专利名称：一种锰配合物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及磁共振成像(MRI)技术领域，特指一种用于磁共振成像的成像剂及其应用。
背景技术：
磁共振成像(MRI)技术一种无创性快速检测脑肿瘤和血管的成像方法。磁共振成像具有安全、无创、无电离辐射、无放射性损伤、高时间分辨力及空间分辨力等优点，目前已成为临床上诊断血管病变、颅内肿瘤等的主要影像学检查技术。自1983年使用Gd-DTPA进行临床试验以来，为提高成像剂的灵敏度和靶向性，降低其毒性，人们对MRI造影剂进行了大量的研发(B.Jebasingh，V.Alexander.Inorg.Chem.，2005，449434-9443)。常用的成像剂为二乙三胺五乙酸钆(Gd-DTPA)和四乙酸四氮杂环十二烷(Gd-DOTA)。Gd-DTPA和Gd-DOTA为细胞外分布，不能通过正常的血脑屏障，其作用机制是改变局部组织的磁环境而间接增强。由于分子量小、半衰期短、体内信号弱，造影时间短、渗透压较高，常需加大剂量乃至多次注射，副作用较大(俞开潮，王国平，丁尚武等.波谱学杂志，2004，21(4)505-525)。为增加成像剂的亲脂性，降低其渗透压，提高对靶组织如肝脏的选择性，Unger等人合成聚集有顺磁性金属螯合物Gd-DTPA，Mn-EDTA等的脂质体成像剂(Unger E，Shen D K，Fritz T.InvestRadiol.，1994，29S168-169)。虽然连接大分子顺磁性成像剂的水质子的弛豫速较小分子成像剂有较大提高，但化合物存在稳定性和生物相溶性等问题。低成本，生物相溶性的肿瘤靶向性大分子顺磁性成像剂的研究仍然是一个挑战。此外由于增进磁共振成像内部结构的可见性的钆基造剂可造成肾源性系统纤维化(NSF)。FDA已要求小分子钆基成像剂生产商在其产品标签上增加“黑框”警告。超顺磁性氧化铁粒子(SPIO)是目前研究得较多的磁化率型成像剂，其磁矩远比其它顺磁性物质高，对邻近组织中氢核的弛豫速率起明显的加速作用，用作成像剂时所需剂量很小，但因其水溶性极小，只能采用匀浆或胶体的形式给药。超小型超顺磁性氧化铁、单晶氧化铁微聚体、脂质体包裹的超顺磁性氧化铁等均属于T2阴性造影剂，不符合人类对亮的、白的物体敏感的特性(1.Li Z，Wei L，GaoM Y.Adv.Mater.，2005，171001-1005；2.Hu F Q，Wei L，ZhouZ.Adv.Mater.，2006，182553-2556)。与此同时，SPIO外包被与其他活性物质的连接也受到较多限制。通过降低成像剂的用量来降低其对生物体的毒性已成为人们研究成像剂的共识。随着MRI新成像技术(如MR血管造影、灌注MR、扩散加权MRI等)的迅速发展及其在临床诊断中应用的普及，MRI成像剂的研究和开发面临更大的挑战，用于肿瘤诊断的成像剂也越来越受到重视。研制低毒性，高弛豫率，靶向性强，多重作用，体内稳定的造影剂是未来的发展趋势。
锰为生物体内存在的微量元素，顺磁性锰配合物能特异性聚集在肿瘤细胞上，成为新型肿瘤靶向性分子(陈秋云，黄娟，高静，郭文杰，“具有抗肿瘤和影响线粒体功能的锰配合物及其制备方法”，中国发明专利号200710192228.5)。进一步研究我们发现螯合型锰配合物在体类能显著提高肿瘤细胞的成像效果，可作为新型肿瘤靶向型具有治疗作用的磁共振成像造影剂。具有肿瘤治疗作用的磁共振成像造影剂未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备新型磁共振成像剂的方法。新型磁共振成像剂成分为二氯N-(2-丙酸乙酯基)-N，N-二(2-吡啶甲基)胺合锰螯合物。试验结果显示能显著提高体内肝癌细胞MRI成像的特性。本发明的成像剂可通过腹腔注射或静脉注射。该成像剂可用于肿瘤的体外和体内磁共振成像。也可用于区别正常组织和肿瘤细胞的磁共振成像剂。这是首次报道的具有治疗效果的多功能成像剂，与临床运用的单一成像功能的成像剂不同。
