牛疱疹病毒1型组合物,疫苗及方法

专利名称：牛疱疹病毒1型组合物,疫苗及方法
牛疱疹病毒1型组合物，疫苗及方法
相关申请的交叉引用本申请要求2008年10月3日提交的第61/195，102号美国临时申请的优先权，该临时申请在此通过引用方式并入本申请。
背景技术：
牛疱疹病毒1型(BHV-I)是传染性的牛鼻气管炎(IBR)的致病体，并且是一种可以导致重大经济损失的牛病毒性病原体，它可以引起严重的呼吸道感染、结膜炎、流产、外阴阴道炎、茎头包皮炎、新生牛崽的全身性感染(Wyler等人，(1989)HERPESVIRUS DISEASES OF CATTLE,HORSES,AND PIGS 1-72(Boston)In G. Witman(ed.)Kluwer Academic Publishers) 0已知BHV-I染色体(1361Λ)的核苷酸序列。它通常包括67个独特的基因和其它2个逆向复制的基因。一般来说，BHV-I基因和其它α疱疹病毒(HSV-1，VZV，EHV-1) 在氨基酸序列水平上展示出同源性并按照相似顺序排列。BHV-I属于α疱疹病毒亚科(疱疹病毒科)、水痘病毒属。该亚科包括人疱疹病毒3型，伪狂犬病病毒，以及牛和其它马科动物的疱疹病毒。BHV-I也是诱发上呼吸道感染的因素之一，上呼吸道感染也被称作“船运热”(shipping fever)或牛呼吸综合症(Tikoo 等人，(1995)Adv. Virus Res. 45 :191;美国专利申请第2004-0185056号)。BHV-I不是诱发船运热的唯一传染源，但是它会抑制被感染牛的免疫系统从而引起免疫失调，这通常会进一步引起继发性的细菌感染和肺炎。感染BHV-I之后会使细胞介导的免疫受到抑制，从而使感染后的动物更容易遭受继发性的感染(Carter 等人，(1989) J. Virol. 63 :1525 ；Griebel 等人(1990) J. Gen. Virol. 71 :369 ； Griebel 等人(1987) Viral Immunol. 1 :287 ；Griebel 等人(1987) Viral Immunol. 1 267)。 BHV-I最初在黏膜上皮细胞中进行复制，随后通常终生潜伏在周身神经系统中神经节的神经元，并且使感染动物具有超出急性感染传染性。潜伏的BHV-I病毒再激活通常会引起病毒散播并传染给其它易受感染的动物。再激活通常在自然诱导的或者皮质类固醇诱导的应激反应后出现(Rock 等人，(1992) J. Virol. 66 :2484 ；Sheffy and Davies (1972) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 140 :974)。为了控制BHV-I感染，现已开发出了常规的病毒灭活疫苗和减毒活病毒疫苗。现市场上销售的疫苗，例如减毒活病毒疫苗，可能会引起宿主免疫系统的免疫抑制或免疫下降或者引起宿主免疫系统的其它改变。这些改变可以归咎于BHV-I编码的蛋白，该蛋白会抑制或者改变被感染宿主的免疫系统。这种免疫抑制会造成这些疫苗丧失预防BHV-I野外强毒株建立潜伏性感染的能力(参见例如Gerber等人，(1978) Am. J. Vet. Res. 39 :753 ； Jericho 等人，(1983) Can. J. Com. Med. 47 :133 ；Pastoret 等人，(1980) Infect. Immun. 29 483)。当前疫苗的一个趋势是共同给药(co-administrated)疫苗或者联合疫苗，这些疫苗通常含有来源于多种病原体或生物体的抗原。这些疫苗可以针对多种病原体和/或疾病提供免疫保护，并且可以在同一个时间点给予宿主或给药。在含有BHV-I的疫苗中，BHV-I可以影响或改变宿主针对共同给药的其它成分的免疫应答。在一个实施例中，相比于抗原没有与BHV-I共同给药时所能诱发的宿主免疫应答，当抗原与BHV-I共可给药或者抗原与BHV-I以联合疫苗形式给药时抗原所能诱导的宿主免疫应答会被抑制、减少或者改变。被影响或者被改变的免疫应答会减弱跟BHV-I共同给药的疫苗抗原诱导宿主针对感染和/或疾病的免疫应答能力，所述感染和/或疾病是由共同给药的抗原所衍生自的传染原所引起。以前和现在的减毒BHV-I病毒通常都不能解决BHV-I免疫抑制和/或宿主针对共同给药抗原的免疫应答被改变的问题。 发明概沭现已发现，通过对BHV-I病毒的特定基因进行修饰和/或改变表达可以减轻、预防或者逆转因BHV-I而引起的宿主免疫应答的改变(例如免疫抑制)。并且还发现，与未经修饰的BHV-I相比，含有修饰和/或改变的BHV-I可以减轻或预防宿主针对共同给药的抗原或者针对联合给药的抗原的免疫应答改变(例如，抑制了对其它抗原的免疫应答)。在这些发现的基础上，对以下发明进行描述。在一个实施例中，本发明提供了一种含有BHV-I免疫原的组合物和疫苗，其中所述BHV-I免疫原至少有一个基因被修饰。在另一个实施例中，含有修饰的BHV-I疫苗和非 BHV-I免疫原共同给药或者以联合疫苗形式给药。BHV-I可以是经过修饰的活BHV-I疫苗株。在一个实施例中，BHV-I上被修饰的基因通常是编码在BHV-I感染期间参与抑制宿主免疫应答的蛋白的基因。组合物或疫苗也可以包含能够降低BHV-I毒性的修饰。修饰的BHV-I基因的实例可以包括，修饰的BHV-I UL49. 5, BHV-I UL4LBHV-I Us4 和BHV-I Cir0可以通过单点突变方式对这些基因进行修饰，在有些情况下，单点突变可以是缺失突变。缺失突变可以是基因的完全缺失也可以是部分缺失。这些修饰可能会使该基因不产生蛋白质。这些修饰也可能会使该基因产生非天然的或者非野生型的蛋白质。在一个实施例中，BHV-I UL49. 5被修饰。在另一个实施例中，BHV-I UL41被修饰。在另一个实施例中，BHV-I Us4被修饰。在另一个实施例中，BHV-I Circ被修饰。修饰还可以发生在其它基因上。含有基因修饰的BHV-I病毒可以包含一个修饰、两个修饰、三个修饰、四个修饰或更多个修饰。这样的修饰也可以发生在已经存在修饰的基因之外，例如在减毒疫苗株上已经存在修饰的基因之外进行修饰。在一个实施例中，BHV-I病毒可以含有UL49. 5和UL41这两个修饰的基因。在另一个实施例中，至少一个选自BHV-I UL49. 5, BHV-I UL41,BHV-1 Us4 禾口 BHV-I Circ 组的基因和至少一个选自 BHV-I LR-ORF 1, BHV-I LR-ORF 2 禾口 BHV-1 Us9 组的基因被修饰。此处公开的任意组合物和疫苗都可以包含标记基因。在特定的实施方式中，标记基因可以是BHV-I UL49. 5, BHV-I UL41, BHV-I Us4禾口 /或BHV-1 Circ0特定的组合物和疫苗也可以包含作为标记基因BHV-I Us8。本发明所公开的疫苗也可以含有药学上可接受的载体。组合物和疫苗也可以含有其它免疫原(例如除BHV-I免疫原之外的免疫原)。所述其它免疫原可以共同给药也可以以联合多价疫苗方式给药。其它免疫原还可以通过其它方式给药。所述其它免疫原可以是细菌免疫原，例如，弧菌、溶血性曼氏杆菌、睡眠嗜组织菌、坏死梭杆酸、梭菌、大肠杆菌、沙门氏菌、牛支原体，和/或豕钩端螺旋体免疫原，和/或病毒免疫原比如BVD I和II、PI3和BRSV免疫原。所述的疫苗和组合物还可以包含寄生虫免疫原，例如犬新孢子虫和/或毛滴虫。本发明所公开的方法包括通过给予宿主治疗剂量的本发明组合物或疫苗(例如含有修饰基因的BHV-I和至少一种其它免疫原)来预防或治疗宿主(通常指牛)BHV-I感染。所述方法通常也包括治疗或预防由病原体引起的感染和/或疾病，其中通过该病原体可以获得其它免疫原。在一个实施例中，给予宿主本发明的组合物或疫苗可以提高宿主对 BHV-I和其它免疫原的免疫应答。在另一个实施例中，给予宿主本发明的组合物或疫苗可以减轻或预防不含有修饰基因的BHV-I所引起的对宿主免疫应答的免疫抑制。在另一实施例中，给予宿主本发明的组合物可以减轻或预防未修饰BHV-I所引起的宿主针对其它免疫原免疫应答的免疫抑制。


本发明所附的附图并入并构成说明书内容的一部分，附图示出了有关本发明组合物、疫苗和方法的实施方式，这些内容与以下记载的详细描述一起用来描述本发明的实施方式。此处应当理解，附图所示的实施方式仅为举例说明之目的，其不对本发明构成任何限制。此处还应当理解，在不背离本发明精神和范围的前提下可以对附图所示的实施方式进行任意的变化、修饰和衍生，这些都落在本发明的保护范围内。图1示出了 Cooper病毒株BHV-1 UL49. 5基因的DNA序列(SEQ ID NO 1)和氨基酸序列(SEQ ID NO :2)。图2示出了 Cooper病毒株BHV-1 UL41基因的DNA序列(SEQ ID NO 3)和氨基酸序列(SEQ ID NO :4)。图3示出了 Cooper病毒株BHV-1 Circ基因的DNA序列(SEQ ID NO 5)和氨基酸序歹丨J (SEQ IDNO 6)。图 4 示出了 Cooper 病毒株 BHV-1 LR-ORF 1 基因的 DNA 序列(SEQ ID NO 7)和氨基酸序列(SEQ ID NO :8)。图 5 示出了 Cooper 病毒株 BHV-1 LR-ORF 2 基因的 DNA 序列(SEQ ID NO 9)和氨基酸序列(SEQ ID NO 10)。图6示出了 Cooper病毒株BHV-1 Us4基因的DNA序列(SEQ ID NO 11)和氨基酸序列(SEQ ID N0:12)。如说明书记载，加下划线的核苷酸表示来自BHV-1 GL756病毒株 Us4基因中被去除的区域，从而获得用于进行某些研究的突变体。加下划线苷酸的缺失会造成基因表达时相应的加下划线氨基酸的缺失。图7示出了 Cooper病毒株BHV-1 Us9基因的DNA序列(SEQ ID NO 13)和氨基酸序列(SEQ ID NO 14)。图8示出了 Cooper病毒株BHV-1 Us8基因的DNA序列(SEQ ID NO 15)和氨基酸序列(SEQ ID NO 16)。图9示出了来源于BHV-1 GL756病毒株的UL49. 5突变体基因的DNA序列(SEQ ID N0:23)。加下划线的核苷酸表示野生型GL756 UL49. 5序列中增加的序列。加下划线的核苷酸在编码序列中增加了两个框内翻译终止子。图10示出了流式细胞仪测得的BHV-1 GL756影响MHC I类分子在细胞表面表达的数据。使用对MHC I类分子具有特异性的单克隆抗体PT85A对模拟感染的MDBK细胞、 被BHV-I GL756感染的MDBK细胞进行染色。使用无反应活性的并且同型匹配的对照抗体 MM605对阴性对照细胞进行染色。图11示出了一项研究数据，该研究是在第0天单独给予牛犊LkT抗原(LkT)或者一起给予牛犊LkT和BHV-I (GL756+LkT)，并在第21天再次给予牛犊LkT抗原(在第21天单独给予LkT)。对照的牛犊只在第0天时给予BHV-1(GL756)。给药的同一天从牛犊身上抽取血清并用ELISA测定对LkT具有特异性的抗体水平。误差线表示测量的平均标准误差 (SEM)。三角符号表示存在显著区别的时间点，所述显著区别是指给予GL756+LkT动物的血清样品中存在的LkT特异的抗体水平与给予LkT动物的血清样品中存在的LkT特异的抗体水平相比存在显著区别。图12示出了一项研究数据，该研究是在第0天单独给予牛犊LkT抗原(LkT)或者一起给予牛犊LkT和BHV-I (GL756+LkT)，并在第21天再次给予牛犊LkT (在第21天单独给予LkT)。给药的同一天从牛犊身上抽取血清并用ELISA方法测定对LkT具有特异性的 IgGl和IgG2的水平。数据被表示成IgGl与IgG2的比例。误差线表示SEM。图13示出了一项研究数据，该研究是在第0天单独给予牛犊LkT抗原(LkT)或者一起给予牛犊LkT和BHV-I (GL756+LkT)，并在第21天再次给予牛犊单独的LkT (在第21天单独给予LkT)。对照的牛犊只在第0天给予BHV-I (GL756)。在第23天采集牛犊的外周血。 将血液样品中的细胞与LkT接触，随后用ELISA方法检测样品中的IL-2水平。图 14 示出了 BHV-I GL756 Δ UL49. 5 (A)和 Us4 Δ (B)缺失重组构建体(DRC)，其可用来通过同源重组的方式来产生缺失修饰。图14也示出了 UL49. 5重组构建体的DNA序列 (SEQ ID NO: 17)和 Us4 重组构建体的 DNA 序列(SEQ ID NO: 18)。图 15 示出了 BHV-I UL41 重组构建体的DNA序列(SEQ ID NO :19)禾口BHV-1 LR-ORF 2重组构建体的DNA序列(SEQ ID NO 20)。图 16示出了 BHV-I GL756 AUL49. 5_EGFP 的克隆体Al和B8 以及原型GL756 BHV-I 经核酸扩增后的聚合酶链反应(PCR)产物，缺失/重组位点使用外侧引物。图 17 示出了 BHV-I GL756 Δ Us4_EGFP 的克隆体 1 和 2 以及原型 GL756 BHV-I 经核酸扩增后的聚合酶链反应(PCR)产物，缺失/重组位点使用外侧引物。图 18 示出了 BHV-I GL756 Δ UL49. 5 的克隆体 A1、A5、B7 和 B8 或原型 GL756 BHV-I 的蛋白印迹实验结果，所用抗体与UL49. 5具有特异性。蛋白印迹结果表明修饰的BHV-I中目标基因的缺失。图19示出了 BHV-I GL756 Δ UL49. 5的克隆体Al和Β8的蛋白印迹，以及 GL756AUs4的克隆体1和2或者原型GL756 BHV-I的蛋白印迹，所用抗体与Us4具有特异性。蛋白印迹结果表明修饰的BHV-I中目标基因的缺失。图20示出了 BHV-I GL756染色体上UL49. 5 (插入了两个终止密码子)和UL41 (完全缺失)的突变。图的上面部分示出了染色体的独特区域(队和仏)以及重复区域aR和 TR)。图的下面部分示出了染色体上J片段内的UL49. 5基因以及I片段内的UL41基因。图21示出了 BHV-I GL756染色体上Us4基因(部分缺失和插入)的突变。图的上面部分示出了染色体的独特区域(队和仏)和重复区域(IR和TR)。图的下面部分示出了染色体K片段内的Us4基因。
