专利名称：用于产生粘膜免疫的口服疫苗的制作方法
技术领域：
本发明一般性地涉及适合储存、施用及改善疫苗中使用的抗原或免疫原的免疫原性的组合物。特别地，本发明涉及用于改善对细菌抗原的免疫应答的基于脂质的佐剂或者载体。更特别地，本发明涉及具有特定的脂质成分的基于脂质的佐剂或者载体，以及其用于提供对衣原体(Chlamydia)和螺杆菌(Helicobacter)引起的感染改善了的免疫应答的用途。背景大量感染性病原体侵入粘膜表面导致感染和疾病。全世界影响人类和动物群体的两种重要粘膜病原体是衣原体和螺杆菌。世界卫生组织(WHO)估计在1999年全世界有9千 2百万个衣原体生殖器感染新病例，并且感染的发病率在发达国家和发展中国家均持续增力口 (KW，Timms P. Journal ofReproductive Immunology 2000 ；48(1) :47-68)。螺杆菌据信感染全世界50%的人群，在一些发展中国家比率超过90% (Del Giudice，G.，et al. ,Annu RevImmunol,2001. 19 :ρ· 523-63 ；Frenck, R. W. , Jr.and J.Clemens, Microbes Infect, 2003. 5(8) :p. 705-13)。衣原体衣原体属的成员引起许多伴有严重并发症的眼部、生殖器和呼吸道疾病，如致盲性沙眼、盆腔炎性疾病、异位妊娠和输卵管因素不孕、间质性肺炎，以及可包括动脉粥样硬化、多发性硬化、成年型哮喘(adult-onsetasthma)和阿尔茨海默病在内的慢性疾病，。沙眼衣原体(Chlamydia trachomati)和肺炎衣原体(C. pneumoniae)感染各种粘膜表面，引起许多疾病，包括盆腔炎性疾病(PID)、不育、致盲的沙眼、呼吸道疾病、动脉粥样硬化和哮喘加剧(Faal，N.，et al.，PLoS Med, 2006. 3 (8) :p. e266 ；Mabey, D. and R. Peeling, Sexually transmitted infections,2002. 78(2) :p. 90-2 ；Hansbro, P. Μ. , et al. ， Pharmacol Ther,2004. 101(3) :p. 193-210 ；Horvat, J. ， et al. ， Am J Respir Crit Care Med，2007)。衣原体科的生物体是专性细胞内细菌。它们缺乏几种代谢和生物合成途径并依赖于宿主细胞的中间体，包括ATP。衣原体以两个阶段存在(1)称为原体(elementary body) 的感染性颗粒，及(2)称为网状体(reticulate body)的细胞质内的繁殖形式。通常感染人类的有三种已描述的衣原体种。沙眼衣原体引起眼病沙眼及性传播感染，衣原体。鹦鹉热衣原体(C.psittaci)引起鹦鹉热，肺炎衣原体导致某形式的肺炎。另外，小鼠易感于鼠型沙眼衣原体(C. muridarum)，其引起小鼠的生殖道感染。前二个种含有许多基于细胞壁和外膜蛋白中的差异的血清变型。肺炎衣原体含有一个血清变型一TWAR生物体。衣原体具有可促进附着于细胞的血凝素。细胞介导的免疫应答很大程度上是炎症期间组织损伤的成因，尽管已描述了一种内毒素样毒素。大多数人类和动物病原体包括衣原体均通过粘膜表面而发起感染。类似地，衣原体生殖道感染可发生自粘膜表面的感染。因此，针对这种病原体的保护性免疫可需要诱导强粘膜免疫应答。尽管明显需要疫苗以针对经粘膜部位的感染提供保护，但是目前使用的疫苗是通过真皮内或皮下注射而给予的。然而，在肠胃外免疫后的粘膜免疫应答通常是弱的。沙眼衣原体感染是世界范围内最常见性传播细菌感染。沙眼衣原体引起性传播生殖器和直肠感染。男人中沙眼衣原体感染的频率可等于或超过淋病的频率。男人中非淋球菌性尿道炎、附睾炎和直肠炎可缘于沙眼衣原体感染。淋病患者由沙眼衣原体超感染也会发生。年轻女性中的急性输卵管炎和宫颈炎可以由源于宫颈的沙眼衣原体感染所引起。已报道了患有淋病的女性中由沙眼衣原体导致的高比率生殖道共感染。沙眼衣原体分离自被感染妇女的输卵管。在一个报道中，从患有输卵管炎的患者的腹膜腔中取得附着于精子的沙眼衣原体原体。在感染的产道中暴露于沙眼衣原体的新生儿可在5-14天内发生急性结膜炎。该疾病由显著的结膜红斑、淋巴网状内皮细胞增殖及脓性排出物所表征。未治疗的感染可发展为肺炎；这种类型的肺炎仅在生命的前4-6个月发生。最近，沙眼衣原体已被怀疑引起成人的下呼吸道感染，并且已报道了几例在无免疫应答的患者中的沙眼衣原体肺炎，从所述患者中分离了所述病原体。还有证据表明沙眼衣原体可在免疫活性的人中引起肺炎或者支气管肺部感染。与沙眼衣原体感染相关的后遗症包括盆腔炎性疾病、异位妊娠和不育，这是除了 HIV/AIDS之外任何STI的代价最大的健康后果(Westrom L, Mardh P. A.，Br Med Bull 1983Apr ;39 (2) :145-50)。另外，存在的衣原体感染增加了感染HIV (Ho几，et al.， J Exp Med 1995Apr 1 ； 181 (4) :1493-505)和单纯疱疹感染(Kaul R, et al.，J Infect Dis 2007Dec 1 ；196(11) :1692-7)的风险。由于大多数衣原体感染无症状的性质(Stamm WE. · In Woodall JP, editor. Proceedings of the Chlamydia Vaccine Development Colloquium ；2004 ；Alexandia,Virginia :The Albert B.Sabin Vaccine Institute ；2004. p. 15-8)，有效的抗生素治疗的可利用性不能减缓日益增加的感染发病率，通常据信需要有效的疫苗来控制这种隐性的流行病(silent印idemic)。螺杆菌螺杆菌属细菌包括幽门螺杆菌被认为是几种类型的胃肠疾病的重要病因。胃粘膜的螺杆菌感染与诸如慢性活动性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡等疾病的发展相关联，并且与胃腺癌发展相关联(Enno, A.，et al.，Am J Pathol, 1998. 152(6) :ρ· 1625-32 ；Correa, P. ,J Natl Cancer Inst,2003. 95(7) :p. E3 ；Ernst, P.and B. Gold, Annu Rev Microbiol, 2000. 54 :p. 615-40 ； Uemura, N.，et al.，N Engl J Med, 2001. 345(11) :ρ· 784-9)。概述我们发现了先前本领域未认识到的问题，即尽管许多人类和动物病原体经粘膜感染生物体，但是在粘膜中发挥作用以保护动物的有效疫苗的开发即便不是不可能也是非常困难的。存在的主要问题是口服输送的疫苗在它们到达免疫诱导部位如淋巴集结 (Peyer' s patches)之前就由于胃酸性及蛋白酶解破坏而降解。肠相关淋巴组织的不适宜刺激也可以诱导口服耐受而非获得性免疫。另外，尽管啮齿类免疫可以通过使用霍乱毒素(CT)而增加，但是CT不被人类耐受。尚未有针对衣原体或螺杆菌的有效疫苗被批准用于人类。因此，目前对于在粘膜有效并且模拟霍乱毒素的有益效果但是没有在人类中观察到有害副作用的组合物和方法有巨大需求。我们出乎意料地发现一些脂质组合物、特别是含有长链脂肪酸的那些脂质组合物当用作佐剂或者载体时，可以解决这些及其它问题以促进粘膜免疫并且提供针对衣原体和螺杆菌引起的粘膜感染的保护。我们还出乎意料地发现一些脂质组合物当用作佐剂或者载体时与分离的衣原体抗原一起可以提供针对衣原体的免疫，其与霍乱毒素一样有效，但是没有有害的毒性副作用。基于现有观测一些脂质组合物当与活生物体一起使用时可以改善免疫应答(PCT/ NZ2002/00132，引入本文作参考)，这个发现是完全出乎意料的。类似地，我们出乎意料地发现一些脂质组合物当用作佐剂或者载体时与幽门螺杆菌抗原一起可以提供针对粘膜幽门螺杆菌感染的免疫。这个发现基于现有观测是完全出乎意料的。另外，口服疫苗接种存在由于疫苗抗原在胃和消化系统的其它部分的降解所致的主要问题。这些问题可以是由于抗原在到达免疫诱导部位如淋巴集结之前的胃酸性和/或蛋白酶解破坏所致。因此，肠相关淋巴组织(“GALT")的不适宜刺激也可以诱导口服免疫耐受而非获得性免疫，不导致保护而是可以恶化与抗原相关的病症状。因此，本文首次证实灭活抗原(killed antigen)(与活生物体或减毒生物体相反)可以在口服活性疫苗中施用，并且可以诱导粘膜免疫，由此保护动物免受病原生物体的粘膜感染。附图简述本发明参照其特定的实施方案进行描述。本发明其它特征可以参照附图理解，其中图IA和IB描绘了血清中(
