专利名称：一种治疗和/或预防病毒感染的药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗和/或预防病毒感染的药物。具体是涉及一个治疗和/或预防病毒感染新型蛋白质药物和佐剂，因此本发明属于生物制品领域。
背景技术：
流行性感冒(简称流感)是由流感病 毒(influenza virus)引起的急性呼吸道传染病。流感给人类的卫生健康带来了巨大的灾难，曾经引起人类历史上4次流感大流行，死亡人数达几千万。近年来在一些国家和地区引来每年小规模的流感流行，全世界每年有9% 的人群感染流感病毒。目前流感的防治尚无特别有效的方法，接种流感疫苗被认为是预防流感发生与传播的最佳方法，流感病毒灭活疫苗是预防流感商品化疫苗。裂解型流感灭恬疫苗是建立在流感全病毒灭活疫苗的基础上，通过选择适当的裂解剂和裂解条件裂解流感病毒，去除病毒核酸和大分子蛋白，保留抗原有效成分HA和NA以及部分M蛋白和NP蛋白，经过不同的生产工艺去除裂解剂和纯化有效抗原成分制备而成。虽然流感疫苗起到了一定的保护作用，但是流感病毒主要通过呼吸道传播，亚型较多，常常伴有变异引起抗原性漂移和抗原性转变；疫苗只对同型病毒感染有效，对异型病毒感染效果较差，这对流感的预防带来了巨大的困难。针对流感病毒灭活疫苗的不足，研究者主要致力于新型疫苗的研究和开发，向疫苗制剂中应用佐剂，可增强较弱免疫原的免疫原性；可减少提供保护性免疫所需的抗原或接种次数；提高疫苗在免疫应答减弱者中的效力及优化免疫应答，可以改变免疫反应类型； 增强粘膜免疫反应；所以选择良好的免疫佐剂，来提高现有流感病毒灭活疫苗的免疫原性。获得性免疫缺陷综合征(Acquired Immunodeficiency Syndrome)简称艾滋病 (AIDS)，已成为危害全球的一种严重传染性疾病。AIDS是由HIV病毒进入机体后，破坏机体 ⑶4+T细胞所产生的免疫缺陷性疾病。编码HIV逆转录病毒蛋白的基因主要有三种Εην、 Pol、Gag。Pol和Gag主要编码病毒的核内蛋白和逆转录酶蛋白，而Env基因主要编码其病毒膜表面的蛋白，并且中和抗体的表位基本都在Env基因上。目前尚无有效的疫苗和药物用于预防和清除感染的HIV病毒。DNA疫苗作为新兴的疫苗，有着传统疫苗无法代替等诸多优点，国内外也将DNA疫苗看作攻克艾滋病的关键技术之一，但目前制约DNA疫苗发展的最大问题是免疫原性不强，国际上公认的评价防治HIV病毒感染的重要途径之一是如何有效的调动细胞免疫反应，尤其是要激发高水平的HIV专一性CD8阳性CTL细胞活性，并分泌高水平的Y —干扰素等有效免疫组分。因此找到有效的佐剂来增强DNA疫苗的效果迫在眉睫。乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒引起的、通过血液与体液传播的、以肝脏损害为主的传染病，是一个严重的公共卫生问题，对人类健康的威胁很大。感染乙型肝炎后，部分患者将发展成为慢性持续性感染状态，有的可能演变为肝硬变或原发性肝细胞癌。我国是乙型肝炎病毒感染高流行区，每年约有35万人死于与乙肝相关的疾病(如肝硬化、肝癌等)。其中，人群感染率为60%，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)人群携带率为10%。目前，据估计，全世界共有3亿HBsAg携带者，而我国就占其中的三分之一，乙型肝炎传播已成为影响人口素质的重要问题。乙型肝炎疫苗的研制先后经历了血源性疫苗和基因工程疫苗阶段，目前基因工程乙肝疫苗技术已相当成熟，乙肝疫苗的发展与应用，将对乙型肝炎的预防和控制起重要作用。目前，乙肝有效的免疫治疗手段应是基于激发病毒携带者体内的免疫系统。国际上公认的评价治疗性乙肝疫苗的指标是抗原专一性的细胞免疫反应，尤其是要激发高水平的乙肝专一性CD8阳性CTL细胞活性，并分泌高水平的γ —干扰素等有效免疫组分。