图22示出了在BHV-I GL756染色体上Circ基因的突变(完全缺失)。图的上面部分示出了染色体的独特区域(队和仏)以及重复区域(IR和TR)。图的下面部分示出了染色体N片段内的Circ基因。图23示出了 BHV-I病毒在MDBK细胞上的生长趋势。病毒具有GL756原型。测试了 GL756 (BHV-1 WT)，GL756 的 UL49. 5 突变体(BHV-1 Δ UL49. 5)，GL756 的 UL41 突变体的两个克隆体(BHV-1AUL41 :1606和BHV-I Δ UL41 1607)，两个UL41/49. 5的双重突变体的克隆体(BHV-1 AUL41/UL49. 5 :1614 和 BHV-I Δ UL41/UL49. 5 :1616)，GL756 的 Circ 突变体 (BHV-1 Δ Circ :1697)和 Us4 突变体(BHV-1 AUs4gG :1698)。图M示出了流式细胞仪测得的BHV-1 GL756和修饰的BHV-I影响MHC I类分子在细胞表面表达的数据。使用对MHC I类分子具有特异性的单克隆抗体PT85A对模拟感染的MDBK细胞、以及被BHV-1 GL756或者GL756 Δ UL4. 5克隆体Al或者Β8感染的MDBK细胞进行染色。使用无反应活性的同型匹配的对照抗体ΜΜ605对阴性对照细胞进行染色。图25示出了流动细胞仪测得的BHV-1 GL756和GL756 Δ UL49. 5- Δ UL41影响MHC I类分子在细胞表面表达的数据。使用对MHC I类分子具有特异性的单克隆抗体ΡΤ85Α对模拟感染的MDBK细胞、被BHV-1 GL756或者GL756 Δ UL49. 5- Δ UL41感染的MDBK细胞进行染色。使用无反应活性的同型匹配的对照抗体ΜΜ605对阴性对照细胞进行染色。图沈示出了流式细胞仪测得的各种BHV-I病毒突变体影响MHC I类分子在细胞表面表达的数据。该数据表示成相对于模拟感染细胞的百分比(100%)。MDBK细胞用BHV-I GL576、GL756 Δ UL49. 5、GL756AUL41 或 GL756AUL49. 5-AUL41 进行感染，并使用可以与 MHC I类分子反应的抗体进行染色。图27示出了各种病毒变异体影响MHC I类分子表达的蛋白印迹实验数据(图中顶部所示)。对这些印迹进行扫描和定量分析，并将结果表示成相对于模拟感染的细胞的百分比(100%，图中底部所示)。MDBK 细胞使用 BHV-1 GL576、GL756 Δ UL49. 5、GL756 Δ UL41、 GL756 Δ UL49. 5-Δ UL41、GL756 Δ Circ 或 GL756 Δ Us4 进行感染。图观示出了流式细胞仪测得的BHV-I病毒和各种BHV-I病毒变异体影响MHC II类分子在细胞表面表达的数据。结果被表示成相对于模拟感染的IFN-Y 处理过的细胞的百分比(100 % )。MDBK细胞使用BHV-1 GL576 (WT克隆体1584)、 GL756 Δ UL49. 5 (克隆体 1610)、GL756 Δ UL41 (克隆体 1606)、GL756 Δ UL41 (克隆体 1607)、GL756 Δ UL49. 5-AUL41(克隆体 1614)、GL756 Δ UL49. 5-AUL41(克隆体 1616)、 GL756ACirc(克隆体1697)或GL756 Δ化4 (克隆体1698)进行感染，并在4°C下培养30分钟，然后在37°C下培养1小时，随后再用IFN-Y进行处理。感染72小时后，使用对MHC II 类分子具有特异性的单克隆抗体CAT82A对细胞进行染色。阴性对照细胞不进行染色。图四示出了流式细胞仪测得的各种BHV-1病毒突变体影响MHC II类分子在细胞表面表达的数据。结果表示为MHC II类分子表达的百分比恢复率(也就是将 GL756感染的细胞中的MHC II类分子水平假定为0，将MHC II类分子恢复到模拟感染的细胞中的水平假定为100)。IFN-Y处理过的MDBK细胞使用BHV-1 GL576(WT克隆体 1584)、GL756 Δ UL49. 5 (克隆体 1610)、GL756AUL41(克隆体 1606)、GL756AUL41(克隆体 1607)、GL756 Δ UL49. 5- Δ UL41 (克隆体 1614)、GL756 Δ UL49. 5- Δ UL41 (克隆体 1616)、 GL756ACirc(克隆体1697)或GL756 Δ化4 (克隆体1698)进行感染，然后使用可以与MHCII类分子反应的抗体对其进行染色。图30示出了一项研究数据，该研究是在第0天给予牛犊单独的LkT抗原(LkT)，或者一起给予 LkT 和 BHV-I GL756 (GL756+LKT)，或者一起给予 LkT 和 GL756 Δ UL49. 5- Δ UL41 或GL756 Δ&4，并在第21天再次给予牛犊LkT (第21天单独给予LkT)。在给药的同一天收集牛犊的血清，并使用ELISA方法测定对LkT具有特异性的IgGl和IgG2抗体水平。数据结果表示成IgGl相对于IgG2的比例。误差线表示SEM。图31示出了另一项研究数据，该研究是在第0天给予牛犊LkT抗原和BHV-I GL756 (LKT+GL756)，或者给予 LkT 和 GL756 Δ UL49. 5- Δ UL41，或者给予 LkT 和 GL756 Δ Us4, 在第21天再次给予牛犊LkT (第21天单独给予LkT)。在第23天收集牛犊的外周血。将血液样品中的细胞与LkT抗原接触，然后利用ELISA法测定样品中的IL-2水平。
详细描述已知BHV-I病毒会引起被感染宿主的免疫抑制。当BHV-I作为疫苗给予宿主时， 它也会抑制或压制宿主针对跟BHV-I —起给药的免疫原的免疫应答。本申请公开了一类 BHV-I病毒，本申请的BHV-I病毒对于宿主的免疫抑制要比正常野生型BHV-I病毒来的低。 此处公开的BHV-I病毒还可以减轻宿主针对跟BHV-I —起给药免疫原的免疫应答的抑制或压制。在有些情况下，同单独给药的免疫原在宿主体内所诱导的免疫应答相比(没有 BHV-1)，免疫原和本发明的BHV-I病毒共同给药并未引起针对该免疫原的免疫应答抑制。 在某些情况下，同单独给药的免疫原所引起的免疫应答相比，免疫原和本发明的BHV-I病毒共同给药时，还可以提高宿主针对该免疫原的免疫应答。本申请还公开了含有本发明的 BHV-I病毒和其它免疫原的组合物。本申请还公开了一种使用本发明的BHV-I病毒在宿主体内诱导针对BHV-I和其它免疫原的免疫应答的方法，其中所述BHV-I病毒可以通过共同给药的方式或者以联合疫苗的方式给予宿主。除非特别指出，本发明的实施采用了常规的病毒学、微生物学、分子生物学、DNA重组技术，这些技术都属于本领域的现有技术。这些技术已经详细记载在现有文献中。所有本申请引用的专利、专利申请以及公开文献，无论其引用在前面或后面，在此全部通过引用方式全文并入本申请以作参考。以下列出本发明所用术语的含义。
定义术语“疫苗组合物”和“疫苗”是指，用于刺激动物产生免疫应答从而减轻现有损害或者是保护动物免受进一步损害的药剂。术语“共同给药疫苗”是指，在基本相同的时间给药但是做成不同制剂的疫苗。此处所用的基本相同的时间可以是在第一种药剂给药后的第五天之内的任意时间。术语“联合疫苗”或“多价疫苗”是指，可以刺激宿主产生针对多种病原体的免疫应答的疫苗，该疫苗使用了多种免疫原来生产并以一种药剂形式给药。术语“双链DNA分子”是指，处在正常的双链螺旋结构的脱氧核糖核苷酸(腺嘌呤， 鸟嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶)的聚合物形式。该术语仅指分子的一级结构和二级结构，而并不将其限定在任何特定的三级结构形式。因此，该术语包括现已发现的线性DNA分子(例如限制性片段)、病毒、质粒和染色体中的双链DNA及其它。在讨论特定双链DNA分子结构时， 序列采用常规方式进行表示，也就是只给出沿着DNA非转录链5'到3'方向的序列(也就与mRNA具有同源序列的链)。术语DNA“编码序列”是指，在适当的调控序列控制下可以转录和翻译成多肽的DNA序列。编码序列的边界由位于5'(氨基)末端的起始密码子和位于3'(羧基)末端的翻译终止密码子来确定。编码序列可以包括但不限于，原核生物的序列，来自真核生物mRNA 的cDNA，来自真核生物(例如哺乳动物)DNA的染色体DNA序列，以及合成的DNA序列。编码序列的3'末端通常带有多腺苷酸化信号和转录终止序列。当多核苷酸在其天然状态下或者通过本领域技术人员公知的方法进行操控后可以被转录和/或翻译从而生成编码多肽和/或多肽片段的mRNA时，该多核苷酸被称为“编码”多肽。反义链是该核酸的互补序列，从反义链中可以推断出编码序列。 术语“调控序列，，是指，启动子序列、核糖体结合位点、多腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调控区、增强子以及类似序列的统称，它们共同调控宿主细胞中编码序列的转录和翻译。术语“重组核苷酸”是指，非天然存在的核苷酸或者是通过人工组合序列中两个分离的片段后获得的核苷酸。这种人工组合通常通过化学合成的方法来完成，或者通过对分离的核苷酸片段进行人工操控来完成，例如基因工程技术。可以使用编码相同氨基酸或者保守氨基酸的冗余密码子来替换某一密码子，通常还可以引入或去除某序列识别位点。或者，也可以将具有期望功能的核苷酸片段连接起来以产生具有期望功能的组合。本申请中， “分离的多肽”是指由分离的以及经过操控的基因序列产生的表达产物，甚至可以是在同源细胞中表达的多肽产物。通过合成方法获得的分子或者通过异源细胞表达获得的分子在本质上都是分离的分子。术语“重组多肽”是指通过重组DNA技术或者重组核苷酸产生的多肽，也就是通过被编码期望的多肽的外源DNA构建体修饰过的细胞生产获得的多肽。术语“启动子序列”或“启动子”是指，能够结合细胞中的RNA聚合酶并启动下游 (3'方向)编码序列转录的DNA调节区域。为定义本发明之目的，启动子序列起始于3'末端编码序列的翻译起始密码子(ATG)并向上游(5'方向)延伸直到包含启动和适当调节可检测水平的转录所必须的最小数量的碱基或元件。启动子序列中具有转录起始位点以及用于结合RNA聚合酶的蛋白结合区域。真核生物启动子通常但并非总是含有“TATA”盒和 “CAT”盒。原核生物启动子除了含有-10和-35保守序列外，还可以含有Siine-Dalgarno 序列。术语“可操作地连接”是指组份的连接，其中所述组份之间的连接能够使它们以预期方式起作用。例如，如果启动子影响到了编码序列的转录或表达，那么可以将启动子可操作地连接到编码序列。除非特别指出外，否则两个DNA或多肽序列“基本上同源”是指在分子中确定的一段长度中，两个DNA或多肽序列的氨基酸匹配率至少为约85% (优选至少90%，最优选至少约95% )。可以通过Southern杂化实验来确定DNA序列是否基本上同源，例如在适用于特定系统的严格条件下进行Southern杂化实验。确定适当的杂化条件属于本领域的现有技术。术语“功能相当”是指，编码蛋白的氨基酸序列所引起的生物应答与特定免疫原或蛋白所引起的生物应答相当，所述特定免疫原或蛋白通常是天然蛋白。