图1A)和阴道灌洗中(图1B)M0MP特异性抗体的图， IgG和IgA由ELISA确定。y轴显示终点效价(Ε. P. T)比率，其通过用免疫组Ε. P. T除以非免疫对照Ε. P. T而确定。脂质C和衣原体MOMP —起产生与非免疫动物相比大约加倍的IgA 生产，这个效果类似于用CpG/CT和MOMP—起所观测到的。我们的结论是脂质C可以增加阴道粘膜对衣原体MOMP抗原的免疫学应答。结果代表两个单独实验，每个实验中每组5只小鼠。0.05，"ρ <0.01，与未免疫对照相比。误差杆，平均值的标准误差。图2Α和2Β描绘了在用鼠型沙眼衣原体进行活细菌攻击后从阴道拭子回收的细菌。在用鼠型沙眼衣原体进行阴道内攻击后以3天间隔从经免疫的(与CpG/CT混合的Μ0ΜΡ、脂质C配制的MOMP或者脂质C配制的与CpG/CT混合的Μ0ΜΡ)和对照小鼠收集阴道拭子。以3天间隔经细胞培养确定从阴道拭子的活细菌回收(细菌释放(bacterial shedding))(图2A)。感染性总水平通过测量每个曲线下面积确定(图2B)。结果代表每组5个动物的2个独立实验。我们出乎意料地发现与暴露于单独MOMP的动物相比脂质C和MOMP —起降低细菌释放大约60% (图2B)。CpG/CT和MOMP—起降低细菌释放57%。 另外，我们出乎意料地发现与CpG/CT+MOMP处理的动物相比脂质C降低细菌释放(脂质 C+MOMP+CpG/CT)大约48% < 0. 05,***p < 0. 001，与未免疫对照相比。误差杆，平均值的标准误差。这些结果表明脂质C可以与CpG/CT协同作用以提高阴道粘膜的免疫学应答。图3A和;3B描绘了血清(上部)和粪便沉淀洗液(fecal pellet wash)(下部)中的幽门螺杆菌特异性抗体的图。IgG和IgA由ELISA确定。y轴显示终点效价(Ε. P. T)比率，其通过用免疫组Ε. P. T除以非免疫对照Ε. P. T而确定。结果代表两个单独实验，其在每个实验中含有每组5只小鼠。图3A显示与未免疫对照相比脂质C增加血清中幽门螺杆菌特异性IgG的产生。另外，图:3B显示脂质C增加粪便沉淀中的幽门螺杆菌特异性IgA的产生(图3B)。用脂质C和幽门螺杆菌抗原观测的保护程度在回收的细菌降低大约25%，其代表生物体中降低的细菌载荷。误差杆，平均值的标准误差。这些结果表明脂质C可以促进胃肠道中的粘膜免疫。图4A、4B和4C描绘了血清(图4A)、支气管肺泡灌洗(图4B)和阴道灌洗(图4C) 中衣原体MOMP特异性抗体的图。IgG和IgA效价由ELISA确定。y轴显示终点效价(Ε. P. T) 比率，其通过用免疫组Ε. P. T除以非免疫对照Ε. P. T而确定。结果代表两个单独实验，其在每个实验中含有每组5只小鼠。< 0. 05，**p < 0. 01，与未免疫对照相比。误差杆，平均值的标准误差。口服脂质C加MOMP产生了血清IgG的适度升高(图4A)。口服脂质C加 MOMP在呼吸道中效果很小(图4B)。相反，口服脂质C加MOMP使阴道MOMP特异性IgA增加大约2倍(图4C)。图5描绘了用幽门螺杆菌SSI胃内攻击后细菌回收的图。小鼠在最终免疫之后1 周用两次胃内接种IxlO7Cfu幽门螺杆菌SSI而攻击。在活细菌攻击后6周，将胃组织勻浆并在含有GLAXO-补充物的CSA琼脂平板上培养6天(见材料和方法)。y轴显示勻浆胃组织的菌落形成单位数量/g(cfu/g)，由log尺度表示。用脂质C和幽门螺杆菌SSl抗原组合免疫导致在胃内接种后6周从胃组织回收的细菌与非免疫动物相比降低大约25%。与未免疫对照相比，幽门螺杆菌加CpG/CT降低细菌回收，而加入脂质C进一步降低细菌回收大约85%。结果代表两个独立实验。与未免疫对照相比0.05;每个实验每组η = 5只动物。误差杆，平均值的标准误差。这些结果表明含有脂质C的口服组合物可以促进胃中针对幽门螺杆菌的粘膜免疫。图6描绘了用鼠型沙眼衣原体活细菌攻击后从肺组织回收的细菌。用活鼠型沙眼衣原体鼻内攻击由与CpG/CT混合的MOMP 口服免疫的、由脂质C配制的MOMP 口服免疫的、 或者由脂质C配制的与CpG/CT混合的MOMP 口服免疫的雌性BALB/c TCI以及及未免疫的对照小鼠。细菌攻击后12天(峰值感染点)取出肺，通过培养确定回收的活衣原体的量。 结果代表两个独立实验。这些结果显示用脂质C和MOMP —起口服免疫与未免疫对照相比降低衣原体的回收、< 0. 05 ；每个实验每组η = 5只动物，误差杆是平均值的标准误差。详细描述粘膜免疫粘膜表面是病原生物体进入的主要入口(portal)。因此，它们由粘膜免疫系统防御，所述系统与全身性免疫系统在功能和解剖学上是不同的。粘膜和全身性免疫系统一起工作以提供针对病原体的保护作用。在肠中，抗原呈递细胞(APC)选取(sample)腔抗原(luminal antigen)将表位呈递给淋巴集结中的淋巴细胞并排出(draining)肠系膜淋巴结(Owen, R. and A. Jones, Gastroenterology, 1974. 66(2) :ρ· 189-203 ；Iwasaki, A. and B. Kelsall, J ExpMed，2000. 191 (8) :ρ· 1381-94)。作为在APC和淋巴细胞群体中丰富的主要的粘膜诱导部位，肠相关淋巴组织(GALT)代表了用于通过口服免疫诱导保护性粘膜免疫的有吸引力的位点。胃肠道暴露于各种抗原，其包括产生自正常代谢过程的“自身”抗原、摄入的食物抗原及来自共生菌群或病原生物体的那些抗原。为了有效起作用，需要免疫系统从可能对宿主“有害”的那些抗原中区分“好”抗原。口服耐受性是免疫系统用于产生对视为无害的那些抗原免疫无应答状态的特定机制。在口服免疫后用于免疫呈递的抗原摄取可以通过许多机制实现。肠细胞摄取、加工并呈递抗原给基底外侧表达的MHC II类分子上的T细胞(S. G. Mayrhofer, and L. Spargo, in Immunology. 1990 ；Hershberg, R. Μ., etal.,J Clin Invest. 1998. p. 792-803)。位于整个固有层的树突状细胞(DC)通过上皮细胞之间的紧密连接而“挤压”它们的树突来选取腔抗原(Rescigno，Μ.，et al.，Nat Immunol, 2001. 2 (4) :ρ· 361-7)。小结相关上皮(M)细胞非特异性地转运腔抗原穿过小肠上皮屏障至下面的抗原呈递细胞(APC)包括 DC 和巨噬细胞(Bockman, D.，etal.，Ann N Y Acad Sci, 1983. 409 :ρ· 129-44 ；Bockman, D. and Μ. Cooper, Am JAnat, 1973. 136(4) :ρ. 455-77 ；Neutra, Μ. R. , et al. , Cell Tissue Res. 1987. p. 537-46)。通过主动免疫引入GALT的蛋白质抗原通常导致诱导耐受而非免疫。因为胃肠道是入口且因为其形成容易接近的、无损伤免疫接种途径，因此口服免疫长期被认为是针对通过胃肠道、呼吸道和泌尿生殖道衬层的粘膜表面侵袭身体感染性介质保护宿主的有吸引力的手段。如在许多动物研究中证实的那样，口服免疫的潜力还没有在人类中实现，仅口服脊髓灰质炎、口服破伤风和口服霍乱疫苗被批准用于人类，它们均是活减毒疫苗。阻止口服免疫在人类中应用的限制包括需要大的抗原剂量，正常消化过程对抗原的破坏及需要强粘膜佐剂以克服口服耐受的诱导，所述口服耐受经常由摄入的蛋白质亚单位抗原而诱导(ffeiner HL. J Clin Invest 20000ct ； 106 (8) :935-7) 口服免疫是不用针的有成本效益的方法，其容易施用并且不伴有在人与人之间扩散诸如HIV、乙型肝炎和丙型肝炎等疾病的风险(Giudice，Ε. L. and J. D. Campbell, Adv Drug Deliv Rev. 2006. p. 68-89)。口服途径也是免疫野生动物的重要方法。口服方案避免了与目前使用的侵袭性捕获以及释放的疾病控制方法相关的动物压力(Cross，Μ. Let al. ,Vet J. 2006)。由于这些原因，口服途径提供了免疫大的动物群和人群以使传染性疾病的传播最小化的潜力。在人类中广泛应用的商业口服疫苗包括萨宾(Sabin)脊髓灰质炎疫苗、活减毒伤寒疫苗及灭活全细胞B亚单位和活减毒霍乱疫苗。这些结果表明口服施用的本发明疫苗在幽门螺杆菌情况中可以作用于胃(图3和图5)，而在衣原体情况中可以作用于生殖道和肺(图1、图2、图4和图6)。这些结果还显明本发明疫苗输送至粘膜表面能够在各种其它粘膜表面触发应答。这些发现因此证实本发明疫苗组合物提供了本领域长期存在问题的解决方案。本发明脂质组合物能进一步增加由传统佐剂CpG和CT引起的粘膜免疫的发现表明本发明组合物可以协同作用以促进粘膜免疫。疫苗佐剂