一种锰配合物，为二氯N-(2-丙酸乙酯基)-N，N-二(2-吡啶甲基)胺合锰，分子式C17H21Cl2MnN3O2，结构如式1
式1 式1简写为LMnCl2，其中L代表N-(2-丙酸乙酯基)-N，N-二(2-吡啶甲基)胺，其结构式见式2
式2 制备上述所说锰配合物的方法是 将配体N-(2-丙酸乙酯基)-N，N-二(2-吡啶甲基)胺和MnCl2按摩尔比1∶1溶于水溶液中，控制温度在20-40℃；加入氯化胺为催化剂，氯化铵与MnCl2的摩尔比为0.2∶1，最佳反应温度为30℃，反应时间1-4小时，最佳反应时间为2小时。产物经硅胶色谱柱层析纯化(展开剂为四氢呋喃∶石油醚＝3∶2)，浓缩去溶液，获得浅黄色锰配合物[LMnCl2]。
上述锰配合物肝癌体内磁共振成像方面的运用，与不加锰配合物的空白水溶液相比(见图1)，配合物能显著提高肿瘤诊断效果，说明配合物具有磁共振成像功能和肿瘤靶向性，可用作肿瘤磁共振成像造影剂。目前临床运用的磁共振成像剂主要为钆基造(Gd-DTPA)，增进磁共振成像内部结构的可见性的钆基造剂可造成肾源性系统纤维化(NSF)。FDA已要求小分子钆基成像剂生产商在其产品标签上增加“黑框”警告。本发明实验数据表明多齿配体N-(2-丙酸乙酯基)-N，N-二(2-吡啶甲基)胺锰配合物具有顺磁性，一次注射0.5ml浓度为5mg/ml的配合物水溶液在体类能显著提高肿瘤细胞的磁共振成像效果。锰配合物在90分钟内能持续增强肿瘤部位的成像效果，说明具有良好的稳定性和肿瘤靶向性。由于用量低，锰为生物体内存在的微量元素，由于配合物还具有良好的抗肿瘤活性，所以配合物可作为新型低毒性多功能肿瘤靶向型磁共振成像造影剂。这是首次报道的具有治疗效果的多功能成像剂，与临床运用的单一成像功能的成像剂不同。
图1锰配合物对大鼠体内肿瘤磁共振成像的影响。
(a)空白；(b)注射后30分钟；(c)，注射后60分钟；(d)注射后90分钟
具体实施例方式 1试剂和原料 实验中所用试剂均为分析纯，除特别注明外，未经进一步处理。元素分析用Carlo-Erba-1106型元素分析仪测定，红外光谱用Fr-IR 169(固体用KBr压片)。
抗肿瘤试验试剂如下(1)RPMI 1640培养基(RPMI 1640+10％小牛血清+HEPES 3.5g/l+NaHCO3 2.2g/l+青霉素0.13g/l+链霉素0.15g/l)。(2)高糖DMEM培养基(DMEM+10％小牛血清+HEPES 3.5g/l+NaHCO3 2.2g/l+青霉素0.13g/l+链霉素0.15g/l)。(3)MTT(美国Amresco公司产品)。
2、锰配合物的合成 实施例1(最佳反应条件举例) 将配体N-(2-丙酸乙酯基)-N，N-二(2-吡啶甲基)胺和MnCl2按摩尔比1∶1溶于水溶液中，控制在30℃；加入氯化胺(0.1mol)为催化剂，反应时间2小时。产物经硅胶色谱柱层析纯化(展开剂为四氢呋喃∶石油醚＝3∶2)，浓缩去溶液，获得浅黄色锰配合物[LMnCl2]。Yield，63％.分子式C17H21Cl2MnN3O2元素分析实测值C，48.34；H，4.62；N，9.58，Mn，12.62.计算值C，48.02；H，4.98；N，9.88，Mn，12.92.IR(v cm-1，KBr)3057m(＝CH)，2986m(-CH2-)，1730m(C＝O)，1603s，1571m，1442s，777s(pyridine).UV-vis((H2O/nm，v cm-1，ε)38461(8900). 实施例2 将配体N-(2-丙酸乙酯基)-N，N-二(2-吡啶甲基)胺和MnCl2按摩尔比2∶1溶于水溶液中，控制在20℃；加入氯化胺(0.1mol)为催化剂，反应时间1小时。