在有些情况中，该生物应答是免疫应答。在有些情况中，该生物应答是指编码蛋白在宿主体内抑制免疫应答的能力。术语“非功能相当”是指与天然蛋白调控的的生物应答不相当的生物应答。此外，如果基因序列编码相同的多肽或者编码的多肽自身是功能相当的，则这些基因被称为功能相当的。术语“多肽”作最广义理解，也就是任何通过肽键连接的氨基酸聚合物(二肽或更多肽)。因此，术语“多肽”包括蛋白、寡肽、蛋白片段、类似物、突变蛋白、融合蛋白及类似物。术语“糖蛋白”是指糖基化的多肽。术语“天然的”蛋白或多肽是指，与野生型BHV-I蛋白或其片段具有相同序列的蛋白或多肽。术语“天然的”基因是指，与野生型BHV-I中发现的基因或片段具有相同核苷酸序列的基因。此处所用的基因“修饰”是指，编码BHV-I蛋白的基因或其片段的核苷酸序列的突变、替换或删除，基因修饰的结果是产生与原型BHV-I蛋白非功能相当的BHV-I蛋白。基因被全部删除或部分删除也被认为是一种修饰。被完全删除的基因通常不能编码蛋白。被部分删除的基因可以编码修饰的蛋白。基因修饰也包括在基因中插入一个或多个序列。基因修饰可以包括各个类型的修饰或者突变的组合。在一个实施例中，可以删除基因的一部分， 并在原删除位置处插入其它序列或者在基因的其它位置处插入其它序列。蛋白质序列也可以被修饰。修饰的蛋白质可以通过用修饰的基因来编码获得。与未修饰过的蛋白质或天然蛋白质相比，修饰的蛋白质通常具有不同的氨基酸序列。在有些情况中，修饰的蛋白质与天然蛋白质具有不同的功能。在这种情况下，与原型BHV-I相比， 修饰的蛋白质属于非功能相当的蛋白质。与原型BHV-I相比，修饰的蛋白质可以含有氨基酸突变、替换或删除。在特定的实施方式中，对基因或蛋白质进行修饰从而产生与野生型的基因或蛋白质非功能相当的蛋白。修饰基因或蛋白的技术属于本领域的现有技术，例如基因删除构建体和细菌人工染色体(BACs)，但本发明又并不局限于这些技术。本发明可以使用任何修饰本发明的基因或蛋白质序列的方法。例如，可以使用任何可以产生非功能相当蛋白的修饰技术。基因修饰也可以包括不是针对基因编码序列而是针对影响基因表达水平的调节序列而进行的改变。在一个实施例中，这种类型的修饰可以降低基因表达水平。就本发明而言，针对特定基因所进行的修饰的类型部分取决于编码蛋白的功能。 在一个实施例中，特定BHV-I基因编码的蛋白被认为可能是抑制了宿主针对跟BHV-I —起给药的抗原的免疫应答。因此，人们希望将该基因删除(例如完全删除该基因)从而使得不会出现由该基因表达的蛋白质。但是当由该特定的BHV-I基因编码的蛋白缺失时，BHV-I 也会因为毒性太强而无法用作疫苗株。出现这种结果的一个原因可能是，由该特定的BHV-I 基因编码的蛋白是可以部分引起宿主体内强免疫应答的强免疫原。病毒缺失该蛋白会导致宿主无法产生足够的免疫应答来抵御感染性病毒的侵入。宿主可能会感染疾病或者遭受其它有害的副作用。解决该问题的一个潜在方案是对特定的BHV-I基因进行修饰，从而使编码的蛋白仍具有免疫原性但又不至于对宿主的免疫应答产生抑制作用。通过该方法可以使宿主仍能产生抵御感染性BHV-I病毒入侵所需的足够的免疫应答能力，同时又能消除蛋白抑制宿主免疫应答的能力。当然还可以使用其它方案来解决这个问题，这些方案中涉及的 BHV-I基因修饰并非全部针对那些抑制宿主免疫系统的基因。本领域技术人员知道如何鉴别和解决这些问题及其类似的问题。此处所用的术语“MHC相关蛋白”是指，任何直接参与通过MHC I类或者MHC II类分子进行抗原加工和呈递过程的蛋白质。本领域技术人员熟知这些蛋白。因此MHC相关蛋白质不仅指MHC分子，还包括但不限于那些参与将抗原传递给MHC I类呈递的蛋白，例如与宿主动物中的抗原加工(TAP)蛋白相关的传递子。术语“标记基因”是指，可以被用来区分被感染的动物与免疫的动物的基因。此处所用的标记基因与野生型的基因的区别可以通过诊断实验方法来进行测定。标记疫苗是指含有至少一个标记基因的疫苗。在本发明的一个实施方式中，标记基因是BHV-I UL49.5， BHV-I UL4LBHV-I Us4或BHV-I Circ。在其它的实施方式中，标记基因可以是BHV-I Us80 如本领域技术人员所知，疫苗中的标记基因可以被用作DIVA(区分感染的动物与免疫的动物)疫苗。在一个实施例中，可以设计和使用一种诊断实验方法来区分给药用的BHV-I疫苗(DIVA疫苗)和天然感染宿主的BHV-I。术语BHV-I蛋白或基因的“突变体类似物”在此是指，与野生型的BHV-I蛋白具有一个或多个不同氨基酸序列修饰的蛋白或者与野生型的BHV-I基因具有一个或多个核苷酸序列修饰的基因。术语“宿主”是指可以天然感染BHV-I病毒的动物。因此，宿主期望获得针对BHV-I 感染的免疫，不管该宿主是否已经被BHV-I感染还是随后将被BHV-I感染。宿主通常是有蹄类动物。有蹄类动物宿主可以是包括任何品种任何年龄的牛。牛宿主包括牛犊和成年的牛，并且还包括食用牛、公牛、小母牛、奶牛和牛犊。牛也可以包括处在怀孕期和哺乳期的牛。本发明还可以应用在兽医学领域。在一些实施方式中，本发明的组合物和疫苗不给予怀孕的、新生期的或三月龄以下的宿主。在特定的实施方式中，将本发明的组合物和疫苗给予一月龄左右的宿主。在另一个具体实施方式
中，将本发明的组合物和疫苗给予怀孕的动物。在这些实施方式中，给予组合物和疫苗是为了避免胎儿感染。在其它具体实施方式
中， 在宿主繁殖后的近30天内，不会对宿主给予本发明的组合物和疫苗。术语“抗原”是指含有一个或多个表位的分子，其中所述表位可以刺激宿主免疫系统以使其产生分泌的体液介导和/或细胞介导的抗原特异性应答。术语抗原和“免疫原” 可以相互替换使用。特定的抗原可以是蛋白质、多糖、脂多糖、脂肽或其它分子；或者可以是以上任意的组合。抗原也可以是其它的组合。特定地，特定抗原可以包括天然蛋白质或其片段，或者包括合成的蛋白质或蛋白质片段或多肽片段；也可以包括糖蛋白、糖肽、脂蛋白、 脂肽、核蛋白质、核多肽；也可以包括多肽与多肽的缀合物；或者也可以包括重组核酸表达产物。抗原的非限定性实例包括但不限于，那些能够诱导宿主产生针对病毒性的牛疱疹病毒、牛呼吸道病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒以及通常与“船运热”相关的细菌菌株的免疫应答的抗原。术语“免疫原的有效量”是指，能够诱导明显的体液分泌和/或细胞介导的免疫应答的免疫原的量。所用免疫原的合适量取决于特定的免疫原，这对本领域技术人员而言是公知的。术语“表位”是指，免疫原或半抗原上结合特定的抗体分子或被T细胞识别的位点。术语表位可以与“抗原决定簇”或“抗原决定位点，，替换使用。术语“免疫应答”是指个体中细胞和/或抗体介导的免疫应答的过程。该应答通常包括但不限于一种或多种以下作用产生抗体，产生B细胞，产生辅助T细胞，产生抑制性T 细胞，和/或产生细胞毒T细胞和/或产生γ δ T细胞，其中所产生的这些抗体和细胞可以特异性地作用于组合物或疫苗中所包含的目标抗原。有很多成分都可以引起免疫应答，例如前面所提到的B细胞和T细胞等。可以通过检测这些成分来推测是否出现了或改变了体液的免疫应答、细胞的免疫应答或者两者组合的免疫或其它免疫应答。例如，体液免疫应答或细胞免疫应答可以分别通过特定的抗体或者抗原抗异性的细胞毒T细胞的形式来进行， 它们可以被许多成分所影响。一种可能的影响成分是，在抗原呈递细胞(APCs)或其它细胞的表面MHC I类和/或MHC II类分子的作用下，将特定表位“呈递”给位于T细胞的能力。 因此，MHC I类分子和/或MHC II类分子的存在或其水平可以表明有机体引发特定类型免疫应答的能力。并且，MHC I类分子和/或MHC II类分子的水平随着时间所发生的变化或在不同情形下所发生的变化可以用来推断是否存在或可能存在特定类型的免疫应答。另外一种免疫应答的成分具有使抗原刺激产生二次免疫应答或“唤醒”初次免疫应答的能力，其中所述抗原已经被呈递给了有机体的免疫系统并且已经刺激引发了初次免疫应答。当抗原被用作唤醒免疫应答时，参与这个过程的免疫细胞可以分泌出各种细胞因子。在一个实例中，可以通过测定白细胞介素_2(IL-2)的变化来推断免疫原是否唤醒了初次免疫应答或者推断唤醒的程度。免疫应答的唤醒与IL-2的量成比例。关于体液免疫应答，表明是否存在免疫应答以及存在的免疫应答是否可以抵御病原体的一个特征是，血清中对于病原体抗原具有特异性的抗体的水平。除了抗体水平外， 特定的抗体类别或抗体类别的组合，或者给定抗体类别情形下的抗体的特定亚类别或子类别，或者特定亚类别或子类别的组合或者组合中各类别的比例都是进行上述推断非常有用的信息。在一个实施例中，血清可以含有IgG类别的不同子类别。子类别IgGl可以是中和特定抗原的抗体(因此被认为具有保护作用)。子类别IgG2可以不是中和特定抗原的抗体 (所以被认为不具有保护作用或者比IgGl子类别的保护作用弱)。因此在这个实施例中， 高比率的IgGl/IgG2(IgG对于特定抗原具有特异性)要比低比率的IgGl/IgG2显示出更好的免疫应答潜力。免疫应答或者免疫应答的成分通常可以用免疫分析方法来测定。使用野生型的 BHV-I病毒感染或者用商业渠道可以获得的BHV-I疫苗感染后，可以检测到免疫应答的增加。与使用商业渠道可以获得的疫苗进行感染或者未经感染的细胞中检测到的结果相比， 可以检测到免疫应答的抑制。在一些实施方式中，通过评估MHC I类细胞表面表达的水平来确定免疫应答的抑制。在其它实施方式中，通过评估MHC I类细胞的胞质表达来确定免疫应答的抑制，也可以同时评估或不评估其细胞表面的表达。在其它实施方式中，通过评估 MHC II类的表达来确定免疫应答的抑制。在其它实施方式中，通过评估细胞因子或其它免疫应答的指示因子来确定免疫应答的抑制，例如测定宿主针对共同给药的免疫原的免疫应答的抑制，并以此作为指示因子。用于测定免疫应答的方法以及免疫应答成分在本领域中是已知的，但本发明又不局限于已知的这些技术。术语“免疫原性多肽”或“免疫原性氨基酸序列”分别是指，可以引发宿主产生中和病毒感染性的抗体和/或调节抗体补体或者调节抗体依赖的细胞毒或者调节细胞介异的免疫从而为免疫宿主提供保护的一类多肽或氨基酸序列。此处所用的“免疫原性多肽”， 包括插入蛋白的全长序列(或近全长序列)及其免疫原性片段。术语“免疫原性片段”是指一类多肽片段，该多肽片段包含一个或多个表位因此可以诱导宿主产生中和病毒感染性的抗体和/或调节抗体补体或者调节抗体依赖的细胞毒或者调节细胞介异的免疫从而为免疫宿主提供保护。这些片段的长度至少为约5个氨基酸，在特定的实施方式中长度至少为约10至15个氨基酸。片段长度的上限并没有特别的要求，其可以包含近乎蛋白序列的全长，或者甚至是包含两个或多个亚单元抗原的融合蛋白。术语“治疗”和“治疗的”是指，给予个体可以预防感染或者再度感染BHV-I或者与其它免疫原有关的疾病的组合物(预防)，或者给予个体可以减轻或消除BHV-I或者与其它免疫原有关的疾病的症状的组合物(治疗)。治疗在此也指缩短BHV-I潜伏-再激活周期或者防止出现BHV-I潜伏-再激活周期，潜伏-再激活周期缩短是指相对于感染野生型 BHV-I后出现的潜伏-再激活周期而言，潜伏-再激活周期可以通过测定激活后的病毒脱落情况来测定。例如，如果初次感染期间或者潜伏期间在宿主动物的粪便中检测出的BHV-I 脱落的量得到了减少或消除，则可以认为动物宿主已经得到了治疗。如果检测后发现可见脱落得到了减少或者传染性病毒在扁桃体或者TG中的脱落得到了减少则可以认为治疗成功。术语“潜伏-再激活周期”是指BHV-I建立潜伏、维持潜伏以及再激活的过程。建立潜伏包括急性感染。维持潜伏是存续于宿主整个生命周期的阶段，其可操作性的定义是使用标准的病毒分离手段不能再检测出传染性病毒的期间。术语“再激活”和“从潜伏期再激活”是指，在给予外源性的皮质类固醇或者因为压力引起天然皮质类固醇水平的提高之后所导致的病毒再激活过程。免疫抑制也会刺激病毒基因的表达从而引起病毒再激活。一旦再激活，在传感神经元中可以检测到大量的病毒基因表达，并且可以从三叉神经节、眼睛分泌物和/或鼻子分泌物中分离出传染性的BHV-I病毒。再激活期间，病毒重新回到初始的感染位置并从该处扩散到其它易受感染的宿主。这种从潜伏期再激活回来的能力会引起重新感染疾病和病毒的传染。病毒已经被“减毒”是指病毒株的致病性和/或毒性被减弱从而使得其可以诱导免疫应答但又不会引起特定的疾病。此处所用的修饰的活疫苗(MLV)是指，含有已经被减毒的活病毒的疫苗。在一些实施方式中，本发明的疫苗可以被进一步减毒。被进一步减毒的病毒的一个实例是，与常规的减毒活病毒疫苗相比，减弱了该病毒引起宿主发热、淋巴球减少、产奶下降、食物摄入下降、自然怀孕的母牛的流产以及未满三日龄牛的致命的病毒血症的能力。在特定的实施方式中，BHV-I病毒可以被进一步减毒。术语“药学上可接受的媒介物”是指与期望的给药途径相适应的载体，该术语在此可以与“兽医学上可接受的载体”或“兽医学上可接受的媒介物”相互替换使用。给药途径的实例包括，非肠道给药，比如静脉注射，皮内注射，皮下注射，口服(比如吸入)，经皮给药(局部的)，透粘膜吸收，直肠给药，以及其它的给药方式。可用于非肠道给药或者皮内给药或者皮下给药的溶液或者悬浮液可以包含以下组份无菌的稀释剂，比如注射用水、盐水、非挥发性油、聚乙烯二醇类、甘油、丙二醇，或其它的合成溶剂；抗菌剂，比如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，比如抗坏血酸、亚硫酸氢钠；螯合剂，比如乙二胺四乙酸；缓冲溶液，比如醋酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐；调节渗透压的试剂，比如氯化钠或者葡萄糖。PH值可以用酸或碱进行调节，比如盐酸或氢氧化钠。非肠道给药的制剂可以装在玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或者多剂量小瓶中。术语“缺失修饰”或“缺失突变”包括至少有一个核苷酸缺失的基因序列，缺失通常发生在蛋白的开放阅读框内。本领域技术人员知道在某些情况下，缺失突变可以包括点突变。在特定的实施方式中，缺失突变会引起修饰的核苷酸序列不表达某些蛋白。在其它具体实施方式