为改善免疫应答，抗原已与许多佐剂物质混合以刺激免疫原性。常用佐剂包括明矾和水包油乳液。后一组典型代表为弗氏矿物油佐剂。但是，在人类和兽用疫苗中使用弗氏完全佐剂(FCA)是禁忌，因为已报道有毒性反应。为此，弗氏佐剂可能也不适用于口服施用。在水包油乳液中因为油含量高而需要表面活性剂。表面活性剂的去污剂性质使它们不适用于肠胃外或者口服施用。另外，甚至经批准的表面活性剂的毒性反应也已有报道。 乳液的另外的缺点是它们是一种不混溶液体分散在另一种中的异质系统。这种制备物通常不稳定并且导致水相随时间分离，因此维持疫苗呈稳定悬浮液有困难。另外，在油包水乳液的水相或者传统脂质体中捕获的抗原不太可能被保护而免于在胃中或消化系统其它部分中降解。相反，本发明的含有脂质的组合物及其使用方法可以在消化道中保护脆弱的蛋白质抗原，由此使得它们能到达淋巴集结及胃肠道中的其它免疫敏感性结构，由此提供对粘膜的免疫学保护。ADP-核糖基化外毒素为了促进用弱免疫原性蛋白质抗原口服免疫后的获得性免疫，使用佐剂如 ADP-核糖基化外毒素(bARE)增强免疫活化及防止诱导口服耐受性。口服免疫的动物研究中最常用的佐剂ADP-核糖基化细菌外毒素(ABARES) (Williams ΝΑ, Hirst TR, Nashar TO. Immunol Today 1999Feb ；20 (2) :95-101)如霍乱毒素(CT)和大肠杆菌热不稳定毒素 (LT)因为胃及神经学毒性而不能用于人类中(van Ginkel Fff et al.，J Immunol 2000 ； 165(9) =4778-82) 0为此人类的口服免疫潜力仅在可以发现安全佐剂以代替如ABARES的佐剂时才能实现。ABAREs如CT或LT是粘膜免疫的有力刺激物并且已实验用于许多免疫途径如口服、鼻内和经皮(Holmgren, J.，et al.，Vaccine, 1993. 11(12) :ρ· 1179-84 ； Hickey, D. K. ， et al. ， Vaccine, 2004. 22(31-32) :p. 4306-15 ；Skelding, K. Α. ， et al.， Vaccine, 2006. 24(3) :p. 355-66 ；Glenn, G.，et al.，J Immunol, 1998. 161(7) :ρ· 3211-4 ； Yu, J. , et al. , Infect Immun, 2002. 70(3) :ρ· 1056-68 ；Berry, L. J. , et al. , Infect Immun，2004. 72(2) :p. 1019-28).但是，它们在使用口服和鼻内途径的兽医和人类免疫方面的应用由于毒性而受限，毒性包括胃肠流体平衡的破坏及在中枢神经系统毒素的聚积 (vanGinkel, F.，et al.，J Immunol,2000. 165(9) :p.4778-82)。用于与本发明组合物相比的熟知的有力粘膜佐剂CT和CpG分别通过细胞toll 样受体9(TLR9)和神经节苷脂受体(GM-I)激活免疫应答。GM-I和TLR的激活和信号传导依赖于细胞膜脂膜筏(lipid rafts)群(association)，其允许蛋白质和信号传导分子的共定位(Fujinaga, Y. , et al. , MolecularBiology of the Cell. 2003 ；Orlandi, P. A. and P. H. Fishman, J Cell Biol. 1998. p. 905-15 ；Wolf, Α. A. , et al. , J Biol Chem. 2002. p. 16249-56 ；Triantafilou, Μ. ， et al. ， J Cell Sci.2002. p. 2603-11 ；Triantafilou, Μ. , et al. , J Biol Chem. 2004. ρ. 40882-9 ；Dolganiuc, Α. , et al. , Alcohol Clin Exp Res. 2006. p. 76-85 ；Latz, Ε. , et al. , Nat Immunol. 2004. ρ. 190-8) (Fujinaga, Y. , et al. , Molecular Biology of the Cell. 2003 ；Orlandi, P.A. and P.H. Fishman, J Cell Biol. 1998. p. 905-15 ；Wolf,Α. A. , et al. ,J Biol Chem. 2002. p. 16249-56 ；Triantafilou, Μ.，et al.，J Cell Sci. 2002. p. 2603—11 ；Triantafilou, Μ.，et al.，J Biol Chem. 2004. p. 40882-9 ；Dolganiuc, Α. , et al. , Alcohol Clin Exp Res.2006. p. 76—85；Latz, Ε. , etal.，Nat Immunol. 2004. p. 190—8)。脂膜筏由鞘脂和含有高比例饱和脂肪酸的胆固醇组成，导致比周围不饱和磷月旨更致密堆积的区域(Simons, K. and W. L. Vaz, Annual review of biophysics and biomolecular structure. 2004. p. 269-95 ；Dykstra,Μ. ,et al. ,Annu Rev Immunol. 2003. p. 457-81)。游离脂肪酸插入到膜双层内直接根据它们的结构组织成不同结构域，并且由于脂肪酸的高周转率，脂肪酸的含量是动态的(Klausner，R.D.，et al. , J Biol Chem. 1980. p. 1286-%)。饱和脂肪酸的掺入通过促进形成脂膜筏而直接影响膜细胞信号传导机制，并且反过来由高比例不饱和脂肪酸而抑制(Stulnig, T.M.，et al.，J Cell Biol,1998.143 (3) :ρ· 637-44 ；Stulnig, Τ. Μ.，et al.，J Biol Chem. 2001. p. 37335-40 ； Weather ill, A. R. , et al. , J Immunol, 2005. 174(9) :p. 5390—7)。脂质体为保护疫苗存活性，研究者已探索开发了各种递送运载体包括惰性颗粒、脂质体、 活载体和病毒样颗粒(VLP) (Bangham, A. D. and R. W. Home, J Mol Biol. 1964. p. 660-8 ； Niikura, Μ.，et al.，Virology. 2002. p. 273—80 ；Guerrero, R. Α.，et al.，J Virol. 2001. p. 9713-22)。脂质体和脂质小泡也已被探索用于疫苗，特别是用于可以容易包囊的小免疫原性成分。通常，脂质体和小泡不用于包囊大抗原如活微生物。另外，脂质体和小泡的生产昂贵且耗时，它们的制备中使用的提取程序可导致疫苗制备物的化学结构或者存活性的改变及因此的其免疫原性的改变。例如，加热和溶剂可改变免疫原性成分如蛋白质的生物学完整性。脂质体通常是小的(在微米大小范围)，及是球形层状(lemellar)结构，其具有可以放置抗原或者其它材料的内侧。脂质体通过将脂质与含有抗原或其它材料的水溶液混合而制成。在涡旋该混合物后，混合物中的脂质倾向于自发形成典型脂质体结构。在一些情况中，可以加入去污剂以帮助脂质成分与水相成分的混合。通过透析除去去污剂，脂质和水相倾向于分离，且脂质自发形成脂质体结构将水相包囊。脂质体然后通常保持在悬浮液中对脂质体接种的免疫学应答高度依赖于该脂质的物理化学性质，因此采用许多成熟及复杂的技术，包括反相蒸发、醚汽化、冻-融挤出和脱水-再水合(&oka，
F.and D. Papahadjopoulos, Proc Natl Acad Sci USA. 1978. p. 4194-8 ；Deamer, D. and A.D.Bangham, Biochim Biophys Acta. 1976. p. 629-34 ；Chapman, CJ. , et al. , Chem Phys Lipids. 1991. p. 201—8 ；Sou, K.，et al.，Biotechnol Prog. 2003. p. 1547—52 ；Kirby, CJ. and
G.Gregoriadis, Journal of microencapsulation. 1984. p. 33-45)。PCT 国际专利申请号 PCT/KR00/00025(W000/41682 ；以下 “Kim”)揭示了一种“亲脂微粒”(即脂质体)，其掺入蛋白质药物或者抗原。所述微粒具有0. l-200im的大小。该亲脂微粒可以通过用在水溶液中的亲脂物质或者使用有机溶剂包被含有活性成分的固体颗粒而制备。所得组合物包括适于注射的水包油乳液。不幸地，Kim的微粒不适用于口服摄取。它们进一步也不太适于提供当抗原通过消化系统时的保护。因此，Kim的微粒不提供有效的粘膜口服免疫。另外，制备脂质体的方法需要成熟的制造技术，这限制了大规模生产的成本效率(Szoka, F. and D. Papahadjopoulos, Proc Natl Acad Sci USA. 1978. p. 4194-8 ；Deamer, D.and A. D. Bangham,Biochim Biophys Acta. 1976. p. 629-34 ；Chapman,C. J. ,et al. ,Chem Phys Lipids. 1991. p. 201-8 ；Sou, K.，et al.，Biotechnol Prog. 2003. p. 1547—52 ；Kirby, CJ. and G. Gregoriadis, Journal ofMicroencapsulation. 1984. p. 33-45)。脂质体在口服免疫中应用有限，部分是因为它们是脆弱的，以及因为水性内腔中的抗原可以随时间降解。