目前，提高疫苗细胞免疫反应的佐剂在临床应用的几乎没有，而现用佐剂如，鋁盐佐剂，油佐剂和SF59佐剂均为以提高抗体水平为主的佐剂，所以，临床上急需以增强细胞免疫反应，尤其是增强CD8T细胞免疫反应的佐剂。
发明内容
白介素17(interleukin-17，IL-17，IL-17A)是近年倍受关注的一种细胞因子。 IL-17主要由T细胞亚群中的Thl7细胞所分泌，Thl7是一种重要的免疫调节细胞，依赖 11^-23产生仏-17，而不产生0^-^或者细胞因子分泌特征。经研究发现，与自身免疫性反应炎症有关。IL-17，最初被命名为细胞毒T淋巴细胞抗原8 (CTLA-8)，有较高的同源性，是T 细胞来源细胞因子。其mRNA中富含AU序列，不稳定、易降解，故该基因的表达受到严格的调控并可能主要在翻译的起始环节。该家族包括6个成员。6个家族成员的配体(IL-17A F)和 5 个受体(IL-17RA IL-17RD 和 SEF)。白介素17A由Thl7细胞分泌产生，其生物学作用不十分清楚，但过多产生白介素 17A与慢性炎症及免疫病理状态有关。白介素17A最早被发现可以诱导成纤维细胞和类风湿关节炎患者的滑膜细胞产生白介素6。很多细胞都表达白介素17A受体，这些受体介导的信号通路可诱导靶细胞产生炎性因子，如白介素6、白介素1、肿瘤坏死因子、白介素8和基质金属蛋白酶。白介素17A通过诱导产生基质蛋白酶能够破坏细胞外基质，引起骨质吸收。在骨骼，白介素17刺激成骨细胞表达核因子B受体活化因子配体。这样的成骨细胞能够激活表面表达核因子B受体活化因子的破骨细胞。Thl7细胞同样表达RANKL，但不能通过RANKL 和RANK相互作用激活破骨细胞，而是通过分泌白介素17，诱导诸如成骨细胞的RANKL等生物学效应来激活破骨细胞。通过RANKL和RANK系统，白介素17在类风湿关节炎、牙周病及假肢松动中起重要作用。在类风湿关节炎患者中，滑膜细胞产生的肿瘤坏死因子、白介素1 和白介素17对关节破坏有预测价值。除了类风湿关节炎，Thl7细胞还参与了银屑病、多发性硬化及炎性肠病的发病过程。遗传学研究发现，白介素23受体基因的某些特定变异(白介素23主要参与维持Thl7 细胞的存活及增殖)与克罗恩病、银屑病及银屑病关节炎的易感性增高有关。所以，目前的知识认为，白介素17A是引起自身免疫性疾病的重要因素之一。关于白介素17A与病毒感染的关系，以及白介素17A作为炎症促进因子的作用机制，认为主要是通过能够募集中性粒细胞，促进纤维细胞分泌IL6和TNF-α来发挥作用。但是白介素17Α是否影响其它淋巴细胞产生抗病毒感染保护作用，以及作为疫苗佐剂产生正向的免疫反应，目前国际国内都没有报道。但由 于本领域对于白介素17A传统的技术偏见和研究不彻底，在本发明人在长期的研究工作中，发现白介素17A本身具有很强的抗病毒感染作用，而且还可以作为疫苗佐剂用于抗病毒疫苗的效果的提高。因此，本发明第一个目的是提供一种能用于制备治疗和 /或预防病毒的药物，以及他作为疫苗的新型佐剂。在一个实施方案中，所叙述的治疗和/或预防病毒的药物是白介素17A蛋白质，是通过基因工程技术将白介素17A基因在大肠杆菌或酵母系统中进行表达出蛋白质，提取纯化后直接应用与人体和动物。在另一个实施方案中，所述的白介素17A可作为核酸疫苗佐剂配合使用，疫苗是人用或兽用疫苗。在第3个方案中，所述的白介素17A可作为蛋白质和多肽疫苗佐剂配合使用，疫苗是人用或兽用疫苗。本发明第二个目的是提供一种用于治疗和/或预防病毒的药物可通过注射、喷雾、滴鼻等方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织，或是被其他物质混合或包裹后导入机体而产生抗病毒作用。