使用衍生自ap205外壳蛋白的病毒样颗粒的分子抗原阵列的制作方法

专利名称：使用衍生自ap205外壳蛋白的病毒样颗粒的分子抗原阵列的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学、免疫学、病毒学和分子生物学领域。
背景技术：
接种提供了抵抗感染性疾病的最有效途径之一，并且在上个世纪对公众健康产生 了最重要的益处。早期接种方案使用活的、减毒的或灭活的病原体作为免疫原。公众和官 方在安全性方面的关注一直以来促进了对更确定的和更安全的疫苗的探索。该探索促进了新的研究方向，其中单个抗原被分离或重组表达，并且作为免疫原 进行注射。这些研究的例子包括亚单元疫苗的开发和利用。然而，因为分离的蛋白质通常 没有足以导致保护性免疫应答的免疫原性，所以这种疫苗常常需要添加佐剂以产生足够抵 抗抗原的免疫应答。尽管已知几种强的佐剂，诸如弗氏完全佐剂，但是它们通常是有毒的， 并且不能在人类中使用。因此，大量的努力被投入到新佐剂的探索中。最近，对免疫系统区分自我和外来物的原理的研究已经表明病毒表面上抗原的 组织程度和重复性是抗原作为外来物被识别的非常强的信号(Bachmarm & Zinkernagel， Immunol. Today 17:553-558(1996))。在基于病毒样颗粒(VLP)的新疫苗设计中利用了病 毒结构的这种特性，该新疫苗联合了病毒结构的免疫原性和非复制疫苗改进的安全性。在 这些疫苗中，抗原融合或化学附着(chemical attachment)于病毒样颗粒上，所述化学附着 是共价或非共价的。这样，通过连接抗原和病毒样颗粒，病毒结构的免疫原特性被转移给抗 原。各种VLP已经用于附着抗原。例如，WO 00/32227描述了乙型肝炎病毒核心抗原
在一些类型疫苗的生产中的用途。WO 03/056905中公开了一类新的高度可表达的并具有高度免疫原性的VLP，这里 将这篇文献整体并入为参考文献。这些VLP由RNA噬菌体的外壳蛋白组成。该外壳蛋白在 细菌中重组表达，并且VLP不含有噬菌体RNA基因组，因此不能复制。最近鉴定了新RNA 噬菌体，AP205(Klovins, J.，等，J Gen. Virol. 83 1523-33(2002).)。AP205RNA 噬菌体(Taxonomy ID :154784)是单链、正链 RNA(没有 DNA 阶段)病毒，其属于轻小病毒科(Leviviridae)，轻小病毒属(Levivirus Genus)，未分类 的轻小病毒(Unclassified Levivirus)亚组。该亚组的其它成员是RNA噬菌体BOl，frl， TW19和PP7。两种已描述的轻小病毒亚组包括下列RNA噬菌体fr，JP501，f2，M12，MS2和 R17(亚组 I)和 BZ13，JP;34，TH1，GA 和 KUl (亚组 II)。AP205 基因组长 4267 核苷酸(nt)。 全长基因组序列登录号AF334111，NC-002700。AP205噬菌体的天然宿主是不动杆菌属 种(Acinetobacter Spp.) (Klovins, J.，等，J. Gen. Virol. 83 1523-33 (2002))。AP205 噬
4菌体基因组包含3个大的开放读框(ORFs)，其编码成熟蛋白、外壳蛋白和复制酶蛋白质。 此外，在5’末端还存在两个小0RF，位于成熟蛋白基因之前。这些ORFs编码的蛋白质的 功能未知。推测这些ORF之一可能编码裂解蛋白质(Klovins，J.，等，J. Gen. Virol. 83 1523-33(2002))。

发明内容
我们已经发现利用本发明载体，可以在细菌中重组表达AP205外壳蛋白。我们也 已经研究出了 AP205病毒样颗粒的纯化方法。而且，正如电子显微镜术(EM)和免疫扩散所 证明的，本发明方法产生的AP205外壳蛋白自发地形成衣壳，因此在大肠杆菌(E. coli)中， 外壳蛋白单独与RNA —起就足以装配衣壳。这排除了两种未知功能ORFs编码的蛋白质的 任何作用。本发明令人惊奇的特征是在结构已阐明的其它RNA噬菌体外壳蛋白和AP205外 壳蛋白之间不存在序列同源性，但是当在电子显微镜(EM)下观察时，AP205外壳蛋白形成 的衣壳和这些RNA噬菌体外壳蛋白形成的衣壳具有几乎是不能区分的结构特征。我们已经 发现AP205VLP具高度免疫原性，并且其可以连接有机分子以产生疫苗构建体，从而展示出 以重复方式定向的有机分子。针对此展示的有机分子已经诱导了高效价，这表明结合的有 机分子可以被抗体分子接近以发生相互作用，并且具有免疫原性。本发明提供了重组表达的病毒样颗粒(VLP)，其从至少一种大肠杆菌中重组表达 的噬菌体AP205外壳蛋白自发装配而成。在相关的方面，本发明提供了能够装配的突变形 式的AP205VLP，其包括在氨基酸5位具有脯氨酸到苏氨酸置换的AP205外壳蛋白(SEQ ID N0:3)。这些VLP，来源于天然来源的AP205VLP(SEQ ID NO :1)或AP205病毒颗粒，可以结合 至少一种有机分子以产生有机分子的有序重复阵列。本发明的有机分子包括抗原和抗原决 定簇、变应原、自身抗原、半抗原、癌抗原和感染性疾病抗原及小的有机分子诸如滥用的药 物，如烟碱和它们的衍生物。利用本发明提供的抗原-AP205VLP缀合物或含有这种缀合物 的组合物进行动物免疫接种，可以诱导抗所展示的抗原的强免疫应答。因此，本发明的VLP 可以用于分子(特别是抗原)的附着和展示。从而，本发明的缀合物、组合物和方法可以用 于刺激抗各种展示抗原的免疫应答，因此可用于在动物中使用。在第一方面，本发明提供了病毒样颗粒，其包含或者备选地或优选地其基本组成 为或者备选地或优选地其组成为至少一种选自以下的蛋白质(a)具有SEQ ID N0:1中所 述氨基酸序列的蛋白质；(b)具有SEQ IDNO 3中所述氨基酸序列的蛋白质；(c)所述(a)或 (b)蛋白质的突变蛋白质。优选地，所述蛋白质是重组蛋白。因此，本发明提供了由至少一 种选自以下的蛋白质形成的衣壳(a)具有SEQ ID NO :1中所述氨基酸序列的蛋白质；(b) 具有SEQ ID NO :3中所述氨基酸序列的蛋白质；(c)所述(a)或(b)蛋白质的突变蛋白质。 在优选的实施方式中，所述突变蛋白质具有SEQ ID NO :1中所述或SEQ ID NO :3中所述的 氨基酸序列，其中添加、缺失或置换了 SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 3的至少1个氨基酸残 基，优选地3个氨基酸残基，更优选地2个氨基酸残基，甚至更优选地1个氨基酸残基，其中 优选地，所述至少1个置换是保守性置换。在另一优选实施方式中，所述突变蛋白质具有 SEQ ID NO 1中所述或SEQID NO 3中所述的氨基酸序列，其中缺失或置换了 SEQ ID NO 1 或SEQID NO 3的至少1个半胱氨酸残基，优选地2个半胱氨酸残基，其中优选地，所述至少 1个，优选地2个置换是保守性置换。在另一个优选实施方式中，所述突变蛋白质具有SEQID NO :1中所述或SEQ ID NO :3中所述的氨基酸序列，其中添加、缺失或置换了 SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 3的至少1个赖氨酸残基，优选地3个赖氨酸残基，更优选地2个赖氨酸残 基，甚至更优选地1个赖氨酸残基，其中优选地，所述至少1个置换是保守性置换。在第二方面，本发明提供了具有SEQ ID NO :3中所述氨基酸序列的突变蛋白质。 做为可替代方案，本发明提供了 SEQ ID NO :1或SEQ IDNO :3的重组蛋白质的突变蛋白质， 其中添加、缺失或置换了 SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :3的至少1个氨基酸残基，优选地3个 氨基酸残基，更优选地2个氨基酸残基，甚至更优选地1个氨基酸残基，其中优选地，所述至 少1个置换是保守性置换。在另一方面，本发明提供了 SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 3的重组蛋白质的突变蛋 白质，其中缺失或置换了 SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :3的至少1个半胱氨酸残基，优选地2 个半胱氨酸残基，其中优选地，所述至少1个，优选地2个置换是保守性置换。做为可替代 方案，本发明提供了 SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 3的重组蛋白质的突变蛋白质，其中添加、 缺失或置换了 SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 3的至少1个赖氨酸残基，优选地3个赖氨酸残 基，更优选地2个赖氨酸残基，甚至更优选地1个赖氨酸残基，其中优选地，所述至少1个置 换是保守性置换。在另一方面，本发明提供了用于产生AP205病毒样颗粒的载体，其序列与SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 4的序列至少80 %，优选地至少90 %，更优选地至少95 %，甚至更优选 地99%相同。做为可替代方案，本发明提供了用于产生重组蛋白质的载体，该重组蛋白质 包含与选自以下的蛋白质融合的多肽(a)具有SEQ ID NO :1中所述氨基酸序列的蛋白质； (b)具有SEQ ID NO 3中所述氨基酸序列的蛋白质；和(c)所述(a)或(b)多肽的突变蛋 白质。在另一方面，本发明提供了产生AP205病毒样颗粒的方法，该方法包括步骤(a) 提供核酸，该核酸包含与SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 4的核苷酸序列至少80%，优选地至 少90 %，更优选地至少95 %，甚至更优选地100 %相同的核苷酸序列，或者提供载体，该载 体包含与SEQ IDNO :2或SEQ ID NO 4的核苷酸序列至少80 %，优选地至少90 %，更优选地 至少95%，甚至更优选地99%相同的核苷酸序列；(b)将所述核酸或载体引入到宿主细胞 中；(c)在所述宿主细胞中表达所述核酸或所述载体的序列，以获得能形成AP205病毒样颗 粒的蛋白质或突变蛋白质。优选地，所述宿主细胞是大肠杆菌。在另一方面，本发明提供了产生AP205病毒样颗粒的方法，该方法包括步骤(a) 提供编码至少一种选自以下的蛋白质的核酸或载体(i)具有SEQ ID NO :1中所述氨基酸 序列的蛋白质；(ii)具有SEQ ID N0:3中所述氨基酸序列的蛋白质；(iii)所述⑴或(ii) 蛋白质的突变蛋白质；(b)将所述核酸或所述载体引入到宿主细胞中；(c)在所述宿主细胞 中表达所述核酸或所述载体的序列，以获得能形成AP205病毒样颗粒的所述蛋白质或所述 突变蛋白质。优选地，所述宿主细胞是大肠杆菌。上面已经指出了(i)和(ii)下所述的蛋 白质和突变蛋白质的优选实施方式。在第一实施方式中，本发明提供了包含一种或多种RNA噬菌体AP205重组VLP或 其突变体的组合物。在另一实施方式中，本发明提供了包含一种或多种AP205VLP和一种或 多种有机分子的组合物，其中所述分子附着、连接、偶联或融合，即，结合于AP205VLP上。在 另一个实施方式中，有机分子是抗原。
在一些其它实施方式中，有机分子选自(a)适于诱导抗癌细胞的免疫应答的有 机分子；(b)适于诱导抗感染性疾病的免疫应答的有机分子；(c)适于诱导抗变应原的免疫 应答的有机分子；(d)适于诱导改进的抗自身抗原的应答的有机分子；(e)适于在农畜或宠 物中诱导免疫应答的有机分子；和(f)适于诱导抗药物、激素或有毒化合物的应答的有机 分子和(g) (a)-(f)中所述任何分子的片段(例如表位或抗原结构域)。在另一个实施方式中，有机分子是一种或多种抗原。在一个这样的实施方式中，抗 原是重组多肽。在另一个实施方式中，从天然来源诸如花粉、蜂、病原体或肿瘤提取抗原。而 在另一个实施方式中，抗原选自(a)适于诱导抗癌细胞的免疫应答的多肽；(b)适于诱导 抗感染性疾病的免疫应答的多肽；(c)适于诱导抗变应原的免疫应答的多肽；(d)适于诱导 抗自身抗体的免疫应答的多肽；和(e)适于在农畜或宠物中诱导免疫应答的多肽。在特别的实施方式中，抗原包含细胞毒性T细胞或辅助T细胞的表位。在相关实 施方式中，抗原包含B细胞表位。在相关方面，本发明提供了用于将有机分子附着，即结合到AP205VLP上的方法。 在一些实施方式中，有机分子以定向方式结合到AP205VLP上。在本发明另一个实施方式中，在免疫动物的方法中使用本发明缀合物或组合物， 其中通过皮下、肌内、鼻内、真皮内、静脉内、经皮、经粘膜、口服方式将缀合物或组合物引入 到动物体中或者直接引入到淋巴结中。在另一个实施方式中，在想要免疫接种以进行抵抗 的肿瘤或局部病毒储库(reservoir)的附近，局部地施用组合物。本发明也涉及包含免疫学有效量的本发明组合物和药物学可接受稀释剂、载体或 赋形剂的疫苗。在进一步实施方式中，该疫苗进一步包含至少一种佐剂，诸如明矾或弗氏不 完全佐剂。本发明也提供了免疫和/或治疗动物的方法，该方法包括向动物施用免疫学有 效量的本发明缀合物、组合物或疫苗。AP205VLP缀合物或组合物可以用于接种以抵抗例如肿瘤、病毒疾病、自身分子或 非肽小分子。接种可以用于预防或治疗目的，或者同时用于这两种目的。AP205VLP缀合物 或组合物还可以用于抗变态反应接种，以诱导适于变态反应治疗或预防的抗变应原的免疫 偏离和/或抗体应答。本发明也提供了通过施用包含或可替代地基本组成为与有机分子结合的 AP205VLP的组合物，治疗或预防个体或一群个体中的疾病、身体病症或状况的方法。在相关 的方面，抗该组合物产生的免疫分子或抗体，如抗体，可以用于疾病、状况或病症的治疗、预 防或诊断。在本发明另一个方面，以试剂盒形式提供包含与有机分子结合的AP205VLP的组 合物。在本发明另一方面，还以试剂盒形式提供了包含免疫分子或抗体的组合物，其中所 述的免疫分子和抗体是利用结合有机分子的AP205VLP分离的。这种试剂盒可以用于各种 目的，包括但不限于检测与VLP上呈递的有机分子反应的免疫分子或抗体，检测有机分子， 筛选免疫分子或抗体；和/或诊断通过免疫分子或抗体的存在或不存在表征的状况。在一 些相关实施方式中，本发明试剂盒可以包含一种或多种额外的成分诸如缓冲液、载体、赋形 剂、佐剂和检测试剂等。在另一方面，本发明也提供了用于表达RNA噬菌体AP205的外壳蛋白从而形成病 毒样颗粒的载体和宿主细胞。宿主细胞包括原核生物，包括大肠杆菌；和真核生物，包括酵母、动物、细胞系等。在另一方面，本发明提供了表达RNA噬菌体AP205及其病毒样颗粒的外壳蛋白的 方法。在另一方面，本发明提供了纯化和分离噬菌体AP205病毒样颗粒的方法。根据本领域的现有技术、下面附图和本发明说明书及权利要求书，本发明的其它 实施方式对本领域普通技术人员显而易见。本发明涉及以下内容1、包含至少一种选自如下的蛋白质的病毒样颗粒(a)具有SEQ ID NO 1中所述氨基酸序列的蛋白质；(b)具有SEQ ID NO 3中所述氨基酸序列的蛋白质；和(c)所述(a)或(b)蛋白的突变蛋白质。2、如项1所述的病毒样颗粒，其中所述蛋白质是重组蛋白。3、如项1或2所述的病毒样颗粒，其中所述突变蛋白质具有SEQ IDNO 1中所述或 SEQ ID NO :3中所述的氨基酸序列，其中添加、缺失或置换了至少1个氨基酸残基，优选地 3个氨基酸残基，更优选地2个氨基酸残基，甚至更优选地1个氨基酸残基，其中优选地，所 述至少1个置换是保守性置换。4、如项1至3任一项所述的病毒样颗粒，其中所述突变蛋白质具有SEQ ID NO=I 中所述或SEQ ID NO :3中所述的氨基酸序列，其中缺失或置换了至少1个半胱氨酸残基，优 选地2个半胱氨酸残基，其中优选地，所述至少1个置换是保守性置换。5、如项1至4任一项所述的病毒样颗粒，其中所述突变蛋白质具有SEQ ID NO=I 中所述或SEQ ID NO :3中所述的氨基酸序列，其中添加、缺失或置换了至少1个赖氨酸残 基，优选地3个赖氨酸残基，更优选地2个赖氨酸残基，甚至更优选地1个赖氨酸残基，其中 优选地，所述至少1个置换是保守性置换。6、具有SEQ ID NO 3中所述氨基酸序列的突变蛋白质。7、SEQ ID NO 1的重组蛋白质的突变蛋白质。8、如项7所述的突变蛋白质，其中添加、缺失或置换了至少1个氨基酸残基，优选 地3个氨基酸残基，更优选地2个氨基酸残基，甚至更优选地1个氨基酸残基，其中优选地， 所述至少1个置换是保守性置换。9、如项7或8所述的突变蛋白质，其中缺失或置换了至少1个半胱氨酸残基，优选 地2个半胱氨酸残基，其中优选地，所述至少1个置换是保守性置换。10、如项7至9任一项所述的突变蛋白质，其中添加、缺失或置换了至少1个赖氨 酸残基，优选地3个赖氨酸残基，更优选地2个赖氨酸残基，甚至更优选地1个赖氨酸残基， 其中优选地，所述至少1个置换是保守性置换。11、用于产生AP205病毒样颗粒的载体，其包含与SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4的 核苷酸序列至少80%，优选地至少90%，更优选地至少95%，甚至更优选地99%相同的核 苷酸序列。12、用于产生重组蛋白质的载体，其包含编码与选自如下的蛋白质融合的多肽的 核苷酸序列(a)具有SEQ ID NO 1中所述氨基酸序列的蛋白质；(b)具有SEQ ID NO 3中所述氨基酸序列的蛋白质；和