中，缺失突变仍会使得其表达蛋白但所表达的蛋白与野生型的蛋白非功能相当。在一些实施方式中，缺失突变包括删除整个基因序列。这样的缺失突变可以称作完全缺失。在其它实施方式中，缺失突变包括至少缺失小于1^,1^-5^,5% -10%基因序列， 或者缺失更多基因序列。这样的缺失突变可以被称为部分缺失。在特定的实施方式中，缺失可以是点缺失，所述点缺失是指单个核苷酸的缺失。缺失修饰或缺失突变也可以包括多于一个核苷酸的缺失。“报告基因”是指，除了天然地可操控地连接有引物的编码序列之外的任何可以检测或者测定出其表达的序列。报告基因通常与可以检测到其内启动子活性的细胞是异源的。报告基因的实例包括但不限于，编码绿色荧光蛋白(或任何其它荧光标记物)的基因，编码氯霉素乙酰基转移酶(cat)的基因，编码葡萄糖苷酸酶(gus)的基因，编码半乳糖苷酶(IacZ)的基因，编码荧光素酶的基因，以及编码其它类似物的基因。报告基因的表达可以通过许多常规方法进行检测，优选的方法取决于许多因素例如报告基因的性质与功能。分析报告基因表达的合适方法通常包括，例如⑴分析报告基因产物的功能(比如检测报告基因产物所催化的酶促反应)；(ii)分析报告基因所表达的蛋白水平(比如通过 SDS-PAGE凝胶电泳方法进行分析，或者通过使用可以与报告基因产物特异性结合的抗体 (比如单克隆抗体或多克隆抗体)来进行免疫测定；以及(iii)测量报告基因转录的mRNA 的水平。本发明还包括通过高通量筛选测试化合物的分析方法。在一个实施例中，可以在白光下通过可视的绿色荧光来检测GFP或者EGFP的表达。
修饰的BHV-I病毒广义地来说，本发明的许多实施方式都包括了对BHV-I基因进行修饰后所获得的修饰的活BHV-I疫苗病毒，从而可以防止或者减少用野生型BHV-I或者疫苗病毒进行感染后所出现的宿主免疫抑制的现象。在一个实施例中，BHV-I修饰可以使获得的病毒不会或者减少其对于跟BHV-I —起给药的免疫原所产生的免疫应答抑制。在另一个实施例中，BHV-I 修饰后所产生的病毒当它与其它非BHV-I免疫原共同给药后可以使得所述的其它免疫原所引起的免疫应答要比其单独给药(没有BHV-1)所引起的免疫应答来的更强。本发明所使用的BHV-I病毒通常是活病毒。该病毒可以是被减毒的或者未经减毒的。在特定的实施方式中，可以使用修饰过的灭活病毒。本发明也提供了一种减轻宿主针对共同给药的和/或以联合疫苗形式给药的其它免疫原应答所存在的免疫抑制的方法。本发明也提供了一种使用本发明创造性的疫苗来治疗宿主动物的方法。本发明提供了一类含有修饰的BHV-I基因的组合物和疫苗，其中所述的基因经过修饰从而使得可以治疗牛疱疹病毒感染期间出现的宿主免疫应答的抑制，和/或减轻宿主针对共同给药的和/或以联合疫苗形式给药的其它免疫原应答的免疫抑制。在多数实施方式中，本发明包括用于治疗BHV-1. 1和BHV-1. 2亚型的疫苗。本发明也包括了使用本发明提供的疫苗的方法。并非所有，但很多具有抑制免疫系统活性的BHV-I基因都具有可以使其被容易识别的细胞同源性。在特定的实施方式中，基因修饰发生在参与MHC免疫原处理和递呈的基因上。MHC I类分子是分布在所有脊椎动物有核细胞中的抗原呈递分子，而MHC II类分子是主要分布在巨噬细胞和B淋巴细胞的抗原呈递分子。修饰可以发生在涉及MHC I类分子和MHC II类分子功能的基因上。在许多实施方式中，修饰的BHV-I基因是编码一类特定蛋白的基因，该蛋白会引起宿主MHC相关蛋白的下调，和/或该蛋白会通过避开宿主免疫系统的方式来避开宿主针对病毒的免疫应答。这种类型的基因的实例包括BHV-1 UL49. 5 (SEQ ID NO. :1)，BHV-I UL41 (SEQ ID NO. :3)，以及 BHV-I Circ (SEQ ID NO. :5)。在另一些实施方式中，修饰的基因所编码的蛋白可以通过调节补体、作用于细胞生长和/或影响干扰素的表达来抑制免疫功能。BHV-I Us4(SEQ ID NO. :11)被认为是通过其作为趋化因子结合蛋白的功能来实现免疫调节。BHV-I UL49. 5基因编码的蛋白与所有已知的疱疹病毒中发现的高度保守的糖蛋白(gN)具有同源性。gN参与了细胞表面上MHC I类的下调，从而可以使BHV-I避开抗原递呈以及宿主免疫系统的激活。Lipinska等人，(2006) J. Virol. 80 :5822对BHV-1 UL49. 5 基因进行了详细描述，该文献在此通过引用方式并入本申请以作参考。BHV-I UL41基因编码的蛋白与被膜宿主关闭蛋白(tegument host shutoff protein)或病毒宿主关闭蛋白(virion host shutoff,vhs)同源。被膜宿主关闭蛋白似乎通过下调MHC I类mRNA的方式参与了免疫抑制。Gopinath等人Q002) Viral Immun. 15 595记载了 BHV-I UL49. 5基因的修饰。BHV-I Circ基因编码的蛋白与马立克氏被膜蛋白(myristylated tegument protein)同源。BHV-1马立克氏被膜蛋白似乎下调了 MHC II类分子的表达。ktiwyzer等人，(2002) Vet. Microbiol. 86 :165 中记载了该基因。BHV-1 Us4基因编码的蛋白与糖蛋白(g)G同源，该糖蛋白是一类趋化因子结合蛋白。Bryant 等人，(2003)EMBO J. 22 :833 记载了 Us4 基因。BHV-1 Us9基因编码的蛋白似乎参与了潜伏-再激活期间从三叉神经节到鼻部的顺向输运过程。BHV-1 LR-ORF 1和2基因或者潜伏相关的ORF基因被认为参与了潜伏感染的发展过程以及病毒在三叉神经节的寄居。BHV-1 UsS基因编码的蛋白与糖蛋白(g)E同源，该糖蛋白被仍为对IgG介导的免疫应答具有抑制作用。在此应当理解，本发明的公开内容包括了所有前面提到的基因的修饰。在一个实施方式中，修饰的BHV-I病毒可以含有单个基因的修饰。在其它的实施方式中，修饰的BHV-I病毒可以含有两个、三个、四个或者甚至更多个不同基因的修饰。在许多实施方式中，同时对参与细胞调亡的基因和参与MHC处理的基因进行修饰，在其它非限定性的实施方式中，针对通过诱导或者抑制细胞凋亡或者程序性细胞死亡的方式来抑制免疫应答的基因进行修饰。作为非限制性的实施例，修饰可以发生在UL49. 5和LR-ORF KSEQ ID N0. 7)上。在其它实施方式中，修饰可以发生在UL49. 5、Us4和LR-ORF 1上，或者仅在UL49. 5和Us4上。在另一个实施方式中，修饰可以发生在UL49. 5和UL41上。应当理解，这些实施方式仅是示例性的，本发明同样包括了免疫抑制基因的各种不同组合。在特定的实施方式中，可以根据修饰的基因在刺激免疫应答方面的协同作用能力来选择不同的组合。在特定的实施方式中，组合物和疫苗含有至少一个修饰的BHV-1 UL49. 5, BHV-I Us4,BHV-1 UL41，和/或BHV-1 Circ0这些修饰的基因通常被认为可以减轻免疫抑制。在有些实施方式中，所有这四种基因都经过修饰。在其它实施方式中，可以是一种、两种或三种基因被经过修饰。这些基因可以是任何组合的修饰。作为非限定性的实施例，组合物或疫苗中可以有两个基因经过修饰，这些修饰的基因可以是BHV-I UL49. 5和BHV-141，UL49. 5 和h4，UL41和Us4，以及BHV-I Circ和BHV-I UL49. 5。在包括对具有减轻免疫抑制反应活性的基因进行修饰的实施方式中，修饰也可以发生在BHV-I LR-ORF 1和2 (SEQ ID NO. 9) 以及BHV-I Us9 (SEQ ID NO. : 13)。反之，组合物和疫苗也可以包含仅发生在BHV-I LR-ORFl 和2，和/或BHV-I Us9的修饰。应当理解，修饰可以发生在BHV-I LR-ORFl或2或BHV-I Us9。BHV-I LR-ORFl和2以及BHV-I Us9被认为可以预防/减少BHV-I的潜伏或者BHV-I 的脱落。在其它的实施方式中，可以将标记基因和具有免疫抑制活性的基因和/或具有预防/减少BHV-I潜伏和脱落活性的基因一起进行修饰，或者将标记基因同时与具有免疫抑制和潜伏的基因一起进行修饰。标记基因可以是BHV-I Us8 (SEQ ID NO. :15)。在一个实施方式中，疫苗可以包含对参与免疫抑制的基因进行的三个修饰，对参与潜伏的基因进行的两个修饰，以及一个标记基因。对于修饰基因组合的唯一限定条件是要求其所产生的免疫原必须同时与动物和疫苗制剂具有相容性。本发明所涉及到的制备和评估修饰的基因和蛋白的方法属于本领域的公知技术。 修饰技术的非限定性实例包括，通过DNA序列的修饰使得(1) 一个或多个氨基酸被其它氨基酸取代，例如被具有不同功能的非等同残基替换，比如用天冬氨酸替代天冬酰胺；被具有相同功能但却有不同的一级、二级或三级结构的残基替换，比如用谷氨酸替代天冬氨酸；被可以破坏环结构的氨基酸替换，比如脯氨酸替换；使用糖基化氨基酸替代非糖基化氨基酸及其类似物，或者反过来进行替换；用其它残基替换半胱氨酸以破坏双硫键桥构型；以及 (2)增加或删除一个或多个氨基酸从而使获得的蛋白具有非等同的功能或结构。一级结构的改变包括疏水性和亲水性的改变，二级结构的改变包括蛋白局部折叠的改变，三级结构的改变包括蛋白立体结构的改变。在许多实施方式中，这些结构的变化可以产生敲除蛋白 (knocked out proteins)或者产生与野生型的蛋白非功能等同的蛋白。在有些实施方式中，基因通过非MHC相关途径引起免疫抑制反应，例如Us4，UL41。 在其它非限定性的实施方式中，修饰可以发生在通过诱导或抑制细胞凋亡或者程序性的细胞死亡的方式来抑制免疫应答的基因上。例如，当细胞调亡发生在包括CD4+细胞在内的白细胞亚群上时，宿主的免疫系统会被抑制。具有这种细胞调亡活化功能的基因包括， bICPO (Geiser等人，(2008)Microb. Pathog. 44 :459)。在有些实施方式中，修饰发生在编码 bICPO (Jones等人，(2006) Vet. Microb. 113 199)的基因上。在其它实施方式中，修饰发生在与潜伏相关的基因上，例如BHV-I LR-ORF 1和2以及BHV-I Us49。其它非MHC相关的路径可以包括例如BHV-I LR-ORF IiPBHV-I Us9基因的修饰。本发明包括了所有与BHV-I原型有关的不同实施方法。例如，BHV-I原型可以是 Cooper病毒株(野生型的)，或者反之，可以是通过商业渠道获得的疫苗中所存在的病毒株例如BHV-I GL756。GL756是常规衍生的经过修饰的活BHV-I病毒实例。其它常规衍生的经过修饰的活BHV-I病毒已为本领域技术人员所知。这些示例性的病毒株不对本发明构成任何限制，本发明的实施方式中可以使用任何可以感染宿主的BHV-I病毒株作为原型。在本发明的疫苗中，原型BHV-I通常是经过减毒处理的病毒或者经过修饰的活病毒。在特定实施方式中，原型BHV-I是灭活的病毒。在有些实施方式中，宿主免疫应答的抑制可以通过与使用野生型BHV-I或者其它
