抗乙肝病毒的银杏叶聚戊烯醇活性组合物及其制备方法

专利名称：抗乙肝病毒的银杏叶聚戊烯醇活性组合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种抗乙肝病毒的银杏叶聚戊烯醇活性组合物及其制备方法，尤其涉 及银杏聚戊烯醇、黄酮和萜内酯组合物对IfepG 2215细胞分泌HBV DNA的抑制作用，可用于 治疗和辅助治疗乙型肝炎的药物。
背景技术：
据世界卫生组织的统计，目前，全球约有3. 5亿人为慢性肝炎患者或为无症状病 毒感染者。这些慢性肝炎的病人有转为肝硬化、肝癌的高危险性，每年有100多万人死于和 肝炎、肝硬化及肝癌有关的疾病。我国是病毒性肝炎的高发区，乙型肝炎病毒携带者有1. 2亿人，丙型肝炎病毒携 带者0. 38亿人，加上其他类型的肝炎，罹患肝炎的总人数近2亿人，估计每年因病毒性肝炎 导致直接经济损失300亿 500亿人民币。尤其是脂肪肝人群日益增多，而脂肪肝变性是 慢性丙肝病毒感染者罹患肝细胞癌的危险因子。目前，用于治疗肝脏疾病的药物有三类1)抗病毒药主要有干扰素和核苷类似 物，如拉米夫定、法昔洛韦等；2)免疫调节药主要有转移因子、白细胞介素_2、胸腺肽、皮质 激素等；3)改善肝功能药或抗肝细胞损伤药主要有易善力(肝得健)和各种中药复方制 剂。国内外已有研究表明，聚戊烯醇参与细胞膜N-糖蛋白生物合成，对保持细胞膜稳 定性和流动性具有重要作用。聚戊烯醇系天然产物，无毒副作用，具有免疫调节功能，促进 肝细胞保护和再生，适于开发保肝药物。聚戊烯醇还可和干扰素共用，或代替干扰素治疗肝 炎病毒。因为干扰素价格贵，因此利用聚戊烯醇开发保肝药物具有很好的市场竞争力。国内外对于植物聚戊烯醇的分离、纯化已有文献报道，主要纯化路线是通过几次 硅胶柱层析将聚戊烯醇粗提物的纯度提高到90%以上。此外，还有一些其他纯化方法，如 采用极性介质树脂(氧化铝或聚酰胺等)吸附，溶剂萃取和结晶，得到70% 75%的聚戊 烯醇，得率1. 0%左右。采用石油醚-乙酸乙酯冷冻脱杂后再进行硅胶柱层析纯化，制备纯 度92.7%聚戊烯醇。但产品中仍含有大量的类胡萝卜素等黄色素，Tetsuo Takigawa等曾 采用活性炭一种脱色剂对聚戊烯醇粗提物脱色，但活性炭用量大，脱色效果差，聚戊烯醇损 失大。因此，传统的聚戊烯醇纯化路线存在明显缺点繁琐、成本高、收率低，不适合工业化 生产。国内外有关专利报道了聚戊烯醇对肝疾病的保护作用，银杏提取物主要活性成分 为黄酮和萜内酯，广泛用于治疗和预防心脑血管疾病，本专利以聚戊烯醇含量低于40%的 植物脂溶性不皂化物为原料，采用活性炭与凹凸棒土作为混合脱色剂，对聚戊烯醇粗品脱 色。脱色后的聚戊烯醇再经过中压柱层析分离，即获得90%以上聚戊烯醇，辅以银杏黄酮 和萜内酯，制备银杏叶聚戊烯醇活性组合物，具有抗乙肝病毒的作用，可用于抗乙肝药物开 发。该方法与以往纯化方法相比，具有收率高、方便、经济、适合工业化生产等优点。

发明内容
为实现上述目的，发明了一种抗乙肝病毒的银杏叶聚戊烯醇活性组合物及其制备 方法，其特征在于由以下步骤组成第一步、聚戊烯醇类化合物粗品的脱色以聚戊烯醇含量低于40%的银杏叶脂溶物为原料，按固液比(g/mL)为1 (1 30)溶解于石油醚中，采用活性炭与凹凸棒土按质量比为1 (1 20)作为脱色剂，脱色剂 与聚戊烯醇粗品质量比为(10 150) 100,50 120°C下搅拌脱色10 80min。