专利名称：用于激活线粒体的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于激活线粒体的组合物。
背景技术：
线粒体是一种可在绝大多数真核细胞中发现的细胞器。线粒体具有自己的DNA，即独立于细胞核DNA之外的DNA(mtDNA)。线粒体最重要的作用是生成三磷酸腺苷(ATP)，ATP是细胞内的能量来源。用线粒体基质内产生的NADH和FADH2、通过TCA循环(三羧酸循环)、从电子传递链产生ATP。因此，产生的ATP是用来激活各种需要能量的生物合成和代谢过程。线粒体还可在基质中短暂地储存钙离子，钙离子对于细胞内信号转导非常重要， 并且当需要时又能将钙离子释放到细胞质中。此外，已知线粒体在细胞凋亡、细胞增殖和细胞代谢等活动中起着中央调控作用。线粒体的DNA相对易受到损坏，因为它与细胞核DNA不同，缺乏自身修复机制，且没有保护DNA的组蛋白。众所周知，线粒体DNA的损坏与线粒体疾病的发病密切相关。线粒体功能的退化，会导致细胞活动所需能量来源ATP合成的减少，从而引起各种疾病。壳聚糖应用于不同领域，包括污水处理的絮凝剂、去除重金属的吸附剂、保健食品、离子交换剂和医疗产品。众所周知，这些功能受壳聚糖的分子量和脱乙酰化的影响很大。近来，据报道，甲壳素、壳聚糖及其衍生物具有吸附或排泄体内积累的坏胆固醇的除胆固醇活性，抑制癌细胞增殖的抗癌活性和吸附使血压升高的氯离子、降低氯离子的吸收并将其排出体外的降血压作用。此外，据了解它们能促进有益的肠道菌的增殖和激活细胞。另外，它们还有各种生理活性，包括控制血糖、改善肝功能以及排泄重金属和污染物等等。因此，在生物医药行业人们将其作为有价值的物质进行研究。虽然壳寡糖已广泛应用于保健食品和一般食品，但有关其功能的研究还不够。公开号为2005-0104910的韩国专利公开了壳寡糖在氧化低密度脂蛋白中(oxLDL)，作为凝集素样氧化低密度脂蛋白受体I(LOX-I)基因的抑制物质的功能，可有效预防动脉硬化。公开号为2005-00913M的韩国专利公开了壳寡糖作为PPAR基因表达的抑制物质的功能，PPAR 基因作为脂类代谢的关键因素参与胆固醇的平衡调控和脂肪细胞的分化与合成。
发明内容
技术问题本发明旨在提供一种通过增加线粒体酶的活性和增加线粒体DNA的数量来激活线粒体的组合物。技术方案总体而言，本发明提供了一种含有壳寡糖作为活性成分来激活线粒体的组合物。有益效果
由于本发明用于激活线粒体的组合物可提高线粒体酶的活性和增加线粒体DNA 的数量，所以所述组合物能激活线粒体并增加线粒体的生物合成。因此，所述本发明组合物可有效用于预防或治疗各种与线粒体活性降低有关的疾病，如退化性疾病、帕金森综合症
图1展示了经本发明实施例中的组合物处理后，乙酰化酶1 (SIRTl)活性的测定结果；图2展示了经本发明实施例中的组合物处理后，PPARy辅助活化因子 1 α (PGC1 α )促进剂的活性的测定结果；图3展示了经本发明实施例中的、平均分子量为1155的壳寡糖乳酸盐处理后，线粒体DNA复制数量的统计结果。
具体实施例方式本发明中使用的“壳寡糖”是指壳聚糖水解后获得的一种低分子量多糖。所述“低分子量”可指小于10000的分子量，特别是9000或更小。本发明的壳寡糖，是一种低分子量的多糖，分子量可为700-9000。据报道，壳寡糖比壳聚糖在体内更易被吸收，具有增强免疫、抗氧化(Shon Y， J. Chitin andChitosan，2001，6 :107-110)，抑制癌细胞生长(Nam MY, J. Chitin and Chitosan, 1999,4 :184-188)的活性。此外，据报道壳寡糖具有抑制四氯化碳引起的肝损伤的效果。然而，是否含有一种或多种壳寡糖及其盐作为活性成分的组合物对线粒体的激活具有直接作用是不知道的。本发明的发明人测定了显示壳寡糖对能量代谢促进的指数，且确认了一种或多种壳寡糖及其盐能够激活线粒体。没有特别限制制备壳寡糖的方法。