专利名称：用于诱导抗金黄色葡萄球菌的保护性免疫应答的多肽的制作方法
用于诱导抗金黄色葡萄球菌的保护性免疫应答的多肽相关申请的交叉引用
本申请要求2008年11月沈日提交的美国临时申请No. 61/200, 308的权益，该申请通过引用并入本文。
背景技术：
金黄色葡萄球菌("S. aureus")是负责许多疾病和状况的细菌病原体。尽管金黄色葡萄球菌通常在健康人的鼻和皮肤中建群，通常仅仅导致较小的感染(如丘疹、疖)，但它也能导致全身感染。由金黄色葡萄球菌导致的疾病和状况的实例包括菌血症、感染性心内膜炎、毛囊炎、疖、痈、脓疱病、大疱性脓疱病、蜂窝织炎、botryomyosis、毒性休克综合征、烫伤皮肤综合征、中枢神经系统感染、感染性和炎性眼病、骨髓炎以及关节和骨的其它感染，以及呼吸道感染{The Staphylococci in Human Disease, Crossley and Archer (eds.), Churchill Livingstone Inc. 1997 ； Archer, 1998, Clin. Infect. Dis. 26:1179-1181)。通常，粘膜和表皮屏障提供抗金黄色葡萄球菌感染的保护；但是，由于损伤(如烧伤、创伤或手术程序)导致的这些天然屏障的打断和损害免疫系统的疾病(如糖尿病、末期肾疾病、癌症)都显著增加感染的风险。机会性金黄色葡萄球菌感染可以变得非常严重，通常导致严重的发病率或死亡率。在20世纪60年代引入的甲氧苯青霉素很大程度克服了金黄色葡萄球菌的青霉素抗性的问题。但是，在金黄色葡萄球菌中出现了甲氧苯青霉素抗性，以及对很多有效抗该生物的其它抗生素(如氨基糖苷类、四环素、氯霉素、大环内酯类和林可胺类(Lincosamides)) 的抗性。甲氧苯青霉素抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)成为世界范围内最重要的医源性病原体之一，并且具有严重感染控制问题。可以采用基于免疫学的策略来控制金黄色葡萄球菌感染和金黄色葡萄球菌的传播。基于免疫学的策略包括被动和主动免疫。被动免疫采用靶定金黄色葡萄球菌的免疫球蛋白。主动免疫诱导抗金黄色葡萄球菌的免疫应答。潜在的金黄色葡萄球菌疫苗靶定金黄色葡萄球菌多糖和多肽。可以用作可能的疫苗成分的多糖的实例包括金黄色葡萄球菌5型和8型荚膜多糖(Shinefield et al., 2002，N. Eng. J. Med. 346:491-496)。可以用作可能的疫苗成分的多肽的实例包括胶原蛋白粘附素、纤维蛋白原结合蛋白和聚集因子(Mamo et al. , 1994，FEMS Immunol. Med. Mic. 10:47-54; Nilsson et al., 1998，J. Clin. Invest. 101:2640-2649; Josefsson et al. , 2001，J. Infect. Dis. 184:1572-1580)。已经从金黄色葡萄球菌基因组测序获得了关于金黄色葡萄球菌多肽序列的信息(Kuroda et al. , 2001，Lancet 357:1225-1240; Baba et al.，2000，Lancet 359:1819-1827; Kunsch et al. , European Patent Publication EP 0 786 519， published July 30，1997)。在某种程度上，已经采用了生物信息学，从而尝试表征从基因组测序获得的多肽序列(参见，例如上文引用的EP 0 786 519)。已经使用了诸如涉及展示技术和来自受感染患者的血清的那些技术，从而尝试帮助鉴定编码潜在抗原的基因(例如，参见2001年12月27日公开的lister等人的PCT 国际公开号WO 01/98499; 2002年8月1日公开的Meinke等人的PCT国际公开号WO 02/059148; Etz et al.，2002，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6573—6578)。发明概述