本发明第二个目的是提供一种用于治疗和/或预防病毒疫苗新型复合物，包含病毒疫苗和白介素17A为佐剂。在第一个实施方案中，所述的治疗和/或预防病毒的药物是基因重组白介素17; 在第二个实施方案中，所述的疫苗是艾滋病DNA疫苗；在第三个实施方案中，所述的重组亚单位乙肝疫苗。上述白介素17可基因克隆重组表达后得到，也可以从生产厂家购买，如美国R&D 系统公司等。在一个具体实施方案中，所述的治疗和/或预防病毒的药物的用量一般为 5-50ug/kg体重/次，每3-10天给药一次，一般共需2-6次。分别在第-7天和第-2天给小鼠注射0. 1-0. 5ug重组白介素17 (相当于5-50 μ g/ kg体重/次)后，在第0天进行LD50 = 5的流感病毒(H5N1)攻毒后，在第6天检测其病毒在体内含量，在10天评价其死亡率，发现白介素17在0. Iug/只，可以产生67%保护率，在 0. 5ug组达到100 %保护，同时他们的病毒载量与保护率成正比。为能够研究白介素17是否可以促进蛋白质疫苗的免疫反应，我们混合了 0. 5ug的白介素17与5ug的乙肝重组亚单位疫苗，并对小鼠进行了免疫，证明其佐剂主要是作用于 CD8T细胞上；为能够研究白介素17是否可以促进核酸疫苗的免疫反应，我们混合了 0. 5ug 的白介素17A与50ug的艾滋病gpl20核酸疫苗，并对小鼠进行了免疫，证明其佐剂主要也是作用于CD8T细胞上。并进一步利用流式细胞仪检测体内CTL实验表明白介素17能够增强的艾滋病核酸疫苗对体内特异性的CTL反应，此反应主要是通提高高水平的gpl20特异性的⑶8阳性CTL细胞活性，同时促进分泌γ —干扰素和perforin等有效免疫组分而达到的。本发明第三个目的是提供白介素17A用于制备抗病毒疫苗佐剂或疫苗复合物的用途。在一个实施方案中，所述的艾滋病疫苗是艾滋病DNA疫苗。在另一个实施方案中，所述的重组亚单位乙肝疫苗。这些疫苗的范围可以是由于人和动物病毒性感染疾病。本发明第四个目的是提供制备上述药物和疫苗复合物的方法。其中，对于本领域技术人员而言，可以使用常规技术将所述的白介素17A单独配制，例如，将适量的白介素17A溶解在适量的生理盐水或PBS缓冲液中，配置成母液，然后将母液加入适量的生理盐水中，配置成标准溶液(使用时可根据需要再加入生理盐水进行调整浓度)，最后将预制的溶液直接使用与使用者，或者，标准溶液通过常规技术(如冷冻干燥、或冷冻喷雾干燥等技术)制备成干粉制剂或针剂，以备存储。另外一个制备使用方法是将白介素17A作为佐剂与疫苗进行复合制备得到疫苗复合物。例如，将适量的白介素17A溶解在适量的生理盐水中，配置成母液，然后将母液加入适量的生理盐水中，配置成标准溶液(使用时可根据需要再加入生理盐水进行调整浓度)，将制备好的疫苗溶解在标准溶液中，即可得到疫苗复合物。最后将预制的溶液直接使用与使用者，或者，标准溶液通过常规技术(如冷冻干燥、或冷冻喷雾干燥等技术)制备成干粉制剂或针剂，以备存储。应当指出的是，本发明在于提供白介素17A作为一种治疗和/或预防病毒感染药物的用途及其制备方法，但对于本领域技术人员可以理解的是，在具体实施过程中，可以使用现有技术中任何已知不同物种的白介素17A DNA序列和蛋白质序列进行表达和合成，以达到在目标物种最优化的药物效果、配制和给药方法，如人用白介素17A的蛋白质序列与小鼠不同，所以人用药物应使用人白介素17A序列生产。还应当指出的是，本发明在于提供白介素17A作为一种治疗和/或预防病毒感染药物的用途及其制备方法，但对于本领域技术人员可以理解的是，在具体实施过程中，可以使用现有技术中任何已知的配制和给药方法和用于与不同病毒的感染和不同动物种类进行调整和制备，如，针对不同病毒感染，丙肝病毒、EV71病毒，以及动物类病毒感染，如口蹄疫病毒、兰耳病病毒等；同时指出的是，本发明在于提供白介素17A作为疫苗佐剂和用于疫苗复合物的用途及其制备方法，但对于本领域技术人员可以理解的是，在具体实施过程中，可以使用现有技术中任何已知的乙肝疫苗、HPV疫苗、流感疫苗等人用疫苗，以及动物用疫苗，如兰耳病疫苗、口蹄疫疫苗、猪瘟疫苗、高致病性禽流感疫苗等。