(c)所述(a)或(b)多肽的突变蛋白质。13、一种组合物，其包含(a)选自如下的核心颗粒(i)AP205病毒颗粒；和(ii)AP205病毒样颗粒；和(b)有机分子，其中有机分子与核心颗粒结合。14、如项13所述的组合物，其中，所述有机分子和核心颗粒形成一个在核心颗粒 表面上的有序重复的有机分子阵列。15、如项13或14所述的组合物，其中有机分子通过第三分子结合核心颗粒，所述 第三分子将有机分子与核心颗粒连接在一起。16、如项13至15任一项所述的组合物，其中所述有机分子通过至少一个共价键结 合核心颗粒，其中优选地所述共价键包括肽键。17、如项13至16任一项所述的组合物，其中所述有机分子通过至少一个共价键结 合核心颗粒，其中优选地所述共价键包括非肽键。18、如项13至17任一项所述的组合物，其中有机分子包括或者优选地是半抗原、 抗原或抗原决定簇，并且其中更优选地所述有机分子是抗原或抗原决定簇。19、如项13至18任一项所述的组合物，其中病毒样颗粒含有至少一个第一附着位 点，并且有机分子含有至少一个第二附着位点，这样所述第二附着位点能够与所述第一附 着位点缔合，优选地通过至少一个非肽键缔合，以形成有序重复的抗原阵列。20、如项13至19任一项所述的组合物，其中所述第一附着位点包含，优选地是氨 基基团，并且其中优选地所述第一附着位点包含，优选地是赖氨酸残基，并且其中所述第二 附着位点包含，优选地是巯基，并且其中优选地所述第二附着位点包含，优选地是半胱氨酸 残基。21、如项13至20任一项所述的组合物，其中所述第二附着位点不天然出现在所述 有机分子中。22、如项13至21任一项所述的组合物，其中所述组合物包含氨基酸接头，并且其 中优选地所述氨基酸接头通过至少一个共价键，优选地通过至少一个肽键与所述抗原或所 述抗原决定簇结合。23、如项13至22任一项所述的组合物，其中所述氨基酸接头包含所述第二附着位
点ο24、如项13至23任一项所述的组合物，其中所述氨基酸接头选自(a) CGG ；(b) N-末端 Yl 接头；(c) N-末端 Y 3 接头；(d) Ig 铰链区；(e) N-末端甘氨酸接头； (f) (G) kC (G) η，η = 0-12 且 k = 0-5 (SEQ ID NO :93)； (g) N-末端甘氨酸-丝氨酸接头；
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(h) (G)kC(G)m(S)1(GGGGS)1^n = 0-3, k = 0-5,m = 0-10,1 = 0—2 (SEQ IDNO 94)；(i)GGC ；(k) GGC-NH2 ；(I)C-末端 Yl 接头；(m) C-末端 γ 3 接头；(n) C-末端甘氨酸接头；(ο) (G)nC(G)k, η = 0-12 且 k = 0-5 (SEQ ID NO 95)；(ρ) C-末端甘氨酸-丝氨酸接头；(q) (G)m(S)1(GGGGS)n(G)0C(G)k, η = 0—3，k = 0—5，m = 0-10, 1 = 0—2，且 ο = 0-8(SEQID NO :96)。25、如项13至M任一项所述的组合物，其中所述有机分子选自(a)适于诱导抗癌细胞的免疫应答的有机分子；(b)适于诱导抗感染性疾病的免疫应答的有机分子；(c)适于诱导抗变应原的免疫应答的有机分子；(d)适于诱导改进的抗自身抗原的应答的有机分子；(e)适于在农畜或宠物中诱导免疫应答的有机分子；和(f)适于诱导抗药物、激素或有毒化合物的应答的有机分子和(g) (a)-(f)中所述分子的片段、突变蛋白质或结构域。26、如项13至25任一项所述的组合物，其中有机分子是选自如下的抗原或抗原决 定簇或者其片段或突变蛋白质(a)适于诱导抗癌细胞的免疫应答的抗原或抗原决定簇；(b)适于诱导抗感染性疾病的免疫应答的抗原或抗原决定簇；(c)适于诱导抗变应原的免疫应答的抗原或抗原决定簇；(d)适于诱导改进的抗自身抗原的应答的抗原或抗原决定簇；(e)适于在农畜或宠物中诱导免疫应答的抗原或抗原决定簇；和(f)适于诱导抗药物、激素或有毒化合物的应答的抗原或抗原决定簇；和(g) (a)-(f)中所述分子的片段或结构域。27、如项13至沈任一项所述的组合物，其中所述有机分子是选自如下的抗原(a) HIV 多肽，(b)流感病毒多肽，(c)丙型肝炎病毒多肽，(d)弓形体多肽，(e)恶性疟原虫多肽，(f)间日疟原虫多肽，(g)卵形疟原虫多肽，(h)三日疟原虫多肽，(i)乳腺癌细胞多肽，(j)肾癌细胞多肽，(k)前列腺癌细胞多肽，
(1)皮肤癌细胞多肽，(m)脑癌细胞多肽，(η)白血病细胞多肽，(ο)重组 profiling,(ρ)蜂螫刺变态反应多肽，(q)坚果变态反应多肽，(r)食物变态反应多肽，(s)哮喘多肽，或(t)衣原体多肽，(u) Her2,(ν) GD2,(w) EGF-R,(χ) CEA，(y) CD52,(ζ)人黑素瘤 gplOO，(aa)人黑素瘤 melanA/MART-1，(bb)酪氨酸酶，(cc)NA17-A nt,(dd)MAGE3,(ee)P53，和(ff)HPV16E7 ；禾口(gg) (a)至(ζ)及(aa)至(ff)的所述抗原的任何片段或突变蛋白质。28、如项13至27任一项所述的组合物，其中所述抗原或抗原决定簇是选自如下的 肽、蛋白质，或者蛋白质或肽的片段或突变蛋白质a)磷脂酶A2蛋白质；b)人 IgE;c)淋巴毒素；d)流感M2蛋白质；和e)Der ρ I 肽。29、如项13至28任一项所述的组合物，其中所述有机分子是抗原或抗原决定簇， 而且所述抗原或所述抗原决定簇是自身抗原或抗独特型抗体，或其片段。30、如项13至四任一项所述的组合物，其中所述自身抗原是选自如下的蛋白质、 肽或者其任何片段或突变蛋白质a)淋巴毒素；b)淋巴毒素受体；c) RANKL ；d) VEGF ；e) VEGFR ；f)白细胞介素5;
g)白细胞介素8;h)白细胞介素17 ；i)白细胞介素13 ；j)血管紧张肽；k)CCL21 ；1)CXCL12 ；m) SDF-I ；n) MCP-I ；ο) Endogl in;ρ)抵抗素；q) GHRH ；r) LHRH ；s) TRH;t)MIF ；U) Eotaxin;ν)缓激肽;w) BLC;χ) M-CSF ；χ)肿瘤坏死因子α (TNFa)；y)淀粉样 β 肽(Ai^42)；和ζ)人 IgE。31、如项13至30任一项所述的组合物，其中所述自身抗原是选自如下的淋巴毒素 或其片段a)淋巴毒素 a (LTa)；b)淋巴毒素β (LT β)；和c) LT α和LT β的混合或组合。32、如项13至31任一项所述的组合物，其中所述有机分子是适于诱导抗药物、激 素或毒素的免疫应答的有机分子。33、如项13至32任一项所述的组合物，其中所述有机分子是适于诱导抗药物的免 疫应答的有机分子。34、如项13至33任一项所述的组合物，其中所述药物选自(a)可待因；(b)芬太尼；(c)海洛因；(d)吗啡;(e)苯丙胺；(f)可卡因；(g)甲烯二氧甲苯丙胺；(h)甲苯丙胺；
(i)哌醋甲酯；(j)烟碱;(k) LSD ；(1)三甲氧苯乙胺；(M)叔胺吲哚磷酯；和(η)四氢大麻酚。35、如项13至34任一项所述的组合物，其中所述药物是烟碱。36、如项13至35任一项所述的组合物，其中有机分子适于诱导抗激素的免疫应答。37、如项13至36任一项所述的组合物，其中所述有机分子是激素，其选自包含如 下激素的组，优选选自由如下激素组成的组(a)孕酮；(b)雌激素；(c)睾酮；(d)促卵泡激素；(e)促黑素激素(melanin stimulating hormone)；(f)肾上腺素；和(g)去甲肾上腺素。38、如项13至37任一项所述的组合物，其中有机分子适于诱导抗毒素的免疫应答。39、如项13至38任一项所述的组合物，其中有机分子是毒素，选自(a)黄曲霉毒素；(b)ciguetera 毒素；(c)河豚毒素；(d)抗生素；和(e)抗癌剂。40、一种药物组合物，其包含(a)项13至39任一项所述的组合物和(b)可接受的药物载体。41、一种疫苗组合物，其包含免疫有效量的项13至39任一项所述的组合物。42、一种免疫方法，该方法包括施用项41所述的疫苗组合物。43、如项41所述的疫苗组合物，其还包含佐剂。44、一种用于产生非天然的、有序重复抗原阵列的方法，该方法包括(a)提供包含核心颗粒的分子支架，该核心颗粒选自(i) AP2O5 病毒；和(ii)AP205病毒样颗粒；禾口(b)提供适于诱导免疫应答的有机分子；(c)提供连接(a)和(b)的物质，所述物质可选地包含在(a)和/或(b)中，或者 作为一个单独分子存在；和
(d)组合(a)到(C)的元件，使所述有机分子与所述支架连接以形成有序重复的抗 原阵列。45、一种治疗或预防个体中疾病、病症或生理状况的方法，该方法包括向个体施用 项13至39任一项所述的组合物。46、一种治疗或预防个体中疾病、病症或生理状况的方法，该方法包括向个体施用 项41所述的疫苗组合物。47、一种核酸分子，其包含SEQ ID NO :125中所述的核苷酸序列。48、一种宿主细胞，其含有项47所述的核酸或项11所述的载体。49、如项48所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。50、一种产生项1至5任一项所述的病毒样颗粒的方法，该方法包括步骤(a)提供项47所述的核酸或项11所述的载体；(b)向宿主细胞中引入所述核酸或所述载体；(c)在所述宿主细胞中表达所述核酸或所述载体的序列以获得能形成项1所述的 病毒样颗粒的蛋白质或突变蛋白质。51、如项50所述的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。52、如项41所述的疫苗组合物，其用于免疫方法中，优选地，其中所述组合物还包 含佐剂。53、如项41所述的疫苗组合物在制备疫苗中的用途，其中所述疫苗被施用给对 象；优选地，其中所述组合物还包含佐剂。54、如项13-39之任一项所述的组合物，其用于治疗或预防个体疾病、病症或生理 学状况的方法中，所述方法包括给所述个体施用所述组合物。55、如项13-39之任一项所述的组合物在制备用于治疗或预防个体疾病、病症或 生理学状况的组合物中的用途，其中所述组合物被施用给所述个体。56、如项41所述的疫苗组合物，其用于治疗或预防个体疾病、病症或生理学状况 的方法中，所述方法包括给所述个体施用所述组合物。57、如项41所述的疫苗组合物在制备用于治疗或预防个体疾病、病症或生理学状 况的疫苗中的用途，其中所述疫苗组合物被施用给所述个体。


图IA-B显示了 AP205病毒样颗粒和AP205噬菌体颗粒相比较的电子显微照片，其 中所述AP205病毒样颗粒自大肠杆菌表达并纯化的重组蛋白质自发装配而成。图IA显示 AP205噬菌体颗粒的电子显微照片，而图IB所示是重组AP205VLP的自装配颗粒的电子显微 照片。图2显示AP205VLP和Q^VLP与Derpl. 2肽的偶联反应的SDS-PAGE分析。在 16% Tris-甘氨酸凝胶上，在还原条件下电泳样品。泳道1是蛋白质标记物，具有凝胶左 侧边缘标明的相应分子量；泳道2，衍生的Qi3衣壳蛋白；泳道3，Q^衣壳蛋白和Derpl. 2 肽的偶联反应的上清液；泳道4，Q^衣壳蛋白和Derpl. 2肽的偶联反应的沉淀；泳道5，衍 生的AP205VLP ；泳道6 :AP205VLP和Derpl. 2肽的偶联反应的上清液；泳道7，AP205VLP和 Derpl. 2肽的偶联反应的沉淀。在图中，箭头标示对应于每个单体与1，2，3，4或5个肽偶联
14的偶联产物。与Q0衣壳蛋白比较，更大数量的表位可以与AP205VLP偶联。图3显示在免疫小鼠血清中“Derpl. 2”特异的IgG抗体的ELISA分析，其中该小鼠 用分别与AP205VLP或Qi3衣壳蛋白偶联的Derpl. 2肽免疫。测定了总IgG效价和IgG亚 型效价。针对每种IgG亚型分析了免疫前血清，在所有分析的免疫前血清中均未能检测到 Derpl. 2特异的抗体。该图显示对于AP205和Q β，诱导了 Thl免疫应答典型的抗体亚型，因 为IgGh效价比IgGl效价高得多。用偶联VLP的肽获得了强的特异性抗肽免疫应答。通 过ELISA也测定了对载体特异的抗体，并且对两种载体，这些是相当的。图4A-4C显示所用不同真核生物表达载体的部分序列。仅示出了修饰的序列。图 4A:pC印-Xa-Fc * 显示了从BamHI位点起的序列，在翻译序列(SEQ ID NO :103和SEQ ID NO 104)上方显示了不同特征。箭头指示因子)(a蛋白酶的切割位点。图4B :pCep-EK-Fc * 显示了从BamHI位点起的序列，在翻译序列(SEQ ID NO :105和SEQ ID NO :106)上方 显示了不同特征。箭头指示肠激酶的切割位点。HindIII位点下游序列与图4A中所示序列 相同。图4C :pC印-SP-EK-Fc * 显示从信号肽起始的序列，翻译序列(SEQ ID NO :107和 SEQ ID NO 108)上方显示了不同特征。用粗体表示信号肽酶切割的信号肽序列。箭头指 示肠激酶切割位点。HindIII位点下游序列与图4A中所述序列相同。图5A-B显示rMIF构建体，和表示rMIF构建体的表达和纯化的SDS-PAGE，该构建 体用于与AP205VLP偶联。图5A显示MIF构建体的示意图，该构建体具有添加的包含半胱 氨酸残基的氨基酸接头。图5B显示在还原条件下电泳并且用考马斯亮蓝染色的纯化MIF构 建体的SDS-PAGE分析。图5A中，凝胶上的加样是纯化的大鼠构建体rMIF_Cl (SEQ ID NO 114), rMIF-C2(SEQ ID NO :115)和 rMIF_C3(SEQ ID NO :117)。图6显示rMIF-Cl与AP205VLP偶联反应的结果。泳道1 分子标记物。泳道2 AP205VLP。泳道3 衍生的AP205VLP。泳道4 经透析的衍生的AP205VLP。泳道5 经透析 的衍生的AP205VLP。泳道6:rMIF-Cl与AP205VLP的偶联反应。在图中用箭头标明了偶联 产物。在凝胶左侧边缘标出了标记物蛋白质的分子量。图7显示在用偶联AP205VLP的rMIF_Cl免疫的小鼠的血清中，对rMIF_Cl特异的 IgG免疫应答的ELISA分析。图8显示在0和14天免疫的3只小鼠(1_3)的血清中Angio I肽特异的IgG抗 体的ELISA分析，其中小鼠用与AP205VLP偶联的Angio I肽免疫。在第21天血清中测定 总IgG效价。发明详述定义下面的定义是对相关领域普通技术人员通常理解的概念的总结，提供这些定义旨 在用于理解下面的公开，但是不意味着其限制本公开。氨基酸接头如这里所使用的，本说明书中“氨基酸接头”，或也称为“接头”在于连 接第二附着位点与抗原或抗原决定簇，或者更优选地，其已经包含或含有第二附着位点，通 常，但不是必需地，该位点为一个氨基酸残基，优选地为半胱氨酸残基。然而，即使由氨基酸 残基组成的氨基酸接头是本发明优选的实施方式，但是这里使用的术语“氨基酸接头”并没 有意指这种氨基酸接头专门地由氨基酸残基组成。氨基酸接头的氨基酸残基优选地由本领 域已知的天然氨基酸或非天然氨基酸，全L或全D或其混合物组成。然而，包含具有巯基或
15半胱氨酸残基的分子的氨基酸接头也包括在本发明中。这种分子优选地包含C1-C6烷基_、 环烷基(C5，C6)、芳基或杂芳基组成部分。然而，除了氨基酸接头外，优选地包含C1-C6烷 基_、环烷基_(C5，C6)、芳基或杂芳基组成部分并且无任何氨基酸的接头也包括在本发明 范围内。抗原或抗原决定簇或可选地第二附着位点和氨基酸接头之间的连接优选地通过至 少一个共价键，更优选地通过至少一个肽键进行。动物这里使用的术语“动物”意在包括例如人类、绵羊、麋鹿、鹿、黑尾鹿、貂、哺乳 动物、猴子、马、牛、猪、山羊、狗、猫、大鼠、小鼠、鸟、鸡、爬行动物、鱼、昆虫和蛛形纲动物。抗体这里所用术语“抗体”指能结合表位或抗原决定簇的分子。该术语意在 包括整个抗体和其抗原结合片段，包括单链抗体。这些抗体包括人抗原结合抗体片段，并 且包括，但不限于Fab，Fab'和F(ab' ) 2，Fd，单链Fvs (scFv)，单链抗体，二硫键连接的 FvS(SdFV)及含有\或Vh结构域的片段。抗体可以来源于任何动物来源，包括鸟类和哺乳 动物。优选地，抗体来自哺乳动物，例如人类、鼠、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马等等或者其它适合 的动物例如鸡。这里所用术语“人”抗体包括具有人类免疫球蛋白氨基酸序列的抗体，并包 括从人类免疫球蛋白文库分离的抗体或者从具有一种或多种人类免疫球蛋白基因并且不 表达内源免疫球蛋白的动物分离的抗体，例如，参见美国专利号5，939，598中所述，这里整 体将该文献并入为参考文献。抗原这里所用术语“抗原”指能被抗体结合或者在被MHC分子呈递后能被T细胞 受体(TCR)结合的分子。这里所用术语“抗原”也包括T-细胞表位。在MHC I类(存在于 除了红细胞以外的所用身体细胞上)背景中，或者MHC II类(存在于免疫细胞上，并且特别 是抗原呈递细胞上)背景中，T细胞受体识别T-细胞表位。该识别事件引起了 T细胞和随 后效应机制的激活，诸如T细胞增殖、细胞因子分泌、穿孔素分泌等。抗原还能被免疫系统 识别和/或能诱导引起B-和/或T-淋巴细胞激活的体液免疫应答和/或细胞免疫应答。 然而，这可能要求，至少在一些情况下，抗原含有或连接Th细胞表位，并且以在佐剂中的形 式给出。抗原可以有一种或多种表位(B-和T-表位)。上述特异性反应意思是指抗原典型 地以高度选择性方式优先地与其相应抗体或TCR反应，并且不与可能由其它抗原激发的大 量其它抗体或TCR反应。这里所用抗原也可以是几种单独抗原的混合物。这里所用抗原包 括但不限于变应原、自身抗原、半抗原、癌抗原和感染性疾病抗原及有机小分子诸如滥用的 药物(象烟碱)及其片段和衍生物。而且，用于本发明的抗原可以是肽、蛋白质、结构域、碳 水化合物、生物碱、脂质或小分子诸如，类固醇激素和其片段和衍生物。抗原决定簇这里所用术语“抗原决定簇”意指B或T淋巴细胞特异地识别的抗原 部分。B-淋巴细胞通过抗体产生对外源抗原决定簇应答，而T淋巴细胞是细胞免疫的介导 者。因此，抗原决定簇或表位是被抗体识别的或者在MHC背景中被T细胞受体识别的那些 抗原部分。抗原决定簇含有一个或多个表位。在脊椎动物中，变应原也起到抗原作用。变应原这里所用术语“变应原”指与变态反应有关的抗原。变态反应以释放炎性 因子，特别是组胺，及在个体中导致病理学炎症为特征。变态反应通常也与抗变应原的IgE 抗体有关。这里所用术语“变应原”也包括“变应原提取物”和“变应原性表位”。变应原的 例子包括但不限于花粉(例如，草、豚草、桦树和雪松(mountain cedar))；屋尘螨和尘螨； 哺乳动物表皮变应原和动物毛发皮屑；霉菌和真菌；昆虫身体和昆虫毒液；羽毛；食物；和 药物(例如，青霉素)。