18免疫原进行感染后检测到的免疫应答进行比较的方式来加以判断。在可替换的实施方式中，宿主免疫应答的抑制是通过与使用BHV-I GL756或者BHV-I Cooper病毒株感染后出现的免疫应答进行比较的方式来加以判断。现有技术已经披露了许多检测宿主免疫应答的方法，例如酶联免疫吸附试验(ELISAs)，或者测定MHC表达的方法。在特定的实施方式中，本发明的组合物被置于适于在体内产生含有修饰基因的 BHV-I的载体内。可以通过添加药学上可接受的媒介物以及可选的佐剂将所述载体配制成疫苗组合物。这些的制剂属于本领域的现有技术。合适的载体可以包括含有修饰基因的人工染色体构建体。人工染色体的一个实例是细菌的人工染色体(BAC)，比如pBeloBACll或 PBAC108L ；参见 Shizuya 等人(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :8794 ；Wang 等人(1997) Biotechniques 23 :992。可以通过标准方法来组装人工染色体构建体的各组份。例如，可以通过共传染细胞的方式将修饰的BHV-I基因插入到人工修饰的染色体中，包括将(i)含有人工染色体的构建体细胞，其中所述人工染色体的侧翼具有与BHV-I染色体区域同源的序列，和(ii)含有BHV-I基因的细胞共转染，从而使得在细胞内发生重组进而产生获得含有人工染色体的重组病毒。从经过共转染的细胞中可以分离得到重组的BHV-1，其中所述经过共传染的细胞是指其细胞内的人工染色体构建体和BHV-I已经进行了共转染并通过同源重组的方式产生了重组病毒，分离得到的BHV-I病毒可以被操控用来产生期望的BHV-I修饰基因。也可以通过直接克隆方法来组装人工染色体的各组份，所述直接克隆使用了 BHV-I 染色体和人工染色体上的独特位点。有关插入有外源基因的人工染色体的实例可以参见美国专利公开第2004-0171569号，该文献在此通过引用方式并入本申请以作参考。在本发明疫苗的具体实施方式
中，通过将人工染色体引入到细胞的方法所获得的重组BHV-I病毒不会杀死细胞。本发明实施例5和6记载了将特定的修饰的BHV-I基因引入到活性病毒中的实例。
制剂本发明所公开的免疫组合物和疫苗可以包含一种或多种兽医学上可接受的载体。 这些兽医学上可接受的载体可以包括溶剂、分散媒介、涂层、佐剂、稳定剂、稀释剂、抗菌剂、 杀真菌剂、等渗剂、吸附剂、延缓剂及其它类似物。此处所用的兽医学上可接受的载体和药学上可接受的载体可以互相替换使用。稀释剂可以包括水、盐水、葡萄糖、乙醇、甘油及类似物。等渗剂可以包括氯化钠、 葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇、乳糖等。稳定剂包括白蛋白等。适于非肠道注射用的药学上可接受的媒介物，通常是无毒的并且是没有治疗活性的。这些媒介物的实例是水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和Hanks液。非水的媒介物，例如是非挥发性的油、麻油、油酸乙酯，或者也可以使用甘油三酯。非肠道给药用的媒介物可以是含有粘性增强剂的悬浮液，例如羟甲基纤维素钠、山梨糖醇、葡聚糖。媒介物也可以含有少量的添加剂，例如增强等渗性和化学稳定性的物质，比如缓冲溶液和防腐剂。缓冲溶液的实例包括磷酸缓冲液、碳酸氢盐缓冲液、三羟基甲基氨基甲烷缓冲液，而防腐剂实例例如硫柳汞、间甲酚或邻甲酚、福尔马林、苯甲醇。标准的制剂是可注射的液体或固体，如果是固体则该固体可以在适宜的液体中形成可用于注射的悬浮液或溶液。因此，在非液体制剂中， 媒介物可以包括葡萄糖、人血清白蛋白、防腐剂等，在给药之前可以加入适量的无菌水或生理盐水。
本发明可以使用任何药学上可接受的水溶性物质或者其混合物。药学上可接受的水溶性物质可以包括一种或多种单糖、二糖、多糖或碳水化合物。它们的实施例包括右旋葡萄糖、甘露醇、果糖、多聚果糖、聚葡萄糖、糊精、葡萄糖、转化糖、乳糖醇、乳糖、异麦芽酮糖醇、麦芽糖醇、麦芽糖、麦芽糖糊精、山梨糖醇、木糖醇、蔗糖、三氯蔗糖、甘露糖、半乳糖、 木糖、阿拉伯糖、果糖、氨基葡萄糖、半乳糖胺、鼠李糖、6-0-甲基-D-半乳糖、2-0-丙酮醇基- β -D-木糖、2-乙酰氨基-2- 二羟基- β -D-半乳糖-4-硫酸盐、N-乙酰葡糖胺、艾杜糖醛酸、单糖醛酸、甲基半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖、α -D-吡喃甘露糖，以及一个或多个单糖或二糖单元通过共价键结合形成的生物大分子。碳水化合物的实例包括藻蛋白酸盐、 淀粉糖、纤维素、角叉(菜)胶、果胶。为了方便，单糖、二糖、多糖、碳水化合物可以统称为 “糖”。本发明也可以使用其它本领域已知的药学上可接受的物质。本发明的疫苗制剂也可以使用本领域中公知的各种佐剂。佐剂可以包括但不限于矿物胶，如氢氧化铝；表面活性剂，如溶血卵磷脂；糖苷，例如皂角苷衍生物比如Quil A或GPI-0100 ；复合多元醇；多聚阴离子；菲离子型嵌段聚合物，如Pluronic通 F-127 (B. Α. S. F.，USA)；多肽；矿物油例如 Montanide ISA-50、聚羟乙烯、Amphigen 、Amphigen . 、Mark I (Hydronics, USA) > Alhydrogel (BSA2 ；Accurate Scientific, Westbury，NY)，油乳剂例如矿物油的乳剂，比如BayolF/Arlacel A和水，或者植物油的乳剂，或者水和乳化剂如卵磷脂形成的乳剂；明矾；牛细胞因子；胆固醇；以及各种佐剂的组合。其它油乳剂还包括在油包水乳剂，以及油包水水包油乳剂。本发明还可以使用其它具有免疫刺激或免疫调节或抗原呈递的性质的佐剂或试剂，以及其它通过商业渠道可以获得的如 Impran (Boehringer Ingelheim Vetmedica, St. Joseph, MO), Emunade (Schering-Plough Animal Health,Summit,NJ),MetaStim (Fort Dodge Animal Health, Overland Park, KS)禾口 / 或 Emulsigen (MVP Laboratories, Inc. , Omaha, NE)等产品。 本发明也可以使用Emulsigen D。在多数实施方式中，只要不与Beef Quality Assurance 抵触的佐剂的类型都可以不受限制的加以使用。本领域技术人员可以容易地确定本发明中佐剂和添加剂的用量和浓度。佐剂的使用方式取决于本发明疫苗的给药方式。例如，当本发明的BHV-I病毒与其它非BHV-I免疫原共同给药时(例如BHV-I在宿主的一个部位给药，而其它免疫原在宿主的另一个部位给药)，则佐剂可以与其它免疫原一起给药，而不与BHV-I —起给药。在其它实施例中，佐剂可以与BHV-I—起给药，而不与其它免疫原一起给药。佐剂也可以同时与 BHV-I和其它免疫原一起给药或者都不给予佐剂(例如当BHV-I和非BHV-I免疫原以多价疫苗组合物形式给药时)。在有些实施例中，BHV-I可以与一种佐剂一起给药，而其它免疫原可以与不同的佐剂一起给药。在有些实施方式中，本发明疫苗被配制成液体形式。在其它实施方式中，本发明的疫苗被配制成干粉。在疫苗是干粉的实施方式中，疫苗的终端用户可以使用适宜的稀释剂对其进行再配制。稀释剂在本领域中是已知的，其包括但不限于如无菌水这样的物质。在有些情况下，疫苗最好在特定时间内使用，例如在疫苗再配制后的M小时内使用。
给药与其它免疫原经过修饰的BHV-I疫苗通常与至少一种其它免疫原通过共同给药方式和/或以联合疫苗形式给药。此处所用的“其它免疫原”是指除BHV-I以外的其它免疫原。此外，在特定实施方式中，其它免疫原可以不含有插入到BHV-I载体中的外源基因。其它免疫原可以包含在共同给药的疫苗中或者包含在联合疫苗/多价疫苗中，也就是含有至少两种免疫原的疫苗。这些其它免疫原可以是来源于一种或多种特定病原体(细菌、支原体、病毒、寄生虫等)的单个免疫原，亦或者可以包含来源于一种或多种特定病原体的至少两种免疫原的组合。所述共同给药疫苗和/或联合疫苗可以全部或者部分是细胞制剂和/或修饰的活制剂，这些制剂对于本领域技术人员而言是已知。其它免疫原也可以包括其它免疫调节分子。可以作为所述其它免疫原来源的病原体和免疫调节分子的实例包括但不限于，牛病毒性腹泻病毒(BVDV) I型，II型和III型；牛呼吸道合胞病毒(BRSV)；副流感病毒3型(PI3)； 溶血性曼氏杆菌；睡眠嗜组织菌(以前称为睡眠嗜血菌)(H. somni)；轮状病毒(BRV)；冠状病毒(BCV)；牛支原体；钩端螺旋体病；犬新孢子虫；毛滴虫类；弧菌；梭菌类抗原；出血败血性巴斯德氏菌；坏死梭杆菌；大肠杆菌0157:H7 ；沙门氏菌和免疫调节细胞因子，例如白细胞介素-Ia (IL-la)，白细胞介素(IL_1 β )，白细胞介素_2 (IL_2)，白细胞间介素-4(IL-4)，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及干扰素类。如上所述，在特定的实施方式中，针对BVD的免疫原可以被包含在共同给药疫苗和/或联合疫苗中。BVDV I型、II型和III型可以引起多种临床综合症。研究表明，这些病毒可以引起严重的呼吸道疾病；被持续感染的牛是其它易受感染牛的主要传染源；BVD感染白细胞库，从而引起免疫系统深远而又广泛的缺损。此外，怀孕母牛感染该病毒会引起流产或者木乃伊化，尤其是在怀孕头三个月感染该病毒。粘膜病是牛病毒性腹泻(BVD)的又一个致命病症，其产生是因为早期胎儿感染了非致细胞病变的BVD生物型，产生了对该病毒的免疫耐受性，进而产出被持久感染的小牛，随后又再度感染了致细胞病变的BVD生物型。BVD II型病毒以前被认为是乳畜群体中可以经常性检测到的主要出血性BVD病毒株。在特定实施方式中，针对牛支原体的免疫原可以包含在共同给药疫苗和/或联合疫苗中，以用来预防食用牛和奶牛中出现的临床疾病以及与支原体感染相关的受损。这些疾病包括传染性的乳腺炎，呼吸道肺炎，关节感染(关节炎症状)，角膜结膜炎，以及中耳炎。出血败血性巴斯德氏菌是一种引起牛肺炎的细菌，本发明的共同给药疫苗和联合疫苗可以包含来源于该病原体的所述其它免疫原。溶血性曼氏杆菌免疫原可以包括白细胞毒素(LkT)，外膜蛋白(OMP)相关的抗原， 或其它抗原。本发明的共同给药疫苗和联合疫苗也可以包含针对钩端螺旋体病的其它细菌免疫原。钩端螺旋体种细菌引起的钩端螺旋体病是一种会引起巨大经济损失的牲畜传染病0 钩端 累旋体 borgpeterseriii serovar hardjo (L. hardjo)禾口钩端 累旋体 interrogans serovar pomona(L. pomona)是世界上与钩端螺旋体病有关联的两种最常见的血清变型。在许多情形下，本发明的共同给药疫苗和/或联合疫苗包含来源于这两种血清变型的所述其它免疫原。其它钩端螺旋体病免疫原包括那些源于犬钩端螺旋体、感冒伤寒群钩端螺旋体、 和出血性黄疸钩端螺旋体的免疫原。牛感染钩端螺旋体可以造成急性发烧，无乳症，流产， 早产，产出虚弱的被感染小牛，并且导致育种失败和受孕率下降。本发明的实施方式还可以使用来源于弧菌属细菌(Vibrio spp.)和梭菌属细菌 (Clostridial species)的其它细菌病原体外源免疫原。梭菌类免疫原的实例包括，来源于肖韦(氏)梭菌，败血梭状芽胞杆菌，诺维氏梭状芽胞杆菌，污泥梭状芽胞杆菌，产气荚膜梭状芽胞杆菌C型和D型，以及溶血梭状芽胞杆菌的免疫原。在另一些实施方式中，本发明的共同给药疫苗和/或联合疫苗可以包含针对犬新孢子虫的其它免疫原。犬新孢子虫是一种引起牛流产的成囊原生动物。在牛中因犬新孢子虫传染而导致的流产通常发生在孕期的中期到晚期，但并非所有受感染的胎儿都会流产。 尽管与那些流产的小牛一样有些被感染的小牛出生时就患有疾病并在新生期夭折，但也有许多先天被感染的小牛可能会健康地出生并受到持久的感染。本发明的共同给药疫苗和/或联合疫苗可以包含来源于毛滴虫的其它免疫原。在特定实施方式中，BHV-I共同给药疫苗和/或联合疫苗可以包含的其它免疫原选自如上所述的细菌组、病毒组、寄生虫组、免疫调节细胞因子组中的一种或者其任意组合。在其它实施方式中，共同给药疫苗和/或联合疫苗中的其它免疫原可以仅是来自前面所述的一种组别的免疫原。在另一些实施方式中，应当理解本发明的共同给药疫苗和/或联合疫苗可以含有来自上述组别的其它免疫原的任何组合。举例来说，联合疫苗可以由修饰过的BHV-1，BVDV I型和II型，PI3以及BRSV组成。在一个实施方式中，联合疫苗含有修饰过的BHV-I, BVD I和II、波摩那群钩端螺旋体、Lepto hardjo-bovis、弧菌、毛滴虫抗原。这种疫苗特别适用于大于一岁龄的食用母牛。