，图1为实施例1中pET28a_IL17A质粒的克隆鉴定；图2A&B为实施例1中小鼠和人白介素17A在E. Coli中表达结果；图3为实施例2的小鼠和人白介素17A表达纯化后的诱导细胞产生IL_6的结果；图4为实施例3的定量检测在白介素17A作用下流感病毒攻毒后在体内病毒载量
结果；图5为实施例3的检测在白介素17A作用下流感病毒攻毒后的保护率结果；图6为实施例4的检测在白介素17A作用下对其它白介素的影响；图7为实施例4的检测在白介素17A作用下是哪种淋巴细胞表达干扰素-gamma ；图8为实施例5的检测在白介素17A作用下，分别去除⑶4，⑶8或NK细胞后对流感病毒攻毒后的保护率影响；图9为实施例5的流式细胞仪检测在白介素17A作用下IFN-γ和Perforin在 ⑶8T细胞中的表达结果；图10为实施例6的流式细胞仪检测艾滋病Env核酸疫苗+白介素17A免疫后，对⑶4和⑶8淋巴细胞产生细胞因子影响结果；图11白介素17A影响的CD8+T细胞对艾滋病Env表面抗原肽靶细胞的杀伤活件的检测图12为实施例7白介素17A激活乙肝疫苗⑶8+T细胞影响及其对乙肝表面抗原肽靶细胞的杀伤活性的检测技术效果
1.由实施例3-5可知，相比于现有技术，本发明创造性地发现利用白介素17A单独使用可以有效地抵抗流感病毒的攻击，起到完全保护作用。它与其它白介素相比具有效果好，使用方便，成本低；2.作为疫苗佐剂，可有效地增强疫苗的细胞免疫反应，为疫苗佐剂的研究提供了新的研究方向和热点。3.由实施例6-7可知，本发明的白介素17A佐剂，相比于现有的佐剂，能更有效地激活机体的CD8 T细胞免疫水平，显著增强了免疫效果，为清除病毒提供了很好的办法。4.本发明的治疗和/或预防病毒的药物，不仅使用方便，成本低，安全，而且易于推广，最重要的是克服了因病毒变异带来的疫苗失效等问题。
具体实施例方式下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例1、克隆表达白介素17A由于原核表达系统无法加工剪切白介素17A信号肽，所以在设计引物时，从信号肽下游开始对其进行克隆和表达，所以以下实验全部使用的是无信号肽序列的IL-17A。小鼠的IL-17A表达质粒是从小鼠脾脏提取的RNA经反转录后，从cDNA中克隆 IL-17的基因。PCR产物电泳后回收，与pMDIS-T载体连接，构建成pMD18-T-IL_17然后用限制性内切酶BamH I和Xba I将其双酶切。酶切分析正确的pMD18_T-IL_17进一步测序，测序结果与GeneBank上号码为NM_010552的IL-17A序列比对，完全一致。人的IL-17A cDNA 克隆是利用GeneBank上号码NM_002190的为序列进行全人工合成而得到，人工合成是委托上海生工生化有限公司完成。序列测定结果与公布序列一致。利用酶切位点将T载体的IL-17A克隆到E. Coli表达载体pET28a上，转入大肠杆菌BL21中后提取质粒DNA，在苯酚氯仿溶液中去掉蛋白质，双链DNA经乙醇沉淀而分离出来。利用酶切鉴定证明克隆正确，如图1所示。以上克隆，提取方法和技术的详细描叙可在Sambrook等人的〃 Molecular Cloning"(第二版 1998，Cold Spring Harbor Laboratory Press，纽约)和厉朝龙等编， 《生物化学与分子生物学实验技术》浙江大学出版社查寻。经1. Ommol/L IPTG诱导后，利用超声破碎，离心后沉淀经SDS-PAGE检测目的蛋白 IL-17。