过滤， 二次，合并脱色清液，室温真空回收溶剂，制备脱色聚戊烯醇；第二步、柱纯化将脱色聚戊烯醇与硅胶按质量比1 (15 50)吸附，洗脱剂为石油醚乙酸乙 酯=100 (1 30)混合溶剂，硅胶柱柱长20 300cm，柱直径2 30cm，柱压为0. 3 3MPa,检测波长199 220nm，流速2 200mL/min，富集聚戊烯醇部位，室温真空回收溶剂， 制备90%以上聚戊烯醇；第三步、制备抗乙肝病毒制剂基于IOOg原料中含有4 8g 90%聚戊烯醇、10 15g银杏黄酮、2 6g银杏萜内 酯、15 20g植物油、3 5g日本木蜡、5 IOg卵磷脂、0. 5 3gVE、3 5g吐温_80、1 5g脱水山梨醇、3 IOg丙二醇、18 56. 5g去离子水。在室温下超声波乳化10 30min， 4°C以下保存，使用前用去离子水稀释到所需浓度，搅拌均勻，制成聚戊烯醇活性组合物制 剂。本专利以银杏叶为原料，通过非极性溶剂提取银杏叶聚戊烯醇乙酸酯，再通过皂 化水解，将聚戊烯醇乙酸酯转化为聚戊烯醇，同时将浸膏中酸性物以及其他酯类转变为水 溶性的盐，聚戊烯醇仍溶解在非极性溶剂中，从而达到分离。皂化均化方式、皂化温度、时 间和皂化剂对皂化反应有明显影响，优化结果表明均化方式为磁力搅拌，转速50 300r/ min，温度55 65°C，时间45 50min，皂化剂为5% 40% NaOH-EtOH，石油醚软膏与皂化 剂的比例为1 (5 10) (g/mL)。皂化后的银杏叶聚戊烯醇软膏为脂溶性不皂化物，按固液比(g/mL)为1 (1 30)溶解于石油醚中，采用活性炭与凹凸棒土作为混合脱色剂，质量比1 (1 20)，脱色 剂与聚戊烯醇粗品质量比为(10 150) 100，50 120°C下搅拌脱色10 80min。过滤， 二次，合并脱色清液，室温真空回收溶剂，制备脱色聚戊烯醇。本专利筛选普通颗粒炭、糖用脱色磷酸炭、味精脱色用炭、分子筛、活性白土、凹凸 棒土、混合脱色剂等脱色剂，优化脱色工艺。首次公开一种分光光度法，在451nm比色测定 聚戊烯醇脱色率。聚戊烯醇脱色率=[(AcrA1)ZAJXlOO^,式中=Atl-聚戊烯醇脱色前的吸 光度；A「聚戊烯醇脱色后的吸光度。设定原料中色素含量为％，脱色一次，结果表明活性炭 与凹凸棒土的混合脱色剂的脱色效果最好。较未脱色聚戊烯醇相比，脱色色度降低200倍 以上。如表1和图1。表1不同脱色剂对GPP的脱色效果 本专利采用L9(34)正交试验确定最佳脱色条件，将聚戊烯醇软膏按固液比(g/mL) 为1 (1 30)溶解于石油醚中，优选1 (6 10)；混合脱色剂活性炭与凹凸棒土质量比 为1 (3 8)，优选1 (5 6)；聚戊烯醇软膏与脱色剂用量质量比为(1 5) (1 5)，优选(1 5) (1 2)；脱色温度50 120°C，优选50 80°C;脱色时间20 50min。 过滤，二次，合并脱色清液，室温真空回收溶剂，制备脱色聚戊烯醇，脱色率大于96 %，较未 脱色聚戊烯醇相比，脱色后色度降低200倍以上。本发明不仅脱色效果好，而且采用活性 炭与凹凸棒土作为混合脱色剂。如，IOg纯度38%的聚戊烯醇粗品溶于IOOmL石油醚，脱 色剂用量10 15g，活性炭与凹凸棒土之比为1 5，脱色温度70 80°C，脱色时间20 30min。经过脱色，纯度提高到50%，聚戊烯醇基本无损失。为了制备90%以上无色的聚戊烯醇，本专利采用中压正相柱纯化，中压柱柱长 20 300cm，柱直径2 30cm，填料选择200 500目的硅胶，流速2 200mL/min，将聚戊烯 醇粗制品与硅胶按质量比1 (15 50)吸附，洗脱剂为石油醚乙酸乙酯=100 (1 30)混合溶剂，优选石油醚乙酸乙酯=100 (1 10)冲压柱填料采用干法装柱，N2加 压，柱压为0. 