例如，通过分离和纯化甲壳素来制备壳寡糖，即对蟹壳和虾壳等进行粉碎、脱盐、去蛋白和纯化可获得甲壳素，再对甲壳素进行脱乙酰化处理得到壳聚糖，接着再用化学降解或酶降解壳聚糖。特别是可通过酶降解壳聚糖来制备壳寡糖。没有特别限制用于酶降解壳聚糖生成壳寡糖的酶。例如，纤维素酶可以用于酶降解壳聚糖。具体来说，当使用酶降解壳聚糖制备壳寡糖时，可按下述方法进行。向壳聚糖中加入纯净水后，接着加入2-3%的盐酸，将混合物在40-60°C下搅拌制备成固体含量为5-10% 的壳聚糖分散液。完全溶解后，将溶液的PH调节至4-6，加入已溶解于纯净水的纤维素酶作为壳聚糖降解酶。然后，在40-60°C下水解14-20小时，接着在80°C热处理30分钟，进行酶去活、过滤和干燥，即可得到壳寡糖。所述一种或多种壳寡糖及其盐的分子量为700-9000。在此分子量范围内，所述壳寡糖表现出了的激活线粒体的卓越效果。根据纤维素酶加入量，所述分子量会有所变化。当纤维素酶的添加量占壳聚糖量的10%时，可获得分子量为1000，甚至更小的壳寡糖。当纤维素酶的添加量占壳聚糖量的6%时，可获得分子量为1500-2000的壳寡糖。当纤维素酶的添加量占壳聚糖量的3%时，可获得分子量为7000-10000的壳寡糖。因此，可通过改变壳聚糖降解酶添加量来制备分子量为700-9000的壳寡糖。用于激活线粒体的所述组合物(如所述一种或多种壳寡糖及其盐)的活性成分， 例如可提高乙酰化酶1 (SIRTl)的活性，提高PPARy辅助活化因子1 α (PGC1 α )的活性或增加线粒体DNA的复制数量。所述活性成分可以是壳寡糖或其各种盐。所述盐没有被特别限定，但是可以是，例如平均分子量为1巧5的壳寡糖乳酸盐(LM)。如下面实施例证明的，在各种壳寡糖及其盐中，用平均分子量为1巧5的壳寡糖乳酸盐(L24)处理的组，显著提高了 SIRTl和PGCl α的活性，或增加了线粒体DNA的复制数量。SIRTl和PGCl α在线粒体的生物合成中具有十分重要的作用。SIRTl是一种NAD 依赖型脱乙酰酶，具有提高线粒体产量的能力。PGCla是一种90-kDa核蛋白，是一种参与能量代谢的转录共激活因子调控基因。PGCla经SIRTl激活后，可提高参与ATP合成和线粒体生物合成的基因的表达。在这方面，下述实施例证实一种或多种壳寡糖及其盐可显著提高SIRTl和PGCl α的活性。还可通过测定线粒体DNA(mtDNA)的损伤或统计线粒体DNA的复制数量来直接测定线粒体的生物合成程度。如下面实施例证实的，确定了一种或多种壳寡糖及其盐能显著提高线粒体DNA的复制数量。因为本发明所述包括壳寡糖作为活性成分的组合物可激活线粒体，所以可用作预防或治疗与线粒体活性降低有关的各种退化性疾病、脑部疾病、神经系统疾病、心脏病、肝病、肾病、胰腺病或肌肉疾病的组合物。没有特别限制所述退化性疾病，但是可以是，例如退化性关节炎、类风湿性关节炎或骨关节炎。当线粒体活性降低时，由于与炎症相关的因子，如软骨细胞中的环氧合酶 2(C0X-2)表达的增加，可引起这些疾病。没有特别限制所述脑部疾病，但是可以是，例如痴呆、帕金森综合症、中风、发育迟缓、神经精神疾病、偏头疼、自闭症、智障、癫痫或瘫痪。当线粒体活性降低时，由于产生的活性氧造成淀粉样蛋白产量的增加和积累可引起以上这些疾病，淀粉样蛋白产量的增加和积累是引起脑部疾病，特别是痴呆症的主因。没有特别限制精神系统疾病，但是可以是，例如上睑下垂、视神经萎缩、斜视、视网膜色素变性、失明、听力丧失、眼肌麻痹、反射减弱、晕厥、神经性疼痛或自主神经失调。没有特别限制心脏病，但是可以是，例如心脏衰竭或心肌症。当线粒体活性降低时，可引起心脏功能问题的钙离子超载或氧化应激可引起这些疾病。没有特别限制肝病，但是可以是，例如低血糖或肝功能衰竭。没有特别限制肾病，但是可以是，例如肾小管性酸中毒。当线粒体活性降低时，由于线粒体呼吸系统损伤而造成的氧化应激的提高可引起这些疾病。没有特别限制胰腺病，但是可以是，例如胰腺外分泌功能不全或甲状旁腺机能减退。没有特别限制肌肉疾病，但是可以是，例如肠易激综合症、肌痛、肌肉萎缩症、胃食管反流病、低血压、抽搐、运动障碍、便秘或腹泻。当线粒体活性降低时，因ATP减少引起的肌肉运动异常可引起这些疾病。该组合物没有特别限制，但是可以是，例如保健食品组合物或药物组合物。