AP205病毒样颗粒或AP205VLP 这里所用术语“AP205病毒样颗粒”或“AP205VLP” 指组合物或病毒样颗粒，其包含，或可替代地基本组成为，或可替代地并优选地组成为至少 一种噬菌体AP205蛋白质或外壳蛋白质，或其片段或突变蛋白质，其中所述至少一种外壳 蛋白或其片段或突变蛋白质典型地并优选地能装配形成病毒样颗粒。在可替代和优选的 实施方式中，这里所用术语“AP205病毒样颗粒”或“AP205VLP”指组合物或病毒样颗粒，其 包含，或可替代地基本组成为，或可替代地和优选地组成为至少一种噬菌体AP205蛋白质 或外壳蛋白或其突变蛋白质，其中所述至少一种噬菌体AP205外壳蛋白或所述其突变蛋白 质能装配形成病毒样颗粒。在本发明非常优选的实施方式中，术语“AP205病毒样颗粒”或 “AP205VLP”指组合物或病毒样颗粒，其包含，或可替代地基本组成为，或可替代地和优选地 组成为至少一种具有SEQ ID NO :1中所述氨基酸序列的噬菌体AP205外壳蛋白，其中典型 地且优选地，所述至少一种外壳蛋白能装配成病毒样颗粒或衣壳。在本发明另一可替代的 非常优选的实施方式中，术语“AP205病毒样颗粒”或“AP205VLP”指组合物，其包含，或可 替代地基本组成为，或可替代地且优选地组成为至少一种具有SEQ IDNO 3中所述氨基酸 序列的噬菌体AP205外壳蛋白的突变蛋白质，其中所述至少一种所述外壳蛋白的突变蛋白 质能装配成病毒样颗粒。在本发明另一可替代的非常优选的实施方式中，术语“AP205病毒 样颗粒”或“AP205VLP”指组合物或病毒样颗粒，其包含，或可替代地基本组成为，或可替代 地且优选地组成为至少一种具有SEQ ID NO :1中或SEQ ID NO :3中所述氨基酸序列的噬 菌体AP205外壳蛋白的突变蛋白质，其中所述至少一种所述蛋白质的突变蛋白质能装配成 病毒样颗粒。在本发明另一可替代的非常优选的实施方式中，术语“AP205病毒样颗粒”或 “AP205VLP”指组合物或病毒样颗粒，其包含，或可替代地基本组成为，或可替代地和优选地 组成为至少一种具有SEQ ID NO :1中所述或SEQ ID NO :3中所述氨基酸序列的突变蛋白 质，其中添加、缺失或置换了至少1个氨基酸残基，优选地3个氨基酸残基，更优选地2个氨 基酸残基，甚至更优选地1个氨基酸残基，其中优选地，所述至少一个置换是保守性置换。 在本发明再一可替代的非常优选的实施方式中，术语“AP205病毒样颗粒”或“AP205VLP” 指组合物或病毒样颗粒，其包含，或可替代地基本组成为，或可替代地和优选地组成为至少 一种具有SEQ ID NO 1中所述或SEQ ID NO 3中所述氨基酸序列的突变蛋白质，其中缺失 或置换了至少1个半胱氨酸残基、优选地3个半胱氨酸残基、更优选地2个半胱氨酸残基， 甚至更优选地1个半胱氨酸残基，其中优选地，所述至少一个置换是保守性置换。在本发明 另一个可替代的非常优选的实施方式中，术语“AP205病毒样颗粒”或“AP205VLP”指组合 物或病毒样颗粒，其包含，或可替代地基本组成为，或可替代地和优选地组成为至少一种具 有SEQ ID NO :1中所述或SEQ IDNO :3中所述氨基酸序列的突变蛋白质，其中添力Π、缺失或 置换了至少1个赖氨酸残基，优选地3个赖氨酸残基，更优选地2个赖氨酸残基，甚至更优 选地1个赖氨酸残基，其中优选地，所述至少一个置换是保守性置换。随着本说明书的描 述，AP205VLP的其它优选的实施方式将显而易见。组成AP205VLP的AP205亚单位每一个 均可以通过二硫键与颗粒中的其它亚单位连接，或者做为替代方案，大多数AP205VLP亚单 位通过二硫键与颗粒中的其它AP205VLP亚单位连接。在一些实施方式中，少数或没有一个 AP205VLP亚单位通过二硫键与颗粒中其它AP205VLP亚单位连接。缔合(association)这里所用术语“缔合”当用于第一和第二附着位点时，指第 一和第二附着位点的结合，优选地通过至少一个非肽键结合。缔合的性质可以是共价的、离子的、疏水的、极性的或它们的任何组合，优选地缔合的性质是共价的。第一附着位点这里所用短语“第一附着位点”指非天然或天然来源的元件，位于 抗原或抗原决定簇上的第二附着位点可以与其缔合。第一附着位点可以是蛋白质、多肽、 氨基酸、肽、糖、多核苷酸、天然或合成聚合物，次生代谢物或化合物(生物素、荧光素、视黄 醇、地高辛配基、金属离子、苯甲基磺酰氟化合物)，或它们的联合或者它们的化学反应基 团。通常地和优选地，第一附着位点位于核心颗粒诸如，优选地病毒样颗粒的表面上。多个 第一附着位点通常以重复构型存在于核心或病毒样颗粒的表面上。第二附着位点这里所用短语“第二附着位点”指与抗原或抗原决定簇连接的元 件，位于核心颗粒或病毒样颗粒表面上的第一附着位点可以与其缔合。抗原或抗原决定簇 的第二附着位点可以是蛋白质、多肽、肽、糖、多核苷酸、天然或合成聚合物、次生代谢物或 化合物(生物素、荧光素、视黄醇、地高辛配基、金属离子、苯甲基磺酰氟化合物)，或它们的 联合或者它们的化学反应基团。至少一个第二附着位点存在于抗原或抗原决定簇上。因此， 术语“具有至少一个第二附着位点的抗原或抗原决定簇”指包含至少该抗原或抗原决定簇 和该第二附着位点的抗原或抗原性构建体。然而，特别是对于非天然来源，即，不天然出现 在抗原或抗原决定簇中的第二附着位点，这些抗原或抗原性构建体包含“氨基酸接头”。结合这里所用术语“结合”指可以是例如通过化学偶联的共价的结合或附着，或 者可以是通过例如离子相互作用、疏水相互作用、氢键等的非共价的结合或附着。共价键可 以是例如酯、醚、磷酸酯、酰胺、肽、二酰亚胺、碳-硫键、碳-磷键等等。术语“结合”更广义， 并且包括术语诸如“偶联”、“融合”和“附着”。外壳蛋白这里所用术语“外壳蛋白”指能在噬菌体或RNA噬菌体衣壳装配中掺入 的噬菌体或RNA噬菌体蛋白质。外壳蛋白也称为CP。在本发明中，该术语更常指RNA噬菌 体AP205的外壳蛋白。核心颗粒这里所用术语“核心颗粒”指具有固有重复组织的刚性结构。这里所用 核心颗粒可以是合成过程的产物或者是生物学过程的产物。疾病(disease)、病症(disorder)，状况(condition)这里所用术语“疾病”或“病 症”指个体的任何不利状态，包括肿瘤、癌症、变态反应、成瘾、自身免疫性、中毒或最佳的精 神或身体功能的受损。这里所用“状况”包括疾病和病症，但是也指生理状态。例如，生育 力是生理状态而不是疾病或病症。因此，将适于通过降低生育力预防怀孕的本发明组合物 描述为对状况(生育力)的治疗，而不是对病症或疾病的治疗。本领域技术人员明了其它 的状况。表位这里所用术语“表位”指由单个抗体或T细胞受体识别的基本元件或最小单 位，因此也指抗体或T细胞受体结合的特定结构域、区域或分子结构。抗原可以由大量表位 组成，而半抗原通常具有很少的表位。免疫应答这里所用术语“免疫应答”指个体免疫系统针对分子或化合物(诸如 抗原)的任何行动。在哺乳动物中，免疫应答包括细胞的活动和可溶分子诸如细胞因子和 抗体的产生。因此，该术语包括体液免疫应答和/或引起B和/或T-淋巴细胞激活或增殖 的细胞免疫应答。然而，在一些情况下，免疫应答可能具有低的强度，只有当使用至少一种 本发明物质时才可检测。“免疫原性的”指用于刺激活生物体的免疫系统的试剂，这种刺激 使得免疫系统的一种或多种功能增强，并且定向于该免疫原性剂。“免疫原性多肽”是在佐剂存在或不存在的情况下，单独地或是与载体连接时能激发细胞和/或体液免疫应答的多 肽。“免疫偏离”这里所用术语免疫偏离指刺激与预先存在的免疫应答具有不同性质 的免疫应答。例如，可以通过本发明实施方式，诱导具有对抗变应原的TH2免疫应答(这样 一旦暴露于变应原将产生IgE抗体)的个体，产生抗变应原的ThI免疫应答。这种ThI应答 将抵消诱导变态反应的Th2应答，由此缓解变应性疾病。免疫治疗这里所用术语“免疫治疗”指用于疾病、病症或状况治疗的组合物。更 具体地，该术语用于指通过接种引起有益的免疫应答的治疗方法。免疫有效量这里所用术语“免疫有效量”指当引入个体中时足以在个体中诱导免 疫应答的组合物的量。达到免疫有效所必需的组合物的量根据许多因素而变化，这些因素 包括组合物，组合物中其它成分的存在(例如，佐剂)，抗原，免疫途径，个体，以前的免疫或 生理状态等。个体这里所用术语“个体”指多细胞生物体，并且包括植物和动物。优选地多细 胞生物体是动物，更优选地是脊椎动物，甚至更优选地是哺乳动物，最优选地是人类。低或不可检测的这里所用短语“低或不可检测的”当用于基因表达水平时指表达 水平显著低于最大限度地诱导基因时所观察到的表达水平(例如，至少低5倍)，或者该表 达水平通过本文实施例中所用方法不容易检测到。模拟表位(mimotope)这里所用术语“模拟表位”指诱导对抗原或抗原决定簇 的免疫应答的物质。一般地，与特定抗原相关联使用术语模拟表位。例如，激发抗磷脂酶 A2(PLA2)抗体产生的肽是与该抗体结合的抗原决定簇的模拟表位。模拟表位可以与诱导的 免疫应答所针对的抗原或抗原决定簇有或没有相似的实质结构或共有结构特性。本领域已 知并且在本文其它地方也描述了产生和鉴定诱导针对特定抗原或抗原决定簇的免疫应答 的模拟表位的方法。突变蛋白质这里所用术语“突变蛋白质”指有一个或多个氨基酸不同于给定的 参照(例如，天然、野生型等)多肽的蛋白质或多肽，其中这种差异由至少一个氨基酸的 添加、置换或缺失或它们的联合引起。优选的实施方式包括由至少一个氨基酸置换引起 的突变，优选地由至少一个氨基酸的保守性置换引起的突变。保守性置换包括同构置换 (isostericsubstitution)，在该置换中维持氨基酸的电荷、极性、芳香族、脂肪族或疏水性 质。例如，用丝氨酸残基置换半胱氨酸残基是保守性置换。在本发明优选的实施方式中，术 语“突变蛋白质”指有3个，优选地2个，最优选地1个氨基酸不同于给定参照(例如，天然、 野生型等)多肽的蛋白质或多肽，其中这种差异由添加、置换或缺失或它们的联合引起。在 本发明其它优选的实施方式中，术语“突变蛋白质”指有3个，优选地2个，最优选地1个氨 基酸不同于给定参照(例如，天然、野生型等)多肽的蛋白质或多肽，其中这种差异来源于 3个，优选地2个，最优选地1个氨基酸的置换，优选地来源于3个，优选地2个，最优选地1 个氨基酸的保守性置换。天然来源这里所用术语“天然来源，，意指物质的整体或其部分不是合成的，而是 在自然界中存在或产生的。优选地，这里所用术语“天然来源”意指就整体而言不是合成的， 而是在自然界中存在和产生的。非天然的一般地，这里用该术语指非来源于自然界，更具体地，该术语指来源于
19人工。非天然来源的这里所用术语“非天然来源的” 一般指合成的，或非来源于自然界 的；更具体地指来源于人工的。有序和重复的抗原或抗原决定簇阵列这里所用术语“有序重复的抗原或抗原决 定簇阵列”一般地指抗原或抗原决定簇的重复模式，其特征在于抗原或抗原决定簇相对于 核心颗粒或病毒样颗粒的一种典型地且优选地一致的空间排列。在本发明一个实施方式 中，重复模式可以是几何学模式。适宜的有序重复抗原或抗原决定簇阵列的典型和优选例 子是具有严格重复的抗原或抗原决定簇次晶晶序的阵列，优选地具有1到30纳米晶面间距 (spacing)，优选地5到15纳米晶面间距。有机分子如这里所用术语“有机分子”或本发明提到的“有机分子”优选地包括 抗原和抗原决定簇、变应原、自身抗原、半抗原、癌症抗原和感染性疾病抗原及有机小分子 诸如滥用的药物(如烟碱)及它们的片段和衍生物。多肽这里所用术语“多肽”指由氨基酸残基，一般地天然氨基酸残基，通过肽键连 接在一起形成的聚合物。多肽不必限定大小，并且包括蛋白质和肽。肽是大小为通常约5 到约50个氨基酸或者该通常范围内的任何数量氨基酸的多肽。然而，肽也可以具有更长的 长度，例如达到120-150个氨基酸。蛋白质这里所用术语蛋白质指通常具有大于约5个或更多个，10个或20个以上 或更多个，25个或更多个，50个或更多个，75个或更多个，100个或更多个，200个或更多个， 500个或更多个，1000个或更多个，2000个或更多个氨基酸的多肽。尽管蛋白质不一定有确 定的三维结构，但是蛋白质通常具有确定的并常常称为折叠的三维结构，这与常常不具有 确定三维结构而是采用大量不同的构象并且称为未折叠的肽和多肽不同。然而，肽也可以 具有确定的三维结构。纯化的如这里所用，当术语“纯化的”用于指分子时，它意指被纯化的分子相对于 在该分子的天然环境中或者在产生、发现或合成该分子的环境中与该分子相关的分子，其 浓度已经得以增加。天然相关分子包括蛋白质、核酸、脂质和糖，但是一般不包括为维持被 纯化分子的完整性或有利于该分子的纯化而添加的水、缓冲液和试剂。例如，即使在寡dT 柱层析期间mRNA被水性溶剂稀释，但如果天然相关核酸和其它生物学分子不结合柱子并 且与所述mRNA分子分离，那么通过该层析亦纯化了 mRNA分子。根据该定义，当相对于杂质 考虑时，物质可以是5%或以上，10%或以上，20%或以上，30%或以上，40%或以上，50%或 以上，60%或以上，70%或以上，80%或以上，90%或以上，95%或以上，98%或以上，99%或 以上或100%纯度。受体这里所用术语“受体”指能与称为配体的另一分子相互作用的蛋白质、糖蛋 白或其片段。该配体可以属于任何类型的生物化学或化学化合物。受体不需要一定是结合 膜的蛋白质。可溶蛋白质，象麦芽糖结合蛋白质或视黄醇结合蛋白质也是受体。残基这里所用术语“残基”意指多肽主链或侧链中的具体氨基酸。重组宿主细胞这里所用术语“重组宿主细胞”指其中已经引入本发明一种或多种 核酸分子的宿主细胞。宿主细胞包括真核生物，包括例如哺乳动物、昆虫、植物、鸟类、酵母； 和原核生物例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(B. subtilis)等。RNA噬菌体这里所用术语“ RNA噬菌体”指感染细菌的RNA病毒，更具体地指感染细菌的单链正义RNA病毒。自身抗原这里所用术语“自身抗原”指能被宿主DNA编码的分子或化合物。这 种自身抗原包括肽、蛋白质、碳水化合物、核酸、脂质和其它生物分子。更通常地和优选地， 术语“自身抗原”指宿主DNA编码的多肽或蛋白质。通过宿主DNA编码的蛋白质或RNA产 生的产物也定义为自身的。通过翻译后修饰和蛋白酶解加工或通过自身基因产物可变剪接 修饰的蛋白质也定义为自身的。通过宿主DNA编码的蛋白质或RNA产生的产物被定义为自 身的。此外，由2种或几种自身分子联合产生的蛋白质，或者代表自身分子的一部分的蛋白 质，和与上述自身分子具有高度同源性(> 95%，优选地> 97%，更优选地> 99%，)的蛋 白质也可以考虑是自身的。载体这里所用术语“载体”指用于向宿主细胞传送遗传材料的工具(例如质粒或 病毒)。载体可以由DNA或RNA组成。病毒样颗粒(VLP)这里所用术语“病毒样颗粒”指类似病毒颗粒的结构。而且， 本发明病毒样颗粒由于缺少所有或部分病毒基因组，特别是病毒基因组中的复制和感染元 件，所以它是非复制和非感染性的。本发明病毒样颗粒可以含有不同于其基因组的核酸。本 发明病毒样颗粒的典型和优选的实施方式是病毒衣壳，诸如病毒，噬菌体或RNA噬菌体的 病毒衣壳。这里可交换地使用的术语“病毒衣壳”和“衣壳”指由病毒蛋白质亚单位组成的 大分子装配物。典型并优选地，病毒蛋白质亚单位装配成病毒衣壳或衣壳，所述衣壳具有固 有的重复组织的结构，其中所述结构通常是球形或管状。例如，RNA噬菌体的衣壳具有二十 面对称的球形。这里所用术语“衣壳样结构”指由病毒蛋白质亚单位组成的大分子装配物， 其形态类似上述意义的衣壳，但是偏离典型的对称装配，而是维持了足够程度的有序和重 复性。噬菌体的病毒样颗粒这里所用术语“噬菌体的病毒样颗粒”指类似噬菌体结构的 病毒样颗粒，其是非复制和非感染性的，并且缺少至少一种或多种编码噬菌体复制机器的 基因，并且典型地也缺少一种或多种编码负责病毒附着或进入到宿主中的蛋白质的基因。 然而，该定义也应该包括这样的噬菌体病毒样颗粒，其中前述一种或多种基因仍旧存在但 是已失活，因此也导致非复制和非感染性的噬菌体病毒样颗粒。病毒颗粒这里所用术语“病毒颗粒”指病毒的形态学形式。在一些病毒类型中， 它包括蛋白质衣壳环绕的基因组；其它病毒还具有另外的结构(例如，包膜，尾等)。一个/ 一种除非另有说明，当在本公开中使用术语“一个/ 一种”时，它们意指 “至少一个/ 一种”或者“一个/ 一种或多个/多种”。如这里所用，当指任何数值时，术语“约”意指所述值士 10%的值(例如，“约50°C” 包括从45°C到55°C的温度范围，包含45°C和55°C在内；类似地，“约lOOmM”包括从90mM到 IlOmM的浓度范围，包含90mM和IlOmM在内)。_既述我们已经公开了利用本发明载体可以在细菌中表达重组的AP205外壳蛋白，并且 获得其纯化形式。在细菌中，重组AP205外壳蛋白自发地自装配为AP205病毒样颗粒。本发 明提供了适于AP205VLP表达的宿主细胞和载体，和能装配的AP205外壳蛋白变异体形式。 这些表达的VLP、来源于天然来源的AP205VLP或AP205病毒颗粒可以结合有机分子以产生 有序重复的有机分子阵列。本发明的有机分子包括抗原、变应原、自身抗原、半抗原、癌症抗
