列。可以在生物体的遗传材料中编码、用于蛋白质重组表达的标签已广泛用于蛋白质 产品的纯化和鉴定。其最出名的实例是His-tag技术，该技术提供了通过使用固定化金属 亲和层析(immobilized metal affinitychromatography, IMAC)从完整细胞中有效分离带 标签蛋白质的简便方法。已开发了多种其它的基于肽之标签用于通过使用识别该肽标签的 抗体来检测细胞培养测定或细胞溶解物中的带标签蛋白质。这些技术可用于原位或体外测 定，但是它们一般不能用于体内分析。肽标签的优点在于，标签与目的蛋白质共价结合，而 无需另外的化学步骤标记蛋白质。MRI成像是研究活的动物和人的结构特征的常用方法。这一技术安全并且是非介 入性的。已开发了造影剂以改善该方法的灵敏度，以及用于加强MRI图像中观察到的特征。 之所以得到改善，是由于造影剂中包含改变了来自邻近分子(通常是水)之信号的金属。 最常用的试剂螯合Gd(III)，但是其它金属可用于增强对比度。含有Gd的造影剂不能用于 患有肾功能损伤的患者，因为可能会引发已知如肾源性系统性纤维化或肾源性纤维性皮肤 病的严重并发症。需要替代性的成像剂来满足这些患者的需求。螯合金属的化合物还用于 PET和SPECT成像中以观察分子水平的细节。
发明内容
本公开内容一般性地涉及三肽基序以及使用该基序的方法。这些肽具有结合金属 的能力，这使得它们可用于多种应用。特别地，本公开内容的三肽可应用于成像、研究、化学 疗法和螯合疗法。根据一些实施方案，本公开内容提供了包含具有序列^(C1C2之三肽的组合物，其中X是使得^(C1C2能够以平面四方形取向或四角锥形取向或两者兼有地结合金属的任意氨基 酸，其中C1和C2相同或不同，并且其中C1和C2独立地选自半胱氨酸和半胱氨酸样非天然氨基酸。根据另一些实施方案，本公开内容提供了包含具有序列^(C1C2之三肽和金属的组 合物，其中所述金属与所述三肽络合，X是使得三肽和金属形成具有平面四方形取向或四角 锥形取向或两者兼有的络合物的任意氨基酸，其中C1和C2相同或不同，并且其中C1和C2独 立地选自半胱氨酸和半胱氨酸样非天然氨基酸。根据另一些实施方案，本公开内容提供了包括使金属与具有序列^(C1C2之三肽络 合以形成金属-XC1C2络合物的方法，其中X是使得金属-XC1C2络合物具有平面四方形取向 或四角锥形取向或两者兼有的任意氨基酸，其中C1和C2相同或不同，并且其中C1和C2独立 地选自半胱氨酸和半胱氨酸样非天然氨基酸。对于本领域技术人员来说，在阅读了以下实施方案的描述后，本发明的特征和优 点将变得显而易见。
参考以下描述并结合附图可以更全面地理解本发明。图1显示结构1——GGH样金属络合物NGH，具有4个N配位。结构2和结构3—— GGH样结构，其包括金属与若干去质子化主链N原子发生配位。图2显示人PRL酶(包括PRl-l、PRL-2和PRL-3) C端部分的序列比对。PRL-1的 H166是显示为蓝色的NGH基序的一部分。PRL-I的C170和C171残基是显示为红色(框) 的CaaX基序的一部分。NCC基序用粗体标出。图3显示A.在pH 10下获得的结合镍之三肽的ESI-MS谱图，其中所示质量表明 镍与肽结合。B.将样品的pH降至5之后的ESI-MS谱图，其显示镍从肽中释放出来。图4显示Cu-NCC磁共振成像(MRI)。图5显示在切割和除去His-标签后，在pH 7. 4下，在Ni (II)存在下纯化的纯化 野生型PRL-I的照片。照片显示其特征性的铁锈色。图6显示A)在Ni2+离子存在下纯化的PRL-I变体的电子吸收谱。在800 200nm 之间记录每种蛋白质变体的三(两)幅谱图，并取平均值。所有变体的蛋白质浓度为5mg/ ml至10%以内(基于A280比较)。所显示的是700 300nm的谱图。可见的特征为吸收 最大值位于318nm和421nm。插图以便于观察421和526nm处吸收最大值的更小比例显示 600 400nm的谱图。各曲线如下PRL-1_WT，黑色(最上部)；PRL-1-H166A，红色(紧邻最 上部)；PRL-l-CHOS-CniS，橙色(底部)；PRL-1-C170S，绿色(紧邻底部)；PRL-1-C171S, 蓝色(中部)。B)PRL-I野生型的解析谱图，使用5条曲线将经Ni纯化的PRL-I野生型蛋 白在300 700nm之间的紫外-可见光解析谱图与数据拟合。