本发明公开了包含与SEQ ID NO :1结构上相关的氨基酸序列的多肽，以及这种多肽在生产药物组合物中的用途，所述组合物提供抗金黄色葡萄球菌感染的保护性免疫应答。 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列代表在本文中称作SAC0L0912的金黄色葡萄球菌抗原的全长蛋白序列。发现具有SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列、含有NH2-末端组氨酸标记物 ("his-tag")的SEQ ID NO: 1的衍生物在金黄色葡萄球菌感染的动物模型中产生抗金黄色葡萄球菌的保护性免疫应答。本发明描述了包含一种氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列具有对SEQ ID NO: 1 所示氨基酸序列的最多八个(8个)氨基酸改变。在一个实施方案中，所述多肽免疫原不由 SEQ ID NO: 1和/或SEQ ID N0: 6组成。所述多肽可以用作免疫原，其中提及“免疫原”， 表示该多肽提供抗金黄色葡萄球菌的保护性免疫的能力，所述金黄色葡萄球菌包括但不限于表达SEQ ID NO: 1的金黄色葡萄球菌菌株。当在本文描述的多肽、免疫原和/或治疗方法的上下文中使用时，提及“保护性” 免疫或免疫应答表示可检测水平的抗金黄色葡萄球菌感染的保护作用。这包括降低金黄色葡萄球菌感染或获得由所述感染导致的病症的可能性，以及降低感染和/或由所述感染导致的病症的严重程度的治疗和/或预防措施。因此，保护性免疫应答包括，例如，降低细菌负荷、改善与所述细菌感染相关的一种或多种病症或症状，和/或延迟由金黄色葡萄球菌感染导致的疾病进展的开始的能力。可以用动物模型，如本文描述的那些动物模型来评估保护作用水平。例如，本文描述的某些多肽在鼠、致死攻击模型和大鼠、留置导管、亚致死攻击模型中都提供了保护作用。“病症”是全部或部分由金黄色葡萄球菌感染导致的任何状况。提及包含一种氨基酸序列，所述氨基酸序列具有对SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的最多八个(8个)氨基酸改变，表示存在SEQ ID NO: 1相关区域，并且可能存在或不存在另外的多肽区域。每个氨基酸改变独立地是氨基酸取代、缺失或添加。本发明的另一方面描述了包含SEQ ID NO: 1相关多肽和与该多肽共价连接的一个或多个另外的区域或部分的免疫原，其中每个区域或部分独立地选自具有至少一种以下特性的区域或部分增强免疫应答、促进纯化或促进多肽稳定性。在一个实施方案中，SEQ ID NO: 1相关多肽由一种氨基酸序列组成，所述氨基酸序列具有对SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的最多八个(8个)氨基酸改变。在一个另外的实施方案中，包含在该免疫原内的 SEQ ID NO: 1相关多肽提供抗金黄色葡萄球菌的保护性免疫，所述金黄色葡萄球菌包括但不限于表达SEQ ID NO: 1的金黄色葡萄球菌菌株。另外的区域或部分可以是，例如，另外的多肽区域或非肽区域。关于例如多肽提及“纯化的”或“基本上纯化的”，表示所述多肽存在于一种环境中，所述环境中缺乏与所述多肽天然相关和/或代表存在的总蛋白的至少约10%的一种或多种其它多肽。
提及“分离的”，表示与自然中存在的形式不同的形式。所述不同的形式可以是例如，与自然中存在的纯度不同的纯度，和/或自然中不存在的结构。自然中不存在的结构包括例如具有组合在一起的不同区域的重组结构。在本文可互换使用的术语“蛋白”或“多肽，，表示连续的氨基酸序列，并且不提供最小或最大的大小限制。蛋白中存在的一个或多个氨基酸可以含有翻译后修饰，如糖基化或二硫键形成。本发明的另一方面描述了能在患者中诱导抗金黄色葡萄球菌的保护性免疫的组合物。所述组合物包含药学可接受的载体和免疫学有效量的本文描述的多肽或免疫原。所述多肽或免疫原可以提供抗表达SEQ ID NO: 1的多肽的金黄色葡萄球菌菌株的保护性免疫。关于多肽、免疫原或其组合物的术语“免疫学有效量”表示足够的量，其使得当引入患者时产生足够水平的预期的多肽或免疫原，导致抗金黄色葡萄球菌的免疫应答。本领域技术人员认识到该水平可以改变。该量应该足以显著预防金黄色葡萄球菌感染和/或降低金黄色葡萄球菌感染的可能性或严重性。本发明的另一个方面描述了包含重组基因的核酸分子，所述重组基因编码产生抗金黄色葡萄球菌的免疫应答的多肽。