产物经硅胶色谱柱层析纯化(展开剂为四氢呋喃∶石油醚＝3∶2)，浓缩去溶液，获得浅黄色锰配合物[LMnCl2]。Yield25％.分子式C17H21Cl2MnN3O2元素分析实测值C，48.34；H，4.62；N，9.58，Mn，12.62.计算值C，48.02；H，4.98；N，9.88，Mn，12.92.IR(v cm-1，KBr)3057m(＝CH)，2986m(-CH2-)，1730m(C＝O)，1603s，1571m，1442s，777s(pyridine).UV-vis((H2O/nm，v cm-1，ε)38461(8900). 实施例3 将配体N-(2-丙酸乙酯基)-N，N-二(2-吡啶甲基)胺和MnCl2按摩尔比1∶1溶于水溶液中，控制在40℃；加入氯化胺(0.1mol)为催化剂，反应时间1小时。产物经硅胶色谱柱层析纯化(展开剂为四氢呋喃∶石油醚＝3∶2)，浓缩去溶液，获得浅黄色锰配合物[LMnCl2]。Yield45％.分子式C17H21Cl2MnN3O2元素分析实测值C，48.34；H，4.62；N，9.58，Mn，12.62.计算值C，48.02；H，4.98；N，9.88，Mn，12.92.IR(v cm-1，KBr)3057m(＝CH)，2986m(-CH2-)，1730m(C＝O)，1603s，1571m，1442s，777s(pyridine).UV-vis((H2O/nm，v cm-1，ε)38461(8900). 实施例4 将配体N-(2-丙酸乙酯基)-N，N-二(2-吡啶甲基)胺和MnCl2按摩尔比1∶1溶于水溶液中，控制在20℃；加入氯化胺(0.1mol)为催化剂，反应时间4小时。产物经硅胶色谱柱层析纯化(展开剂为四氢呋喃∶石油醚＝3∶2)，浓缩去溶液，获得浅黄色锰配合物[LMnCl2]。Yield55％.分子式C17H21Cl2MnN3O2元素分析实测值C，48.34；H，4.62；N，9.58，Mn，12.62.计算值C，48.02；H，4.98；N，9.88，Mn，12.92.IR(v cm-1，KBr)3057m(＝CH)，2986m(-CH2-)，1730m(C＝O)，1603s，1571m，1442s，777s(pyridine).UV-vis((H2O/nm，v cm-1，ε)38461(8900). 实施例5抗肿瘤活性测定 以实施例1得到的配合物为受试化合物 筛选的细胞株有人癌细胞株(HepG2，U251)(由江苏大学药学院提供)。测定采用溴化四氮唑蓝(MTT)法。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性溴化四氮唑蓝还原为难溶性的蓝紫色结晶物(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值。
操作步骤如下 3.1.1接种取处于指数生长期，状态良好的细胞一瓶，加入适量胰蛋白酶 消化液，消化使贴壁细胞脱落，用含12％小牛血清的RPMI1640(或DMEM)培养液配成细胞悬液，计数，并将细胞密度调整稀释至2.2*104/ml.取细胞悬液接种于96孔板上，180ul/孔(含肿瘤细胞4000/孔)。
3.1.2培养将培养板转入恒温CO2培养箱中，在37℃，5％CO2及饱和湿度条件下培养24小时。
3.1.3加药受试化合物先用DMSO或超纯水配制成0.1M浓度，再作4个稀释度，浓度依次为10-4M，10-5M，10-6M，10-7M。加入受试化合物，20ul/孔，培养48小时。每组设3个平行孔，并重复3次。
3.1.4染色 3.1.4.1将MTT加入96孔板(贴壁细胞)中，20ul/孔，置于培养箱中孵育4小时，吸弃孔内上清液，加入DMSO100ul/孔，置平板摇床上震荡5分钟。
3.1.4.2将MTT加入96孔板中(悬浮细胞)，20ul/孔，置于培养箱中孵育4小时，再加入20％SDS 50ul/孔，置于培养箱中过夜。