将318nm肩部(shoulder) 解析成306、325和372nm的峰。显示了经解析的吸收峰(灰色虚线)和原始数据(黑色实 线)的总和。还存在421和526nm的峰。本专利或申请文件包含至少一幅彩图。经请求和支付必要费用后，可以从专利局 获得包括彩图的本专利或专利申请公布文件的副本。尽管本公开内容允许多种改动和替代性形式，但是附图中显示了具体实施例实施方案并且在本文中进行了详细描述。然而，应当理解，对具体实施例实施方案的描述不旨在 限制本发明至所公开的特定形式，与之相反，本公开内容将覆盖所附权利要求定义的所有 改动和等同形式。发明详述本发明一般性地涉及短肽基序和使用该基序的方法。这些肽具有选择性地结合金 属的能力，这使得它们可用于多种应用。特别地，本发明的肽可应用于成像、研究、化学疗法 和螯合疗法。一般地，本公开内容涉及与选定金属强烈结合的短的新型肽基序，称为MAP标签。 因此，这些MAP标签可用于从组合物中提取选定金属等。本公开内容的MAP标签的长度为 三个氨基酸，并且可以位于较长多肽和蛋白质的N端、C端或其间任意位置。然而，在一些 实施方案中，将MAP标签置于多肽或蛋白质构型中使MAP标签展示(用于结合金属)的位 置(例如该金属存在在环状物表面)可以是有利的。MAP标签还可以与非肽实体连结。此 外，可以使特定分子上存在多于一个MAP标签。已知多种蛋白质与金属结合。但是，此类结合通常利用折叠蛋白质结构中不连续 的氨基酸序列来实现紧密结合，一旦该蛋白质解折叠，则很容易释放出金属。另一方面，金 属与MAP标签的结合通过使用非常靠近的原子来实现，因此需要极端的条件才能释放出金 属。蛋白质的热变性和化学变性允许金属的缓慢释放。例如，使用极端条件(如沸腾温度、 强酸)可以在一段时间(如几个到很多个小时)内缓慢释放金属。A.化学结构在一些实施方案中，本公开内容提供了新的基于肽的标签或金属结合剂(MAP标 签)。该MAP标签可用于在多肽或蛋白质中直接编码高亲和力的金属结合位点。本公开内 容的MAP标签的特征在于，它们能够以平面四方形或四角锥形几何构造结合金属。1.肽序列本公开内容的MAP标签一般地包含能够结合金属的至少三个连续氨基酸残基。本 公开内容的MAP标签一般地具有表示为XC1C2的序列，其中C1和C2可以相同或不同并且可 以是半胱氨酸或半胱氨酸样非天然氨基酸(如含硫的α-或β-氨基酸)，X可以是另一种 天然或非天然的氨基酸或氨基酸类似物(只要所形成的肽标签能够以平面四方形或四角 锥形几何构造结合金属即可)。本文使用的L-氨基酸对映体的缩写形式是常规的(如下所 示)表1 天然氨基酸的缩写氨基酸单字母符号三字母符号丙氨酸AAla精氨酸RArg天冬酰胺NAsn天冬氨酸DAsp半胱氨酸CCys谷氨酸EGlu谷氨酰胺QGln甘氨酸GGly
组氨酸HHis异亮氨酸 IIle亮氨酸LLeu赖氨酸KLys甲硫氨酸 MMet苯丙氨酸 FPhe脯氨酸PPro丝氨酸SSer苏氨酸TThr色氨酸 W Trp酪氨酸Y Tyr缬氨酸V Val在一些实施方案中，X可以是天冬酰胺(N)、谷氨酰胺⑴)、组氨酸(H)、赖氨酸(K) 或精氨酸(R)。当氨基酸序列用三字母或单字母氨基酸缩写表示时，应当理解左侧方向是氨基端 方向，右侧方向是羧基端方向，这与标准用法和惯例是一致的。本公开内容的MAP标签可以采用任意重组技术系统与基因或用于表达的核苷酸 序列一同编码。此外，还可以通过使用针对肽或蛋白质生产的任意合成或生物合成方法将 所述MAP标签掺入肽或蛋白中。在应用中，所述MAP标签自发地与金属反应，形成肽-金属 络合物。这种肽-金属络合物可以在溶液中形成或者通过金属交换或任何其它过程而形 成。所述MAP标签可以单独使用，或者作为可连接至多肽链之N-端、C-端的标签或插 入多肽链内柔性接头或环中的标签。除了参与金属配位的侧链以外，所述MAP标签可以在 任意位置进行修饰。相应地，所述MAP标签可包含如Z-XC1C2-Z1的序列，Z可以为任意氨基 酸或任意氨基酸序列，Z1可以是与Z相同或不同的任意氨基酸或氨基酸序列。所述氨基酸 如上表1所示。该表中未列出非天然氨基酸和氨基酸类似物，但是可将它们掺入Z、Z1和/ 或X中。在一些实施方案中，所述MAP标签可以连接置另一分子。例如，所述MAP标签可以 连接至非肽实体(如碳水化合物，例如透明质酸)。该连接可以是共价的，也可以通过接头 进行连接。