3 3MPa，紫外检测波长199 230nm，优选210nm，流速2 200mL/min，优选 5 20mL/min，根据UV吸收峰值富集聚戊烯醇部位，室温真空回收溶剂，制备90%以上无色 的聚戊烯醇。采用传统的硅胶柱层析的纯化方法，聚戊烯醇粗提物须经过连续三次硅胶柱层 析，将聚戊烯醇的纯度提高到90%以上，最终收率7.4%。采用本发明的中压柱纯化，聚戊 烯醇粗提物先在最佳条件下脱色，再经过一次中压柱层析即可将聚戊烯醇的纯度提高到 90%以上，收率30%。与以往纯化方法相比，此种方法具有简便、快捷、经济的优点，而且收 率明显提高4倍以上，同时适合工业化生产。本专利公开HPLC外标法测定聚戊烯醇的纯度。通过HPLC分析，绘制标准曲线，测定聚戊烯醇的纯度。色谱柱为Kromasil C18 0DS-1 (5 μ m，150 X 4. 6mm)，柱温为室温，紫夕卜 检测波长210nm，流动相为异丙醇甲醇=38 37，流速为1. OmL/min。本发明以无色的聚戊烯醇为原料，基于IOOg原料中含有4 8g 90%聚戊烯醇、 10 15g银杏黄酮、2 6g银杏萜内酯、15 20g植物油、3 5g日本木蜡、5 IOg卵磷 脂、0. 5 3gVE、3 5g吐温_80、1 5g脱水山梨醇、3 IOg丙二醇、18 56. 5g去离子 水。在室温下超声波乳化10 30min，4°C以下保存，使用前用去离子水稀释到所需浓度，搅 拌均勻，制成的聚戊烯醇活性组合物可制备胶囊，口服液，滴丸，乳液和注射剂。本专利中银杏叶黄酮和萜内酯来源于银杏叶提取物，其中银杏黄酮>24%，萜内 酯> 6 %，银杏酚酸< lppm。而国际上标准银杏叶提取物中银杏黄酮> 24 %，萜内酯> 6 %， 银杏酚酸< 5ppm，因此本发明中银杏酸的含量更少，对人体更有利。通过本专利制备的聚 戊烯醇活性组合物可制备胶囊，口服液，滴丸，乳液和注射剂，用于治疗乙肝病毒药物的应 用，对细胞毒性较弱，实验中未见到细胞形态异常及细胞破碎等毒性变化。在浓度最高到 100 μ M时，对细胞生长没有抑制作用，与阳性药3TC效果相当，对H印G 2215细胞分泌乙肝 s抗原、e抗原具有明显的抑制作用，对细胞分泌HBV DNA有较好的抑制作用。本发明获得以下技术效果(1)首次将银杏叶聚戊烯醇、黄酮和萜内酯活性物按功效作用组成复合制剂，应用 于抗乙肝HBV DNA病毒，与阳性药3TC效果相当，对H印G 2215细胞分泌乙肝s抗原、e抗 原具有明显的抑制作用，对细胞分泌HBV DNA有较好的抑制作用，其效果比单一组方提高 50%，相对于化药，具有明显的减毒增效的作用。(2)本发明采用活性炭与凹凸棒土的混合脱色剂脱色，较未脱色聚戊烯醇相比，脱 色后色度降低200倍以上，脱色率大于96%，制备的无色聚戊烯醇可用于医药注射剂，并且 凹凸棒土价格低廉，脱色装置设备易于实现，脱色条件容易控制，适合工业化生产。(3)本发明采用活性炭与凹凸棒土的混合脱色剂，经过脱色，聚戊烯醇纯度提高到 50%，聚戊烯醇基本无损失。而以往任何聚戊烯醇的纯化工艺都会伴随聚戊烯醇的损失。(4)采用传统的硅胶柱层析的纯化方法，聚戊烯醇粗提物须经过连续三次硅胶柱 层析，将聚戊烯醇的纯度提高到90%以上，最终收率7.4%。采用本发明的中压柱纯化，聚 戊烯醇粗提物先在最佳条件下脱色，再经过一次中压柱层析即可将聚戊烯醇的纯度提高到 90%以上，收率30%。与以往纯化方法相比，此种方法具有简便、快捷、经济的优点，而且收 率明显提高4倍以上，同时适合工业化生产。