图2A证明其小鼠的IL-17可以表达；图2B显示为人的IL-17A表达。实施例2、白介素17A生物活性检测为证明表达的IL-17A是具有生物学活性的，我们利用IL-17可以作为前炎症因子具有刺激先天免疫细胞产生IL-6和TNF- α的作用，因此我们将IL-17在不同浓度(50ng/ ml和100ng/ml)处理RAW264. 7细胞，刺激48小时后，检测IL-6的分泌水平，如图3所示，表达的IL-17A能够刺激RAW264. 7细胞分泌11_6，同时这种刺激具有剂量依赖性。实施例3、白介素17A保护动物抵抗流感病毒攻击实验 白介素17A为实验室克隆在pET28a质粒中，经E. Coli表达后经纯化得到。IOOug 白介素17A溶于IOml IOmM的pH7. 0的PBS缓冲液中，得到10ug/ml的溶液。6_8周龄雌性 Balb/c小鼠分为3组，每组15只，另外1组为白介素17A基因敲除Balb/c小鼠(IL-17K0)。 每组小鼠分别注射0ul、10ul或50ul上述白介素17A，间隔6天重复一次，共2_4次。7天后，对每小鼠接种LD50 = 5的H5W流感病毒，在第6天每组取其中3只小鼠肺部进行RNA 提取和实时荧光定量RT-PCR对病毒载量进行分析(图4)，对其余动物每天观察死亡情况 (图5)。结果如图1所示，在未处理组(naive)病毒RNA拷贝数为3. 8 士0. 6，0. Iug白介素 17A处理组为2. 4士0.3，0. 5ug白介素17A处理组为1. 7士0. 25，白介素17A基因敲除小鼠组为4. 3士0. 2。结果如图2所示的小鼠死亡情况可以看出，在未处理组在第13天全部死亡，保护率=0,0. Iug白介素17A处理组保护率=67%,0. 5ug白介素17A处理组保护率= 100%，而白介素17A基因敲除小鼠组比阴性对照组提前3天全部死亡，保护率=O。此实验证明白介素17A具有抵抗流感病毒攻击的保护作用极为重要。实施例4、白介素17A对其它细胞因子的影响为了解白介素17A的作用对其它细胞因子的影响，我们在提取的动物RNA中进一步进行了 RT-PCR，图6中可以发现在白介素17A处理后受到影响的细胞因子主要是gamma 干扰素(IFN-g)。调查表达IFN-g的淋巴细胞为了进一步了解哪一类淋巴细胞在白介素17A作用影响下表达此IFN-g，我们在各组取其淋巴结，进行⑶4、⑶8和NK淋巴细胞分离纯化，并对其进行IFN-g表达检测。如图7所示，表达IFN-g的细胞主要为⑶3+⑶8+T细胞，即常常称为的⑶8T细胞。实施例5、白介素17A作用于⑶8T细胞⑶8T细胞的重要性为了说明此白介素17A诱导的⑶8T细胞在攻毒保护中的重要性，我们进行了进一步的攻毒保护实验，在白介素17A处理动物后，利用抗CD4、抗CD8和抗NK细胞的抗体对这3类细胞分别进行抗体封闭以抑制其功能。从图8看出，当抗CD8抗体将CD8T细胞封闭后，小鼠的死亡时间提前，并在第9天全部死亡，保护率=0，这与图4 中，白介素17A基因敲除小鼠死亡情况相似。说明白介素17A并不直接提供抗病毒攻击，而是通过诱导⑶8T细胞产生IFN-g而起到保护作用。⑶8 T细胞的功能鉴定⑶8T细胞一般为细胞毒细胞(CTL)，其功能之一是通过分泌大量穿孔素(Perforin)杀伤病毒感染的细胞。为了证明白介素17A诱导的CD8 T细胞在不仅表达IFN-g也可以表达Perforin，我们对白介素17A处理的⑶8 T细胞进行了检测。 如图9所示，经白介素17A处理后，⑶8 T细胞表达高水平的IFN-g同时，也表达Perforin， 所以进一步证明了白介素17A诱导的靶细胞为CD8T细胞，提高诱导后的CD8T细胞杀伤流感病毒感染的细胞，从而清除病毒达到保护效果。实施例6、白介素17增强艾滋病核酸疫苗作用的动物实验白介素17为实验室制备和纯化。