21原和感染性疾病抗原。在一个实施方式中，有机分子是多肽或蛋白质。通过附着、连接、融合或其它结合方式(包括共价和非共价键)可以形成本发明缀 合物，即，有机分子与VLP结合。在一个实施方式中，VLP含有第一附着位点，有机分子含有 第二附着位点。可以通过直接地或者利用第三分子，典型地且优选地借助于交联剂，连接第 一和第二附着位点，从而实现与有机分子间的缔合。附着位点可以天然存在或者可以引入。 在优选的实施方式中，该结合包含至少一个共价键，优选地包含肽键或者可替代地和优选 地包含非肽键。用本发明提供的AP205VLP缀合物或用包含这种缀合物的组合物免疫动物，可以 诱导抗所展示的有机分子的强免疫应答。因此，本发明缀合物和组合物可以用于刺激抗各 种展示的抗原的免疫应答，因此可以用于动物中使用。本发明也涉及一种疫苗，该疫苗包含 免疫有效量的具有本发明一种或多种缀合物的组合物及药物学可接受的稀释剂、载体或赋 形齐IJ。AP205VLP可以用于接种以抵抗例如半抗原、变应原、肿瘤、病毒疾病或自身分子或非 肽小分子。接种可以用于预防或治疗目的，或者这两种目的。在相关方面，抗这种组合物产 生的免疫分子或抗体，诸如抗体，可以用于疾病、状况或病症的治疗、预防或诊断。本发明的 这种抗体和组合物也可以以试剂盒形式使用。AP205噬菌体外壳蛋白的克隆AP205基因组由成熟蛋白质、外壳蛋白、复制酶及在相关噬菌体中不存在的两个开 放读框(一个裂解基因和一个开放读框在成熟基因的翻译中起作用)组成(Klovins，J.， 等，J. Gen. Virol. 83 1523-33 (2002))。在本发明的一个方面，利用本领域已知的方法，通 过AP205噬菌体RNA的逆转录，之后通过PCR分离外壳蛋白质cDNA。将包含外壳蛋白基因 上游的核糖体结合位点的外壳蛋白cDNA克隆到载体pQblO (K0Zl0VSka，T. Μ.，等，Gene137 133-37(1993))中。在另一个方法中，AP205外壳蛋白cDNA可以克隆到载体pQbl85中，置 换噬菌体Q0外壳蛋白基因，并由此位于载体中的核糖体结合位点下游。这两种方法都引 起了蛋白质的表达和衣壳的形成。因此，在本发明中，可以从含有核糖体结合位点的载体表 达外壳蛋白，其中该核糖体结合位点不是AP205核糖体结合位点，而是诸如载体pQbl85中 的核糖体结合位点。载体pQblO和pQbl85是来源于pGEM载体的载体，在这些载体中trp启动子控 制克隆基因的表达(Kozlovska, Τ. Μ..等，Gene 137:133-37(1993))。pAP283_58 (SEQ ID NO. 2)在下面序列中包含推定的AP205核糖体结合位点，其位于^CbaI位点下游和AP205外 壳蛋白 ATG 起始密码子的紧上游tctagatagaATTTTCTGCGCACCCATCCCGGGTGGCGCCCAAAGT^A GGAAAATCACatg (SEQ ID NO :5)。载体pQbl85包含位于)(bal位点下游和起始密码子上游的 SD (Shine DelaRarno)序列(tctagaTTMCCCAACGCGTAGGAGTCAGGCCatg (SEQ ID N0:6)，下划 线的是SD序列)，其也存在于载体pAP^l-32(SEQ ID No. 4)中。本领域已知的其它载体包 括，例如PKK223. 3，ρΕΤ载体家族，pBR322(Sutcliffe，J. G. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 43Ptl :77-90 (1979))，pUC18，pUC19，如本领域技术人员所认识到的，如果这些载体不 存在启动子和核糖体结合位点或者不适于外壳蛋白的表达和随后病毒样颗粒的形成，则可 以对所有这些载体进行修饰以包含适宜的启动子和核糖体结合位点。来源于前述载体的其 它载体和适于在大肠杆菌或者本领域技术人员已知的其它宿主中表达蛋白质的其它载体， 和一般地适于在大肠杆菌或者其它宿主中表达蛋白质的任何载体均适于实施本发明，条件是它们允许外壳蛋白表达和随后形成病毒样颗粒。在本发明的一个方面，将用于AP205外 壳蛋白基因表达的载体转染到大肠杆菌中。适合的大肠杆菌菌株包括，但不限于大肠杆菌 K802，JM109，RRl。本领域普通技术人员已知其它大肠杆菌菌株，并且通过SDS-PAGE检测外 壳蛋白的表达，及通过可选地首先凝胶过滤纯化衣壳，随后在免疫扩散试验(Ouchterlony 试验)或电子显微镜术(Kozlovska, T.M..等，Gene 137 :133-37(1993))中检测衣壳来测 试衣壳的形成和装配，可以鉴定载体和菌株的适宜联合。由于在大肠杆菌胞质中加工，从载体pAP^3_58和pAP^l_32表达的AP205外壳 蛋白可以无起始的甲硫氨酸氨基酸。切除了甲硫氨酸的多肽，特别是切除了甲硫氨酸的SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 3的多肽，及产生本发明AP205VLP的未切割形式的AP205多肽，或 者产生本发明AP205VLP的以上多肽的混合物均是本发明实施方式，并且在本发明范围内。AP205病毒样颗粒在一个实施方式中，本发明提供了形成衣壳的AP205外壳蛋白。这种蛋白质通过 重组方式表达或从天然来源制备。能装配为VLP的重组AP205外壳蛋白片段也是本发明的 实施方式。通过外壳蛋白的内部或者末端缺失可以产生这些片段。与装配为VLP相容的在 外壳蛋白序列中的插入或与外壳蛋白序列的融合也是本发明的实施方式。可以通过电子显 微镜术检测外壳蛋白序列的插入、缺失和融合的结果、及其是否与装配为VLP相容。本发明提供了重组AP205外壳蛋白的纯化方法。利用沉淀分级分离步骤和凝胶过 滤纯化步骤的联合，可以以纯化形式分离由AP205外壳蛋白形成的颗粒。分离病毒样颗粒 的其它方法是本领域已知的，并且可以用于分离噬菌体AP205的病毒样颗粒(VLP)。例如， 美国专利号4，918，166中描述了超离心用于分离酵母逆转录转座子Ty的VLP的用途，这 里将这篇文献整体并入为参考文献。除了凝胶过滤外，也可以使用其它层析步骤诸如离子 交换、疏水相互作用或者亲和层析。重组AP205外壳蛋白的表达引起病毒样颗粒的装配，当通过电子显微镜术分析 时，该病毒样颗粒和噬菌体颗粒具有相同外观和大小。可以纯化这些VLP是本发明的发现。 因此，本发明提供了新的VLP，该VLP可以以高数量纯化形式获得。大肠杆菌中自装配的AP205VLP与AP205噬菌体颗粒具有相同的外观和大小。与 针对其它VLP所证明的一样(多瘤病毒VPlVLP和乳头瘤病毒L1VLPS，Chackerian B.等， PNAS 96 :2373-2378(1999)),实验条件的操作或表位与VLP的融合可以导致具有不同装 配状态的VLP。例如，可以获得比野生型或主要颗粒形式具有低的三角划分数的颗粒。因 此，比AP205噬菌体颗粒更小尺寸的AP205VLP，或者与AP205噬菌体颗粒相比同样尺寸的 AP205VLP和更小尺寸的AP205VLP的混合物也是本发明的实施方式。如W003/0M481的实施例17中所述，在非还原性PAGE中分析时比在还原性PAGE 中分析时，AP205VLP亚单位电泳具有更高表观分子量，表明这些亚单位通过二硫键缔合。在另一个方面，本发明提供了含有适于AP205病毒样颗粒产生的开放读框的载 体，所述载体还包含额外的核酸，这样，由此得到的载体能产生包含所述额外核酸编码的氨 基酸的重组AP205病毒样颗粒。在另一方面，本发明提供了含有适于AP205病毒样颗粒产生的开放读框的载体， 所述载体还包含适于引入额外核酸的限制酶位点，这样由此得到的载体能产生包含所述额 外核酸编码的氨基酸的重组病毒样颗粒。
有机分子，半抗原和抗原本发明方法、缀合物和组合物中使用的有机分子包括任何抗原、半抗原、有机分子 或其片段。本发明分子包括本身(g卩，不结合AP205病毒或病毒样颗粒)在动物中不能诱导 免疫应答的半抗原、有机分子和抗原片段。有机分子包括例如(a)适于诱导抗癌细胞的免 疫应答的有机分子；(b)适于诱导抗感染性疾病的免疫应答的有机分子；(C)适于诱导抗变 应原的免疫应答的有机分子；(d)适于诱导抗自身抗原的免疫应答的有机分子；(e)适于诱 导抗药物、激素或毒素，特别是滥用的药物的免疫应答的抗原或半抗原；和(f) (a)-(e)中 所述任何有机分子、抗原或半抗原的片段(例如，结构域)。感染性疾病在本发明一个特别实施方式中，有机分子、抗原或抗原决定簇可以用于感染性疾 病的预防。这种治疗方法可以用于治疗影响广泛宿主，例如人类、母牛、绵羊、猪、狗、猫、其 它哺乳动物物种及非哺乳动物物种的广泛种类的感染性疾病。这种疫苗可以预防地用于 防止个体或群体中的传染，或者治疗地用于减轻正在发生的感染。已知存在疫苗的或期望 使用疫苗的感染性疾病是本领域技术人员已知的，所述感染性疾病例如包括病毒病因学的 感染，诸如HIV，流感、疱疹、病毒性肝炎、EB、脊髓灰质炎、病毒性脑炎、麻疹、水痘等；细菌 病因学的感染诸如肺炎、结核病、梅毒、Lyme氏疏螺旋体病、霍乱、沙门氏菌病、脑膜炎、脓毒 等；或者寄生虫病因学的感染，诸如疟疾、锥虫病、利什曼病、毛滴虫病、阿米巴病等。本发明 缀合物、组合物和方法中可以使用的抗原或抗原决定簇是相关领域普通技术人员已知的。 抗原或抗原决定簇的例子包括HIV抗原gpl40和gpl60 ；流感病毒抗原血凝素，M2蛋白质 和神经氨酸酶、乙型肝炎表面抗原和疟疾的环子孢子蛋白。在本发明一个这种实施方式中，抗原或抗原决定簇选自(a)重组HIV蛋白质，(b) 重组流感病毒蛋白质(例如流感病毒M2蛋白质或其片段)，(c)重组丙型肝炎病毒蛋白质， (d)重组弓形体属(Toxoplasma)蛋白质，(e)重组恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)蛋 白质，(f)重组间日疟原虫(Plasmodium vivax)蛋白质，(g)重组卵形疟原虫(Plasmodium oval)蛋白质，(h)重组三日疟原虫(Plasmodium Malariae)蛋白质，(i)重组衣原体 (Chlamydia)蛋白质和(j) (a)-(i)中所述任何蛋白质的片段。在另一个实施方式中，本发明涉及疫苗组合物，该疫苗组合物包含至少一种流感 病毒核酸编码的抗原或抗原决定簇；并涉及这种疫苗组合物激发免疫应答的用途。在特 定的这种实施方式中，流感抗原或抗原决定簇是M2蛋白质(例如，具有GenBank登录号 P06821, PIR登录号MFIV62中所示氨基酸的M2蛋白质或其片段(例如，从约2到约M位 的氨基酸))。适于本发明使用的引起免疫应答的M2蛋白质部分及其它蛋白质包括长度为 任何数量氨基酸的肽，但是一般为至少6个氨基酸长度的肽(例如，6，7，8，9，10，12，15，18， 20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95 或 97 个氨基酸长度的肽)。激素、毒素和药物，特别是滥用的药物在另一个方面，本发明提供了适于刺激抗半抗原的免疫应答的组合物。这些半抗 原包括，但不限于激素、药物和有毒化合物。抗各种药物、激素和有毒化合物的免疫应答可 以用于保护有危险暴露于这种化合物的个体，用于治疗已暴露于这种化合物的个体，或者 用于预防或治疗对这种化合物的成瘾性。代表性的有毒化合物包括但不限于有毒植物、动物和微生物的天然产物。这种产物包括黄曲霉毒素、cigimutera毒素和河豚毒素。人工或作为代谢结果产生的其它代表性 有毒化合物包括抗生素(例如，万古霉素)，抗癌化合物(例如，长春花碱)和化学战试剂 (例如，沙林，芥子气，VX) 0本发明的一个方面包括产生抗体，以抵抗通常所用的药剂的有 毒代谢物；由此个体可以继续接受药剂的有益效果，而不出现与有毒代谢物有关的副作用。 因此，在优选的实施方式中，毒素是个体身体中产生的代谢物，其中所述代谢物是药剂的代 谢物。在进一步优选的实施方式中，毒素是化学战试剂。适于在治疗药物成瘾，特别是消遣性药物成瘾的缀合物、组合物和方法中使用的 有机分子，抗原或抗原决定簇是相关领域普通技术人员已知的。有机分子、抗原或抗原决定 簇的代表性例子包括，例如阿片样物质和吗啡衍生物诸如可待因、芬太尼、海洛因、吗啡和 鸦片；兴奋剂诸如苯丙胺、可卡因、MDMA(甲烯二氧甲苯丙胺)、甲基苯丙胺，哌醋甲酯和烟 碱；致幻剂诸如LSD、三甲氧苯乙胺和叔胺吲哚磷酯；Carmabinoids诸如大麻粉和大麻；其 它成瘾性药物或化合物；和这些化合物的衍生物，副产物，变异体和复合物。变态反应和癌症在相关实施方式中，本发明提供了适于作为免疫疗法用于变态反应或癌症的治疗 或预防的组合物。适于在治疗或预防变态反应的缀合物、组合物和方法中使用的抗原或抗原决定簇 将是相关领域普通技术人员已知的。这种抗原或抗原决定簇的代表性例子包括蜂毒磷脂 酶 A2、Bet ν 1(桦树花粉变应原)、5Dol m V(white faced hornet 毒液变应原)、Mellitin 和Der ρ I (屋尘螨变应原)、谷蛋白、麦醇溶蛋白、贝类变应原、蟑螂变应原、花生和其它坚 果变应原、豚草和其它花粉变应原，银桦属(Grevillea)变应原，及其可以用于激发免疫应 答的片段。在本发明特定的实施方式中，变应原选自(a)重组蜂螫刺变态反应蛋白质，(b) 重组坚果变态反应蛋白质，(c)重组食物变态反应蛋白质，(d)重组哮喘蛋白质，(e)重组衣 原体(Chlamydia)蛋白质和(f) (a)到(e)任何变应原的片段。如上所述，适于本发明缀合物、组合物或方法中使用的抗原或抗原决定簇是Der P I。Der ρ I是在屋尘螨粪粒中发现的25kD蛋白酶，并且是屋尘螨的主要变应原。因 此，80%螨变应性患者具有抗Der ρ I IgE抗体。特别地，已知其中Der ρ I肽ρ52_72 和pll7-133(SEQ ID NO :64)包含天然Der ρ I特异性抗体所识别的表位。在针对整个 抗原的多克隆应答中产生的IgE抗体以高亲和力结合肽区域59-94(L.PierS0n-Mullany 等“2000) Molecular Immunology)。其它区域也以高亲和力结合IgE。肽pll7_133在其 N末端包含可以作为本发明第二附着位点的半胱氨酸。3D模建将肽p52-72和pll7-133分 配至整个蛋白质的表面(Jeannin，P.等，MolecularImmunology 30 1511-1518 (1993))。然 而，Der ρ I蛋白质的其它片段也可能包含适用于本发明的B细胞表位。在本发明组合物的优选实施方式中，抗原或抗原决定簇是Der ρ I肽，其中具有所 述第二附着位点的所述 Der ρ I 肽有选自a) CGNQSLDLAEQELVDCASQHGCH(SEQ ID NO :97)； 和 b)CQIYPPNANKIREALAQTHSA(SEQ ID NO :64)的氨基酸序列。在另外实施方式中，本发明提供了适于在预防和/或减弱变应性反应(诸如引起 过敏反应的变应性反应)的方法中使用的疫苗组合物。如本文其它地方所公开的，变应性 反应的特征在于引起IgE抗体出现的抵抗抗原的TH2应答。ThI免疫应答的刺激和IgG抗体 的产生可以缓解变应性疾病。因此，本发明疫苗组合物包括引起如下抗体产生的组合物，该抗体可以预防和/或减弱变应性反应。因此，在一些实施方式中，本发明的疫苗组合物包括 激发抗变应原的免疫应答的组合物。这种变应原的例子包括磷脂酶诸如意大利蜜蜂(Apis MelIifera) (GenBank 记录号 443189，GenBank 记录号 2四378)，大蜜蜂(Apis dorsata) (GenBank 记录号 B59055)，中华蜜蜂(Apis cerana) (GenBank 记录号 A59055)，Bombus Pennsylvanicus (GenBank 记录号 B56338)禾口纯尾毒晰(Heloderma Suspectum) (GenBank 记 录号 P80003 ；GenBank 记录号 S 14764 ；GenBank 记录号 226711)磷脂酶 A2 (PLA2)蛋白质。利用意大利蜜蜂(Apis MelIifera)的PLA2蛋白质氨基酸序列(GenBank记录号 443189, GenBank记录号2四378)做为示例，构成整个PLA2序列中的任何一个部分的长至少 约60个氨基酸的肽也可以用在组合物中以预防和/或减弱变应性反应。这种肽的例子包括 含有氨基酸1-60，氨基酸1-70，氨基酸10-70，氨基酸20-80，氨基酸30-90，氨基酸40-100， 氨基酸47-99，氨基酸50-110，氨基酸60-120，氨基酸70-130或氨基酸90-134的肽，以及 其它PLA2蛋白质(例如上述PLA2蛋白质)的相应部分。这种肽的进一步例子包括包含氨 基酸1-10，氨基酸5-15，氨基酸10-20，氨基酸20-30，氨基酸30-40，氨基酸40-50，氨基酸 50-60，氨基酸60-70，氨基酸70-80，氨基酸80-90，氨基酸90-100，氨基酸100-110，氨基酸 110-120或者氨基酸120-130的肽，以及其它PLA2蛋白质(例如上述PLA2蛋白质)的相应 部分。适于本发明使用的引起免疫应答的PLA2部分及其它蛋白质部分可以包含一般地 至少 6 个氨基酸长度的肽(例如，6，7，8，9，10，12，15，18，20，25，30，；35，40，45，50，55，60，