可将保健食品组合物制成各种形式，包括粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊和饮剂。必要时，所述保健食品组合物可包括一种或多种添加剂。所述添加剂可包括果汁(包括浓缩果汁和粉状果汁)，如葡萄柚汁、苹果汁、橙汁、柠檬汁、菠萝汁、香蕉汁和梨汁等；维生素(包括水溶性和脂溶性维生素)，如维生素A棕榈酸酯、维生素B2、维生素B6、 维生素B12、抗坏血酸钠、烟酰胺、泛酸钙、叶酸、维生素H、维生素D3、重酒石酸胆碱、维生素 E和β-胡萝卜素等；香料，如柠檬香精、橙类香精、草莓香精、葡萄柚香精、香草香精等；氨基酸，核酸及其盐，如谷氨酸、谷氨酸钠、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、天冬氨酸纳、肌苷酸等； 植物纤维，如聚葡萄糖、果胶、黄原胶、葡甘露聚糖、藻酸等；矿物质，如氯化钠、醋酸钠、硫酸镁、氯化钾、氯化镁、碳酸镁、氯化钙、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、甘油磷酸钙、柠檬酸亚铁钠、 柠檬酸铁铵、柠檬酸铁、硫酸锰、硫酸铜、碘化钠、山梨酸钾、锌、锰、铜、碘和钴等。所述药物组合物还可包括药用辅料，如防腐剂、稳定剂、保湿剂、乳化加速剂、控制渗透压的盐、缓冲液等以及其他治疗上有用的物质。所述药物组合物可制成用于口服或肠外给药的各种剂型。口服剂型包括，如片剂、丸剂、硬或软胶囊、液体、悬浮液、乳液、糖浆、颗粒剂或类似的形式。这些剂型除活性成分外，还可包括稀释剂(如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素和甘氨酸)、润滑剂(如硅、滑石粉、硬脂酸或硬脂酸镁或硬脂酸钙及聚乙二醇)。 所述片剂还可包括黏合剂，如硅酸铝镁、淀粉糊、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和聚乙烯吡咯烷。根据不同场合的要求，所述片剂中还可包括药物添加剂，如崩解剂(例如淀粉、琼脂、藻酸或其钠盐)、吸收剂、着色剂、香料、甜味剂及类似的物质。所述片剂可通过普遍采用的混合、制粒和涂层的方法来制备。用于肠外给药的典型剂型包括注射用的等渗水溶液或悬浮液。本领域的技术人员可很容易确定所述活性成分的剂量。所述活性成分的日剂量可根据各种因素改变，这些因素包括疾病的发展和阶段、患者的年龄和身体状况、并发症存在与否等。一般情况下，具有上述重量组成的所述组合物可一天给药一次或两次，剂量为 l-500mg/kg，特别是30-200mg/kg。但是所述给药剂量不以任何形式限制本发明的范围。虽然没有特别限定所述活性成分的含量，但其含量可占所述组合物总重的 10-90wt%。片剂或软胶囊包括的活性成分的含量可为10-60wt%，硬胶囊包括的所述活性成分的含量可为10-90%。
实施例下面将描述实施例和试验。以下实施例和试验仅作说明用途，并非为了限制本发明的范围。通过体外试验分析了一种或多种壳寡糖及其盐对线粒体生物合成的作用。为了研究一种或多种壳寡糖及其盐是否能提高线粒体的生物合成，用一种或多种壳寡糖及其盐处理C2C12肌肉细胞，然后测定乙酰化酶1 (SIRTl)和PPARy辅助活化因子1 α (PGC1 α )促进剂的活性以及线粒体DNA(mtDNA)的复制数量。「测试实施例11对SIRTl活性的影响用"SIRT1荧光药物检测试剂盒”(AK-555，Biomol)测定SIRTl的活性。随试剂盒一起提供SIRTl人类重组蛋白、SIRTl底物Fluor de Lys-SIRTl和NAD+。在总反应体