IOOug白介素17A溶于10ml IOmM的pH7. 0的PBS 缓冲液中，得到10ug/ml的溶液。艾滋病Env蛋白特异性中和抗体表位肽mBl (ENFDMWKNDM)、 mB2 (QKVYALFYRLD)、mB3 (PNNNTRKSIRIGPGQTFYAT)，特异性 CTL 表位肽 mCTLl (WYIKIFIMI)、mCTL2 (RYLKDQQLL)、mCTL3/Th (TSAITQACPKVSFDPIPIHYCAPAG)表位肽均由上海生工生化有限公司合成。艾滋病核酸疫苗pGX-Env的构建1)DNA疫苗及质粒DNA的制备DNA疫苗pGX-Env质粒由美国宾夕法尼亚大学 Dr. David Weiner教授馈赠；将质粒DNA转入DH5 α中发酵培养，采用大规模碱裂解法提取， Qiagen公司纯化柱纯化质粒DNA，并用生理盐水调节质量浓度至lmg/ml于_20°C保存。动 物分组及免疫方法Balb/c小鼠随机分为5组，每组10只，第1组免疫 100 μ μ gpGX-Env ；第 2 组免疫 100 μ g pGX-Env+0. 5 μ g 白介素 17Α ；第 3 组免疫 0. 5ug 白介素17A;第4组NaiVe (空白对照组)。免疫采用多点肌肉注射于小鼠两后腿股四头肌的方法进行免疫。各组小鼠均免疫2次，每次间隔14天，第二次免疫后的7天处死小鼠检测各项免疫学指标。2)流式细胞仪检测细胞因子表达水平第二次免疫后7天，无菌条件下分离脾细胞，通过尼龙柱除去B细胞制成单细胞悬液，调整细胞浓度到5x IO6个/mL，每孔加入 100 μ L细胞悬液到96孔细胞培养板上，加HIV-I型抗原表位肽每孔终浓度为5 μ g/mL,每组细胞设3个重复孔。37°C，5 % CO2,培养8h，加入莫能菌素再培养2h后，离心收集细胞， 抗Fc γ抗体封闭，4%多聚甲醛固定12min，0. 皂素破膜7min，PBS洗2次，用10 μ L荧光单克隆抗体4°C暗处染色30min，取300 μ L流式细胞仪检测。FlowJo软件进行分析。但图10的统计结果中，我们发现⑶8+T细胞分泌IFN-γ的结果显示，IL-17作为佐剂组与未加佐剂组比较差异有统计学意义(P < 0. 05)，提示IL-17作为佐剂能够明显促进⑶8+分泌 IFN- γ，说明IL-17可以促进⑶8+T细胞的激活，从而增强细胞免疫水平。3)体内CTL检测在第二次免疫后8天，处死末经免疫的空白小鼠，分离得到脾细胞，制成单脾细胞悬液，分成二等份作为为靶细胞，一份加lOmol/L Env特异性CTL表位多肽池(mCTLl+mCTL2+mCTL3)刺激，一份不刺激，37°C，5% CO2，培养4h，离心弃上清，PBS洗1 次，末刺激的靶细胞用0. 5 μ mol/L CFSE暗处染色lOmin，刺激的靶细胞用5 μ mol/L CFSE 暗处染色lOmin，加入等体积小牛血清终止染色2min，离心弃上清，PBS洗5次，最后将两种靶细胞等体积的混合，将IXlO7个靶细胞尾静脉注射到免疫小鼠体内，进行体内细胞毒杀伤反应，杀伤4h后处死小鼠，暗处分离得到脾细胞，取ImL流式细胞仪检测分析。试验结果如图11所示，IL-17作为佐剂组与未加佐剂组比较差异有统计学意义(P < 0. 05)，说明 IL-17能够明显诱导机体内产生强烈的CTL杀伤反应。实施例7、白介素17增强乙肝亚单位疫苗细胞免疫的动物实验白介素17有实验室制备和纯化，商品用氢氧化铝佐剂重组乙肝疫苗(成分为 rHBsAg+Alum)由华北制药集团提供。6-8周龄雌性C57BL/6小鼠，分4组，每组5。每只小鼠第0天首次肌肉注射，第14 天再次肌肉注射一次。第1组为未处理组；第2组为0. 5ug重组乙肝疫苗，每次每只免疫药物体积为200ul ’第3组为0. 5ug重组乙肝疫苗+0. 