65，70，75，80，85，90，95或100个氨基酸长度的肽)，或者可替代由上述肽组成。PLAJt (例如上述全长PLA2蛋白质及每个蛋白的子部分)也可以与允许有序和 重复抗原阵列形成的任何物质(例如，AP205衣壳蛋白或其片段)偶联。对于在治疗癌症的组合物和方法中使用的抗原或抗原决定簇，其选择将是相关 领域普通技术人员已知的。在本发明特定的实施方式中，抗原或抗原决定簇选自(a)重 组乳腺癌细胞蛋白质；(b)重组肾癌细胞蛋白质；(c)重组前列腺癌细胞蛋白质；(d)重组 皮肤癌细胞蛋白质；(e)重组大脑癌细胞蛋白质；(f)重组白血病癌细胞蛋白质；(g)重组 profiling;和(h) (a)-(g)中所述任何蛋白质的片段。这种类型的抗原或抗原决定簇的代表性例子包括Her2(乳腺癌)，⑶2 (成神经 细胞瘤)，EGF-R(恶性成胶质细胞瘤)，CEA(甲状腺髓样癌)，和CD52(白血病)，人黑素 瘤蛋白质gplOO，人黑素瘤蛋白质melan-A/MART-1，酪氨酸酶，NA17-A nt蛋白质，MAGE-3 蛋白质，P53蛋白质和HPV16E7蛋白质，及可以用于激发免疫应答的这些蛋白质之每一个 的片段。可以用于癌症治疗组合物和方法的另外抗原决定簇是参与血管生成的分子和抗 原决定簇。血管生成，即新血管的形成，在生理学和病理生理学过程诸如伤口愈合和实体 肿瘤生长中起到必需的作用(Folkman, J. (1995) Nat. Medicine 1，27-31 ；Folkman, J.，和 Klagsbum, Μ. (1987)Science 235,442-446 ；Martiny-Baron, G.，禾口 Marme, D. (1995)Curr. Opin. Biotechnol. 6,675-680 ；Risau, W. (1997)Nature 386,671-674)。快速生长的肿瘤起 始并依赖于血管的形成以提供所需的血液供应。因此，认为抗血管生成药剂作为抗癌疗法 是有效的。在已经鉴定的几种推定的血管生成因子中，血管内皮生长因子(VEGF)是有效的 内皮细胞特异性促细胞分裂剂和许多实体肿瘤血管形成的主要刺激剂。因此，VEGF作用的阻断可以作为干扰肿瘤诱导的血管生成的靶标，成为一种阻断内皮而不是肿瘤的抗肿瘤策 略(Millauer, B.等· (1994) Nature367, 576-579 ；KIM，J 等.(1993) Nature 362,841-844)。已经公开了抗VEGFR-II 抗体(IMC-1C11)和抗 VEGF抗体(Lu，D.等.Q000) J. Biol Chem. 275，14321-14330 ；Presta，L. G，等(1997) Cancer Res. 47，4593-4599)。前者，中和性 单克隆抗VEGFR-2抗体识别已经鉴定为推定的VEGF/VEGFR-II结合位点的表位(Piossek， C.等· (1999) J Biol Chem. 274，5612-5619)。因此，在本发明一个实施方式中，本发明缀合物、组合物或方法中使用的抗原或抗 原决定簇是来源于VEGFR-II接触位点的肽。这提供了具有用于癌症治疗的抗血管生成 特性的本发明组合物和疫苗组合物。在小鼠中，利用对VEGFR-2特异的血清，已经证明了 对肿瘤生长的抑制作用(Wei，YQ等· (2000) Nature Medicine 6，1160-1165)。因此，适于 抗血管生成的本发明组合物和本发明疫苗组合物的其它抗原决定簇包括具有氨基酸序列 CTARTELNVGI DFNWEYPSSKHQHKK(SEQ ID NO 99)的 VEGFR-II 衍生肽，和 / 或具有氨基酸序 列 CTARTELNVGLDFTWHSPPSKSHHKK (SEQ ID NO :113)的鼠 VEGFR-II 衍生肽，和 / 或 VEGFR-II 的相关细胞外球状结构域1-3。自身抗原在特定实施方式中，本发明提供了适于在预防和/或减弱由“自身”基因产物(例 如，肿瘤坏死因子)引起或加重的疾病或状况的方法中使用的疫苗组合物。通常通过常规 接种诱导对自身分子的抗体应答，即使可能，也是困难的。本发明通过利用抗原与AP205VLP 的结合，增加待用于免疫的抗原的重复程度，提供了一种提高接种效率的方法。不同于分离的蛋白质，在有和无T细胞辅助，不存在任何佐剂的情况下，病毒 均能诱导迅速和有效的免疫应答(Bachmann & Zinkernagel，Ann. Rev. Immunol :15: 235-270(1997))。尽管病毒常常由少数蛋白质组成，但是它们能比它们的分离的成分引起 强得多的免疫应答。对于B细胞应答，已知病毒免疫原性的一个至关重要的因素是表面表 位的重复性和次序。许多病毒显示了准晶体表面，该表面展示出一个有规则的表位阵列， 该表位阵列可以与B细胞上的表位特异性免疫球蛋白有效交联(Bachmarm &Zinkernagel, Immunol. Today 17:553-558(1996))。B细胞上表面免疫球蛋白的这种交联是强激活信号， 其直接诱导细胞周期进程和IgM抗体的产生。而且，这种触发的B细胞能激活T辅助细胞， 这接着可以诱导B细胞中IgM产生向IgG抗体产生的转换和长寿记忆B细胞的形成——任 何接种的目的(Bachmann & Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol :15 :235-270 (1997))。在自身 免疫疾病中，甚至可以将病毒结构与抗-抗体的产生联系起来，作为针对病原体的天然应 答的一部分(参见，Fehr，T.等，J Exp. Med. 185 :1785-1792(1997))。这样，通过高度有组 织的病毒表面呈递的抗体能诱导强的抗-抗体应答。免疫系统通常不能产生抵抗来源于自身的结构的抗体。对于低浓度存在的可溶抗 原而言，这是由Th细胞水平上的耐受性所致。在这些条件下，将自身抗原与可以递送T辅 助作用的载体偶联可以破坏耐受性。对于高浓度存在的可溶蛋白质或低浓度的膜相关蛋白 质，B和Th细胞可以是耐受性的。然而，B细胞的耐受性可能是可逆的(无变应性)，并且可 以通过施用偶联外源载体的高度有组织形式的抗原来破坏(Bachmarm &Zinkernagel,Ann. Rev. Immunol :15 :235-270(1997))。因此，本发明疫苗组合物包括引起抗体产生的缀合物、组合物和方法，其中该抗体可以预防和/或减弱由“自身”基因产物引起或加重的疾病或状况。这种疾病或状况的例 子包括移植物抗宿主病、IgE介导的变应性反应，过敏反应，成人呼吸窘迫综合征，局限性回 肠炎、变应性哮喘、急性成淋巴细胞白血病(ALL)，糖尿病，非霍奇金淋巴瘤(NHL)，突眼性 甲状腺肿，系统性红斑狼疮(SLE)，炎性自身免疫性疾病，重症肌无力，免疫增生性疾病淋巴 结病(IPL)，血管免疫增生性淋巴结病(AIL)，免疫母细胞性淋巴结病(IBL)，类风湿性关节 炎，糖尿病，多发性硬化，阿尔茨海默氏病，骨质疏松症，和与一些感染有关的自身免疫状况 包括风湿热、猩红热、Lyme氏疏螺旋体病和传染性多关节炎。对于在治疗与自身抗原相关的其它疾病或状况的缀合物、组合物和方法中使用的 抗原或抗原决定簇，其选择也是相关领域普通技术人员已知的。这种抗原或抗原决定簇的 代表性例子是，例如淋巴毒素(例如，淋巴毒素α (LT α )，淋巴毒素β (LTi3))，和淋巴毒素 受体，核因子κΒ受体活化因子配体(RANKL)，血管内皮生长因子(VEGF)，血管内皮生长因 子受体(VEGF-R)，白细胞介素-5，白细胞介素-17，白细胞介素-13，CCL21，CXCLl2, SDF-I, MCP-I, Endoglin，抵抗素，GHRH，LHRH，TRH, MIF, Eotaxin，缓激肽，BLC，肿瘤坏死因子 α 和 淀粉样β肽(Αβ L42)，以及其可以用于激发免疫应答的片段。在一个实施方式中，抗原决定簇是淀粉样β肽(Α β ^42) (DAEFRHDSGYEVHHQKL VFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(SEQ ID NO :7)，或其片段。Αβ肽在阿尔茨海默氏病的神 经病理学中具有重要作用。Αβ肽的区域特异性细胞外积累伴随着小神经胶质细胞增生 (microgliosis)，细胞骨架改变，营养不良性神经炎和突触损失。据认为这些病理学改变与 定义这种疾病的认知下降有关。在阿尔茨海默氏病小鼠模型中，通过基因工程改造产生Ah_42的转基因动物 (PDAPP-小鼠)在大脑中出现了斑块和神经元损害。最近的工作表明利用Ah_42免疫年 青的PDAPP小鼠引起了对斑块形成和相关营养不良性神经炎的抑制作用(Schenk，D.等， Nature 400:173-77(1999))。而且，对已经患有AD样神经病的老年PDAPP小鼠的免疫也降低了神经病理学的程 度和进展。在另一个研究中，外周施用抗Ah_42产生的抗体能诱导对预先存在的淀粉状蛋 白的清除(Bard, F.等，Nature Medicine 6:916-19(2000))。该研究利用了抗 A β 卜42 的多 克隆抗体或抗来源于Aβ不同区域的合成片段的单克隆抗体。因此，利用本发明缀合物，组 合物和方法诱导抗Αβ抗体可以被认为是阿尔茨海默氏病的潜在治疗方法。公认单独施用纯的蛋白质通常不足以引发强的免疫应答；一般地，分离的抗原必 须与称为佐剂的辅助物质一起施用。这些佐剂保护施用的抗原免受快速降解，并且佐剂可 以实现抗原的低水平长期释放。在本发明中，Αβ肽或其片段通过结合AP205VLP而获得免 疫原性，因此不一定需要佐剂。如所表明的，阿尔茨海默氏(AD)的一个关键事件是淀粉状蛋白沉积为不溶性纤 维块(amyloidogenesis)，引起细胞外神经炎斑和在脑血管壁周围的沉积物(综述参见 Selkoe, D. J. (1999)Nature. 399，A23-31)。神经炎斑和嗜刚果红血管病的主要组分是淀粉 状蛋白β (Αβ)，尽管这些沉积物也含有其它蛋白质诸如糖胺聚糖和载脂蛋白。Αβ从称 为淀粉样前体蛋白(APR)的大得多的糖蛋白蛋白酶解切割产生，该前体蛋白包括具有单 一疏水跨膜区域的695-770个氨基酸的同种型。Αβ形成不超过43个氨基酸长度的一组 肽，这些肽显示了相当大的氨基和羧基末端异质性(截短)及修饰(Roher，A.E.等，(1988)
28J.Cell Biol. 107,2703-2716. Roher，Α. E.等(1993) J. Neurochem. 61，1916-1926)。重要 的同种型是Αβ 1-40和1-42。它具有形成片层以聚集为原纤维的高度倾向，这最终导 致淀粉状蛋白。最近的研究已经表明接种诱导的大脑淀粉状沉积物的减少引起了认知的改 进(Schenk, D.等· (1999)Nature. 400，173-177)。因此，适于产生本发明疫苗的Aβ片段 包括，但是不限于Αβ 1-15，Aβ 1-27和Αβ 33-42。如本文其它地方所述，可以利用氨基酸 接头与Aβ或Αβ片段的氨基酸序列融合以实现和AP205VLP偶联。适于与Aβ或Αβ片 段的N末端融合的氨基酸接头包括但不限于序列CGG和CGHGNKS。适于与Aβ或Αβ片段 的C末端融合的接头包括但不限于序列GGC。在一个实施方式中，当接头与Aβ或Αβ片段 的C末端融合时，酰胺化C末端半胱氨酸。A β片段1-15与氨基酸接头融合，并且具有序列 DAEFRHDSGYEVHHQGGC-NH2 (SEQ ID NO :8)，其中用C末端“ΝΗ2”表示酰胺化C末端半胱氨酸。 A β片段1-27与氨基酸接头融合，并且具有序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNGGC-NH2 (S EQ ID NO :9)。A β片段33-42与氨基酸接头融合，并且具有序列CGHGNKSGLMVGGVVIA (SEQ ID NO 10)。在本发明一个实施方式中，抗原或抗原决定簇包含，或者优选地是血管紧张肽 或其片段。这里所用术语“血管紧张肽”包括含有血管紧张肽原、血管紧张肽I或血管 紧张肽II的序列或其任何片段的任何肽。血管紧张肽与高血压有关(Gardiner等， Br. J. Pharm. 129 1178 (2000))。因此，适于降低血管紧张肽水平的本发明缀合物、组合物和 方法适于治疗高血压。在一个实施方式中，缀合物或组合物包含至少一种血管紧张肽。一 些实施方式中肽的氨基酸序列如下血管紧张肽原DRVYIHPFHLVIHN(SEQ IDNO :11)；血管 紧张肽 I :DRWIHPraL(SEQ ID NO :12)；血管紧张肽 II :DRVYIHPF(SEQ ID NO :13)。通常 地，在血管紧张肽序列的C和/或N末端添加一个或多个额外的氨基酸。这些额外氨基酸 对于定向和有序地缔合AP205病毒样颗粒特别有价值。此血管紧张肽序列对应于与鼠源序 列相同的人类序列。因此，用包含这种血管紧张肽作为抗原或抗原决定簇的本发明疫苗或 组合物免疫人类或小鼠是抗自身抗原的免疫接种。在一些实施方式中，带有所述第二附着 位点的血管紧张肽具有选自如下的氨基酸序列a)CGGDRVYIHPF(SEQ ID NO :14)氨基酸序 列；b) CGGDRVYIHPi7HL (SEQ ID NO :1 氨基酸序列；c) DRVYIHPFHLGGC (SEQ ID NO: 16)氨基 酸序歹丨J ；禾口 d) CDRVYIHPra(SEQ ID NO 98)氨基酸序列。在本发明另一个实施方式中，抗原决定簇是RANKL(NFkB受体活化因子配体)。 RANKL也称为TRANCE(TNF-相关的激活诱导细胞因子)，ODF(破骨细胞分化因子)或 OPGL(骨保护素(Osteoprotegerin)配体)。在EMBL数据库保藏RANKL_人类=TrEMBL 014788中显示了人类RANKL细胞外部分的氨基酸序列。分别在EMBL数据库保藏RANKL_小 鼠Tr EMBL =035235 中和在 RANKL_ 小鼠剪接形式TrEMBL :Q9JJK8 和 TrEMBL :Q9JJK9 中示 出了鼠源RANKL及同种型的细胞外部分氨基酸序列。已经证明RANKL是破骨细胞形成(osteoclastogenesis)中的必需因子。抑制 RANKL与其受体RANK的相互作用可以引起破骨细胞形成受抑，因此提供了阻止骨质疏松 症和其它状况中所观察到的过度骨吸收的方法。通过RANK-Fc融合蛋白或称为骨保护素 (OPG)的RANKL可溶性诱饵受体可以抑制RANKL/RANK相互作用。在骨骼中，RANKL在基质细胞或成骨细胞上表达，而RANK在破骨细胞前体上表 达。RANK和RANKL的相互作用对于破骨细胞前体发育为成熟的破骨细胞至关重要。通过OPG可以阻断该相互作用。OPG缺陷的小鼠患有通过重组OPG注射可以救助的骨质疏松症， 表明OPG能逆转骨质疏松症。因此，通过提供适宜的本发明缀合物、组合物和方法(例如， RANKL-AP205VLP缀合物)抑制RANK-RANKL相互作用在逆转或预防骨质疏松症方面是有效 的。此外，在剔除OPG的小鼠中观察到了可以通过OPG注射逆转的动脉钙化(Min等， J. Exp. Med. 4 :463(2000)).在佐剂诱导的关节炎模型中，OPG注射能防止骨丢失和软骨破 坏，但是不能防止炎症(爪肿胀)。推测活化的T细胞可以引起RANKL介导的破骨细胞形 成和骨丢失的增加。OPG抑制小鼠骨中前列腺癌诱导的破骨细胞形成并防止前列腺肿瘤生 长。OPG减少了小鼠中晚期骨癌的疼痛。RANKL是属于TNF超家族的245个氨基酸的跨膜蛋白质。可以通过TACE样蛋白酶 切下部分细胞外区域(178个氨基酸)(Lum等，J Biol Chem. 274 13613 (1999))。此外，已 经描述了缺少跨膜结构域的剪接变异体(Ikeda等，Endocrinology 142 1419 (2001)) 0切 割的细胞外部分含有与可溶性TNF-α高度同源的结构域，并且形成如在TNF-α中所观察 到的同源三聚体。C末端看似参加了三聚体的接触位点。在序列的这个区域中存在一个半 胱氨酸。我们已经建立了 RANKL相应区域的3维结构模型，并且发现在折叠结构中天然存 在的半胱氨酸不可能接近以用于与本发明载体上第一附着位点相互作用。N末端是适于附 着包含第二附着位点的氨基酸接头(其具有额外半胱氨酸残基)的一个位点。具有融合了 N末端氨基酸接头(含有半胱氨酸残基)的RANKL细胞外部分的人类RANKL构建体，是本发 明一个实施方式。然而，含有半胱氨酸残基作为第二附着位点并且融合在RANKL序列C末 端或者RANKL细胞外部分上的氨基酸接头也是本发明的实施方式。可以根据这里公开的教导产生人类RANKL构建体，并且本领域普通技术人员能在 氨基酸序列比对中比较鼠和人的RANKL序列以鉴定载体中要克隆的人RANKL序列部分。含 有氨基酸138-317并且对应于人类RANKL细胞外结构域C末端区域的片段为本发明一个实 施方式，并且可以按本发明教导根据需要修饰该片段以便偶联AP205VLP。本发明也包括适 用于在下述适宜宿主中表达的其它载体。本发明范围中意欲包括的其它人RANKL构建体包 括包含可以被TACE样蛋白酶释放的部分细胞外区域(178个氨基酸)或其片段(Lum等， J Biol Chem. 274 :13613(1999))的人类RANKL构建体，或者该人类RANKL构建体可以包含 对应于缺少跨膜结构域的可变剪接变异体的序列，以及其保守性片段。包含氨基酸165-317 的人RANKL的C末端片段也是本发明实施方式。包含整个细胞外区域(氨基酸71-317)并 可以根据需要按本发明教导进行修饰以偶联AP205VLP的RANKL片段也在本发明范围内。已经在不同系统中(例如，大肠杆菌，昆虫细胞，哺乳动物细胞)表达了 RANKL，并 且已经证明这些RANKL是活性的。因此，几种表达系统可以用于产生组合物中适宜的RANKL 抗原。在使蛋白质表达定向于大肠杆菌周质的情况下，可以用细菌信号肽置换RANKL或 RANKL构建体(由蛋白质的细胞外部分组成)的信号肽，该RANKL或RANKL构建体可以经修 饰包含本发明的第二附着位点。对于在大肠杆菌胞质中表达蛋白质，RANKL构建体无需信 号肽。在本发明一个实施方式中，抗原决定簇是MIF或其片段。MIF是起巨噬细胞移动 抑制剂作用的细胞因子。它也被称作延迟早期应答蛋白质6 (delayed early responseprotein 6，DER6)、糖基化抑制因子或苯丙酮酸互变异构酶。已经证明MIF涉及多种状况。在结核菌素诱导的迟发型超敏(DTH)反应中 MIF(mRNA和蛋白质)被上调，并且抗MIF抗体抑制该DTH反应。在肾脏同种异体移植排斥 中MIF也被上调。在眼睛自身免疫病模型中(实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎(EAU))， 抗MIF治疗引起了 EAU发展的延迟。患者血清中MIF增加，该增加也出现在贝赫切特病患 者和患有虹膜睫状体炎的患者中。抗MIF的免疫可以提供抗类风湿性关节炎的治疗方法。 因此适于引起抗MIF免疫或适于降低血清MIF的本发明缀合物、组合物和方法可以用于治 疗或预防与MIF超量产生有关的这些疾病、病症和状况。在特应性皮炎患者中已经发现了高血清MIF浓度。在皮肤损伤中，MIF弥散性表 达，而在对照中MIF存在于基细胞层中。