图1冷冻脱色后聚戊烯醇的HPLC 2C95polyprenol 标准曲线3GP-1对IfepG 2215分泌的HBV DNA的抑制作用
具体实施例方式以下实施例为本发明的一些举例，不应被看做是对本发明的限定。实施例1聚戊烯醇的HPLC方法本实施通过HPLC分析，色谱柱为Kromasil C18 0DS-1 (5 μ m，150 X 4. 6匪)，柱温
6为室温，紫外检测波长210nm，流动相为异丙醇甲醇=38 37，流速为1. OmL/min。以 C95polyprenol为标准对照品，纯度98% (瑞典Larodan Fine Chemiclals公司提供)。(1)标准对照品溶液的配制用分析天平准确称取聚戊烯醇标准对照品(C95 polyprenolH.Omg，用正己烷溶 解，定容到10mL，配制的标准液浓度为0. 40mg/mL。(2)标准对照品曲线的绘制用微量注射器分别吸取聚戊烯醇标准对照品溶液(0. 4mg/mL) 1 μ L、2 μ L、3 μ L、 4 μ L和5 μ L，按上述色谱条件进样，各重复三次，测定相应的峰面积，绘制标准曲线，线性 方程Y= 1.5751X+1. 1546。根据HPLC标准曲线，同样条件下测定样品中聚戊烯醇的纯度。 如图2。(3)样品的处理精密称取银杏叶聚戊烯醇样品10mg，用正己烷溶解，定容到10mL，为HPLC供试样 品。取配制好的供试样品，按上述色谱条件进样，进样量为5yL，测定聚戊烯醇的含量。(4)精密度试验取银杏叶聚戊烯醇(批号为090420T)样品，按上述拟定的方法测定聚戊烯醇的含
量，其结果如下 (5)加样回收率试验分别精确称取已知含量的银杏叶聚戊烯醇样品(批号090420T，聚戊烯醇含 量65.3% ) 5. Omg，置于锥形瓶中，各精密加入聚戊烯醇标准对照品溶液(每ImL溶液含 0. IOmg聚戊烯醇标准品)lmL、2mL、3mL、4mL、5mL，按样品含量测定方法处理分析，计算加样
回收率，其结果如下 (6)稳定性试验精确称取已知含量的银杏叶聚戊烯醇样品(批号090420T，聚戊烯醇含量 65.3%) 5. Omg，用正己烷溶解，定容到IOmL, % HPLC供试样品。分别于O、2、4、6、8、10、12h 进样，测定样品的峰面积，计算，RSD = 1. 06% (η = 7)。 实施例290%银杏叶聚戊烯醇制备方法以聚戊烯醇含量低于40%的银杏叶脂溶物为原料，按固液比(g/mL)为1 (1 30)溶解于石油醚中，采用活性炭与凹凸棒土作为混合脱色剂，质量比1 (1 20)，脱色 剂与聚戊烯醇粗品质量比为(10 150) 100,50 120°C下搅拌脱色10 80min。过滤， 二次，合并脱色清液，室温真空回收溶剂，制备脱色聚戊烯醇。将脱色聚戊烯醇与硅胶按质 量比1 (15 50)吸附，洗脱剂为石油醚乙酸乙酯=100 (1 30)混合溶剂，硅胶 柱柱长20 300cm，柱直径2 30cm，柱压0. 3 3MPa，检测波长199 220nm，流速2 200mL/min，富集聚戊烯醇部位，室温真空回收溶剂，制备90%以上聚戊烯醇。实施例3聚戊烯醇的中压硅胶柱纯化方法取25%聚戊烯醇的植物脂溶性不皂化物20g，加入250mL正己烷乙酸乙酯丙 酮=8 3 89的混合溶剂中，-30°C冷冻3h，-20°C离心过滤，二次，合并上清液，室温真 空回收溶剂，制备聚戊烯醇软膏16g。取IOg纯度为31. 