另外，典型用于制备脂质体的脂质是在室温是液体的那些，因此， 它们通常在储存条件下是液体形式。这些特征限制了基于脂质体的疫苗的保存期限。免疫刺激复合物已知为ISC0MS 的免疫刺激复合物主要由具有限定的极性和非极性区域的磷脂和胆固醇分子组成。另外，ISC0MS .含有高免疫原性佐剂皂苷(Quil A) (Morein, B.，et al.，Nature. 1984. p. 457-60)。磷脂形成球形环，产生由周围的疏水性力保持在一起的脂双层，并且将水相内的各种抗原包囊。在两个系统中，保持膜完整性均很关键，否则抗原被释放进局部环境并经受降解。因此，保持最佳储存条件对于疫苗存活性和输送是重要的。 ISCOMS 需要比于脂质体较不复杂的制造技术，如透析、超滤和超离心(SjSlander, A.，et al.，Vaccine. 2001. p. 2661-5)。这些方法不必然产生抗原的自发掺入。另外，最近描述了另一种佐剂。ISC0MATRIX 是类似于ISC0MS 的脂质佐剂。但是， ISC0MATRIX 不物理掺入抗原而是作为佐剂共施用以通过皂苷的免疫原性性质来诱导免疫，因此其不用作在口服免疫期间保护疫苗抗原的输送运载体(Skene，⑶.and P. Sutton, Methods. 2006. p. 53-9)。脂质体和ISC0MS 已实验用于经各种途径包括肌肉内、皮下、鼻内、口服及经皮输送疫苗(Mishra, D.，et al.，Vaccine. 2006 ；Wang，D.，et al.，J Clin Virol. 2004. p. S99-106 ；Perrie, Y. , et al. , Journal of liposome Research. 2002. p. 185-97)。用于粘膜免疫的作为口服疫苗佐剂及载体的脂质组合物上述产生粘膜免疫的困难出人意料地由本发明的含有脂质的组合物所克服。代替现有技术所使用的典型短链脂质(例如油)或者磷脂，我们发现使用长链脂肪酸作为脂质基质以保持抗原在悬浮液中相对于现有技术组合物具有独特优势。首先，长链脂肪酸在胃肠道中更抗降解，因此提供保护性周围环境，在其中抗原保持它们的天然构象，由此增加粘膜中的免疫应答。人类和其它动物消耗脂质作为它们日常饮食并且脂肪(三酰基甘油)的消化是正常代谢过程。脂质在胃中很少被胃酸降解，大约90%脂质消化发生在肠道中由胆汁盐和脂酶进行(Erickson, R. H. and Y. S. Kim, Annu Rev Med. 1990. p. 133-9)。在口服免疫期间，饱和脂肪酸不像不饱和脂肪酸那样容易掺入胆汁盐微团，因此不容易被肠细胞吸收。过量的腔(luminal)饱和脂肪酸可以与疫苗成分非特异性转移穿过特化的小结相关上皮“M”细胞。在上皮下穹隆(sub epithelial dome)内脂质基质的饱和脂肪酸部分掺入抗原呈递细胞(APC)的膜双层中，促进功能性GM-I受体和TLR复合物的上调。本发明的脂质配制的疫苗的增强的保护作用通过完整抗原的物理输送及粘膜佐剂对 APC的激活均可以是两倍。与许多用于药物和疫苗的现有技术脂质组合物相反，本发明的脂质组合物由甘油三酯而非磷脂组成。甘油三酯不含有极性和非极性区域，因此不组织成同心球形双层。相反，用于本发明疫苗中的脂质可以形成网状基质，在其中疫苗成分被捕获。这在暴露于变化的储存因素如湿度和水分期间及在胃的强酸性不适环境中提供了对掺入脂质的抗原的物理保护。上述配制物中采用的脂质被希望适用于动物或者人类消耗并且可以选自广泛的天然(源于植物或者动物的)或者合成脂质产品，包括油、脂肪和蜡。在开发新疫苗时，避免产生不利副作用是疫苗应用于人类中的试验的主要决定因素。使用“安全的”亚单位抗原而不共施用毒性佐剂将是理想的。本发明的脂质配制物使用不与任何副作用相关的食品或者药品级膳食脂肪酸制造。用这种脂质配制的MOMP 口服免疫诱导显著的保护呼吸道和生殖器粘膜免于衣原体感染的作用。另外，将灭活的全细胞幽门螺杆菌掺入本发明的脂质配制物在用幽门螺杆菌SSl活细菌攻击后在胃肠道引起保护作用(图3和图5)。用脂质C 和幽门螺杆菌抗原所观测到的这种保护程度在回收的细菌中降低大约25%，其代表在动物中降低了的细菌负荷。免疫导致在用幽门螺杆菌SSl胃内接种后六周从胃组织回收的细菌显著降低。灭活的全细胞生物体由众多未鉴别的、也未分离其免疫原性的抗原组成。但是纯化的MOMP是含有I类和II类T细胞表位的免疫显性表面抗原(Caldwell, H. D.，et. al.， Infect Immun. 1981. p. 1161-76)。本发明的MOMP脂质配制物引发针对呼吸道和生殖器衣原体感染部分保护小鼠的免疫应答。本发明疫苗的生产是简单的廉价机械过程，无专门的技能或设备需求。尽管脂质体和IC0MS 与其它非脂质输送载体相比被突出为较廉价的选择，本发明组合物的简便性可以提供更廉价的选择。在一些实施方案中，脂质配制物可以在高于约30 V的温度是液体。即，可以选择脂质以实现在最常见通过口服途径施用的动物中处于生理学温度的熔点。希望的是，脂质在大气压下于10°c -30°c是固体形式，优选在大气压下在20°C -30°c仍然是固体。但是脂质的熔解温度不是排他的，并且可以包括具有各个范围熔解温度的油、脂肪和蜡。在一些实施方案中，用于本文的脂质在大约30°C和大约37°C的人类生理温度之间可经历从固相到液相的转变。脂质相行为的总结可得自现有技术。因此，本领域技术人员可以基于现有技术的信息和简单的实验来选择具有所希望的性质和熔点的脂质。通常，合适的脂质配制物可以包括甘油三酯如羧酸的甘油酯，由脂族链和-COOH 末端组成的化合物，饱和和不饱和脂肪酸及其混合物。在一些实施方案中，甘油三酯可以主要含有C8-C^1酰基基团，例如豆蔻酸、棕榈酸、 硬脂酸、油酸、亚油酸、parinic acid、月桂酸、亚麻酸、花生四烯酸及二十碳五烯酸，及其混合物。在一些实施方案中，用于本发明的脂质配制物包括较长链的脂肪酸，例如C16-C18。 已发现在用于小鼠和负鼠(possum)的疫苗中的生物体如BCG的保护中长链脂肪酸更有效。 由此，优选用于本发明的脂质配制物含有约30 %至约100 %、或者约60 %至约100 %、者大约80%至约100%、及在其它实施方案中约90%至约100%的C16和/或C18脂肪酸。在其它实施方案中，C16脂肪酸可以代表约10 %至约40 %、或者约20 %至约35 %、 及在其它实施方案中约25%至约32%的总脂肪酸含量。C18脂肪酸可以代表约30%至约 90%、或者约50%至约80%、及在其它实施方案中约60%至约70%的总脂肪酸含量的C18。
其它实施方案具有含有少于约35% C14脂肪酸或者更短的脂质配制物，或者少于约25%、及在其它实施方案中少于约10%。在一些实施方案中脂质链长是C14链或者更短的少于约5%脂肪酸，约25%至约 35%的C16脂肪酸，及约60%至约70%的C18脂肪酸链。在一些实施方案中，用于本发明的脂质配制物可以含有量为约20 %至约60 %、 或者约30%至约55%、及在其它实施方案中约40%至约50%的饱和脂肪酸。单不饱和脂肪酸可以在约25%至约60%、或者约30%至约60%、及在其它实施方案中约40%至约55% 的范围。多不饱和脂肪酸可以在约0.5%至约15%、或者约3%至约11%、及在其它实施方案中约5%至约9%的范围。本发明的一些实施方案包括约40%至约50%饱和脂肪酸、约40%至约50%单不饱和脂肪酸及约5%至约9%多不饱和脂肪酸。在一些实施方案中，用于本发明的脂质配制物经HPLC分析测定具有约3%豆蔻酸、约棕榈酸、约15%硬脂酸、约40%油酸和约6%亚油酸。在其它实施方案中，本发明的脂质配制物具有约豆蔻酸、约25%棕榈酸、约 15%硬脂酸、约50%油酸和约6%亚油酸(脂质C)。在这些实施方案的一些中，组合物含有脂质C和Μ0ΜΡ。在其它实施方案中，组合物含有脂质C和幽门螺杆菌抗原。如本文所用，术语“脂质C”和“LipoVax”是等价的。本发明的其它实施方案包含脂质C的变异“脂质Ca”，具有2. 8%豆蔻酸、22. 7% 棕榈酸、2.5%棕榈油酸、1. 曼陀罗酸(daturic acid)、15. 9 %硬脂酸、38. 0 %油酸 (C18: ln-7)、1. 7 %油酸(C18 ln-9)和4. 0 %亚油酸，具有42. 4 %的总饱和脂肪组成， 42. 2%的单不饱和脂肪组成，及4.0%的多不饱和脂肪组成。在这些实施方案的一些中，组合物含有脂质Ca和Μ0ΜΡ。在其它实施方案中，组合物含有脂质Ca和幽门螺杆菌抗原。或者，本发明的脂质配制物包括氢化椰子油(“脂质K”)。一些含有脂质K的组合物包括7. 6%辛酸(C8:0)、6. 8%癸酸(C10:0)、45. 月桂酸(C12 0)、18. 3 %豆蔻酸 (C14:0)、9. 7%棕榈酸(C16:0)、2. 7%硬脂酸(C18:0)、7. 7%油酸(C18:l)和 2. 3%亚油酸 (C18:2)并且具有约27. 1°C的熔点。在这些实施方案的一些中，组合物含有脂质K和Μ0ΜΡ。 在其它实施方案中，组合物含有脂质K和幽门螺杆菌抗原。含有脂质K其它变体的实施方案(脂质Ka)包含具有如下重量组成的脂肪酸， 6. 5% 的己酸(C6:0)、5. 4%癸酸(C10:0)、44. 5%月桂酸(C120)、17. 8%豆蔻酸(C14:0)、 9. 