类固醇治疗后，MIF浓度降低，这与炎症中MIF的作 用一致。也发现MIF有助于肾小球肾炎的确立。用抗MIF抗体治疗的动物显示了显著降低 的肾小球肾炎。MIF是垂体来源的并在例如受到LPS刺激时分泌，并且其增强内毒素血症。 因此，抗MIF mAb抑制内毒素血症和脓毒性休克，而重组MIF显著地增加腹膜炎的致死率。 MIF也是糖皮质激素诱导的、可以调节细胞因子产生的物质，并且其促进炎症。T细胞(Th2)也产生MIF，并且MIF可以支持T细胞增殖，而抗MIF治疗降低T细胞 增殖和IgG水平。在多发性硬化和神经贝赫切特病(neuro-Behcets disease)患者的脑脊 髓液中存在增加的MIF浓度。在患有长期银屑病的患者的血清中也发现了高MIF水平。在 溃疡性结肠炎患者而不是局限性回肠炎患者的血清中发现了高MIF水平。在支气管哮喘患者的血清中已经发现了高MIF水平。在类风湿性关节炎患者 的滑液中MIF也被上调。在小鼠和大鼠模型中，抗MIF治疗有效地降低类风湿性关节 炎(Mikulowska 等，J. Immunol. 158 :5514-7(1997) ；Leech 等，Arthritis Rheum. 41 910-7(1998)，Leech 等.Arthritis Rheum. 43 :827-33 (2000)，Santos 等，Clin. Exp. Immunol. 123 :309-14 (2001))。因此，利用包含MIF作为抗原决定簇的组合物定向抑制MIF 活性的治疗将有益于上述状况。如MIF 大鼠=SEQ ID NO :120，MIF 小鼠:SEQ ID NO :121 和 MIF 人类:SEQ ID NO 119SwissProt中所示，来源于小鼠、大鼠和人类的MIF由114个氨基酸组成，并且含有3个 保守性半胱氨酸。3个亚基形成没有通过二硫键稳定的同源三聚体。X射线结构已经解析， 显示了 3个自由半胱氨酸(Sun等，PNAS 93 :5191-96 (1996))，而一些文献数据声称存在二 硫键。尽管如此，没有一个半胱氨酸被足够暴露以致可以与载体上存在的可能的第一附着 位点最佳地相互作用。因此，在本发明该实施方式中，一方面，含有半胱氨酸残基的氨基酸 接头被添加到蛋白质的C末端(因为在三聚体结构中蛋白质C末端是暴露的)用于产生第 二附着位点。在小鼠和大鼠MIF之间只有一个氨基酸改变，相似地，在人类和大鼠MIF或人 类和小鼠MIF之间也具有非常高的序列同源性(约90%序列同一性)。本发明包括含有与 AP205VLP缔合的人类和小鼠MIF构建体的缀合物、组合物和方法。在MIF序列N末端添加含有半胱氨酸的氨基酸接头也是本发明的实施方式。在 大肠杆菌中已经表达、纯化了 MIF，并且已证明其具有完全的功能性的(Bernhagen等， Biochemistry 33:14144-14155(1994)。因此，可以在大肠杆菌中表达MIF以产生本发明有 用的实施方式。如果不从构建体切下起始甲硫氨酸，那么MIF的互变异构酶活性将受到抑制。大肠杆菌中表达的MIF构建体显示了互变异构酶活性。切割了起始甲硫氨酸并且在该序列中 正好位于起始甲硫氨酸后的脯氨酸残基被突变为丙氨酸的MIF突变体也不显示互变异构 酶活性，其代表了本发明进一步的实施方式，并且意欲包括在本发明范围内。在一个具体实 施方式中，AP205缀合无互变异构酶活性的MIF突变体。在本发明一个实施方式中，抗原或抗原决定簇是白细胞介素-17 (IL-17)。人 类IL-17是具有可变糖基化的32kDa、二硫键连接的同源二聚体蛋白质(私0，Z.等， J. Immunol. 155 :5483-5486(1995) ；Fossiez，F.等，J. Exp. Med. 183 :2593-2603 (1996))。该 蛋白质包含巧5个氨基酸，并且包含19-23个残基的N末端分泌信号序列。IL-17的氨基酸 序列只与疱疹病毒(Herpesvirus)蛋白质(HSV13)相似，并且与其它细胞因子或已知蛋白 质不相似。在GenBank记录号# :AAC50341中给出了人类IL-17氨基酸序列。在GenBank 记录号# :AAA37490中给出了小鼠蛋白质序列。在评估的大量组织和细胞系中，仅在活化 的T细胞和佛波醇12-豆蔻酸13-乙酸/离子霉素刺激的外周血单核细胞中检测到了编 码 IL-17 的 mRNA 转录物(Yao，Ζ.等，J. Immunol. 155 :5483-5486(1995)，Fossiez, F.等， J. Exp. Med. 183 2593-2603(1996)) 0人类和小鼠序列都含有6个半胱氨酸残基。IL-17的受体在许多组织和细胞类型中广泛地表达(私0，Ζ.等，Cytokine 9 794-800 (1997))。尽管人类IL-17受体的氨基酸序列(866个氨基酸)预测为具有单跨膜结 构域和一个525个氨基酸的长细胞内结构域的蛋白质，但是该受体序列是独特的，与来自 细胞因子/生长因子受体家族的任何受体均不相似。这点和IL-17本身与其它已知蛋白质 缺少相似性联系在一起，表明IL-17和其受体可能是新信号传递蛋白质和受体家族的一部 分。临床研究表明IL-17可能与许多炎性疾病有关。类风湿性关节炎患者的滑液T细胞分 泌 IL-17，并且 IL-17 刺激炎性介质产生(Chabaud，M.等，J. Immunol. 161 :409-414(1998)； Chabaud，Μ.等，Arthritis Rheum. 42 :963-970 (1999))。在类风湿性关节炎患者中已经报 道了 高水平 IL-17 (Ziolkowska M.等，J Immunol. 164 :2832-8 (2000)) 已经证明白细胞介素17对鼠膝关节中蛋白聚糖的降解具有作用(Dudler J.等，Ann Rheum Dis. 59 :5四_32 (2000))，并且有助于滑膜基质的破坏(Chabaud M.等， Cytokine. 12 :1092-9 ； (2000) ) 0现已存在检测抗IL-17免疫作用的相关关节炎动物模型 (Chabaud M.等，Cytokine. 12 1092-9 ； (2000)) 0在来源于多发性硬化患者的单核的细胞 中已发现了升高水平的 IL-17mRNA(Matusevicius，D.等，Mult. Scler. 5 101-104 (1999))。 在患有系统性红斑狼疮的患者中观察到了升高的IL-17血清水平(Wong C. K.等，Lupus 9 :589-93(2000)).此外，在分离自损伤的银屑病皮肤的T细胞中IL_17mRNA水平增加 (Teunissen, M. B.等，J. Invest. Dermatol, 111 :645-649 (1998))。也已经证实了 IL-17参与肾脏移植排斥(Fossiez F.等，Int. Rev. Immunol. 16 541-51(1998)) ο Antonysamy 等(J. Immunol. 162 :577-84 (1999))也已经提出了器官同 种异体移植排斥中IL-17作用的证据，他证明IL-17促进树突细胞祖先细胞的功能性分 化。他们的发现提示了在同种异体T细胞增殖中IL-17的作用，其中可能部分地通过对 DCs的成熟诱导作用来介导该T细胞增殖。而且，该研究小组还报道了(Tang J. L.等， Transplantation 72 :348_5(K2001)) IL-17在急性血管性排斥的免疫发病机理中的作用， 其中白细胞介素17拮抗作用可以抑制急性而不是慢性血管性排斥。IL-17看似有潜力作为 同种异体移植排斥干预性治疗的新靶标。
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抗IL-17 单克隆抗体 mAb5 (Schering-Plough Research hstitute)能完全抑 制类风湿性关节炎(RA)滑膜上清液中通过50ng/ml IL-17诱导的IL-6产生。在该测定 中，不相关的mAb MXl没有作用。mAb5是用人类rIL_17(r =重组蛋白)免疫后获得的小 鼠IgGl。在此测定系统中，1 μ g/ml浓度的mAb5能完全抑制IL-6产生(Chabaud, M.等， J. Immunol. 161 :409-414(1998))。因此，抗IL-17免疫为上述各种状况提供了治疗方法。因此，在本发明一个实施方式中，组合物包含与重组IL-17C末端融合的接头，该 接头含有第二附着位点。在进一步实施方式中，含有半胱氨酸的氨基酸接头与加工后的蛋 白质的序列的N末端融合，或者插入到信号肽C末端，即成熟蛋白质序列的N末端。对于 真核生物表达系统，与这里所述的其它自身抗原一样，IL-17基因的信号肽可以用例如来 源于特定真核生物表达载体的另一个信号肽置换。对于在细菌中表达，可以用指导在周质 中可溶性表达的细菌信号肽置换该信号肽。对于在细胞质中表达，构建体不带有信号肽。 在一些实施方式中，无信号肽的人类IL-17构建体将包含残基M-155，22-155，21-155或 20-155。在一些实施方式中，无信号肽的小鼠IL-17构建体将包含残基沈-158，25-158， M-158或27-155。可以在CVl/ ΒΝΑ细胞中表达人类IL-17 ；已经证明重组hIL_17可以以 糖基化和非糖基化两种形式分泌(Yao, Z.等，J. Immunol. 155 =5483-5486 (1995)) IL-17 也可以表达为hIL-17/Fc融合蛋白，随后从融合蛋白切割IL-17蛋白质。也可以在酵母巴斯 德毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达 IL-17 (Murphy K. P.等，Protein Expr Purif. 12 208-14(1998))。也可以在大肠杆菌中表达人类IL-17。当使大肠杆菌中IL-17的表达定向 于周质时，可以用细菌信号肽置换IL-17信号肽。在一个实施方式中，IL-17构建体无信号 肽以便该蛋白质在大肠杆菌细胞质中表达。在本发明另一个实施方式中，抗原决定簇是白细胞介素13 (IL-13)。IL-13是活化 的T淋巴细胞分泌的细胞因子，其主要影响单核细胞、巨噬细胞和B细胞。前体蛋白质的头 20个氨基酸对应于信号肽，并且在加工后的蛋白质中不存在。已经描述了小鼠序列(Brown K. D.等，J. Immunol. 142 :679-687 (1989))。根据表达宿主，IL-13构建体将含有(例如对于 在真核生物宿主中表达和分泌)前体蛋白质的序列，或者(例如对于在大肠杆菌中细胞质 表达)由成熟蛋白质组成。为了在大肠杆菌周质中表达，可以用细菌信号肽置换IL-13信 号肽。IL-13是最近发现涉及变应性气道应答(哮喘)的T辅助细胞2来源的细胞因子 (象IL-4，IL-5)。在许多肿瘤类型(例如，霍奇金淋巴瘤)中已经发现IL-13和IL-13受 体被上调。白细胞介素13可以由霍奇金和里-斯细胞分泌并且刺激这些细胞的生长(Kapp U.等，J Exp Med. 189 :1939-46 (1999))。因此，抗IL-13免疫提供了治疗诸如上述状况，如 哮喘或霍奇金淋巴瘤的方法。在一个实施方式中，组合物包含含有半胱氨酸残基的氨基酸接头，该接头融合到 成熟IL-13序列的N或C末端以在蛋白质中引入第二附着位点。在其它实施方式中，因 为根据IL-13的NMR结构，成熟形式的IL-13的N端可以自由接近，所以将含有半胱氨酸 的氨基酸接头添加到成熟形式蛋白质的N末端(Eisenmesser，Ε. Ζ.等，J. Mol. Biol. 310 231 (2001))。在其它实施方式中，含有半胱氨酸的氨基酸接头融合到对应于加工后的蛋白 质的序列的N末端，或者插入到信号肽C末端，即成熟形式蛋白质序列的N末端。在其它实 施方式中，将含有半胱氨酸残基的氨基酸接头添加到蛋白质的C-末端。
可以在大肠杆菌(Eisenmesser Ε. Z.等，Protein Expr. Purif. 20 :186-95(2000)) 中或在 NS-O 细胞(真核细胞系)(Cannon-Carlson S.等，Protein Expr. Purif. 12 239-48(1998))中表达 IL-13。在本发明一个实施方式中，抗原决定簇是白细胞介素-5(IL_5)。IL_5是促嗜酸性 粒细胞生成的谱系特异性细胞因子，在与增加数量的嗜酸性粒细胞有关的疾病，诸如哮喘 中起重要作用。在几个研究中已经证明了 IL-5的生物学功能(Coffman R. L.等，Science 245 308-10(1989) ；Kopf等，Immunity 4 15- (1996))，其中指出在嗜酸性粒细胞介导的疾病 中抑制IL-5功能的有益作用。因此，对IL-5作用的抑制提供了治疗与嗜酸性粒细胞有关 的哮喘和其它疾病的方法。IL-5形成通过二硫键共价连接的二聚体。已经报道了单链(sc)构建体，其中通过 肽接头连接IL-5的两个单体。在本发明一个实施方式中，在加工形式的IL-5序列的N末端添加含有半胱氨酸 的肽接头。也设想在加工形式的scIL-5序列的N末端添加含有半胱氨酸的接头。在其它 实施方式中，含有半胱氨酸的氨基酸接头融合到对应于加工后的蛋白质序列的序列的N末 端，或者插入到信号肽C末端，即成熟形式的蛋白质序列的N末端。在其它实施方式中，含有半胱氨酸的接头融合到IL-5序列的C末端，或者融合到 scIL-5序列的C末端。已经描述了用于IL-5的大量表达系统，并且可以在制备本发明组合物时使用这 些表达系统。Proudfoot等(Biochem J. 270 :357-61 (1990))描述了利用大肠杆菌的细菌 表达系统。在大肠杆菌胞质中表达IL-5的情况下，IL-5构建体无信号肽。昆虫细胞也可 以用于产生用于制备本发明组合物的IL-5构建体(Pierrot C.等，Biochem. Biophys. Res. Commun. 253 :756-60(1998))。同样地，也可以使用杆状病毒表达系统(sf9细胞Jngley E.等，Eur. J Biochem. 196 :623-9(1991)禾口 Brown P.M.等，Protein Expr. Purif. :6: 63-71 (1995))。最后，也已报道了哺乳动物表达系统(CH0细胞)，并且在制备本发明组合物 时也可以使用这些表达系统(Kodama S 等，J. Biochem. (Tokyo)IlO =693-701 (1991)) 也已经描述了用于小鼠IL-5的杆状病毒表达系统(Mitchell等，Biochem. Soc. Trans. 21 :332S (1993)，Kunimoto DY 等，Cytokine 3 :224-30(1991))和利用 CHO 细胞的哺 乳动物表达系统(Kodama S 等，Glycobiology2 :419-27 (1992))。其中IL-5序列在其N末端融合了包含半胱氨酸残基的氨基酸接头的鼠IL_5构建 体的表达适于IL-5偶联AP205VLP。根据这里的教导可以产生人类构建体，得到适于偶联 AP205VLP的蛋白质人C-IL-5-E、人C-IL-5-F和人C-IL-5-S，其为本发明的其它实施方式。在本发明一个实施方式中，抗原决定簇是CCL-21，CCL-21是CC亚家族的趋化因 子，也称为小诱导型细胞因子A21，exodus-2, SLD (次级淋巴细胞细胞因子)，TCA4(胸腺来 源的趋化剂4)或6Ckine。CCL21抑制血细胞生成，并且刺激胸腺细胞的趋化性，激活T细胞和树突细胞，但 是不激活B细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞。它显示了对幼稚T细胞优先的活性。它也是 有效的肾小球系膜细胞(mesangia cell)化学引诱物。(根据物种)CCL21结合趋化因子受 体CCR7和CXCR3。在生理学剪切下，它可以触发快速的依赖于整联蛋白的淋巴细胞滚动抑制作用，并且其被高内皮小静脉(high endothelial venules)高度地表达。在人月市癌 SCID 小鼠模型(Arenberg 等，Cancer Immunol. Immunother. 49 587-92(2001))和小鼠结肠癌肿瘤模型中(Vicari 等，J. Immunol. 165 :1992-2000 (2001)), 鼠CCL21抑制肿瘤生长和血管生成。在大鼠角膜微囊试验中也检测到鼠CCL21的 angiostatic 活性(Soto 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 :8205-10 (1998)。也证明在乳腺癌细胞中趋化因子受体CCR7和CXCR4被上调，并且在代表乳 腺癌转移的第一目的地的器官中高度表达CCL21和CXCL12及各自的配体(MUller 等· (Nature410 :50-6 (2001))。体外，通过中和性抗CCL21抗体可以阻断CCL21介导的趋 化性，同样地CXCR4介导的趋化性也可以被相应抗体阻断。因此，抗CCL21免疫提供了治疗 癌症，更特别是乳腺癌中瘤转移扩散的方法。在小鼠和人类中分泌的CCL21分别具有110或111个氨基酸。在Swissprot :SY21_ 人类中和在Swissprot SY21_小鼠中示出了各自的序列。与其它CC细胞因子不同，CCL21 确实在C末端延伸区域中多包含2个半胱氨酸。推测所有半胱氨酸都参与了二硫键。在下文中，描述了用于制备包含CCL21抗原决定簇的本发明组合物的构建体和表 达系统。在同源蛋白质Eotaxin的NMR结构中，N和C末端都暴露于溶剂。在一些实施方 式中，在蛋白质C末端添加包含作为第二附着位点的半胱氨酸残基的氨基酸接头。已经表 达了(在CCL21的C末端)与碱性磷酸酶融合的蛋白质，并且证明其是功能性的，表明在 CCL21的C末端的融合与受体结合相容。在具体实施方式