8%的聚戊烯醇软膏，溶于IOOmL石 油醚，采用活性炭与凹凸棒土作为混合脱色剂，脱色剂用量12g，活性炭与凹凸棒土之比为 1 5，脱色温度70°C，搅拌脱色20min。经过脱色，纯度提高到49. 6%。取硅胶400目，干 法装柱(柱长30cm，柱直径2. 5cm)，在-0. 05至-0. 08MPa抽空气20 30min，从柱的底部 加入石油醚，直到石油醚全部充满柱子，空气排尽，在柱压为0. 3 3MPa，检测波长210nm， 流速lOmL/min循环5_10Bv柱平衡后，将脱色后纯度为49. 6%的聚戊烯醇6g溶于50mL石 油醚中，柱压0. 3 3MPa，检测波长199nm，流速6mL/min，依次使用石油醚、1 %乙酸乙酯/ 石油醚、2%乙酸乙酯/石油醚、3%乙酸乙酯/石油醚洗脱，3%乙酸乙酯/石油醚的洗脱液 富集聚戊烯醇部位，室温真空回收溶剂，制备93%聚戊烯醇。实施例4银杏叶聚戊烯醇脱色方法筛选普通颗粒炭、糖用脱色磷酸炭、味精脱色用炭、分子筛、活性白土、凹凸棒土、 混合脱色剂等脱色剂，在451nm比色测定聚戊烯醇脱色率。聚戊烯醇脱色率=[(A0-A1)/ AJ X100%，式中=Atl-聚戊烯醇脱色前的吸光度聚戊烯醇脱色后的吸光度。IOg聚戊烯醇粗品置于250mL三口烧瓶中，加入IOOmL石油醚溶解，按选择的因素 和水平进行脱色。脱色后的产品过滤、浓缩，测定吸光度，计算聚戊烯醇的脱色率。设定原 料中色素含量为％，脱色一次，结果表明活性炭与凹凸棒土的混合脱色剂的脱色效果最好， 选择活性炭与凹凸棒土作为混合脱色剂。
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选取混合脱色剂的比例、脱色剂用量、脱色温度、脱色时间4个因素，以收率和脱 色率两个指标考查脱色工艺，设计了 4因素3水平L9 (34)正交试验，得出银杏叶聚戊烯醇的 最佳脱色条件。如表2和表3。表2正交试验因素水平表
水平AB因素 CD脱色剂用量活性炭凹凸棒土时间々日 FiF ism.) 又1101:510502121:320603141:13070表3正交试验结果与分析因素试验号A BC D 收率/%脱色率/%
1111181.1293.852122278.1696.253133378.2897.444212377.6497.915223173.0996.556231266.3896.967313274.5098.738321371.0898.819332159.6898.68K1237.56233.26218.58213.89K2217.11222.33215.48219.04K3205.26204.34225.87227kt79.1977.7572.8671.30k272.3774.1171.8373.01k368.4268.1175.2975.67R10.779.643.464.37K1'287.54290.49289.62289.08K2'291.42291.61292.84291.94K3'296.22293.08292.72294.16ki'95.8596.8396.5496.36k2'97.1497.2097.6197.31k3'98.7497.6997.5798.05R'2.890.861.071.69通过对各因素的综合评价，由极差大小可见，A、B、C、D 4个因素影响收率的主次顺 序为A > B > D > C，即脱色剂用量>脱色剂比例>温度>时间；影响脱色率的主次顺序为 A > D > C > B，即脱色剂用量>温度>时间>脱色剂比例。