8%棕榈酸(C16:0)、11. 5%硬脂酸(C18:0)、2. 2%油酸(C18:0)，及95. 5%的总饱和脂肪组成，和2. 2 %的单不饱和脂肪组成。在这些脂质Ka实施方案的一些中，组合物含有脂质Ka 和MOMP。在这些脂质Ka实施方案的其它一些中，组合物含有脂质Ka和幽门螺杆菌抗原。在其它替代方案中，本发明脂质配制物包括药用级的氢化椰子油(脂质PK)。在一些含有脂质I3K的实施方案中，包含具有如下重量组成的脂肪酸，7.0%的己酸、5. 8%癸酸、 45. 0%月桂酸、18. 2%豆蔻酸、9. 9%棕榈酸、2. 9%硬脂酸、7. 6%油酸及2. 3%亚油酸，及 88. 8%的总饱和脂肪组成、7. 6%的单不饱和脂肪组成、和2. 3%的多不饱和脂肪组成。在这些实施方案的一些中，组合物含有脂质I3K和Μ0ΜΡ。在其它实施方案中，组合物含有脂质Hi 和幽门螺杆菌抗原。在另外替代方案中，本发明脂质配制物包括“脂质SPK”，其具有如下重量组成，6. 7%的己酸、5. 6%癸酸、44. 3%月桂酸、17. 9%豆蔻酸、9. 6%棕榈酸、3. 0%硬脂酸、8. 4% 油酸及2. 6%亚油酸，及87. 3%的总饱和脂肪组成、8. 4%的单不饱和脂肪组成、和2. 6%的多不饱和脂肪组成。在这些实施方案的一些中，组合物含有脂质SH(和Μ0ΜΡ。在其它实施方案中，组合物含有脂质SH(和幽门螺杆菌抗原。组合物可容易地由轻易可得的脂质成分制造。在一些实施方案中，本发明的脂质组合物由纯化的和分级分离的甘油三酯组成，所述甘油三酯当加热至37°C以上的熔融态时允许掺入各种抗原和免疫调节剂，但是一旦冷却其形成固体稳定相(Aldwell，F. Ε.，et al. , Infect Immun, 2003. 71 (1) :p. 101-8)。本发明疫苗的制造是简单的廉价机械过程，无专门技能或者设备的需求。尽管脂质体和IC0MS 与其它非脂质输送载体相比被突出为较廉价的选择，制造本发明疫苗的简便性提供更廉价的选择。本发明的脂质配制物可用于制备免疫原性组合物，用于保护组合物内抗原免于降解。所述脂质配制物特别用于维持活生物体特别是细菌的存活性。所述脂质配制物发挥作用以维持生物体在活的但休眠状态。这对于配制用于口服施用的包含活生物体的疫苗是特别重要的。脂质也将抗原维持在均勻悬浮液中。即，本发明组合物中免疫原性成分可以均勻分布在整个固体或糊状脂质基质中。脂质还保护抗原在口服施用时免于被胃肠分泌物破坏。当通过其它途径施用如皮下施用时保护免受巨噬细胞攻击也是可能的。这允许通过胃肠粘膜摄取抗原特别是活生物体，随后在宿主中复制生物体。本发明组合物在储存条件期间对降解更具抗性。例如，已知脂质体长时间储存时聚集，在一些情况中，脂质体制备物可能需要正或负电荷必须加入脂质体中，以提供静电排斥以有利于将脂质体维持在悬浮液中。免疫原性成分通常，疫苗包括一或多种可以产生针对其的免疫应答的物质。这种物质包括脂质、 蛋白质、碳水化合物或者其它生物体特异性成分。要求是简单的，所述物质必须能被呈递到免疫细胞并且该免疫细胞必须能产生免疫应答。在许多情况中，蛋白质是免疫原。在其它情况中，使用活生物体。经这个途径皮下免疫人类后的有效保护通常对于生物体如 BCG 是高度可变的，其范围为 0-80% (Colditz, G. Α.，etal.，Pediatrics. 1995. p. 29-35 ；Colditz, G. Α. ， et al. ， JAMA. 1994. p. 698-702 ；Fine, P. Ε. ， Lancet. 1995. p.1339-45)。最近发明人之一和同事使用了基于脂质的口服输送系统，脂质C，用于在动物中口服输送疫苗(Aldwell FE, et al. , Infect Immun 2003 ；71(1) 101-8 ；Aldwell, F., et al. , Vaccine,2003. 22(1) :ρ· 70-6 ;PCT International PatentApplication No :PCT/ NZ2002/00132)。给小鼠喂食掺入脂质C中的牛分支杆菌(Mycobacterium bovisss)卡介苗(Bacille Calmette-Geurin, BCG)疫苗产生了对感染的抗性(Aldwell, FE, et al.， Infect Immun 2003 ;71 (1) 101-8)。类似结果在白尾鹿(Nol P, et al. J Wildl Dis 2008Apr ；44(2) :247-59)、豚鼠(Clark S，et al. ,Infect Immun 2008 Jun 2)及刷尾负鼠 (brushtail possum) (Aldwell FE, et al. ,Vaccine 2003Dec 8 ；22(1) :70-6)中发现,其中用基于脂质C的疫苗针对用活牛分支杆菌的气雾剂攻击进行保护。保护水平观测为高于在用非掺入BCG免疫的动物中见到的，并且等价于通过皮下途径施用的BCG，并且伴有全身和粘膜T细胞的强干扰素γ (IFNa)产生。因为脂质C-活减毒疫苗生物体BCG的掺入在口服输送后大大增加其免疫原性，我们确定脂质C也可以增强针对经口服途径输送的衣原体或者幽门螺杆菌的限定的亚单位蛋白质抗原的免疫应答。但是，在病原生物体情况中，重要的是保证免疫动物不被病原体严重及不利地影响。与使用上述活生物体抗BCG成功免疫相反，使用非活性、非复制性BCG抗原不引起免疫原性有效的免疫应答(Μ· I. Cross，et al. , Immunology and Cell Biology，1-4， 13November 2007)。因此，现有技术中有另外问题，即使用非感染性抗原产生对病原生物体的有效免疫应答。许多疫苗依赖于使用生物体的冻干制备物。例如，目前用于人类TB的疫苗基于称为卡介苗(BCG)的活减毒细菌的冻干制备物。但是，已经示出冻干程序导致BCG存活性丧失 30% -50%及剩余活细菌回收受损(Gheorghiu, M.，et al.，Dev. Biol. Stand. Basel, Karger. 87 :251-261)。在使用前保持生物体更大存活性的组合物会对这种疫苗的有效性有很大贡献。在其它情况中，希望的是使用来自生物体的特异性蛋白。在衣原体情况中，主要外膜蛋白(major outer membrane protein, Μ0ΜΡ)被用作免疫原性化合物，因为这个蛋白质参与衣原体生物体的功能。衣原体抗原性成分衣原体外细胞壁含有几种免疫原性蛋白，包括40千道尔顿(kDa)主要外膜蛋白 (MOM)，两个富半胱氨酸蛋白质，60-62kDa外膜复合物B蛋白(OmcB)和12_15kDa外膜复合物A蛋白(OmcA)，74kDa物种特异性蛋白，及31kDa和ISkDa真核细胞结合蛋白质，它们有相同的一级序列。针对来自血清型L2的40kDa MOMP蛋白的超免疫小鼠抗血清在间接免疫荧光期间与沙眼衣原体血清型Ba、E、D、K、Ll、L2和L3的原体反应，但是不与血清型A、B、C、F、G、H、 I和J或者鹦鹉热衣原体(C psittaci)反应。事实上，沙眼衣原体MOMP基因的克隆及测序揭示血清变型L2和B的氨基酸数目相同，而血清变型C的MOMP基因含有编码3个额外氨基酸的密码子。衣原体MOMP的多样性反映在4个序列可变结构域，其中两个是推定的类型特异性抗原决定簇的候选者。沙眼衣原体血清变型中MOMP差异的基础是对于紧密相关血清变型的簇生(clustered)核苷酸取代及对于远缘相关血清变型的插入和缺失。当MOMP 插入到外部原体包膜时，MOMP的暴露结构域作为血清分型和保护性抗原决定簇。C和B血清型的主要保守区中散布有短的可变结构域。已知血清变型D、E、F、G、H、I、J和K与人类疾病相关。针对血清变型E、F和G — 起的接种会保护大约75-80%个体。血清变型D、E、F、G、H、I、J、K和L与衣原体生殖器感染相关，血清变型A、B、C、D、E、F、G、H、I、J和K与眼部感染相关。肺炎衣原体也与阿尔茨海默病、冠心病和哮喘相关。识别富半胱氨酸膜蛋白上的表位的3种单克隆抗体与全部15个人类沙眼衣原体血清型相互作用，建立这个抗原的物种特异性。针对OmcA的单克隆抗体显示生物变型特异性和物种特异性。OmcB和OmcA富半胱氨酸蛋白质在天然感染中是高度免疫原性的，但是抗体不中和沙眼衣原体原体的感染性。因此，开发疫苗的候选抗原是衣原体主要外膜蛋白(MOMP)。我们出人意料地发现用掺入脂质C或者与强粘膜佐剂CT和CpG寡脱氧核苷酸混合的衣原体MOMP来口服免疫的动物针对鼠型沙眼衣原体(Clamydia muridarum)的阴道内攻击而被保护。令人^(讶地，我们发现脂质C、CpG/CT和MOMP组合在一起改善针对鼠型沙眼衣原体攻击的免疫应答，比用脂质C加MOMP或者CpG/CT加MOMP观测到的更大。除了 MOMP介导的免疫，衣原体感染可以通过用除MOMP之外的免疫原性成分免疫易感动物而降低。在沙眼衣原体和鹦鹉热衣原体中已识别了几种独特的免疫原性成分，一些是群特异性，其它是物种特异性。已使用去污剂从原体和网状体中提取抗原。肺炎衣原体(TWAR生物体)是血清学独特的并且与沙眼衣原体物种和所有鹦鹉热衣原体株不同。可以理解来自鼠型沙眼衣原体的免疫原性成分也可以掺入组合物中用于在小鼠衣原体感染模型中测试。