3.1.5测定酶标仪设定波长为570nm，参考波长为630nm，测定96孔板每孔吸光值，记录结果并计算细胞抑制率，以判断受试药物的抗肿瘤活性。
3.3数据处理 3.3.1细胞抑制率的计算 抑制率＝(对照组平均OD值-给药组平均OD值)/对照组平均OD值×100％ IC50的计算根据中国药科大学新药筛选中心提供的IC50软件计算所得。
MTT法测试结果示于表1。
表1锰配合物对癌细胞抑制作用MTT实验数据
锰配合物[LMnCl]对种癌细胞U251半数抑制率需要的化合物浓度IC50为4.5umol/L，锰配合物[LMnCl2]癌细胞半数抑制率需要的化合物浓度为IC50为在12umol/L。而MnCl2在小于300umol/L对肿瘤细胞的生长没有抑制作用。这说明本发明的锰配合物具有良好的抗肿瘤活性，可作为抗癌药用先导物。
实施例6肿瘤体内成像实验 以实施例1得到的锰配合物为受试化合物 肿瘤体内磁共振成像实验用西门子3.0TMR成像仪测定。将肝癌细胞HepG-2接种于体重170-200克的腋下。接种肿瘤5天后的大鼠用于成像实验。核磁共振成像采用multislice-multiecho T1-weighted spin-echo sequence成像方法，扫描参数为TR＝800ms、TE＝11.4ms，影像切片厚度1mm。每一个动物首先在注射探针前作一次肿瘤扫描，然后在静脉注射后每隔30分钟扫描一次。腹腔静脉注射方式，一次注射0.5ml浓度为5mg/ml成像剂的水溶液。成像结果示于图1。
图1数据显示与不含锰配合物的空白水溶液相比，锰配合物显著增强肿瘤细胞的磁共振成像清晰度。目前临床运用的磁共振成像剂主要为钆基造(Gd-DTPA)，增进磁共振成像内部结构的可见性的钆基造剂可造成肾源性系统纤维化(NSF)。FDA已要求小分子钆基成像剂生产商在其产品标签上增加“黑框”警告。本发明数据锰配合物一次注射0.5ml浓度为5mg/ml在体类能显著提高肿瘤细胞的成像效果，由于用量低，锰为生物体内存在的微量元素，所以配合物可作为新型低毒性多功能肿瘤靶向型磁共振成像造影剂。
权利要求
1.一种锰配合物，其特征在于所述锰配合物具有如下结构
2.权利要求1所述锰配合物的制备方法，具体为将配体N-(2-丙酸乙酯基)-N，N-二(2-吡啶甲基)胺和MnCl2按摩尔比1∶1溶于水溶液中，以氯化铵为催化剂进行合成，氯化铵与MnCl2的摩尔比为0.2∶1，反应温度为20-40℃，反应时间1-4小时，产物经硅胶色谱柱层析纯化，浓缩去溶液，获得浅黄色锰配合物。
3.权利要求1所述锰配合物的制备方法，其特征在于反应温度为30℃，反应时间2小时。
4.权利要求1所述锰配合物的在制备抗肿瘤药物中以及在制备肿瘤磁共振成像造影剂中的应用。
5.权利要求1所述锰配合物作为肿瘤磁共振成像造影剂使用的量为一次使用0.5ml浓度为5mg/ml的锰配合物水溶液。
全文摘要
一种锰配合物及其制备方法和用途，涉及磁共振成像(MRI)技术领域，所述锰配合物为二氯N-(2-丙酸乙酯基)-N，N-二(2-吡啶甲基)胺合锰，分子式C17H21Cl2MnN3O2，所述锰配合物的制备方法，具体为将配体N-(2-丙酸乙酯基)-N，N-二(2-吡啶甲基)胺和MnCl2按摩尔比1∶1溶于水溶液中，控制在20-40℃；以氯化铵为催化剂进行合成，氯化铵与MnCl2的摩尔比为0.2∶1，反应温度为30℃，反应时间1-4小时，产物经硅胶色谱柱层析纯化，浓缩去溶液，获得浅黄色锰配合物。上述锰配合物肝癌体内磁共振成像方面的运用，与不加锰配合物的空白水溶液相比，配合物能显著提高肿瘤诊断效果，说明配合物具有磁共振成像功能和肿瘤靶向性，可用作肿瘤磁共振成像造影剂。
文档编号A61K31/555GK101812092SQ20101015881
公开日2010年8月25日 申请日期2010年4月27日 优先权日2010年4月27日
发明者陈秋云 申请人:江苏大学