5g白介素17，每次每只免疫药物体积为 200ul ’第4组为0. 5g白介素17。流式细胞仪检测体外CTL正常未免疫的6-8周龄C57BL/6小鼠被处死，分离脾脏中的淋巴细胞，将分离得到的淋巴细胞二等份。其中一分孵育10_6M乙肝S抗原短肽(aa208 215)(上海吉尔生化有限公司)，另一分孵育相等量的无关的肽0VA，每皿的体积为l-2mL，37°C，5% C02培养4小时。4小时后将细胞转入15mL的细胞管中，2000rmp离心5分钟，将孵育0VA(aa323 339) (上海吉尔生化有限公司)的靶细胞用低浓度的CFSE(0. 5uM)染色，孵育乙肝S抗原短肽靶细胞用高浓度的CFSE (5uM)染色，37°C避光轻摇染色15分钟。染色后用等体积的胎牛血清终止反应，2000rmp离心5分钟，弃上清，用IOmL的PBS洗3次。将低浓度和高浓度染色的靶细胞等体积的混合，按每只小鼠2X IO7个细胞由尾静脉注射上述各免疫组小鼠及正常小鼠体内，进行体内细胞毒反应。注射后4小时，处死实验小鼠，避光分离得到脾细胞，铜网过滤后转入FACS专用 管中，准备进行仪器检测和分析。杀伤率=[1_(特异性杀伤的百分数/非特异性杀伤的百分数)]xioo。结果如图13所示，动物在白介素17单独免疫、或乙肝疫苗单独免疫只能产生低水平的CTL反应，而乙肝疫苗加白介素17能产生较高水平的CTL反应，明显高于其它组。图 13中纵坐标为杀伤的百分比；Na'ive表示5只正常未免疫的阴性小鼠对照。图13中的数值为5只小鼠的平均值士标准差。序列表<160>2<210>1<211>477<212>DNA<213> 小鼠白介素 17A(Mus musculus IL-17A)<400>1atgagtccag ggagagcttc atctgtgtct ctgatgctgt tgctgctgct gagcctggcg 60gctacagtga aggcagcagc gatcatccct caaagctcag cgtgtccaaa cactgaggcc 120aaggacttcc tccagaatgt gaaggtcaac ctcaaagtct ttaactccct tggcgcaaaa 180gtgagctcca gaaggccctc agactacctc aaccgttcca cgtcaccctg gactctccac 240cgcaatgaag accctgatag atatccctct gtgatctggg aagctcagtg ccgccaccag 300cgctgtgtca atgcggaggg aaagctggac caccacatga attctgttct catccagcaa 360gagatcctgg tcctgaagag ggagcctgag agctgcccct tcactttcag ggtcgagaag 420atgctggtgg gtgtgggctg cacctgcgtg gcctcgattg tccgccaggc agcctaa 477<210>2<211>467<212>DNA<213> 人白介素 17A(homo sapiens IL-17A)<400>2atgactcctg ggaagacctc attggtatca ctgctactgc tgctgagcct ggaggccata 60gtgaaggcag gaatcacaat cccacgaaat ccaggatgcc caaattctga ggacaagaac 120ttcccccgga ctgtgatggt caacctgaac atccataacc ggaataccaa taccaatccc 180aaaaggtcct cagattacta caaccgatcc acctcacctt ggaatctcca ccgcaatgag 240gaccctgaga gatatccctc tgtgatctgg gaggcaaagt gccgccactt gggctgcatc 300aacgctgatg ggaacgtgga ctaccacatg aactctgtcc ccatccagca agagatcctg 360gtcctgcgca gggagcctcc acactgcccc aactccttcc ggctggagaa gatactggtg 420