也可以理解有许多衣原体抗原组合可以混合在一起并且掺入本发明口服活性疫苗中。螺杆菌抗原成分为了提供广谱接种物，可以使用紫外(UV)灭活的全细胞幽门螺杆菌悉尼株(幽门螺杆菌SSl)。使用全生物体避免了需要确定哪种螺杆菌抗原是免疫原性的。可以理解其它螺杆菌菌株可以使用而不偏离本发明范围。本发明实施方案本发明脂质组合物的制造本发明的组合物可以用本领域已知技术制备。方便地，在需要时加热脂质配制物以液化，并且加入免疫原性成分及上述其他成分(在使用时)。免疫原性组合物的分散可以通过混合、振荡或者不负面影响免疫原性成分的存活性的其他技术来实现。在一些实施方案中，抗原均勻分散在整个脂质配制物中。用于本发明中的替代组合物可以基本上不含水性成分包括水。术语“基本上不含” 如本文所用是指组合物含有小于约10%的水性成分，优选小于约5%的水性成分。如上所述，成分特别是水性溶剂的存在降低脂质配制物特别是在肠道中的保护作用。本发明的免疫原性组合物也可以用于产生对上述免疫原性成分类型的第二种或进一步的免疫原性分子的应答，特别是那些弱免疫原性的。这可以通过将免疫原性分子与组合物的另一种免疫原性成分缀合来共输送免疫原性组合物中的第二种或进一步的免疫原性分子而实现。缀合可以用标准现有技术实现。特别地，感兴趣抗原可以与免疫原性载体或者佐剂通过不干扰体内抗体产生的接头基团缀合。所述免疫原性载体或佐剂可以是任何免疫原性成分包括上述生物体，但是优选是分支杆菌，更优选是BCG。合适的接头基团包括甘露糖受体结合蛋白如卵清蛋白和结合Fc受体的那些。第二种或进一步的免疫原性分子优选是蛋白质或者肽。特别优选的蛋白质是免疫避孕蛋白(immimocontraceptive protein)。脂质再一次作为输送基质。当施用组合物时，产生对缀合分子或共输送分子的增强的免疫应答。术语“动物”如本文所用是指温血动物，特别是哺乳动物。人、狗、猫、鸟类、牛、绵羊、鹿、山羊、大鼠、小鼠、兔、负鼠、獾、豚鼠、雪貂、猪和水牛是该术语含义范围内的动物的例子。单胃动物和反刍动物特别包含在本术语中。术语“抗原”在本发明疫苗组合物上下文中等价于术语“免疫原”，是指在动物中能引起免疫应答的物质或者可以被抗体或者动物的免疫系统细胞特异性结合的物质，所述动物已针对所述物质而进行免疫。
用于各种输送途径的配制物除了脂质配制物和一或多种免疫原性成分之外还可以包括添加剂，如填充剂、增充剂、粘合剂、湿润剂、乳化剂、缓冲剂、表面活性剂、悬浮剂、防腐剂、着色剂、盐、抗氧化剂包括谷氨酸一钠(MSG)、维生素如维生素E、丁羟茴醚 (butylated hydroxanisole,BHA)、白蛋白右旋糖-过氧化氢酶(ADC)、保护性包衣、引诱剂和除味剂(odourant)以及帮助生物体或者脂质中含有的其它抗原存活的制剂，但不限于此。保护性包衣或者肠包衣可以选自例如凝胶、石蜡和塑料包括明胶。当选择口服施用途径时包衣进一步帮助防止暴露于胃酸和酶。当用于口服施用时，配制物还可以包括添加剂，其例如改善适口性，如调味剂(包括茴香油、巧克力和薄荷)和甜味剂(包括葡萄糖、果糖或者任何其它糖或者人工甜味剂)。从以上可以理解免疫原性成分可以是蛋白质或者肽的复合物，或类似物。在一个实施方案中，组合物包括至少两个选自上述任一的免疫原性成分，且可包括亚单位抗原的多个组合。三个或更多个免疫原性成分是可行的。组合物中免疫原性成分的浓度可根据已知技术方案变化，只要其以在施用于动物时有效刺激免疫应答的量存在。特别地，肠道中免疫应答与小肠淋巴组织相关。在分支杆菌情况中，IxlO5至IxIOici菌落形成单位(CFU)/ml的范围是合适的。优选地，浓度为IxlO7至 lxl09CFU/mlo对于蛋白质和肽类型抗原，包括衣原体MOMP和幽门螺杆菌抗原，IO-IOOOFg/ g的配制物范围是合适的。对于病毒类型抗原，IxlO3至1χ101(ι、优选IxlO5至IxlO8噬斑形成单位(PFU)/ml的范围是合适的。免疫应答可以是体液的(例如经可溶性成分如抗体或者免疫调节物)或者细胞介导的包括粘膜免疫应答。例如，在一系列体内实验中，我们研究了胃螺杆菌和衣原体生殖器、胃肠和呼吸道感染的BALB/c小鼠模型。这些系统公知与人类疾病相关，并被用于确定本发明组合物和方法诱导保护性粘膜免疫的有效性。灭活的或者亚单位疫苗提供了活减毒疫苗的安全替代品，具有更低的相关副反应。用灭活全细胞幽门螺杆菌或者纯化的衣原体MOMP单独口服免疫在活细菌攻击后不保护粘膜表面。我们因此研究了脂质配制的组合物在用非活性全细胞抗原和限定的蛋白质抗原口服免疫后诱导粘膜免疫的潜力，口服免疫添加或者不添加强粘膜佐剂CT和CpG-ODN用于针对螺杆菌和衣原体粘膜感染进行保护。在本公开中，我们证实用配制在本发明脂质组合物中的疫苗口服免疫小鼠增强了在多个粘膜表面针对活细菌攻击的保护作用。与CpG-ODN和霍乱毒素(CpG/CT)混合的脂质配制的灭活全细胞或者蛋白质抗原不仅在肠道局部引起保护作用，而且在解剖学上远处的生殖器和呼吸道表面也引起保护作用。口服免疫的主要限制是确定和维持最佳抗原剂量用于免疫接种。口服施用的抗原以不能预测的和有些低的速率在小肠腔被吸收。导入到GALT的蛋白质抗原通常导致诱导耐受而非免疫(Challacombe, S. J. and Τ. B. Tomasi, J Exp Med. 1980. p. 1459—72)。为此， 口服疫苗需要大剂量抗原和/或佐剂以增强获得性免疫。不幸地，高抗原剂量和毒性佐剂的存在增加了副作用的可能性。在本研究中，单独施用的衣原体MOMP和灭活全细胞幽门螺杆菌均不能保护粘膜表面免受细菌感染，结果与未免疫对照相当。期望强粘膜佐剂的共施用以使用口服途径诱导保护性免疫性。
因为CT对于人类是毒性的，因此其是本发明人类免疫原性组合物不希望的成分。 但是因为CT对于一些其他动物不是毒性的，因此CT可以包括在免疫原性组合物中以在其他动物中诱导免疫性。因为CpG是寡核苷酸，其毒性低于CT，CpG可以掺入本发明免疫原性组合物中用于人用。因此，为在人类中诱导免疫性，本发明组合物可以包括衣原体抗原、脂质配制物和CpG 寡核苷酸。在其它实施方案中，本发明组合物可以包括来自衣原体或者幽门螺杆菌的抗原、 包含脂质C、脂质Ca、脂质K、脂质Ka、脂质1 或者脂质SH(的脂质配制物及CpG寡核苷酸。效用本发明组合物和方法可用于提供针对感染粘膜的生物体的免疫性。因为本发明的含脂质组合物提供粘膜免疫，它们可适于多种用途。本发明的免疫原性组合物包括维持抗原在稳定基质中的脂质配制物，它们可以均勻分散在其中。这促进了恒定剂量抗原的施用， 避免剂量倾弃(dumping)和无效低剂量。脂质配制物还保护抗原免于被胃酸和消化酶降解。在基于脂质的配制物中的免疫原性成分存活性的丧失也显著低于冻干产物所报道的。 由于配制物的疏水性质也可以实现在潮湿或者水分条件下储存而不破坏。疫苗制备物中的免疫原的稳定性对于诱导强的持久保护性免疫是重要的。这可以用本发明的组合物来实现。所述组合物还易于制备，生产更廉价，并且发现了提高的消费者接受性及安全性，其中可以避免使用针和注射器。本公开提供了诱导针对衣原体和螺杆菌感染的粘膜免疫的直接证据。我们出人意料地发现，在BALB/c小鼠针对鼠型沙眼衣原体生殖器攻击的保护中，用掺入脂质C的MOMP 口服免疫小鼠与用与强粘膜佐剂CT和CpG混合的MOMP的免疫一样有效。这是令人惊奇的， 鉴于与用CT/CpG加MOMP免疫的那些相比用脂质C免疫的小鼠中观测的较低水平IFNa产生和生殖道抗体水平。重要的是，MOMP和CT/CpG的脂质C掺入导致甚至更高水平的保护作用，提示当佐剂与脂质C组合时的协同作用。我们还出人意料地发现用掺入紫外(UV)灭活的全细胞幽门螺杆菌悉尼株1 (幽门螺杆菌SSl)的本发明脂质组合物口服免疫有效诱导针对活生物体感染的粘膜免疫。另外， 与霍乱毒素(CT)和细菌CpG寡核苷酸(CpG-ODN或者CpG)混合的上述组合物也诱导在胃肠、呼吸道和生殖器粘膜的保护性免疫性。本发明脂质/抗原组合物提供的保护程度与用抗原加CpG/CT作为抗原观测到的那些相当。因此，本发明的脂质组合物提供粘膜免疫而无CT和CpG的有害副作用。粘膜保护作用与强脾IFNY细胞因子表达及血清和粘膜分泌物中的抗原特异性抗体相关。在血清和BAL液中主要检测到IgG，而IgA产生在生殖器灌洗液和粪便洗涤液中明显。在本研究中，在用本发明脂质组合物配制的MOMP 口服免疫后也观测到无需添加额外佐剂CT和CpG的保护作用。这导致在活细菌攻击后在呼吸道和生殖道的衣原体负荷降低 50%。用本发明组合物口服免疫在多个粘膜表面有效引起保护性免疫性。尽管口服免疫通常已用于诱导针对胃病原体及程度较低的呼吸道病原体的保护作用，许多研究已证实口服免疫可以靶向妇女生殖道。Challacombe et al. Vaccine 1997 Feb ； 15 (2) :169-75显示用在聚D，L-丙交酯-共-乙交酯(PLG)微粒中的卵清蛋白口服免疫引发在阴道灌洗液中显著OVA特异性抗体。用活流感病毒口服免疫在膀胱、子宫、阴道和在子宫洗涤液勻浆中引发病毒特异性IgA(Briese V，et al. ,Arch Gynecol 1987 ；240 (3)153-7)。用表达精子受体ZP3的重组沙门氏菌(Salmonella) 口服免疫小鼠在阴道分泌物中引起ZP-3特异性 IgA 以及不育(Zhang X et al.