重组基因含有重组核酸分子，其中所述核酸分子的所述核苷酸序列编码多肽以及用于适当的转录和加工的调节元件(其可以包括翻译和翻译后元件)。重组基因可以独立于宿主基因组存在，或可以是宿主基因组的部分。所述核酸分子可以是表达载体。优选地，表达载体也含有用于在宿主细胞中自主复制的复制起点、选择标记、有限数目的有用的限制酶位点和高拷贝数目的潜能。术语“核酸”或“核酸分子”是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)。重组核酸分子是其序列和/或形式在自然中不存在的核酸分子。重组核酸分子的实例包括纯化的核酸、组合在一起提供与自然中存在的核酸不同的核酸的两个或更多个核酸区域，以及天然彼此相关的一个或多个核酸区域(例如，上游或下游区域)的缺乏。本文还描述了重组细胞。所述重组细胞包含重组基因，所述重组基因编码提供抗金黄色葡萄球菌的保护性免疫应答的多肽。重组细胞可以用于制备所述重组基因编码的多肽，本文也描述了制备方法。该方法包括使包含编码所述多肽的重组核酸的重组细胞生长， 并且纯化所述多肽。本发明的另一方面描述了提供抗金黄色葡萄球菌的保护性免疫应答的多肽，所述多肽通过包括以下步骤的方法制备在宿主中使含有编码所述多肽的重组核酸分子的重组细胞生长并纯化所述多肽。可以采用不同的宿主细胞。本发明还提供了对患者进行抗金黄色葡萄球菌感染治疗的方法。所述方法包括在患者中诱导抗金黄色葡萄球菌感染的保护性免疫应答。术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性措施这两者。需要治疗的患者包括已经有感染的那些，以及倾向于患感染的那些，或感染可能性正在降低的那些。另外的实施方案包括免疫学有效量的SEQ ID NO: 1相关多肽或其免疫原在制备用于诱导患者中抗金黄色葡萄球菌感染的保护性免疫应答的药物中的用途。除非特定的术语互相排斥，提及“或”，表示之一或两者的可能性。有时，短语例如 “和/或”被用于突出显示之一或两者的可能性。
提及开放式的术语例如“包含”，允许另外的要素或步骤。有时，短语例如“一个或多个”与或不与开放式术语一同使用来突出显示另外的要素或步骤的可能性。除非明确地指出，提及术语例如“一个”、“一种”或“该”，不局限于一，并且包括复数形式，除非上下文明确指出另外的意思。例如，“一个细胞”不排除“多个细胞”。有时，短语例如一个或多个被用于突出显示可能存在复数形式。从本文提供的包括不同实施例的另外的描述，本发明的其它特征和益处是明显的。提供的实施例举例说明了在实施本发明中有用的不同成分和方法。实施例不限制所要求保护的发明。根据本公开内容，本领域技术人员可以鉴定和采用对于实施本发明有用的其它成分和方法。附图简述
图1图解了 SEQ ID NO: 2的氨基酸序列。加下划线的部分代表SEQ ID NO: 1的实质部分，仅仅缺乏SEQ ID NO: 1的起始甲硫氨酸。氨基末端不加下划线的区域是组氨酸标记物区。图2图解了 SEQ ID NO: 1的氨基酸序列。图3图解了编码SEQ ID NO: 2的核酸序列(SEQ ID N0: 3)。编码氨基末端组氨酸标记物的部分加下划线。图4A (实验1)和B (实验2)图解了来自两个攻击实验的结果，所述实验使用羟基磷酸铝佐剂中的SEQ ID N0: 2多肽(实线)或使用单独的佐剂(虚线)。发明详述
下文提供的实施例中用SEQ ID N0: 2举例说明了 SEQ ID NO: 1相关多肽提供抗金黄色葡萄球菌感染的保护性免疫的能力。SEQ ID N0: 2是SEQ ID NO: 1的衍生物，其含有氨基末端组氨酸标记物。该组氨基酸标记物促进多肽纯化和鉴定。与SEQ ID NO: 1结构上相关的多肽包括这样的多肽其含有存在于不同金黄色葡萄球菌菌株中的对应区域和天然存在的区域的衍生物。SEQ ID NO: 1的氨基酸序列图解于图2中。图1中图解了 SEQ ID NOs: 1和2所示氨基酸序列之间的关系。I. SAC0L0912 (SEQ ID NO: 1)序列
金黄色葡萄球菌SAC0L0912是保守的、表面表达的蛋白。SAC0L0912具有SEQ ID N0: 1所示的氨基酸序列。该序列在目前已经测序过的13种金黄色葡萄球菌菌株之间是保守的。表1列出了所述13种金黄色葡萄球菌菌株、它们的对应NCBI GenBank登记号(修订版本和最初的提交编号)，以及每种基因组序列的提交者。表 1