这种示例性疫苗可以用在怀孕的母牛中以预防由BVD I和II引起的胎儿感染，预防因BHV-I导致的流产，预防由于弧菌和L.hardjo bovis引起的胚胎早期死亡，以及预防毛滴虫感染。在另一个实施方式中，本发明的联合疫苗含有针对于修饰过的BHV-1、BVD I和II型、波摩那群钩端螺旋体、Lepto hardjo-bovis、弧菌、以及犬新孢子虫的免疫原。这种疫苗特别适用于大于一岁龄的母奶牛。在另一个实施方式中，适用于一个月到六个月龄小牛的联合疫苗可以含有修饰过的 BHV-U BVD I和II、BRSV、溶血性曼氏杆菌、睡眠嗜组织菌、牛支原体、波摩那群钩端螺旋体、L印to hardjo-bovis抗原。在有些实施方式中，可以对大于一天小于一个月龄的小牛进行预防接种。对于六个月到十二个月龄的小牛，联合疫苗可以含有针对修饰过的BHV-1、 BVD I和II、溶血性曼氏杆菌、睡眠嗜组织菌、牛支原体、波摩那群钩端螺旋体、以及L印to hardjo-bovis 的抗原。示例性的共同给药疫苗包括那些具有一种或多种梭菌抗原、溶血性曼氏杆菌、睡眠嗜组织菌、出血败血性巴斯德氏菌、坏死梭形杆菌、大肠杆菌0157:H7以及沙门氏菌的免疫原的疫苗。在特定实施方式中，所述共同给药疫苗是一种仅针对梭菌的疫苗。在其它实施方式中，所述共同给药疫苗是仅针对睡眠嗜组织菌、坏死梭形杆菌、或者二联沙门菌(死) 菌(Salmonella Dublin-Typhimurium)的疫苗。本领域技术人员理解，共同给药疫苗和/或联合疫苗的唯一区别是疫苗中的单个成分是共同给药的还是以联合疫苗形式给药以达到减少BHV-I引起的免疫抑制作用的期望目的。应当理解，每个本发明所述的共同给药疫苗和/或联合疫苗都可以包含任何此处记载的兽药学上可接受的组份，包括但不限于佐剂、稀释剂、溶剂等。应当理解，在特定的实施方式中虽然共同给药疫苗和/或联合疫苗诱导的免疫原性可能与单个疫苗的不同，但共同给药疫苗或者联合疫苗仍是优选的疫苗。在许多情况下， 用联合疫苗替代数种不同的疫苗是有利的，因为联合疫苗通常可以从工作量和材料这两方面来降低治疗费用。此外，联合疫苗占用的空间更少从而使其易于运输和储存。
将本发明的疫苗组合物给予宿主动物的许多方法都是本领域的现有技术，包括口服，经鼻给药，局部给药，经皮给药，以及非肠道给药。在特定的实施方式中，给药途径是经鼻给药或者非肠道给药，特别是肌内给药。在特定的实施方式中，本发明的制剂特别适宜通过肌内注射方式给药，因为静脉注射不适宜家畜的大规模应用。尽管如此，本发明的制剂也可以通过其它途径给药，例如皮下注射或皮内注射，因为当宿主动物作为食用肉制品时就不适宜通过肌内注射方式给药。可选择地，疫苗也可以与药学上可接受的媒介物一起配制并通过口服方式给药。在这些实施方式中，本发明的疫苗可以通过口服方式给药以提高黏膜免疫，以及通过肌肉注射方式给药以提高全身免疫。对于鼻内滴注的给药方式，宿主动物的接种量可以在将近102至108 TCID50的各修饰的活疫苗病毒株的范围之间。对于肌内注射的疫苗来说，可以将102至108 TCID50的病毒注射到宿主的肋腹部(尾部肌肉群)或颈部(臂头肌)。对于皮下给药，宿主动物的接种剂量将近102至108 TCID50的各修饰的活疫苗株。在许多实施方式中，每剂量疫苗至少含有102. 5 TCID50病毒。在特定的实施方式中，疫苗的剂量体积为将近2mL至5mL。前面提到的疫苗给药途径仅是为了示例作用，本发明的疫苗还可以通过任何本领域已知的适宜方法进行给药。疫苗组合物中抗原的浓度足以在宿主体内产生有效剂量从而使得抗原可以在宿主体内诱导细胞介导的免疫或者诱导宿主体内产生针对多肽中和表位的抗体。只要疫苗剂量在允许的大限量范围内，那么疫苗剂量本身就不是个非常关键的因素。可选地，在特定的实施方式中，可以在初始免疫后的数周至数月时间内给予宿主动物第二免疫促进剂。在特定的实施方式中，可以在初始免疫后的一年时间内给予宿主动物免疫促进剂。为了保持针对疾病的稳定的高水平免疫保护，可以定期地给予宿主动物免疫促进剂。定期可以是在每月至每六个月、每年、或数年的时间范围。在特定的实施方式中， 本发明的组合物不使用在怀孕期或哺乳期的个体。在其它实施方式中，本发明的组合物不使用在繁殖后还未满一周、两周、三周或四周的个体。在其它一些实施方式中，本发明疫苗不使用在将在观天或更短时间内屠宰的动物。仅为示例性说明之目的，对于食用动物而言，通常在打烙印的时候(在夏季放牧之前)对其进行免疫接种，在断奶期间对其进行免疫接种，在送到育成牛棚 (back-grounding facility)(冬季麦田放牧)时对其进行免疫接种，在到达饲育场时对其进行免疫接种。对母牛来说，也可以在进入断奶期或者在孕检期间对其进行免疫接种。对奶牛来说，通常在断奶期对其进行免疫接种。本发明的经过修饰的组合物和疫苗可以用作标记物。通过分析宿主动物的样品可以确定宿主动物是否被本发明的疫苗保护，以及确定宿主动物是否暴露于野生型的BHV-I 病毒株。在特定的实施方式中，本发明提供了一种采用免疫分析方法来确定样品中是否存在针对BHV-I基因和修饰的BHV-I基因的抗体以及此类抗体的浓度(如果存在)的方法。 该免疫分析方法的特征在于使用可以与BHV-I抗体进行反应的修饰的BHV-I免疫原作为反应试剂，从而形成BHV-I抗体和修饰的BHV-I免疫原的复合物，然后再通过测定是否存在该复合物以及该复合物的浓度(如果存在)的方式来测定是否存在针对修饰的BHV-I的抗体，而后再确定该抗体的浓度(如果存在)。例如，可以在免疫分析方法中使用修饰的免疫原作为底物试剂来测定样品(例如，来自宿主动物的血样)中针对BHV-I蛋白的抗体，进而再确定宿主动物是否被BHV-I感染以及样品中抗体的浓度。BHV-I免疫原可以被混合在或者固定在合适的基质(支托)或载体上，例如橡胶颗粒，塑料微型滴定板或者其它类似材料。根据所用免疫分析方法的需要，BHV-I免疫原也可以与酶、染料、放射性同位素或者其它类似物质偶联。本发明所述使用修饰的BHV-I免疫原进行免疫分析的方法包括但不限于， 放射免疫测定，竞争免疫分析法，免疫沉淀反应，酶联免疫吸附测定，免疫荧光测定等等。在许多实施方式中，优选方便、快速、灵敏并具有特异性的方法来进行免疫分析。以下对本发明进行举例说明，所举的例子仅为示例之目的。这些例子不对本发明的保护范围构成任何限制，本领域技术人员根据本发明公开的内容可以容易地知道权利要求保护范围内的许多实施方式。本领域技术人员被认为熟知本申请中所引用的文献，这些文献在此通过引用方式全文并入本申请以作参考。
实施例下列实施例仅为对本发明实施方式进行说明之目的，其不对本发明构成任何限制。
实施例1 BHV-I感染引fe被感染细朐卜.MHC I类分子表汰的下调。为了评估BHV-I感染对被感染细胞表面上MHC I类分子表达的影响，现使用BHV-I GL756病毒株以10的感染复数(MOI)感染马-达氏牛肾细胞(MDBK)或者对其进行模拟感染。在感染后的16-24小时，使用与MHC I类分子具有特异性的单克隆抗体PT85A(VMRD， Inc. ；Pullman, Washington, USA)对细胞进行染色。阴性对照细胞使用无反应活性的同型匹配对照抗体(MM605 ；Dr. Subramaniam Srikumaran ；Washington State University)进行染色° 一级抗体用 Zenon Mouse IgG Labeling Kits (Molecular Probes, Invitrogen Detection Technologies,Carlsbad,California,USA)进行标记或者使用荧光标记的二级抗体。然后通过流式细胞仪检测细胞的表面免疫荧光。如图10所示，检测数据显示被BHV-I感染的细胞在细胞表面表达MHC I类分子，但是与模拟的被感染细胞相比，其表达水平被降低或调低。因此，野生型的BHV-I会降低MHC I类分子在被感染细胞表面上的表达水平。
^MM 2 BHV-I弓丨走(寸其它共同i合药免疫 的免疫应答抑泡丨为了评估BHV-I对牛犊针对跟其共同给药的其它非BHV-I免疫原免疫应答的影响，进行下列研究。所使用的牛犊是3至6月龄的BHV-I血清阴性牛犊(Hereford-Angus 杂交牛或者Holstein-Dairy杂交牛)。这些牛犊具有最小限度的ELISA测定的LkT滴定度。这些牛犊在第O天通过颈部皮下给药方式单独给予来源于溶血性曼氏杆菌的重组 LkTdOOyg重组LkT分散在2mL含有Emulsigen D佐剂的制剂中)，或是单独给予BHV-I (将近IO5-5BHV-I GL756病毒株分散在2mL制剂中)，或者是给予LkT和BHV-I (BHV-1和LkT 在颈部共同给药，给药部位相隔将近5厘米)。对于单独给予LkT的牛犊组以及共同给予 BHV-I和LkT的牛犊组，在第21天时再次给予LkT。在给药前(第O天)、第4天、第10天、 第14天、第21天、第观天和第35天分别抽取血液并收集血清。用ELISA方法分别测定前述时间点血清中可以与LkT反应的血清抗体。将第4天血清中测得的抗体水平设为1，然后再分别计算其它时间点抗体水平相对此的数值。
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图11中的结果显示，单独给予LkT的牛犊组和同时给予LkT和BHV-I的牛犊组中 LkT特异性抗体的水平在研究期间基本上是被提高的，并在第观-35天时达到顶峰水平。在所有时间点的血清中，单独给予LkT的牛犊血清中所存在的LkT特异性抗体的水平要高于同时给予BHV-I和LkT的牛犊。单独给予LkT的牛犊组与同时给予BHV-I和LkT的牛犊组之间在LkT特异性抗体水平上出现明显差别的时间是在第10、14、21和观天。这些结果表明，与单独给予某种免疫原相比，BHV-I会抑制宿主针对与其共同给药的其它免疫原的免疫应答。
t施例3给予BHV-I引fe牛ft体内与跟BHV-I共同给药它免,疮原H有特异t牛的 IgG中IgGl亚型与IgG2亚型比例的下降。为了评估BHV-I对宿主体内特异于跟BHV-I共同给药的其它免疫原的IgG亚型所产生的影响，现使用实施例2所记载的从单独给予LkT以及同时给予BHV-I和LkT的牛犊中收集的血清样品来进行试验。使用包被有LkT和IgG亚型特异性抗体的ELISA板来检测这些血清样品中LkT特异性的IgGl亚型和IgG2亚型。如图12的结果所示，与单独给予LkT的牛犊相比，同时给予LkT和BHV-I的牛犊血清中LkT特异的IgGl/IgG2的比例被降低了。这些结果说明，BHV-I可以改变(降低)宿主体内与跟BHV-I共同给药的免疫原具有特异性的IgGl/IgG2比例。
t施彻丨4给予BHV-I抑制了牛ft体内针对共同给药免鹿原的杭原回仅俯答为了评估BHV-I对宿主动物针对跟BHV-I共同给药的非BHV-1免疫原的抗原回忆应答的影响(通过检测IL-2的生成水平来进行评估)，在第23天抽取实施例2研究中所用牛犊的血样。对血样进行稀释然后再加入LkT抗原。随后用ELISA方法测定血样中IL-2 的水平。如图13中的结果所示，与单独给予LkT的牛犊相比，共同给予BHV-I和LkT的牛犊样品中响应回忆抗原的IL-2生成水平被抑制。这些结果表明，BHV-I可以抑制宿主动物针对跟BHV-I共同给药的其它免疫原的回忆应答。
实施例5利用缺失重组构建体在哺乳动物细胞中构建BHV-I缺失变异体利用图14A所示的以及图14中SEQ ID NO 17所示的缺失重组构建体(DRC)来生成BHV-I GL756的UL49. 5突变体，克隆体A1、A5、A7和B8。将增强型绿色荧光蛋白(EGFP) 插入到该构建体从而可以对重组病毒进行分离。将DRC转染到MDBK细胞中，随后用BHV-I GL756感染该细胞。稀释被感染细胞培养物的上清液，然后将其点板到新的MDBK细胞中。 分离呈现绿色荧光的病毒斑，然后利用重组聚合酶链反应(PCR)筛选技术对该病毒斑进行纯化和鉴定。PCR筛选中使用的引物位于缺失/重组位点的两侧。对于突变体而言，其PCR 产物的期望尺寸是2072碱基对(bp)，对于野生型/母代病毒而言，其PCR产物的期望尺寸是657bp。图16示出了 Al和B8突变体的期望式样。使用被感染细胞培养物的裂解物通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)来筛选 BHV-I GL756 Δ UL49. 5 Al 和 Β8，并通过蛋白印迹法(Western blot)来确认目标基因是否删除。UL49. 5基因在原型病毒中表达的蛋白产物的期望尺寸为15kDa。 图18显示，A1、A5、B7和B8克隆体没有表达UL49.5基因的蛋白产物。在此使用模拟感染的细胞作为对照。利用图14B所示的以及图14中SEQ ID NO 18所示的缺失重组构建体(DRC)来生成BHV-I GL756的Us4缺失突变体，克隆体1和2。将EGFP插入到该构建体从而可以对重组病毒进行分离。将DRC转染到MDBK细胞中，随后用BHV-I GL756感染该细胞。稀释被感染细胞培养物的上清液，然后将其点板到新的MDBK细胞中。分离呈现绿色荧光的病毒斑， 然后利用PCR筛选技术对该病毒斑进行纯化和鉴定。PCR筛选使用的引物位于缺失/重组位点的两侧。对于突变体而言，其PCR产物的期望尺寸是2072碱基对(bp)，对于野生型/ 母代病毒而言，其PCR产物的期望尺寸是1757bp。图17示出了 1和2突变体的期望式样。使用被感染细胞培养物的裂解物通过SDS-PAGE来筛选BHV-1 GL75 Δ Us4-1和2， 并通过蛋白印迹法来确认目标基因是否删除。Us4基因在原型病毒中表达的蛋白产物的期望尺寸为40kDa。图19显示，克隆体1和2没有表达Us4基因的蛋白产物。在此使用模拟感染的细胞作为对照。