，(published erratum appears in Biol Reprod 1997Apr ；56 (4) 1069). Biology of Reproduction 1997 ；56(1) :33_41)。用含有针对衣原体糖脂外抗原的抗独特型抗体的PLG微粒口服免疫小鼠也针对沙眼衣原体人类株的生殖器攻击部分地保护小鼠(Whittum-Hudson JA, et al.，Nature Medicine 1996 ；2 (10) :1116-21)。所有上述研究需要使用活(流感病毒)或者减毒(沙门氏菌)生物体或者将抗原掺入PLG微粒以引发生殖道中的免疫。PLG微粒的产生是昂贵的，并且使用的溶剂提取方法可以破坏一些蛋白质抗原的免疫原性。另外，使用活衣原体疫苗不太可能被批准，这是因为在活疫苗和灭活疫苗防止沙眼试验后见到的增强的炎性应答所致(Grayston JT,Wang SP.SexuallyTransmitted Diseases 1978 ；5 (2) :73_7)。因为脂质C仅由作为正常饮食部分常规消费的食品级脂质组成并且可以通过简单混合成分而容易地制备，它们可以提供优于其它颗粒输送系统如脂质体和PLG微粒的在制备容易性和成本方面的明显优势。另外，因为脂质C在33°C以下形成固体，其可以保护成分抗原免于储存期间降解，由此延长疫苗的有效储存寿命。BCG掺入脂质C的确增强其在 4°C 和室温长期储存期间的存活性(Aldwell FE, et al. ,Vaccine 2006 Mar 15 ；24(12) 2071-8)。本发明脂质配制物的作用机制不完全了解。不受任何特定作用机制限制，但是， 脂质C的佐剂或者载体作用可能是由于各种因素所致。首先，因为脂肪在小肠中通过胰酶降解而在胃中不降解(Armand M. Curr Opin Clin Nutr Metab Care 2007 Mar ； 10 (2) 156-64)，本发明组合物可以保护抗原免受胃消化过程和酸性pH的破坏并且输送抗原至诱导部位如小肠中的淋巴集结或者小肠树突细胞(Rescigno M, et al. Nat Immunol 2001 ； 2(4) :361-7)。脂质还可以通过它们对脂膜筏和膜流动性的影响而直接影响这些诱导部位中的免疫细胞的功能。脂膜筏对于免疫细胞之间的信号传导是关键的，因为信号传导分子如MHC 分子、T细胞和B细胞受体需要在脂膜筏中聚集以进行有效细胞-细胞信号传导(Horejsi V. Immunol Rev 2003Feb；191 :148-64 ；Dykstra M, et al.，Annu Rev Immunol 2003 ；21 457-81 ；Anderson HA,et al. , Nat Immunol 2000Aug ； 1 (2) :156-62)。脂膜筏正常含有比周围细胞膜区域更高量的饱和脂肪酸，可能脂膜筏功能可由脂质C中的饱和脂肪酸增强。相反，增加比例的不饱和脂肪酸可以增加膜流动性，其可以增强胞吞，由此潜在增加APC对抗原的摄取(Mahoney EM, et al.，Proc Natl Acad Sci U S A 1977Nov ；74(11) :4895-9 ；Weatheri11 AR, et al.，J Immunol 2005May 1 ；174(9) 5390-7 ；Schweitzer SC, etal. J Lipid Res 2006Nov ；47 (11) :2525-37)。也已报道各种脂质具有抗炎作用及抑制淋巴细胞刺激(Calder PC, et al., Biochem Soc Trans 1989 Dec ； 17 (6) :1042-3 ；Calder PC,et al. ,Biochem SocTrans 1990 Oct ；18(5) :904-5)。其可以用于确定哪些基质对于脂质C的佐剂作用是重要的。从食品级脂质配制的佐剂的低毒性可以提供粘膜免疫的另一种显著优势。粘膜应答通常寿命较短， 这是由于浆细胞的短半衰期所导致以及由于妇女生殖道中作为正常生殖周期一部分的组织重塑所致。由此，可能需要频繁加强以维持保护性免疫水平。在使用脂质C的这些及其它研究中，我们观测到脂质C多剂量口服没有副作用，提示频繁使用是耐受良好的。载体动物免疫接种降低动物中的疾病的一个方式是降低动物对病原体的暴露。在一些病原体情况中，载体动物可以提供病原体的“库”，即使所述动物不显示疾病迹象或者症状。因此，野生动物如负鼠、獾、牛、啮齿动物、鹿等的免疫可以有效降低由病原体引起的疾病的发生。为了接种载体动物，希望的是经粘膜途径输送疫苗。因此口服疫苗代表实用的和成本有效的输送选择。因此，在一些实施方案中，本发明的脂质组合物可以包括引诱剂、调味剂和除味剂， 它们可以基于待免疫载体动物而选择。人类的口服免疫也是更成本有效的接种方法并且可以发现用户爱好。另外，当以其它方式如皮下施用时，本发明的脂质配制物可以提供保护免于例如巨噬细胞或者其它清除细胞的攻击。使用皮下施用或者注射施用，脂质库(depot)的配制允许缓释以模拟感染过程，并且促进免疫应答的引发。所述组合物可以有效诱导针对广泛感染性生物体包括生殖器、眼部、胃肠和呼吸道病原体的免疫应答。例如，脂质C可以有效引发生殖道和胃肠道中的免疫应答，脂质1 可以有效引发上消化道和下消化道及呼吸道中的免疫应答。本发明组合物还可以用作疫苗输送系统用于广泛抗原，或者用于共输送或者缀合输送免疫原性分子，特别是由于剂量或者免疫原性原因而具弱免疫原性的那些分子。本发明组合物还可用作疫苗佐剂，并且可以与常规佐剂(例如弗氏完全佐剂或者弗氏不完全佐剂)一起输送。
实施例下述实施例用于示出本发明具体实施方案.可以理解本领域技术人员可以容易地适应本公开及教导而无需过度实验以产生其它实施方案。所有这些实施方案均被认为是本发明一部分。实施例1 制备重组衣原体MOMP小鼠中的衣原体及其感染性质与在人类疾病中发现的那些非常类似，因此，这种感染研究、它们的性质及它们的治疗对于人类治疗是高度预测性的。为进行衣原体感染研究，通过来自 Berry et al. (Berry, LJ.，et al.，Infect Immun,2004. 72(2) :ρ· 1019—28) 的经适应的方法纯化主要外膜蛋白(MOMP)。简而言之，表达编码重组麦芽糖结合蛋白 (MBP)-MOMP融合蛋白的pMAL-c2载体的经转化大肠杆菌(DH5 α {pMMM3})(来自Harlam Caldwell-Rocky Mountain Labs, Hamilton, Mont. (Su, H. ,et al. ,Proc Natl Acad Sci U S A, 1996. 93(20) :p. 11143-8)的惠赠)在氨苄青霉素营养琼脂上生长后分离，通过超声处理收获(根据Berry et al)。鼠型沙眼衣原体的主要外膜蛋白(MOMP)通过Berry et al的方法从表达编码重组麦芽糖结合蛋白(MBP)-MOMP融合蛋白的pMAL-c2载体的经转化大肠杆菌 (DH5a {pMMM3})(来自 Harlam Caldwell-Rocky Mountain Labs，Hamilton，MT 惠赠)中纯化。鼠型沙眼衣原体是导致小鼠生殖道感染的介质。用根据厂商指导制备的透析管从8M尿素到PBS (pH7. 2)纯化并重折叠MOMP (Sigma-Aldrich, Castle Hill，Australia)。用 Pierce BSA 蛋白质评估试剂盒评估蛋白质浓度，储存在-20°C备用。实施例2 用于针对幽门螺杆菌免疫的抗原的制备为进行幽门螺杆菌感染研究，用生长在弯曲杆菌(Campylobacter)选择性琼脂 (CSA)上的幽门螺杆菌悉尼株 1 (Dr Hazel Mitchell, University of New South Wales 惠赠(Lee, A.，et al.，Gastroenterology, 1997. 112(4) :ρ· 1386-97))产生全灭活抗原 (whole killed antigen)，所述琼脂由 5% (ν/ν)无菌马血与血琼脂基 No. 2 (Oxoid Ltd., Basingstoke, England)及 Sutton et al. (Sutton, P. , et al. , Vaccine,2000. 18(24) p. 2677-85)公开的Skirrow' s补充物组成。平板收获至无菌PBS中，用Mci^arland标准建立浓度(菌落形成单位/ml)。活细菌通过暴露于紫外(UV)照射以及培养建立的细菌存活性缺乏而进行失活。灭活的全细胞幽门螺杆菌储存在_20°C备用。实施例3 免疫组合物I的制备脂质C 配制物由 Immune Solutions Ltd(Dunedin, New Zealand)供应，其由含有豆蔻酸、25%棕榈酸、15%硬脂酸、50%油酸和6%亚油酸的分级分离及纯化的甘油三