权利要求
1.包含一种氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列具有对SEQID NO: 1所示氨基酸序列的最多8个氨基酸改变，其中所述多肽不是SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 6，并且其中所述多肽提供抗金黄色葡萄球菌的保护性免疫。
2.权利要求1的多肽，其中所述多肽包含SEQID NO: 1的选自氨基酸5_60、氨基酸 9-64、氨基酸1-56、氨基酸4-59、氨基酸8_63、氨基酸2_57、氨基酸3_58、氨基酸7_62和氨基酸6-61的部分。
3.权利要求1或权利要求2的多肽，其中所述多肽是基本上纯化的。
4.权利要求1-3的任一项的多肽，其中所述多肽提供抗表达SEQID NO: 1的金黄色葡萄球菌菌株的保护性免疫。
5.免疫原，其包含由一种氨基酸序列组成的多肽和与所述氨基酸序列共价连接的一个或多个另外的区域或部分，所述氨基酸序列具有对SEQ ID NO: 1的最多8个氨基酸改变， 其中每个区域或部分独立地选自具有至少一种以下特性的区域或部分增强免疫应答、促进纯化或促进多肽稳定性。
6.权利要求5的免疫原，其中所述多肽提供抗表达SEQID NO: 1的金黄色葡萄球菌菌株的保护性免疫。
7.能够在患者中诱导抗金黄色葡萄球菌感染的保护性免疫应答的组合物，该组合物包含免疫学有效量的(a)权利要求1-4的任一项的多肽；或，(b)权利要求5或权利要求6的免疫原；和药学可接受的载体。
8.能在患者中诱导抗金黄色葡萄球菌感染的保护性免疫应答的组合物，所述组合物包含免疫学有效量的包含一种氨基酸序列的多肽和药学可接受的载体，所述氨基酸序列具有对SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的最多8个氨基酸改变，其中所述多肽不由SEQ ID NO: 1 所示的氨基酸序列组成。
9.权利要求8的组合物，其中所述组合物提供抗表达SEQID NO: 1的金黄色葡萄球菌菌株的保护性免疫。
10.权利要求7-9的任一项的组合物，其中所述组合物进一步包含佐剂。
11.包含重组基因的核酸分子，所述重组基因包含编码权利要求1-4的任一项的多肽的核苷酸序列。
12.权利要求11的核酸分子，其中所述核酸分子是表达载体。
13.包含重组基因的重组细胞，所述重组基因包含编码权利要求1-4的任一项的多肽的核苷酸序列。
14.制备多肽免疫原的方法，该方法包括以下步骤(a)使权利要求13的重组细胞在表达所述多肽的条件下生长；和(b)纯化所述多肽。
15.在患者中诱导抗金黄色葡萄球菌感染的保护性免疫应答的方法，该方法包括给所述患者施用免疫学有效量的一种或多种以下物质的步骤(a)权利要求1-4的任一项的多肽；(b)权利要求5或权利要求6的免疫原；(c)具有SEQID NO: 1所示氨基酸序列的多肽；(d)具有SEQID NO: 6所示氨基酸序列的多肽；或，(e)权利要求7-10的任一项的组合物。
16.权利要求15的方法，其中所述患者是人。
17.免疫学有效量的一种或多种以下物质在制备用于在患者中诱导抗金黄色葡萄球菌感染的保护性免疫应答的药物中的用途(a)权利要求1-4的任一项的多肽；(b)权利要求5或权利要求6的免疫原；(c)具有SEQID NO: 1所示氨基酸序列的多肽；(d)具有SEQID NO: 6所示氨基酸序列的多肽；或，(e)权利要求7-10的任一项的组合物。
18.权利要求17的用途，其中所述药物提供抗表达SEQID NO: 1的金黄色葡萄球菌菌株的保护性免疫。
19.权利要求17或18的用途，其中所述患者是人。
全文摘要
本发明公开了包含与SEQIDNO1结构上相关的氨基酸序列的多肽，以及这种多肽和其组合物的用途。SEQIDNO:1是全长金黄色葡萄球菌序列。发现含有氨基末端组氨酸标记物的SEQIDNO:1的衍生物产生抗金黄色葡萄球菌的保护性免疫应答。
文档编号A61K39/40GK102292104SQ200980155350
公开日2011年12月21日 申请日期2009年11月18日 优先权日2008年11月26日
发明者D. 科普 L., D. 舒尔茨 L., A. 米勒 M., B. 麦尼利 T., 王心民 申请人:默沙东公司