中，含有半胱氨酸的氨基酸接头融 合到对应于加工后的蛋白质序列的序列的N末端，或者插入到信号肽C末端，即成熟形式蛋 白质序列的N末端。已经描述了用于CCL21产生的几种表达系统(例如，Hedrick等，J. Immunol. 159 1589-93(1997))。例如，可以在杆状病毒系统中表达CCL21 (Nagira等，J. Biol. Chem. 272 19518-24(1997))ο在相关实施方式中，抗原决定簇是基质来源的因子I(SDF-I)，现在称为CXCL12。 CXCL12是骨髓基质细胞产生的趋化因子，并且最初被鉴定为前B细胞的刺激因子。如上所述，已经证明在乳腺癌细胞中趋化因子受体CCR7和CXCR4上调，并且在代 表乳腺癌转移的第一个目的地的器官中高度表达CCL21和SDF-I及各自的配体(MUller 等.Nature 410:50-6(2001))。体外，通过中和性抗SDF-I和抗CXCR4抗体，可以抑制 SDF-1/CXCR-4介导的趋化性。在利用人MDA-MB-231乳腺癌细胞系的SCID小鼠乳腺癌转移模型中，当用抗CXCR4 抗体治疗小鼠时观察到了显著减少的肺转移。在引流淋巴结中，观察到了向腹股沟淋巴结 和腋淋巴结转移的减少(38%而不是在对照中的100%的转移)。因此，抗CXCL12免疫提供 了抗癌，更具体地抗乳腺癌转移的治疗方法。已经证明SDF-1/CXCR4趋化因子-受体对可以增加更原始的造血祖先细胞归巢成 为骨髓的效力。此外，推测CXCR4和SDF-I影响慢性淋巴细胞性白血病细胞的分布。这些 细胞总是浸润患者的骨髓，并且证明这些细胞在骨髓中的迁移是CXCR4依赖性的。如果慢 性淋巴细胞性白血病细胞不与基质细胞共培养，它们将出现细胞程序死亡。SDF-I阻断性抗 体可以抑制基质细胞的这种保护性作用(Burger等，Blood96 =2655-63 (2000)) 0因此，抗 CXCL12免疫提供了抗慢性淋巴细胞性白血病的治疗方法。
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已经证明CXCR4是HIV进入到T细胞的共同受体。SDF-I抑制X4 (依赖于CXCR4) HIV 株系对 CD4+细胞的感染(Oberlin 等，Nature 382 :833-5(1996) ；Bleul 等，Nature 382 :拟9-33 (1996) ,Rusconi 等，Antivir. Ther. 5 :199-204 (2000)) 已经证明 SDF-1 的合成 肽类似物有效地抑制HIV-I借助于CXCR受体的进入和感染(W0059928A1)。因此，抗CXCL12 免疫提供了阻断HIV进入T细胞的方法和由此治疗AIDS的方法。也报道了 SDF-1-CXCR4相互作用在类风湿性关节炎滑膜内⑶4+T细胞聚积中起重 要作用(Nanki等，2000)。因此，抗SDF-I免疫提供了抗类风湿性关节炎的治疗方法。已知人和鼠SDF-I通过单基因的不同剪接，以两种形式SDF-I α和SDF-I β出 现。它们有4个C末端氨基酸不同，SDF-I β (74个氨基酸)中存在这4个C末端氨基酸，而 SDF-I α (70个氨基酸)中不存在这4个C末端氨基酸。在Swissprot :SDF1_人类中示出 了人类SDF-I序列，在Swissprot :SDF1_小鼠中示出了小鼠SDF-1序列。SDF-1含有形成2 个分子内二硫键的4个保守性半胱氨酸。SDF晶体结构显示非共价连接的二聚体(Dealwis 等，PNAS 95 :6941-46(1998)) ο SDF-I结构也显示了长N末端延伸。丙氨酸扫描诱变被用于鉴定SDF-I上的受体结合位点(部分)(Ohnishi等， J Interferon Cytokine Res. 20 :691_70(K2000))，Elisseeva 等·(J. Biol. Chem. 275 26799-805(2000))和 Heveker 等.(Curr. Biol. 8 :369-76(1998))描述了抑制受体结合(和 HIV进入)的SDF-I衍生肽。在下文中，描述了适于产生与SDF-I有关的本发明组合物的构建体和表达系统。 SDF-I的N和C末端均暴露于溶剂。因此，在具体实施方式
中，含有作为第二附着位点的半 胱氨酸的氨基酸接头融合到蛋白质序列C末端，而在其它具体实施方式
中，含有作为第二 附着位点的半胱氨酸的氨基酸接头融合到蛋白质序列N末端。含有半胱氨酸的氨基酸接头 可以融合到对应于加工后的蛋白质序列的序列的N末端，或者插入到信号肽C末端，即成熟 形式蛋白质序列的N末端。可以在适宜的表达载体中克隆编码这些特异构建体的基因。已经描述了 SDF-I在鸡胚成纤维细胞中在仙台病毒系统中的表达(Moriya等， FEBS Lett. 425 :105-11 (1998))，此外大肠杆菌中(Holmes 等，Prot. Expr. Purif. 21 367-77 (2001)) SDF-I 的表达，和 SDF-1 的化学合成(Dealwis 等，PNAS 95 :6941-46(2001)) 也已有描述。在本发明另一个实施方式中，抗原决定簇是B淋巴细胞化学引诱物(BLC， CXCL13)。BLC在脾脏、淋巴集结和淋巴结中表达(Gurm等，1998)。在生发中心中其表达最 强，B细胞在此经受体细胞突变和亲和力成熟。BLC属于C)(C趋化因子家族，并且它的最接近 同系物是 GRO α (Gunn 等，Nature 391 :799-803 (1998))。人 BLC 与鼠 BLC 具有 64% 同源性。 它的受体是CXCR5。BLC也与IL-8有同源性。在次级淋巴器官诸如脾脏和淋巴集结中，BLC 向滤泡募集B细胞。BLC对于向富含滤泡树空细胞(FDCs)的淋巴结区室募集B细胞也是必 需的(Ansel等，Nature 406 :309-314 Q000) )。BLC也诱导在募集的B细胞上增加的淋巴毒 * α 1 β 2 (LT α 1 β 2)表达。由于LT α 1 β 2促进BLC表达，这就提供了正反馈循环(Ansel 等，Nature 406 :309-314 (2000)) 也已证明 BLC 能诱导淋巴新生(Lymphoidneogenesis) (Luther 等，Immunityl2 :471-481 (2000))。看起来 FDCs 也表达 BLC。因此，抗 BLC 免疫 可以提供涉及淋巴新生的自身免疫病诸如类风湿性滑膜炎和类风湿性关节炎或I型糖尿 病的治疗方法。已经描述了具有C末端His标签的BLC构建体，并且该构建体是功能性的(Ansel, K. Μ.等，J. Exp. Med. 190 :1123-1134(1999))。在本发明一个实施方式中，组合物包含含有作为第二附着位点的半胱氨酸残基的 接头，并且该接头融合在BLC序列的C末端。在与BLC同源的IL-8中，N和C末端都是游离的。含有作为第二附着位点的半胱 氨酸残基的氨基酸接头和BLC的N末端融合产生了本发明的一个实施方式。在本发明其它实施方式中，组合物包含含有半胱氨酸的氨基酸接头，并且该接头 融合到对应于加工后的蛋白质序列的序列的N末端，或者插入到信号肽C末端，即成熟形式 蛋白质序列的N末端。可以在适宜表达载体中克隆和相应地表达编码这些特定构建体的基 因。在记录号NP_006410中示出了人类BLC序列。该序列的氨基酸1_22是信号肽。在记 录号NP_061354中示出了小鼠序列。氨基酸1-21是信号肽。在一些实施方式中，具有BLC 做为抗原决定簇的本发明组合物利用了成熟形式的蛋白质来产生本发明的组合物。在另一个具体实施方式
中，抗原决定簇是Eotaxin。Eotaxin是对嗜酸性粒细胞、 嗜碱性粒细胞和Th2细胞上存在的趋化因子受体3特异的趋化因子。然而，看起来Eotaxin 对嗜酸性粒细胞具有高度特异性(ZimmermanJ. Immunol. 165 :5839-46 (2000))。尽管在剔 除Eotaxin-I的小鼠中，嗜酸性粒细胞迁移减少70%，但是其还可以发生嗜酸性粒细胞增 多(Rothenberg 等，J.Exp. Med 185:785-90(1997))。IL-5 看起来负责嗜酸性粒细胞从 骨髓向血液的迁移，而Eotaxin与组织中的局部迁移有关(Humbles等，J. Exp. Med. 186 601-12(1997))。人类基因组含有3种Eotaxin基因，Eotaxinl-3。它们相互有30%同源性。 目前在小鼠中己知 2 种基因=Eotaxinl 禾口 Eotaxin2 (Zimmerman 等，J. Immunol. 165 5839-46(2000))。它们有38%同源性。鼠Eotaxin2与人Eotaxin2有59 %同源性。在 小鼠中，看起来Eotaxinl在胃肠道中普遍地表达，而Eotaxin2似乎主要在空肠中表 达(Zimmerman 等，J. Immunol. 165 :5839-46 (2000)) Eotaxinl 存在于支气管肺泡液中 (Teixeira 等，J. Clin. Invest. 100 1657-66 (1997))。Eotaxin 具有 8. 3kDa 的 MW。在多种 条件下，它在单体和二聚体之间保持平衡，在37°C具有估算的1. 3mM Kd(Crump等，J. Biol. Chem. 273 :2M71_9 (1998))。然而，单体形式是主要的。通过NMR光谱学已经阐述了 Eotaxin 的结构。与受体CCR3的结合位点在N末端，并且第一个半胱氨酸之前的区域是至关重要的 (Crump 等，J. Biol. Chem. 273 :22471-9 (1998))。结合 Eotaxin 的趋化因子受体肽证实了该 发现。Eotaxin具有形成2个二硫键的4个半胱氨酸。因此，在一个实施方式中，本发明组 合物包含含有作为第二附着位点的半胱氨酸残基的氨基酸接头，并且在一个实施方式中， 该接头融合到Eotaxin序列C末端。在另外的实施方式中，含有半胱氨酸的氨基酸接头融 合到对应于加工后的蛋白质序列的序列的N末端，或者插入到信号肽C末端，即成熟形式蛋 白质序列的N末端。可以在适宜的表达载体中克隆编码这些特定构建体的基因。可以化学合成Eotaxin (Clark-Lewis 等，Biochemistry 30 :3128-3135 (1991))。 已经描述了大肠杆菌细胞质中Eotaxinl的表达(Crump等，J. Biol. Chem. 273 22471-9(1998))。也已描述了大肠杆菌中Eotaxin2作为包函体的表达，及随后的重折叠 (Mayer 等，Biochemistry 39 ；8382—95 (2000))，禾口 Eotaxin2 的昆虫细胞表达(Forssmann 等，J. Exp. Med. 185 :2171-6 (1997))，并且这些可以用于达到本发明具体的实施方式。在本发明另一个具体实施方式
中，抗原决定簇是巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF或CSF-1)。M-CSF或CSF-I是巨噬细胞和其骨髓祖先细胞增殖、分化和生存的调节物。M-CSF 的受体是原癌基因cFMS编码的细胞表面酪氨酸激酶受体。M-CSF和其受体升高的表达与 几种上皮癌(诸如乳腺癌、子宫癌和卵巢癌)中的不良预后有关。在由易患乳腺癌的转基 因小鼠(PyMT)和含有csf-Ι基因隐性无效突变的小鼠杂交得到的小鼠株系中，研究了肿 瘤进展。这些小鼠与PyMT小鼠比较显示了减弱的晚期侵入性癌和肺转移(Lin等，J.Exp. Med. 193 :727-739(2001)) 0原因看起来是缺少向肿瘤组织募集巨噬细胞。在csf. 1无效小 鼠中Lewis肺癌的表下生长也受损。推测肿瘤生长的巨噬细胞增强机理是通过巨噬细胞产 生的血管生成因子、生长因子和蛋白酶实现的。可以得到M-CSF可溶形式的结构数据(晶体结构=Pandit等，Science258 1358-62(199 )，并且表明蛋白质N和C末端是可以接近的。然而，N末端接近与受体相互 作用的位点。此外，M-CSF以可溶和细胞表面形式存在，其中跨膜区域在其C末端。因此， 本发明的一些实施方式包含含有半胱氨酸的氨基酸接头，并且在一个实施方式中，该接头 添加在M-CSF或其片段的C末端、可溶形式M-CSF的C末端。在其它实施方式中，含有半胱 氨酸的氨基酸接头融合到对应于加工后的蛋白质或可溶形式的蛋白质的序列的N末端，或 者插入到信号肽C末端，即成熟形式蛋白质或可溶形式蛋白质序列的N末端。M-CSF是二聚 体，其中两个单体通过链间二硫键连接。已经描述了用于M-CSF N末端149个氨基酸(功能性)片段的大肠杆菌表达系统 (Koths等，Mol. Reprod. Dev. 46 :31-37 (1997))。按上述进行修饰的这个M-CSF片段代表根 据本发明实施方式的一个抗原决定簇。在记录号NP_000748中示出了人类序列。本发明 其它抗原决定簇包含对应于可溶形式受体的、由上述序列的残基33-181或33-185组成的 N末端片段。在记录号NP_031804中示出了小鼠序列。成熟序列在氨基酸33开始。因此，本发 明一个抗原决定簇包含氨基酸33-181或33-185。在一个实施方式中，抗原决定簇是抵抗素(Res)。用兔多克隆抗体进行被动免疫 研究，其中该多克隆抗体抗细菌中表达的GST与小鼠抵抗素(mRes)的融合蛋白质而产生。 该被动免疫在肥胖症/11型糖尿病动物模型中导致改进的葡萄糖摄取(St印pan等，Nature 409 :307-12(2001))。抵抗素(Res)是约12KD的114个氨基酸的肽激素。它含有11个半胱氨酸，其中 已证明最N端的半胱氨酸负责蛋白质的二聚化，而其它10个半胱氨酸被认为参与分子内二 硫键形成(Banerjee 和 Lazar, J. Biol. Chem. 276 =25970-3 (2001)) 第一个半胱氨酸突变 为丙氨酸将废止mRes的二聚化。动物模型中，在其C末端具有FLAG标签的mRes保留了活性(St印pan等，Nature 409:307-12(2001)).相似地，C末端HA标记(血凝素标签)的抵抗素在组织培养测定中 也显示了活性(Kim等，J.Biol. Chem. 276 =11252-6 (2001)) 因此，在一个实施方式中，本发 明组合物包含含有作为第二附着位点的半胱氨酸残基的氨基酸接头，并且该接头融合在抵 抗素序列的C末端。在另一个实施方式中，包含半胱氨酸的氨基酸接头融合到对应于加工 后的蛋白质序列的序列的N末端，或者插入到信号肽C末端，即成熟形式蛋白质序列的N末 端。在本发明一个实施方式中，MRes或huRes也可以表达为Fc融合分子(其中在构建体的抵抗素和Fc部分之间插入蛋白酶切割位点)，诸如C末端为真核生物表达系统中融合 蛋白的Fc部分的铰链区之一个或多个半胱氨酸残基，或者诸如这里所述的融合方式。切割 融合蛋白可以释放抵抗素，此时抵抗素还包含含有半胱氨酸残基的氨基酸接头或者融合蛋 白R部分的全部或部分铰链区(其在C末端包含适于偶联AP205VLP的半胱氨酸残基)。在 记录号AF323081中示出了人类抵抗素序列。在记录号AF323080中示出了鼠序列。本发明 有利的实施方式是在其C末端融合了包含半胱氨酸残基的氨基酸接头的人抵抗素蛋白质。 可以根据这里公开的教导产生人抵抗素构建体，并且通过在蛋白质序列比对中比较鼠和人 抵抗素序列可以鉴定将要克隆到这里所述载体或其它适合表达载体中的人抵抗素序列部 分。适于产生本发明组合物的人抵抗素构建体的例子是人抵抗素-C-Xa，人抵抗素-C-EK和 人抵抗素-C。这样产生的人抵抗素构建体是本发明的一个实施方式。因此，利用本发明上述组 合物接种以对抗抵抗素，可以提供治疗II型糖尿病和肥胖症的方法。在另一个实施方式中，抗原决定簇是淋巴毒素，抗淋巴毒素免疫可以用于 治疗朊病毒介导的疾病。朊病毒是在大多数哺乳动物物种中存在的细胞蛋白质。朊病毒蛋 白质以两种形式存在，通常存在于健康个体中的正常折叠形式(PrF)和引起疾病的错误折 叠形式(PrPse)。目前朊病毒假说假设错误折叠的朊病毒能催化健康朊病毒重 折叠为引起疾病的PrPse (A. Aguzzi，Haematologica 85, 3-10 (2000)) 在一些罕见的例子 中，这种转换也可以自发出现，在人类中引起经典的CJD。I^rF中一些突变与这种自发转换 的增加有关，从而引起各种形式的家族性CJD。然而，PrPsc也可以具有传染性，可以通过输 血或通过食物链传递。后一种形式的朊病毒介导的疾病称为库鲁病(Kuru Kuru)，过去该病 出现在食人者中。然而，因为以自己个体为食的物种不多，所以这种通过口传递的疾病形式 太罕见以致于没有有关其它物种的文献记载。整个欧洲用牛肉产品大量饲养奶牛改变了受押！^可传染形式感染(引起BSE)的 奶牛的状况和数量，最近几年奶牛感染数量急剧增加，几十万奶牛受到这种感染。这种大量 BSE患病奶牛的突然出现在人群中引起了可以在人类中诱导相似疾病的极大恐慌。实际上， 在1996年，已报道了第一例变异形式的CJD，其由食用Pri^e感染的牛肉引起。到现在，这 种恐慌继续增加，因为在接下来的几年里受感染的人的数量持继地增加，并且没有治愈前 景。而且，因为绵羊会死于称为瘙痒病的朊病毒介导的疾病，且因为其它哺乳动物物种也可 以受IM3se感染，所以BSE样疾病也可能在其它物种中发生。据认为瘙痒病(朊病毒介导的疾病)因子的复制主要发生在淋巴组织中，并且 已证明其依赖于表达朊病毒-蛋白质的滤泡树空细胞(FDCs) (Brown等，Nature Med 11 1308-1312(1999))。已经很详细地研究了朊病毒传递的机制。现在清楚朊病毒首先在 感染的小鼠的淋巴器官中复制，随后向中枢神经系统转运。已证明在缺少功能性滤泡树 空细胞的小鼠中，朊病毒在脾脏中的复制会受损且神经侵入出现(小)延迟(Montrasio 等，Science 288 1257-1259 (2000)) 0这通过用可溶性淋巴毒素β受体-Fe-融合蛋白 (LTiBR-Fc)注射小鼠而达到。该可溶性受体构建体通过干扰Τ，B或NK细胞上的淋巴毒 素β和FDC前体细胞上的淋巴毒素β受体的重要相互作用，可以抑制FDCs发育。