实施彻丨6用细人工染fM本构律体在Π甫gL云M勿细胞构律BHV-I缺失突夺体在有些研究中，使用细菌人工染色体构建体(BAC)来生成BHV-I突变体。该方法已经记载在Tischer等人，(2006)BioTechniques 20 :191中。该方法通常使用一种重组转移质粒(transfer plasmid)，其含有期望被引入到BHV-I中的突变，该突变体的两侧与野生型的BHV-I序列相连。重组转录质粒含有编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因以及细菌复制起点。将重组的转录质粒转染到MDBK细胞中，随后用BHV-I GL756进行感染。稀释被感染细胞培养物的上清液并将其点板到新的MDBK细胞中。分离呈现出绿色荧光的病毒斑， 然后对病毒斑进行纯化并通过电穿孔方式将其引入到大肠杆菌细胞中。通过限制性内切酶酶切消化和Southern印迹法(Southern blotting)从转化后的大肠杆菌克隆体中筛选出 DNA，从而获得期望的BHV-I突变体。通过Tische等人的文献中所记载的顺势突变方法(en passant mutagenesis)从BHV-1突变克隆体中除去不想要的GFP和细菌复制起点序列。该方法利用红色催化插入法生成一段序列，该段序列会在随后的红色催化(Red-catalyzed) 步骤中与GFP和细菌起点序列一起被切除。将产生的BHV-I克隆体转染到了 MDBK细胞中， 进而获得具有传染性的突变病毒库。通过上述方法得到五种不同的BHV-I突变或修饰的病毒。所有BHV-I突变病毒都是在GL756病毒株原型上进行制备。一种突变的BHV-I病毒含有在UL49. 5基因上进行的修饰。图9的SEQ ID NO 23示出了 UL49. 5突变的DNA序列。图9所示DNA序列中加下划线的核苷酸表示被插入到GL756野生型UL49. 5序列中的核苷酸。所述加下划线的核苷酸在编码序列中增加了两个框内翻译终止密码子。另外一种突变BHV-I病毒的UL41编码序列完全缺失。第三种突变BHV-1病毒同时含有之前已经描述过的UL49. 5和UL41突变。因此，该种BHV-I含有在两个基因上进行的修饰，即UL49. 5和UL41上进行的修饰。图20示出了 UL49. 5和UL41基因区在BHV-I染色体上的位置，同时也示出了前面提到过的修饰。第四种突变BHV-I病毒含有Us4编码序列的部分缺失，并在缺失位置处插入了一段新序列。图6示出了来源于BHV-I Cooper病毒株的Us4基因的DNA序列(SEQ ID N0: 11)和氨基酸序列(SEQ ID N0:12)，其与来源于GL756病毒株的Us4基因的序列相同。图 6DNA序列中加下划线的核苷酸表示BHV-I Us4突变中被删除的核苷酸。删除这些核苷酸会相应地造成如图6所示的氨基酸序列中加下划线氨基酸的缺失。所述缺失是框内缺失。因此，缺失的核苷酸下游所编码的氨基酸序列与野生型的Us4序列的核苷酸编码的氨基酸序列相同。除了这些缺失外，Us4突变基因也可以在前面提到的缺失位置处插入M个核苷酸 (GGATCTGGTAGTGGCTCCGGGAGC ；SEQ ID NO :21)。这M个核苷酸编码的氨基酸序列为Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser (SEQ ID NO :22)。因为这种插入属于框内缺失，所以修饰后的Us4基因所编码的蛋白含有Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser的氨基酸序列，该氨基酸序列替代了图6中SEQ ID NO :12所示的加下划线的氨基酸。图21示出了基因Us4区在 BHV-I染色体中的位置，以及所进行的修饰。第五种突变BHV-I病毒的Circ编码序列完全缺失。图22示出了 Circ基因区在 BHV-I染色体中的位置，以及所进行的修饰。
实施例7含有修饰的BHV-I病毒的牛长为了评估目标基因所含的修饰对BHV-I病毒的生长性能所产生的影响，现使用实施例6中记载的病毒对MDBK细胞进行感染，此后检测各个时间点的病毒滴度。被检测的病毒包括，不包含前面提到过的修饰的病毒(GL756;BHV-1 WT)，在UL49. 5基因位置处有修饰的病毒(BHV-1 AUL49. 5)，在UL41基因位置处有修饰的两个不同的BHV-I克隆体 (BHV-1 AUL41 1606禾口 BHV-1 Δ UL41 1607)，在UL49. 5和UL41基因位置处同时有修饰的两个不同的 BHV-I 克隆体(BHV-1 AUL41/AUL49. 5 :1614 和 BHV-I ΔUL41/Δ UL49. 5 :1616)， 在Circ基因位置处有修饰的病毒(BHV-lACirc 1697)，在Us4基因位置处有修饰的病毒 (BHV-1 AUs4gG :1698)。图23的结果显示，所有被检测的带有修饰的BHV-I病毒与未经修饰的BHV-1病毒具有相似的生长动力学。这些数据说明，针对被测试的基因所进行的修饰并未对病毒的生长性能产生影响。
MHC I类分子在被含有修饰的BHV-I病毒感染i寸的细胞,表面表汰的t灰复情况为了评估含有修饰的BHV-I病毒对MHC I类分子在被感染细胞表面上表达的影响，现使用实施例5所记载的经修饰的BHV-I病毒对MDBK细胞进行感染(图M示出了获得的实验数据)，或者使用实施例6所记载的经修饰的BHV-I病毒对MDBK细胞进行感染(图25-31示出了获得的实验数据)。为了在本实施例的实验中对MHC I类分子的表达进行检测，使用10的感染复数对MDBK细胞进行感染，或者进行模拟感染。在感染后的 16-24小时，使用与MHC 1类分子具有特异性的单克隆抗体PT85A(VMRD，Inc. ；Pullman, Washington, USA)对细胞进行染色。阴性对照细胞使用无反应活性的同型对照抗体 (MM605 ；Dr. Subramaniam Srikumaran ；Washington State University)进行染色。一级抗体用 Zenon Mouse IgG Labeling Kits (Molecular Probes, Invitrogen Detection Technologies, Carlsbad, California, USA)进行标记，或者使用荧光标记的二级抗体。然后通过流式细胞仪检测细胞的表面荧光。图M的结果显示，与被UL49. 5基因位置处不含有修饰的BHV-I (BHV-1 GL756)进行感染后的细胞相比，被BHV-I Δ UL49. 5 Al或Β8 (如实施例5中所记载的)感染的细胞表面具有部分逆转或恢复的MHC I类分子表达。图25的结果显示，与使用不含有修饰的 BHV-1 (BHV-1 GL756)进行感染后的细胞相比，被同时在UL49. 5和UL41基因都含有修饰的 BHV-1GL756AUL41-AUL49. 5(如实施例6所记载)感染的细胞在其细胞表面完全逆转或恢复了 MHC I类分子的表达。这些数据说明含有这些修饰的BHV-I病毒没有引起MHC I类分子表达的下调，或者至少没有达到未经修饰的BHV-I病毒所引起的MHC I类分子下调的程度。附图沈中的数据显示，与使用不包含修饰的BHV-I GL756进行感染的细胞相比， 使用在UL49. 5有修饰的BHV-I GL756AUL49. 5感染的细胞(如实施例6所记载)，以及使用在UL41有修饰的GL756AUL41感染的细胞(如实施例6所记载)部分逆转或恢复了 MHC I类分子在被感染细胞表面上的表达。这些数据也显示了，与使用不含有修饰的 BHV-I GL756进行感染后的细胞相比，使用同时在UL49. 5和UL41基因都含有修饰的BHV-I GL756AUL49. 5-AUL41感染的细胞完全逆转或恢复了 MHC I类分子在被感染细胞表面上的表达。除了使用流式细胞仪对MHC I类分子的细胞表面表达进行分析外，本发明还从前面所述的被感染细胞中制备获得了细胞裂解物，并使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹法(Western Bloting)来对细胞裂解物进行分析，所述蛋白印迹法中使用了可以与MHC I类分子反应的抗体。附图27(顶部)示出了被感染细胞的分析结果，用于感染细胞的病毒包括不含有修饰的BHV-I病毒(GL756)，含有在UL49.5 上修饰的BHV-I病毒(GL756 Δ UL49. 5)，含有在UL41上修饰的两个BHV-I病毒克隆体 (GL756 AUL41)，同时含有在UL49. 5和UL41上修饰的两个BHV-I病毒克隆体(GL756 Δ UL49. 5- Δ UL41)，含有在Circ上修饰的BHV-I病毒(GL756 Δ Circ)，以及含有在Us4上修饰的BHV-I病毒(GL756 Δ Us4)。这些病毒都是实施例6中所记载的BHV-I病毒突变体。 附图27示出了蛋白印迹法分析获得的光密度定量数据。附图27中的数据显示，与不含有修饰的BHV-I病毒相比，就在单个基因上有修饰的BHV-I病毒组而言，在UL41上有修饰的BHV-I病毒对MHC I类分子表达具有最大的恢复效果(也就是具有最小的抑制作用)。这些数据也显示了，与不含有修饰的BHV-I病毒相比，含有在UL49. 5和UL41都有修饰的BHV-I病毒完全恢复了 MHC I类分子的表达(没有抑制作用)。这些数据还显示了，与模拟感染的细胞相比，含有GL756 AUL49.5-AUL41修饰的BHV-I病毒甚至增强了 MHC I类分子的表达。
实施例9 BHV-I下调了 MHC II类分子在被感染细胞上的表达，含有修饰的BHV-I病毒恢复了 MHC II分子的表达为了评估BHV-I病毒和含有修饰的BHV-I病毒对MHC II类分子在被感染细胞表面上表达的影响，现使用实施例6中所记载的修饰的BHV-I病毒来对MDBK细胞进行感染。 使用0. 1的感染复数对MDBK细胞进行感染，或者进行模拟感染，并在4°C下孵化30分钟，然后在37°C下继续孵化1小时，最后进行IFN-Y处理。感染72小时后，使用与MHC II类分子具有特异性的单克隆抗体CAT82A(VMRD)对细胞进行染色。CAT82A抗体用Zenon. Mouse IgG Labeling Kits(Molecular Probes,Invitrogen Detection Technologies,Carlsbad, California,USA)进行标记，或者使用荧光标记的二级抗体。阴性对照的细胞未经过染色。 然后通过流式细胞仪检测细胞的荧光。附图观中的数据示出了 MHC II类分子在被病毒感染的细胞上的表达相对于在模拟感染的细胞中的表达(模拟感染的细胞表示为100%表达)的情况。附图四中的数据显示了，与使用不含有修饰基因的病毒进行感染的细胞相比，MHC II类分子在被含有修饰的病毒感染的细胞中表达的恢复百分比(假定MHC II类分子在感染了 BHV-I GL756的细胞内的表达水平为0 ；在模拟感染细胞的表达水平为100% )。这些数据表明，不含修饰的BHV-I 病毒抑制了 MHC II类分子在被感染细胞表面上的表达。这些数据还显示，与未经修饰或野生型的BHV-I病毒相比，在UL49. 4上有修饰的BHV-I病毒和在UL41上有修饰的BHV-I病毒部分恢复了 MHC II类分子的表达(没有明显的抑制反应)。这些数据还显示，同时含有 UL49. 5和UL4修饰的BHV-I病毒对MHC II类分子在被感染细胞表面上的表达所产生的抑制作用要低于只含有单个基因修饰的BHV-I病毒(也就是说，要比只含有单个修饰基因的 BHV-I病毒具有更好的MHC II类分子表达恢复能力)。