在一些实施方案中，所述MAP标签可包含以下序列=NC1C2 ；Z-NC1C2-Z1 ；Z-NC1C2 ； NC1C2-Z1 ； QC1C2 ；Z-QC1C2-Z1 ；Z-QC1C2 ； QC1C2-Z1 ；HC1C2 ； Z-HC1C2-Z1 ； Z-HC1C2 ；HC1C2-Z1 ；KC1C2 ； Z-KC1C2-Z1 ；Z-KC1C2 ；KC1C2-Z1 ；RC1C2 ；Z-RC1C2-Z1 ；Z-RC1C2 或 RC1C2-Z10 如上所述，Z 可以为任 意氨基酸或氨基酸序列，Z1可以为与Z相同或不同的任意氨基酸或氨基酸序列。所述氨基 酸如上表1所示。该表中未列出非天然氨基酸和氨基酸类似物，但是可将它们掺入Z和Z1 中。在一些实施方案中，所述MAP标签包含具有如下结构式的NCC
权利要求
1.组合物，其包含具有序列^(C1C2的三肽，其中X是使得^(C1C2能够以平面四方形取向 或四角锥形取向或两者兼有地结合金属的任意氨基酸，其中C1和C2相同或不同，并且其中 C1和C2独立地选自半胱氨酸和半胱氨酸样非天然氨基酸。
2.权利要求1的组合物，其中X选自天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸和精氨酸。
3.权利要求1的组合物，其还包含如下多肽，所述多肽包含具有序列^(C1C2的三肽。
4.权利要求1的组合物，其还包含如下非肽实体，所述非肽实体包含具有序列^(C1C2的 三肽。
5.组合物，其包含具有序列^(C1C2之三肽和金属，其中所述金属与所述三肽络合，其中 X是使得三肽和金属形成具有平面四方形取向或四角锥形取向或两者兼有的络合物的任意 氨基酸，其中C1和C2相同或不同，并且其中C1和C2独立地选自半胱氨酸和半胱氨酸样非天 然氨基酸。
6.权利要求3的组合物，其中X选自天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸和精氨酸。
7.权利要求3的组合物，其中所述金属选自Si、Ni、Cu、Pt、Pd、Au、Ag、Pb和狗。
8.权利要求3的组合物，其中所述金属为放射性同位素。
9.权利要求3的组合物，其中所述金属为62Cu。
10.权利要求3的组合物，其还包含如下多肽，所述多肽包含具有序列^(C1C2的三肽。
11.权利要求3的组合物，其还包含如下非肽实体，所述非肽实体包含具有序列^(C1C2的三肽。
12.方法，其包括使金属与具有序列^(C1C2之三肽络合以形成金属-XC1C2络合物，其 中X是使得金属-XC1C2络合物具有平面四方形取向或四角锥形取向或两者兼有的任意氨基 酸，其中C1和C2相同或不同，并且其中C1和C2独立地选自半胱氨酸和半胱氨酸样非天然氨基酸。
13.权利要求12的组合物，其中X选自天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸和精氨酸。
14.权利要求12的组合物，其中所述金属选自Si、Ni、Cu、Pt、Pd、Au、Ag、Pb和狗。
15.权利要求12的组合物，其中所述金属为放射性同位素。
16.权利要求12的组合物，其中所述金属为62Cu。
17.权利要求12的组合物，其还包含如下多肽，所述多肽包含具有序列^(C1C2的三肽。
18.权利要求12的组合物，其还包含如下非肽实体，所述非肽实体包含具有序列^(C1C2 的三肽。
19.权利要求12的方法，其中所述金属存在于生物样品中。
20.权利要求12的方法，其中所述金属存在于对象中。
21.权利要求12的方法，其还包括检测所述金属-XC1C2络合物。
22.权利要求12的方法，其还包括对所述金属-XC1C2络合物成像。
全文摘要
包含具有序列XC1C2之三肽的组合物，其中X是使得XC1C2能够以平面四方形取向或四角锥形取向或两者兼有地结合金属的任意氨基酸，其中C1和C2相同或不同，并且其中C1和C2独立地选自半胱氨酸和半胱氨酸样非天然氨基酸；以及金属-XC1C2络合物和形成该络合物的方法。
文档编号A61K33/24GK102088991SQ200980127523
公开日2011年6月8日 申请日期2009年5月13日 优先权日2008年5月13日
发明者安托尼·安德鲁·瓦尔蒂亚, 玛丽·伊丽莎白·克劳斯, 珍妮弗·安·斯托厄尔·劳伦斯 申请人:堪萨斯大学