tccgtgggct gcacctgtgt caccccgatt gtccaccatg tggcctaa467SEQ ID NO 2人白介素17A前体氨基酸序列1 mtpgktslvs Illllsleai vkagitiprn pgcpnsedkn fprtvmvnln ihnrntntnp61 krssdyynrs tspwnlhrne dperypsviw eakcrhlgci nadgnvdyhm nsvpiqqeil121 vlrrepphcp nsfrlekilv svgctcvtpi vhhvaSEQ ID NO 3人白介素17A氨基酸序列1 gitiprnpgc pnsedknfpr tvmvnlnihn rntntnpkrs sdyynrstsp wnlhrnedpe61 rypsviweak crhlgcinad gnvdyhmnsv piqqeilvlr repphcpnsf rlekilvsvg121 ctcvtpivhh va
权利要求
1.一种治疗和/或预防病毒的药物，该药物为白介素17A，其氨基酸残基序列如SEQ ID NO 2和氨基酸残基序列如SEQ ID NO :3。
2.根据权利要求1所述的药物，其特征在于所述白介素17A包括基因工程重组白介素17A和化学合成白介素17A。
3.根据权利要求1所述的药物，其有效剂量为5-lOOug/kg体重/次，优选为10-30ug/ kg/次，每3-10天给药一次，一般共需2-6次。
4.根据权利要求2所述的药物，其特征在于所述白介素17A作为增强免疫反应的佐剂与疫苗一起使用；
5.根据权利要求4所述的药物，其特征在于与其配合的疫苗包括核酸疫苗、DNA疫苗、 多肽疫苗和重组亚单位蛋白质疫苗；
6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于所述白介素17A和所述重组亚单位疫苗的质量比为0.5 1-1 10，优选为1 1-1 5。
7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于所述白介素17A和所述核酸疫苗的质量比为 1 10-1 1000，优选为 1 50-1 200。
8.根据权利要求5所述的药物，其特征在于所述白介素17和所述多肽疫苗的质量比为 1 5-1 50，优选为 1 10-1 20。
9.用于制备权利要求4-8中任一项所述疫苗复合物的方法。
全文摘要
本发明提供了一种治疗和/或预防病毒的药物。该治疗和/或预防病毒的药物，包括白介素17A和利用白介素17A作为佐剂与疫苗一起使用增强疫苗免疫效果产生的药物作用，其氨基酸残基序列如SEQ ID NO2和其SEQ ID NO3所示。本发明的治疗和/或预防病毒的药物的作用机理是通过激活与提高机体的细胞免疫反应，主要是通过诱导高水平的CD8阳性CTL细胞活性，使其分泌高水平的γ-干扰素和Preforin等有效免疫组分而达到的治疗和/或预防病毒的目的。本发明的治疗和/或预防病毒的药物相比于现有技术，不仅使用方便，成本低，安全，而且易于推广。
文档编号A61K39/39GK102218139SQ201010148610
公开日2011年10月19日 申请日期2010年4月16日 优先权日2010年4月16日
发明者俞庆龄, 王宾, 靳津 申请人:北京艾棣维欣生物技术有限公司