t施彻丨10含有修饰的BHV-I病毒t灰复禾时是高了牛ft体内与共同给药它免,疮原H 有特异件的IgG中IgGl/IgG2亚型的比例实施例3和图12中的数据表明，与单独给予免疫原诱导的IgG中IgGl/IgG2比例相比较，BHV-I会降低与其同时给药的其它免疫原具有特异性的IgG中IgGl/IgG2亚型的比例。为了评估含有修饰的BHV-I病毒对与其同时给药的免疫原所诱导的IgG中IgGl/ IgG2亚型比例所产生的影响，现使用BHV-I血清阴性的3-6月龄牛犊(Hereford-Angus 或者Holstein-Dairy cross)来进行试验。用ELISA测定，这些牛犊也都只具有最小量的LkT滴度。通过颈部皮下给药的方式给予它们以下组单独给予来自溶血性曼氏杆菌的重组LkT (IOOyg分散在2ml含有Emulsigen D佐剂的体系中)，LkT和BHV-1 GL756 (将近IO5 5BHV-I GL756菌株分散在2ml的体系中)，LkT和同时含有UL49. 5和UL41修饰的BHV-I (如实施例6所记载的GL756 Δ UL49. 5- Δ UL41)，或者LkT和含有Us4修饰的 BHV-I (如实施例6所记载的GL756 Δ Us4)。在第0天，在间隔5cm的部位同时给予BHV-I或者修饰的BHV-I以及LkT。在第21天，再次单独给予牛犊LkT (没有病毒)。在第14、21、观和35天分别抽取血液并收集血清。使用ELISA板测定每个时间点血清所含的可以与LkT 反应的IgGl和IgG2血清抗体，该ELISA板使用LkT和IgG亚型特异性的抗体来进行包被。附图30中的结果显示，与单独给予LkT所产生的与LkT特异性的IgGl/IgG2的比例相比，同时给予野生型BHV-I (GL756)和LkT降低了 LkT特异性的IgGl/IgG2的比例(见第洲天和第35天时间点的结果)。这些结果与实施例3中所讨论的以及实施例12中所显示的结果相同。附图30中的结果还显示，当LkT与同时含有UL49. 5和UL41上修饰的BHV-I 病毒同时给药时，或者与含有Us4上修饰的BHV-I病毒一起给药时，没有观察到IgGl/IgG2 比例的下降。这些数据还显示，与同时给予LkT和野生型的BHV-I后所观察到的LkT特异性的IgGl/IgG2比例下降情况相反(与单独给予LkT相比)，同时给予LkT以及两种修饰的BHV-I病毒中的一种后所观察到的LkT特异性的IgGl/IgG2的比例得到了提高(要高于单独给予LkT后所观察到的IgGl/IgG2比例)。这些数据表明，修饰的BHV-I病毒可以逆转IgGl/IgG2比例的下降，IgGl和IgG2是与跟野生型的BHV-I共同给药的其它免疫原具有特异性的抗体。这些数据还表明，与单独给予免疫原(没有野生型的BHV-1)后产生的 IgGl/IgG2比例相比，修饰的BHV-I病毒甚至可以提高与共同给药的免疫原具有抗体特异性的IgGl/IgG2比例。
^MM η y^mm BHV-I病毒对Φ 体寸共同i合药的其它免疫 的抗ic回忆应答的恢复情况实施例4和附图14中的数据说明，与单独给予免疫原所产生的回忆应答相比， BHV-I会抑制针对与野生型BHV-I共同给药的其它免疫原的回忆应答。为了评估含有修饰的BHV-I病毒对于针对与其共同给药的其它免疫原回忆应答所产生的影响，现使用IL-2的生成水平来进行相关测量，并从实施例10研究中所用的牛犊中抽取其第23天的血样。对血样进行稀释并加入LkT抗原。然后利用ELISA测定样品中IL-2的水平。附图31中的结果显示，通过测定血液中细胞生成的IL-2水平，与同时给予牛犊 LkT和不包含修饰的BHV-I病毒(GL756)相比，当LkT与同时含有UL49. 5和UL41修饰的 BHV-I病毒(如实施例6中所记载的GL756AUL49. 5-UL41)共同给予牛犊时，可以提高抗原回忆。这些数据还显示，当LkT与含有Us4修饰的BHV-I病毒(如实施例6中所记载的 GL756AUs4)同时给予牛犊时，可以进一步增强抗原回忆。本说明书列举了示例性的组合物、方法等，但这些例子不对本申请的保护范围构成任何限制。当然，为了描述本发明中的组合物、方法等之目的，在此不可能列举出所有可能的组合和方法。本发明的其它优化和变化方案对于本领域技术人员而言是显而易见。因此，本发明并不限于说明书和实施例中所描述的内容。因而，本申请包括任何落入本申请范围内的变化和修改。此外，前面的描述并不对本发明的范围构成任何限制。本发明的保护范围取决于所附的权利要求书以及其等同物。本发明说明书或权利要求书中所用的术语 “或”(例如，A或B)是指“A或B或两者”。如果申请人想要表明的是“只有A或B，而不包括两者”则会使用术语“只有A或B，而不包括两者”。因此，术语“或”在本申请包含了同时含有多个元素的情形，而并非排除了同时包含多个元素的情形。
权利要求
1.一种含有对两个或多个基因进行了修饰的牛疱疹病毒1型(BHV-I)，其中所述基因编码的蛋白会抑制被感染宿主的免疫系统，其中所述修饰可以减轻或预防免疫系统受到的抑制。
2.如权利要求1所述的BHV-1，其中所述基因编码的蛋白会引起宿主MHC相关蛋白的下调，或者引起宿主不对BHV-I产生免疫应答。
3.如权利要求1所述的BHV-1，其中所述修饰可以减轻或预防宿主针对其它免疫原的免疫系统抑制。
4.如权利要求3所述的BHV-1，其中所述其它免疫原与BHV-I通过共同给药的方式或者以联合疫苗的形式给予宿主。
5.如权利要求1所述的BHV-1，其中所述修饰的基因参与了一种或多种以下活动MHC I类表达、趋化因子表达、MHC II类表达、潜伏感染和病毒持续感染的发展、潜伏再激活、以及IgG介导的免疫应答的表达。
6.如权利要求1所述的BHV-1，其中所述修饰的基因是一个或多个以下基因UL49.5、 UL41、Us4、Circ、LR-ORF-1、LR-0RF-2、Us9 和 Us8。
7.如权利要求1所述的BHV-I，其中所述修饰的基因是UL49.5和UL41。
8.如权利要求1所述的BHV-1，其中所述的BHV-I原型包括Cooper病毒株或者GL756 病毒株。
9.一种含有BHV-I和其它免疫原的组合物，其中所述BHV-I包含基因的修饰，修饰所针对的基因会抑制宿主对其它免疫原的免疫应答，其中该修饰可以减轻免疫应答的抑制。
10.如权利要求9所述的BHV-1，其中被修饰的基因参与了一种或多种以下活动MHCI 类表达、趋化因子表达、MHC II类表达、潜伏感染和病毒持续感染的发展、潜伏再激活、以及 IgG介导的免疫应答的表达。
11.如权利要求9所述的BHV-1，其中被修饰的基因参与了MHC I类表达和趋化因子表达中的一种。
12.如权利要求9所述的BHV-1，其中修饰的基因是UL49.5、UL41js4、Circ、LR-0RF_l、 LR-0RF-2、Us9 或Us8。
13.如权利要求9所述的BHV-I，其中修饰的基因是UL49.5或UL41。
14.如权利要求9所述的BHV-I，其中修饰的基因是Us40
15.如权利要求9所述的BHV-I，其中修饰的基因是UL49.5，并且所述BHV-I还在UL41 或Us4基因上有修饰。
16.如权利要求9所述的BHV-I，其中BHV-I原型包括Cooper病毒株和GL756病毒株。
17.如权利要求9所述的BHV-1，其中所述其它免疫原包括细菌免疫原、病毒免疫原或寄生虫免疫原。
18.如权利要求9所述的BHV-1，其中所述其它免疫原包括来源于以下组的免疫原牛病毒性腹泻病毒(BVDV) I型、BVDV II型、BVDV III型、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、副流感病毒3型(PI3)、轮状病毒(BRV)、冠状病毒(BCV)、溶血性曼氏杆菌、睡眠嗜组织菌、牛支原体、豕钩端螺旋体种、弧菌种、梭状芽胞杆菌种、多杀性巴氏杆菌、坏死梭杆菌、大肠杆菌 0157:H7、肠道沙门氏菌、牛新孢子虫或者毛滴虫种。
19.如权利要求9所述的BHV-1，其中所述的其它免疫原包括来自溶血性曼氏杆菌的LkT。
20.如权利要求9所述的BHV-1，其中所述的BHV-I是经过修饰的BHV-I活疫苗株。
21.如权利要求9所述的BHV-1，其中所述的BHV-I是灭活病毒。
22.—种诱导宿主免疫应答的方法，包括给予宿主a)不是BHV-I抗原的免疫原(非BHV-I免疫原)；和b)含有基因修饰的BHV-1，修饰所针对的基因所编码的蛋白会抑制宿主对非BHV-I免疫原的免疫应答。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述基因包括UL49.5、UL41js4、Circ、LR-0RF_l、 LR-0RF-2、Us9 或 Us8。
24.如权利要求22所述的方法，其中所述基因包括UL49.5，并且所述BHV-I还在U41 基因处有修饰。
25.如权利要求22所述的方法，其中所述非BHV-I免疫原来源于牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) I型、BVDV II型、BVDV III型、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、副流感病毒3型(PI3)、 轮状病毒(BRV)、冠状病毒(BCV)、溶血性曼氏杆菌、睡眠嗜组织菌、牛支原体、豕钩端螺旋体种、弧菌种、梭状芽胞杆菌种、多杀性巴氏杆菌、坏死梭杆菌、大肠杆菌0157:H7、肠道沙门氏菌、牛新孢子虫或者毛滴虫种。
26.如权利要求22所述的方法，其中所述非BHV-I免疫原和BHV-I通过共同给药方式或者以联合疫苗方式给予宿主。
27.如权利要求22所述的方法，与使用野生型BHV-I或者使用可以通过商业渠道获得的BHV-I疫苗进行感染后所产生的宿主免疫应答进行对比，宿主对所述非BHV-I免疫原的免疫应答得到了提高。
28.如权利要求22所述的方法，相比于野生型的BHV-I或者可以通过商业渠道获得的 BHV-I疫苗株，所述含有修饰的BHV-I减少了 MHC I类表达的下调水平，提高了非BHV-I免疫原具有特异性的IgG中IgGl与IgG2的比例，和/或提高了用非BHV-I免疫原再刺激血细胞后所产生的IL-2的量。
29.—种含有基因修饰的BHV-I在诱导有蹄类宿主对BHV-I和非BHV-I免疫原的免疫应答中的应用，其中所述BHV-I中被修饰的基因所编码的蛋白会抑制被感染的有蹄类动物的免疫应答。
30.如权利要求四所述的应用，其中所述BHV-I含有至少在两个基因上的修饰，所述被修饰的基因所编码的蛋白会抑制被感染的有蹄类宿主的免疫应答。
31.如权利要求四所述的应用，其中所述被修饰的基因是UL49.5和UL41。
32.如权利要求四所述的应用，其中所述基因编码的蛋白参与了一种或多种以下活动MHC I类表达、趋化因子表达、MHC II类表达、潜伏感染或病毒持续感染的发展、潜伏再激活、以及IgG介导的免疫应答的表达。
33.如权利要求四所述的应用，其中所述基因编码的蛋白参与了一种或多种MHCI类表达和趋化因子表达。
34.如权利要求四所述的应用，其中所述修饰的基因是UL49.5、UL41、Us4、Circ, LR-ORF-1、LR-0RF-2、Us9 或 Us8。
35.如权利要求四所述的应用，其中所述修饰的基因是化4。
36.一种含有基因修饰的BHV-I用于制备诱导有蹄类宿主针对BHV-I和非BHV-I免疫原免疫应答的疫苗中的应用，其中所述被修饰的基因所编码的蛋白会抑制被感染的有蹄类动物的免疫应答，其中所述BHV-I和非BHV-I免疫原通过共同给药或者以组合多价疫苗的形式给予有蹄类宿主。
37.如权利要求36所述的应用，其中所述修饰的基因是化4。
38.如权利要求36所述的应用，其中所述修饰的基因是化49.5，并且所述BHV-I还在 UL41处有修饰。
全文摘要
本发明主要涉及治疗或预防牛的疾病。更具体地说，本发明涉及生产和使用经修饰的牛疱疹病毒1型(BHV-1)以及它们在组合物和疫苗中的应用，所述的组合物和疫苗可以保护牛免受BHV-1的感染且不会抑制宿主的免疫应答。在一个实施方式中，本发明涉及修饰的牛疱疹病毒1型与其它免疫原共同给药的应用，它们通过共同给药的方式和/或以联合疫苗的形式给予宿主，本发明还涉及这些疫苗在预防牛疾病方面的应用。在另一个实施方式中，给药组合物中所包含的修饰的BHV-1可以提高宿主针对其它免疫原的免疫应答。
文档编号A61K39/265GK102238961SQ200980148786
公开日2011年11月9日 申请日期2009年10月1日 优先权日2008年10月3日
发明者B·B·考弗, G·拉尤西斯曼, M·N·帕特尔, N·奥斯特莱德, 理查德·哈兰, 里戴维德·奥尔比二世 申请人:康奈尔大学, 诺华公司