酯组成。为进行衣原体感染研究，使用200 μ g MOMP作为抗原，IO7Cfu灭活全细胞幽门螺杆菌被用作螺杆菌免疫。免疫组包括(1)未免疫对照动物，( 用混合有IOyg CpG-ODN 1826(5' -TCC ATGACG TTC CTG ACG TT-3' ；SEQ ID NO 1) (Geneworks)禾口 10 μ g 霍乱毒素(Sapphire Biosciences) (CpG/CT)的抗原处理的动物，(3)脂质C和抗原单独，及(4)脂质C加混合有CpG/CT的抗原。脂质C、MOMP, CT和CpG用3路活塞(3_way stopcock)和2个注射器混合，从而 150 μ 1脂质C含有200 μ g MOMP单独或者其与CT (IOyg)和CpG(IOyg) —起。先前已发现与用免疫原但是不加CT或CpG处理的动物相比，这些剂量的CT和CpG提供最佳佐剂作用，因此，代表足以使免疫应答最大化的剂量。对于非脂质配制的疫苗，在PBS中制备MOMP 单独或者与MOMP与CT和CpG组合。所有配制疫苗均在第一次免疫前制备并储存在4°C备用。未配制疫苗需要在每次免疫当天制备。实施例4:免疫小鼠无特异病原体(SPF)的雌性BALB/c 小鼠得自 Animal Resource Centre (ARC) (Perth,WA)。动物在标准日-夜周期下笼养并无限制地提供无菌食物和水。The University of Newcastle ‘ s Animal Care and Ethics Committee 批准所有禾呈序。每周间隔在异荧烷(isofluorane)麻醉下通过用球端针经口服强饲法用150il免疫溶液免疫小鼠3次，3周后加强。对照动物相同处理但是不免疫。用衣原体或螺杆菌感染的小鼠代表现有技术已知的系统，其能合理预测在人类中观察的作用。因此，用本发明组合物在这些小鼠系统中获得的结果是在衣原体或螺杆菌影响的人类中观察到的作用的代表。实施例5 样品收集及MOMP特异性IgG和IgAELISA分析I根据上述实施例4免疫动物的最终免疫后一周，通过用50 μ 1无菌PBS冲洗阴道穹窿而收集阴道灌洗液(VL)。在施用致死剂量戊巴比妥钠后通过心脏放血收集血液。经ELISA 确定血清和 VL 中的 MOMP 特异性 IgG 和 IgA。Greinerimmunopure ELISA 平板(Interpath Ltd,Australia)用在硼酸盐缓冲溶液(pH9. 6)中稀释的鼠型沙眼衣原体MBP-MOMP包被O μ g/孔)，在4 °C保温过夜。平板用在PBS中的0. 05 % Tween 20 (PBST) 洗涤3次，在37°C用100 μ 1含有5%胎牛血清的PBST在37°C封闭1小时。平板在PBST中洗涤3次，一式二份加入100 μ 1样品并在PBST中二倍系列稀释。血清在PBST中稀释至从 1/100到1/12，800，VL稀释至从1/20到1/2，560。使用无菌PBS作为每个ELISA的阴性对照。覆盖平板并在37°C保温1小时，然后用PBST洗涤3次。用分别稀释1/500和1/1000 的 HRP 缀合的抗 IgA 或者抗 IgG(Sourthern Biotechnology Associates,Birmingham, AL) 及随后的四甲基benzidine (TMB)显色系统检测MOMP结合的抗体。终点效价(Ε. P. T)定义为PBS对照孔的平均值+2标准偏差。通过用“测试”组免疫样品的Ε. P. T除以非免疫对照的Ε. P. T计算抗原特异性抗体比率。实施例6 =T细胞增殖及细胞因子产生I脾淋巴细胞如上述实施例1处理的动物所述制备，用CFSE标记，然后以切106细胞 /ml悬浮于完全RPMI (补加5% FCS,L-谷氨酰胺、5χ1(Γ5Μ2-巯基乙醇、HEPES缓冲液、青霉素-链霉素的RPMI 1640，均来自TraceBiosciences)。细胞(100 μ 1) 一式三份加入到96 孔平板中(未染色细胞用作阴性对照)。培养基(背景对照)、抗原MOMP (2 μ g/孔)或者 ConAQ μ g/孔)(阳性对照)加入到合适孔中。平板在37°C于5%C02中保温96小时，然后离心收集细胞。细胞用PECy7预缀合的CD3抗体(Becton Dickinson)染色，用FACSCanto 流式细胞仪(Becton Dickinson, Sydney, Australia)分析增殖的T细胞。与抗原的体外培养诱导的增殖T细胞百分比(> 3次细胞分裂)用Weasel软件(Walter and Elisa Hall Institute, Melbourne, Australia)石角定。实施例7 =MOMP特异性T细胞应答IT细胞增殖使用CFSE经染料稀释测定而测定，并表示为已经历> 3个细胞分裂的 CD3+细胞的百分比。体外再刺激来自用ΜΟΜΡ+CT/CpG免疫的小鼠的细胞导致10. 2% (范围7-13%)细胞经历>3轮分裂，而9. 7% (范围8-11%)来自用在脂质C中的MOMP免疫的动物的CD3+脾细胞增殖。用MOMP及CT/CpG组合在脂质C中免疫导致体外刺激后9. 9% (范围8-11% )CD3T细胞增殖(表1)。表 权利要求
1.一种免疫原性组合物，包含含有至少30% C16至C18脂肪酸的脂质配制物，所述配制物具有高于约30°C的固体至流体转变温度；及来自衣原体(Chlamydia)或者螺杆菌(Helicobacter)的抗原性成分，所述组合物在经口服或者胃肠途径接受所述组合物的动物中能引起粘膜免疫应答。
2.权利要求1的组合物，其中所述脂质配制物包含约豆蔻酸、约25%棕榈酸、约 15%硬脂酸、约50%油酸和约6%亚油酸(脂质C)。
3.权利要求1的组合物，所述脂质配制物包含脂质C、脂质Ca、脂质K、脂质Ka、脂质1 或者脂质SPK。
4.权利要求1-3任一项的组合物，其中来自所述衣原体生物体的所述抗原性成分是主要外膜蛋白(MOMP)、60kDa-62kDa富半胱氨酸蛋白质膜蛋白、15kDa富半胱氨酸膜蛋白、 74kDa物种特异性蛋白质、31kDa真核细胞结合蛋白或者ISkDa真核细胞结合蛋白中的一或多种。
5.权利要求4的组合物，其中所述MOMP是选自由A、B、Ba、C、D、E、F、G、Hi、I、J、K、Ll、 L2或L3所组成的组的血清型。
6.权利要求4的组合物，其中所述螺杆菌的抗原性成分是来自幽门螺杆菌OLpylori) 的全灭活抗原。
7.权利要求1-6的组合物，进一步包含额外的佐剂。
8.权利要求7的组合物，其中所述额外的佐剂是霍乱毒素(CT)和CpG寡脱氧核苷酸 (“CpG-ODN" =SEQ ID NO 1)中的一或多种。
9.一种包含MOMP和脂质C的口服免疫原性组合物。
10.一种治疗由衣原体科生物体引起的粘膜感染的方法，包括将权利要求1-5或者7-9 任一项的组合物施用给需要其的动物。
11.权利要求10的方法，其中所述的治疗通过在所述动物中诱导粘膜免疫应答而发生。
12.权利要求10的方法，其中所述动物是人类。
13.权利要求10的方法，其中所述组合物包含Μ0ΜΡ、脂质C以及CT和CpG-ODN中的一或多种。
14.一种给动物提供针对衣原体或螺杆菌引起的感染的免疫学保护的方法，包括将权利要求1-9任一项的组合物施用给所述动物，其中所述动物具有指示免疫应答的发现。
15.权利要求14的方法，其中所述发现选自由以下组成的组胸腺细胞(T细胞)增殖、 干扰素Y (IFNa), γ免疫球蛋白(IgG)、白介素12 (IL-12)和白介素IO(IL-IO)的产生或者所述衣原体或所述螺杆菌的释放的降低。
16.含有至少30% C16至C18脂肪酸和至少一种来自衣原体的抗原的脂质配制物在制备用于预防、降低或者治疗由所述衣原体引起的粘膜感染的口服药物中的用途。
17.权利要求16的用途，其中所述至少一种抗原选自由如下组成的组主要外膜蛋白 (MOMP)、60kDa-62kDa富半胱氨酸蛋白质膜蛋白、15kDa富半胱氨酸膜蛋白、74kDa物种特异性蛋白、31kDa真核细胞结合蛋白或者ISkDa真核细胞结合蛋白。
18.权利要求16的用途，其中所述MOMP是选自由A、B、Ba、C、D、E、F、G、Hi、I、J、K、Ll、L2或L3所组成的组的血清型。
19.权利要求17的用途，其中所述血清型选自由034、6、!1、1、、1(和1^所组成的组， 并且所述用途是预防、降低或者治疗由衣原体引起的生殖器感染。
20.权利要求17的用途，其中所述脂质选自由脂质C、脂质K、脂质1 和脂质SH(组成的组。
21.含有至少30% C16至C18脂肪酸和至少一种来自螺杆菌的抗原的脂质配制物在制备用于预防、降低或者治疗由所述螺杆菌引起的粘膜感染的口服药物中的用途。
22.权利要求21的用途，其中所述至少一种抗原是灭活的全细胞幽门螺杆菌 (Helicobacter pylori)。
23.—种试剂盒，含有权利要求1-9任一项的组合物；及使用说明。
全文摘要
本发明的实施方案包括基于脂质的免疫原性组合物(佐剂或者载体)，其用于口服或者胃肠施用以改善经接种动物对各种细菌感染的粘膜免疫应答。在一些实施方案中，本发明的脂质组合物包括具有不同链长的脂肪酸的混合物，由此提供希望的物理-化学性质。当细菌抗原与基于脂质的佐剂或者载体混合时，所得组合物引发改善的粘膜免疫应答并由此降低由衣原体或者螺杆菌引起的感染和疾病后遗症。
文档编号A61K39/118GK102176907SQ200980140172
公开日2011年9月7日 申请日期2009年10月7日 优先权日2008年10月8日
发明者F·E·阿尔德维尔, K·W·比格利 申请人:免疫解决方案有限公司