6积50 μ L中，SIRTl蛋白质的使用量为1U，Fluor de Lys-SIRTl和NAD+的底物浓度分别为 50 μ M和100 μ Μ。在500ppm的浓度下处理壳寡糖。在用SIRTl蛋白、所述底物和供测物质处理后，等待45分钟，加入Fluor de Lys Developer II/2mM烟酰胺，在37°C的条件下培育细胞30分钟。在净体积96孔微孔板(Corning Costar)上，用荧光检测器Flexstation 3(EX.360nm，Em.460nm，分子仪器)测定其结果。不使用SIRTl蛋白质时作为空白对照。用 ΙΟΟμΜ白藜芦醇作为阳性对照，用100 μ M烟酰胺作为阴性对照。由表1可知，使用各种壳寡糖及其盐对SIRTl活性的测定，测定结果见图1。由图1可知，绝大多数壳寡糖提高了 SIRTl的活性(约是对照组的1. 5-3倍)。表1
权利要求
1.用于激活线粒体的组合物，包括一种或多种壳寡糖及其盐作为活性成分。
2.根据权力要求1所述的用于激活线粒体的组合物，其特征在于，所述一种或多种壳聚糖及其盐的分子量为700-9000。
3.根据权力要求1所述的用于激活线粒体的组合物，其特征在于，所述一种或多种壳聚糖及其盐包括壳寡糖乳酸盐。
4.根据权力要求1所述的用于激活线粒体的组合物，其特征在于，所述活性成分提高了乙酰化酶I(SIRTl)的活性。
5.根据权力要求1所述的用于激活线粒体的组合物，其特征在于，所述活性成分提高了 PPARy辅助活化因子1 α (PGC1 α )的活性。
6.根据权力要求1所述的用于激活线粒体的组合物，其特征在于，所述活性成分增加了线粒体DNA的复制数量。
7.根据权力要求1所述的用于激活线粒体的组合物，其特征在于，所述组合物是一种用于预防或治疗退化性疾病、脑部疾病、神经系统疾病、心脏病、肝病、肾病、胰腺病或肌肉疾病的组合物。
8.根据权力要求1所述的用于激活线粒体的组合物，其特征在于，所述组合物是一种用于预防或治疗退化性关节炎、类风湿性关节炎或骨关节炎的组合物。
9.根据权力要求1所述的用于激活线粒体的组合物，其特征在于，所述组合物是一种用于预防或治疗痴呆、帕金森综合症、中风、发育迟缓、神经精神疾病、偏头疼、自闭症、智障、癫痫或瘫痪的组合物。
10.根据权力要求1所述的用于激活线粒体的组合物，其特征在于，所述组合物是一种用于预防或治疗上睑下垂、视神经萎缩、斜视、视网膜色素变性、失明、听力丧失、眼肌麻痹、 反射减弱、晕厥、神经性疼痛或自主神经失调的组合物。
11.根据权力要求1所述的用于激活线粒体的组合物，其特征在于，所述组合物是一种用于预防或治疗心脏衰竭或心肌症的组合物。
12.根据权力要求1所述的用于激活线粒体的组合物，其特征在于，所述组合物是一种用于预防或治疗低血糖或肝功能衰竭的组合物。
13.根据权力要求1所述的用于激活线粒体的组合物，其特征在于，所述组合物是一种用于预防或治疗肾小管性酸中毒的组合物。
14.根据权力要求1所述的用于激活线粒体的组合物，其特征在于，所述组合物是一种用于预防或治疗胰腺外分泌功能不全或甲状旁腺机能减退的组合物。
15.根据权力要求1所述的用于激活线粒体的组合物，其特征在于，所述组合物是一种用于预防或治疗肠易激综合症、肌痛、肌肉萎缩症、胃食管反流病、低血压、抽搐、运动障碍、 便秘或腹泻的组合物。
16.根据权力要求1所述的用于激活线粒体的组合物，其特征在于所述组合物是保健食品组合物或药物组合物。
17.根据权力要求1所述的用于激活线粒体的组合物，其特征在于，所述活性成分的含量占所述组合物总重量的10-90wt%。
全文摘要
本发明涉及一种用于激活线粒体的组合物，该组合物含有壳寡糖作为活性成分。所述壳寡糖可增加线粒体酶的活性和线粒体DNA的数量，这样它可用于激活线粒体的组合物中的活性成分。
文档编号A61P25/28GK102292090SQ200980155348
公开日2011年12月21日 申请日期2009年11月27日 优先权日2008年11月28日
发明者孙钟熙, 宋旻庭, 徐大方, 曺始永, 申宜锡, 金完起 申请人:株式会社爱茉莉太平洋