FDC 是很少研究的细胞类型，但是现在清楚它们的发育依赖于B细胞产生的淋巴毒素和/或 TNF (F. Mackay, J.L.Browning，Nature 395, 26-27 (1998)) 实际上，淋巴毒素缺陷的小鼠不显示 FDCs (M. S. Matsumoto 等，Science 264，703-707 (1996))。除了 FDCs 外，抗体也可 以在疾病的进展中起作用(S. Brandner, M.A.Klein, A. Aguzzi, Transfus Clin Biol 6， 17-23(1999))。因此，从淋巴器官消除FDCs的抗淋巴毒素β (也称为TNF γ )，LT α或LT β受体 的接种可以提供用于治疗或预防克-雅氏病(变异体形式)或其它朊病毒介导的疾病，诸 如牛海绵状脑病(BSE)的疫苗，并且由此预防朊病毒的复制和神经侵入。抗淋巴毒素β的免疫也可以提供治疗糖尿病的方法。非肥胖型糖尿病NOD小鼠中 可溶性LTiiR-Fc融合蛋白的转基因表达阻断了糖尿病发生而不阻断胰岛炎^ttinger等， J. Exp. Med. 193 1333-40Κ (2001))。Wu 等·(J. Exp. Med. 193 1327-32 (2001))也利用 NOD 小鼠研究了淋巴毒素β的参与，但是代替利用转基因动物，他们在试验中注射LT β R-Fc融 合蛋白。他们观察到对糖尿病发生的强抑制和对胰岛炎的抑制。最有趣地，通过融合蛋白 治疗，他们甚至逆转了先前存在的胰岛炎。因此，在胰腺中，可以逆转淋巴滤泡结构的形成。 因此，抗淋巴毒素β的接种可以提供抗I型糖尿病的治疗方法。在一个实施方式中，本发明组合物包含含有半胱氨酸的氨基酸接头，并且该接头 被添加到对应于加工形式的淋巴毒素β的序列的N末端，或者插入到对应于成熟形式蛋白 质的序列的N末端和信号肽之间，即信号肽C末端。在本发明相关实施方式中，淋巴毒素β 的细胞外部分表达为融合蛋白，其中该融合蛋白具有在淋巴毒素β的N端融合的谷胱甘 肽-S-转移酶，或者该融合蛋白具有在淋巴毒素β细胞外部分的N端融合的6个组氨酸标 签及随后的myc标签。含有蛋白酶切割位点的氨基酸间隔区及含有作为附着位点的半胱氨 酸的接头序列(蛋白酶切割位点C端)融合到淋巴毒素β细胞外部分序列的N末端。在 一个实施方式中，淋巴毒素β细胞外部分由对应于淋巴毒素β氨基酸49-306或126-306 的片段组成。可以在PCEP-Pu真核载体中克隆和表达本发明的这些特定的组合物。在一 些实施方式中，本发明组合物包含含有适于作为第二附着位点的半胱氨酸残基的氨基酸接 头，并且该接头融合到淋巴毒素β或淋巴毒素β片段的C末端。在特别有利的实施方式 中，氨基酸序列LACGG包含氨基酸接头ACGG，该接头本身含有用于偶联AP205VLP的半胱氨 酸残基，将该氨基酸序列融合到淋巴毒素β细胞外部分或淋巴毒素β细胞外部分的片段 的N末端，用肠激酶切割在载体pCEP-SP-GST-EK或载体pCP-SP-his-myc-EK中表达的相应 融合蛋白后，产生人C-LT β 49_306和人C-LT β 126_3Q6蛋白质。在一个实施方式中，抗原或抗原决定簇是朊病毒蛋白，其片段，特别是朊病毒蛋白 的肽。在本发明的一个实施方式中，抗原决定簇是朊病毒蛋白或其片段。抗朊病毒蛋白的免 疫可以提供治疗或预防克-雅氏病(变异体形式)或其它朊病毒介导的疾病的方法。对应于 鼠朊病毒蛋白片段和序列 CSAMSRPMIHFGNDTODRYYRENMYR(SEQ ID NO :17) (〃 cprplong") 和 CGNDTODRYYRENMYR( “ cprpshort “ ) (SEQ ID NO 18)的鼠肽包含用于化学偶联 AP205VLP的添加的N末端半胱氨酸残基，并且产生了本发明一个实施方式。在一个实施 方式中，朊病毒蛋白是人朊病毒蛋白。在整个申请中给出了如何修饰人朊病毒蛋白以连接 AP205VLP的指导。公开了小鼠朊病毒蛋白构建体，并且也可以制备人朊病毒蛋白构建体。包 括整个人朊病毒蛋白序列和人朊病毒蛋白的其它片段的其它构建体也是本发明的组合物。 抗朊病毒蛋白的免疫可以提供治疗或预防克-雅氏病(变异体形式)或其它朊病毒介导的 疾病的方法。利用包含朊病毒蛋白的本发明组合物进行免疫也可以提供治疗其他动物中朊
40病毒介导的疾病的方法。对应于上述鼠肽和氨基酸序列CSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHR(〃 人类 cprplong" ) (SEQ ID NO :19)禾口 CGSDYEDRYYRENMHR( 〃 人类 cprpshort 〃 ) (SEQ ID NO 20)的人朊病毒蛋白肽产生了本发明的实施方式。这些肽包含被添加用于偶联 AP205VLP的N末端半胱氨酸残基。相应的牛和绵羊肽是CSAMSRPLIHFGNDYEDRYYRENMHR(" 牛 cprplong “ )(SEQ ID NO 21)禾口 CGNDYEDRYYRENMHR(“牛 cprpshort “ )(SEQ ID NO 22)禾Π CSAMSRPLIHFGNDYEDRYYRENMYR(“绵羊 cprplong “ ) (SEQ ID NO 23)和 CGNDYEDRYYRENMYRC绵羊cprpshort" ) (SEQ ID NO J4)，所用这些都构成本发明实施方 式。在本发明一个实施方式中，抗原决定簇是肿瘤坏死因子(TNF-α)，其片段或 TNF-α肽。特别地，通过用分别包含本发明的这种肽或片段的疫苗和组合物免疫人和动 物，TNF-α肽或片段可以用于诱导抗整个蛋白质的自身特异性免疫应答。下面的鼠肽是 人肽的鼠源同系物，已经证明该肽可以与中和TNF-α活性的抗体结合Wone等.J. Biol. Chem. 270 :19509-19515)，并且在本发明另一个实施方式中，该肽用半胱氨酸残基修饰以便 与AP205VLP偶联。MuTNF α肽在由成熟鼠TNF- α氨基酸残基22_32组成的表位的N末端添加序列 cgg，产生了序列cggveeqle^wlsqr(seq id no :25)。3’ TNFII肽在由成熟鼠TNF- α氨基酸残基4-22组成的表位的C末 端融合序列GGC，并且将谷氨酰胺21突变为甘氨酸。由此得到的肽序列是 SSQNSSDKPVAHVVANHGVGGC(SEQ ID NO :26)。5’ TNFII肽在由成熟鼠TNF- α氨基酸残基4-22组成的表位的N末 端融合半胱氨酸残基，并且将谷氨酰胺21突变为甘氨酸。由此得到的肽序列是 CSSQNSSDKPVAHVVANHGV(SEQ ID NO :27)。与4-22 表位对应的人类序列是 SSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQ(SEQ ID NO :28)。对于 鼠源序列，在一个实施方式中，半胱氨酸融合在该表位N末端或者序列GGC融合在该表位C 末端以便共价偶联本发明AP205VLP。然而，将含有半胱氨酸的其它序列融合在表位的N或 C末端，也在本发明范围内。一般地，在一个实施方式中，将一个或两个甘氨酸残基插在添加 的半胱氨酸残基和表位序列之间。然而，也可以插入其它氨基酸而不是甘氨酸，并且这些氨 基酸残基包括小氨基酸，诸如丝氨酸。在本发明组合物的其它优选实施方式中，抗原或抗原决定簇是肿瘤坏 死因子(TNF-α )、其片段或突变蛋白质，或者TNF-α肽或其片段或突变蛋白 质的肽，其中具有所述第二附着位点的所述抗原或抗原决定簇具有选自如下 的氨基酸序列a)CSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQ(SEQ IDNO :100)氨基酸序列；b) SSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQGGC (SEQID NO :101)氨基酸序列；和 c) CGGQLQWLNRRANA (SEQ ID NO 102)氨基酸序列。对应于氨基酸残基22-32的人类序列是QLQWLNRRANA (SEQ IDNO 29)。在一个相 关实施方式中，序列CGG融合在该表位N末端以便共价偶联本发明AP205VLP。适于本发明 中使用的其它TNF-α表位也已经例如，由^ne等.(J. Biol. Chem. 270:19509-19515)描述 和公开。本发明还包括含有这里所述的抗原或抗原决定簇的模拟表位的组合物。本发明的一个特定组合物包含呈递在病毒样颗粒上用于诱导抗抗体免疫应答的抗体或抗体片段。在一个实施方式中，选择淋巴瘤细胞产生的抗体或抗体片段，将其和用于 免疫的病毒样颗粒附着，以便诱导抗淋巴瘤的保护性免疫应答。在其它进一步实施方式中，将模拟抗原的抗体或抗体片段附着在AP205VLP 上。这些模拟抗体或抗体片段可以通过免疫及随后分离此模拟抗体或抗体片段，或者通 过本领域任何已知的方法诸如杂交瘤技术(Gherardi, E.等，J. Immunol. Methods 126 61-68 (1990))，噬菌体展示(Harrison 等，Methods Enzymo 1. 267 :83-109 (1996))，核糖体 展示(Hanes, J.等，Nat. Biotechnol. 18 1沘7_1四2 (2000)，酵母双杂交(Visintin,M.等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 11723-117 (1999))，酵母表面展示(Boder，ET. &ffittrup, KD. Methods. Enzym. 328 :430-444 (2000)),细菌表面展示(Daugherty, PS.等，Protein Eng. 12 :613-621(1999))产生。也可以利用本领域已知的方法从抗体文库或幼稚抗体文库 (na'ive antibody library)分离模拟抗体。在进一步实施方式中，使用识别另一个抗体的结合位点的抗体，S卩，抗独特型抗 体，也称为免疫性抗体(immunizing antibody) 0抗独特型抗体识别的抗体也称为中和抗 体。因此，通过免疫以抵抗抗独特型抗体，可以在原位产生具有中和抗体特异性的分子；我 们也将这些产生的抗体称为诱导型抗体。在另一个实施方式中，选择免疫性抗体使它与免 疫作用所要对抗的靶分子的配体分子相互作用。配体分子可以是与靶分子相互作用的任何 分子，但是在一个实施方式中，优选地，配体分子与这样的靶分子位点相互作用，其中为了 抑制该靶分子的功能而产生的抗体应针对该靶分子位点。配体分子可以是靶分子的天然配 体或者可以是具有适宜结合特性的基因工程改造的、设计的或分离的任何配体。免疫性抗体可以来自于人，诸如从幼稚或免疫人类抗体文库分离，或者可以从产 生自其它动物来源，例如鼠源的文库分离。通过暴露的二硫键(例如，Fab片段中CHl和C κ或C λ之间的链间二硫键)的 有限还原，或者在另一个实施方式中，通过在抗体或抗体片段C末端融合含有半胱氨酸残 基的接头，实现抗体或抗体片段与AP205VLP的偶联。在另一实施方式中，含有半胱氨酸残 基的接头融合到抗体或抗体片段的N末端以附着VLP或菌毛蛋白质。如同产生和鉴定特定表位的模拟表位的方法，利用模拟表位的大量疫苗组合物也 是本领域已知的。例如，Arnon等，Immunology 101 :555-562 Q000)(这里将整个公开文献 并入为参考文献)描述了抗曼氏裂体吸虫(Schistosoma Mansoni)的基于模拟表位肽的 疫苗。这些疫苗中使用的模拟表位通过筛选固相Smer随机肽文库以鉴定抗曼氏裂体吸虫 保护性单克隆抗体识别的表位的模拟表位而获得。相似地，Olszewska等，Virology 272 98-105 Q000)(这里将整个公开文献并入为参考文献)描述了 f小鼠。此外，Zuercher等， Eur. J. Immunol. 30 =128-135(2000)(这里将整个公开文献并入为参考文献)描述了利用表 位展示噬菌体进行口服抗IgE免疫的组合物和方法。具体地，表位展示M13噬菌体用做口服 抗IgE疫苗的载体。试验的疫苗组合物含有单克隆抗IgE抗体BSW17的模拟表位和表位。本发明的实施方式包括含有引发针对特定抗原的免疫应答的模拟表位的疫苗组 合物，及组成这些疫苗组合物的单个模拟表位/AP205VLP缀合物，及这些疫苗组合物在引 发抗特定抗原或抗原决定簇的免疫应答中的用途。模拟表位也可以是多肽，诸如抗独特型 抗体。因此，在本发明另一实施方式中，抗原或抗原决定簇是抗独特型抗体或抗独特型抗体 片段。
本发明还包括含有这里所述的抗原或抗原决定簇的模拟表位的组合物。可以通过 大量方法(包括筛选随机肽噬菌体展示文库(参见，例如WO 97/31948，这里将整个公开文 献并入为参考文献))产生和鉴定特定抗原的模拟表位。常常会进行这种文库的筛选以鉴 定结合一种或多种对特定抗原具有特异性的抗体的肽。适于用在本发明疫苗组合物中的模拟表位可以是线性或环状肽。线性或环状肽模 拟表位可以通过非肽键连接非天然分子支架或核心颗粒或VLP。如上所述，已经鉴定了可以引发抗人IgE分子的免疫应答的大量人IgE模拟表位 和表位(参见，例如WO 97/31948)。因此，在一些实施方式中，本发明疫苗组合物包括引发 抗免疫球蛋白分子(例如，IgE分子)的免疫应答的组合物。可以用于激发这种免疫应答的肽包括蛋白质、蛋白质亚基、IgE分子结构域和能激 发对IgE分子具有特异性的抗体产生的模拟表位。一般地，用于制备疫苗组合物的IgE分 子部分将来源于组合物将要施用的物种的IgE分子。例如，打算给予人类的疫苗组合物将 常常含有人类IgE分子的一个或多个部分，和/或能激发抗人类IgE分子的免疫应答的一 种或多种模拟表位。在具体实施方式
中，施用给人类的本发明疫苗组合物将含有记录号AAB59424中 所述IgE重链恒定区的至少一部分。在更具体实施方式
中，用于制备本发明疫苗组合物的 IgE肽包含或者可替代地其组成为具有下面氨基酸序列的肽￡^VNLTWSRASG(SEQ ID NO: 30)。在其它特定实施方式中，本发明疫苗组合物将含有至少一种能激发免疫应答从而 导致对特定抗原具有特异性的抗体产生的模拟表位。适于在本发明疫苗组合物制备中使用 的IgE模拟表位的例子包括具有下面氨基酸序列的肽
权利要求
1.包含至少一种选自如下的蛋白质的病毒样颗粒(a)具有SEQID NO 1中所述氨基酸序列的蛋白质；(b)具有SEQID NO 3中所述氨基酸序列的蛋白质；和(c)所述(a)或(b)蛋白的突变蛋白质。
2.具有SEQID NO :3中所述氨基酸序列的突变蛋白质。
3.SEQ ID NO 1的重组蛋白质的突变蛋白质。
4.用于产生AP205病毒样颗粒的载体，其包含与SEQID NO :2或SEQ ID NO :4的核苷 酸序列至少80 %，优选地至少90 %，更优选地至少95 %，甚至更优选地99 %相同的核苷酸 序列。
5.用于产生重组蛋白质的载体，其包含编码与选自如下的蛋白质融合的多肽的核苷酸 序列(a)具有SEQID NO 1中所述氨基酸序列的蛋白质；(b)具有SEQID NO 3中所述氨基酸序列的蛋白质；和(c)所述(a)或(b)多肽的突变蛋白质。
6.一种组合物，其包含(a)选自如下的核心颗粒(i)AP205病毒颗粒；和(ii)AP205病毒样颗粒；和(b)有机分子，其中有机分子与核心颗粒结合。
7.一种药物组合物，其包含(a)权利要求6所述的组合物和(b)可接受的药物载体。
8.一种疫苗组合物，其包含免疫有效量的权利要求6所述的组合物。
9.一种用于产生非天然的、有序重复抗原阵列的方法，该方法包括(a)提供包含核心颗粒的分子支架，该核心颗粒选自(i)AP205病毒；和(ii)AP205病毒样颗粒；和(b)提供适于诱导免疫应答的有机分子；(c)提供连接(a)和(b)的物质，所述物质可选地包含在(a)和/或(b)中，或者作为 一个单独分子存在；和(d)组合(a)到(c)的元件，使所述有机分子与所述支架连接以形成有序重复的抗原阵列。
10.一种核酸分子，其包含SEQ ID NO :125中所述的核苷酸序列。
11.一种宿主细胞，其含有权利要求10所述的核酸或权利要求4所述的载体。
12.—种产生权利要求1所述的病毒样颗粒的方法，该方法包括步骤(a)提供权利要求4所述的核酸或权利要求11所述的载体；(b)向宿主细胞中引入所述核酸或所述载体；(c)在所述宿主细胞中表达所述核酸或所述载体的序列以获得能形成权利要求1所述的病毒样颗粒的蛋白质或突变蛋白质。
13.如权利要求8所述的疫苗组合物，其用于免疫方法中，优选地，其中所述组合物还 包含佐剂。
14.如权利要求8所述的疫苗组合物在制备疫苗中的用途，其中所述疫苗被施用给对 象；优选地，其中所述组合物还包含佐剂。
15.如权利要求6所述的组合物，其用于治疗或预防个体疾病、病症或生理学状况的方 法中，所述方法包括给所述个体施用所述组合物。
16.如权利要求6所述的组合物在制备用于治疗或预防个体疾病、病症或生理学状况 的组合物中的用途，其中所述组合物被施用给所述个体。
17.如权利要求8所述的疫苗组合物，其用于治疗或预防个体疾病、病症或生理学状况 的方法中，所述方法包括给所述个体施用所述组合物。
18.如权利要求8所述的疫苗组合物在制备用于治疗或预防个体疾病、病症或生理学 状况的疫苗中的用途，其中所述疫苗组合物被施用给所述个体。
全文摘要
本发明涉及使用衍生自AP205外壳蛋白的病毒样颗粒的分子抗原阵列。本发明提供了包含AP205病毒样颗粒(VLP)和抗原的组合物。本发明也提供了制备结合AP205VLP的抗原或抗原决定簇的方法。可以使用结合抗原的AP205VLP制备用于诱导免疫应答的组合物，其中所述免疫应答可以用于预防或治疗疾病、病症或状况，包括感染性疾病、变态反应、癌症、药物成瘾、中毒，和有效地诱导自身特异性免疫应答，特别是抗体应答。
文档编号A61K39/35GK102061288SQ20101015879
公开日2011年5月18日 申请日期2003年7月14日 优先权日2002年7月17日
发明者A·蒂索, I·西伦斯, M·F·巴赫曼, P·庞朋斯, R·伦霍法 申请人:希托斯生物技术股份公司