考查总体脱色效果时，要求收 率和脱色率尽量都要高，由表4可以看出最佳脱色工艺为A2B1C2D3和A3B1C3D215两者脱色剂 用量分别为12g和14g，而通过HPLC测定，得出这两种脱色条件下得到的聚戊烯醇纯度相差 不大，从经济角度考虑，最终选择A2B1C2D3为最佳脱色工艺，即脱色剂用量12g，活性炭与凹 凸棒土之比为1 5，脱色温度70°C，脱色时间20min。实施例5聚戊烯醇的活性组合物制剂的制备方法基于IOOg原料，其中含有4 8g 90%聚戊烯醇、10 15g银杏黄酮、2 6g银 杏萜内酯、15 20g植物油、3 5g日本木蜡、5 IOg卵磷脂、0. 5 3g VE、3 5g吐 温-80、1 5g脱水山梨醇、3 IOg丙二醇、18 56. 5g去离子水。在室温下超声波乳化 10 30min，4°C以下保存，使用前用去离子水稀释到所需浓度，搅拌均勻，可制成IOOOmL聚戊烯醇活性组合物口服液，乳液，滴丸和注射液。实施例6聚戊烯醇的活性组合物胶囊取聚戊烯醇活性组合物30g、橄榄油55g、日本木蜡3g、蜂蜡4g、微晶纤维素Sg。依 次加入到500mL反应器中，60 70°C，真空700 760mmHg，搅拌20 30min，混勻。将明 胶、甘油、纯水按1 0.5 1.2的比例加入溶胶罐中搅拌，蒸汽夹层加热，温度50 80°C， 使其溶化，保温1 2h，真空脱气，过滤，胶液待用。调整压丸室的环境条件，使其达到恒温 恒湿，温度为25°C、相对湿度为35%。将物料压制成圆形软胶囊800 1000粒。实施例7聚戊烯醇的活性组合物注射剂取聚戊烯醇活性组合物15g、聚氧乙烯硬蓖麻油60g、脱水山梨醇2g、丙二醇5g、去 离子水18g。在室温下超声波乳化10 30min，使用前用去离子水稀释到所需浓度，搅拌均 勻，分别装入IOmL安瓿，在100°C蒸汽下灭菌40min，制成聚戊烯醇活性组合物注射剂。实施例8聚戊烯醇抗乙型肝炎病毒的药理试验一、实验目的用H印G 2215细胞作为模型，研究银杏叶聚戊烯醇(GP-1)的细胞毒性以及抗乙型 肝炎病毒的药效，包括对细胞毒性、乙肝病毒表面和核心抗原的分泌及对DNA的复制水平 的影响。二、受试药物GP-1，实验室制备。基于IOOg原料，其中含有5g90%聚戊烯醇、15g银杏黄酮、6g 银杏萜内酯、20g橄榄油、8g卵磷脂、2gVE、3g吐温-80、5g脱水山梨醇、7g丙二醇、4g日本木 蜡、25g去离子水。在室温下超声波乳化10 30min，4°C以下保存，使用前用去离子水稀释 到所需浓度，搅拌均勻，可制成IOOOmL聚戊烯醇活性组合物乳液。每个样品做5个稀释浓 度试验，阳性对照药物拉米夫定(3TC)，购自葛兰素史克。三、实验方法采用四氮唑还原法(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide assay MTT)检测药物对IfepG 2215生长的抑制作用；ELISA法测定 上清液中HBsAg、HBeAg含量；荧光定量PCR法测定上清中病毒DNA含量四、主要步骤1)取H印G 2215细胞一瓶，用胰酶消化后制备成单细胞悬液，计数后调整细胞浓 度至2X104cell/mL，加入96孔培养板中(每孔100 μ L)。置于细胞培养箱中，37°C、5% CO2 培养过夜。2)取出培养板，吸去上清后加入含有不同浓度药物的DMEM培养基(含5%胎牛 血清)；放入细胞培养箱，继续37°C、5%C02培养48小时。药物浓度分别为100yg/mL， 10 μ g/mL,1 μ g/mL,0. 1 μ g/mL,0. 01 μ g/mL。3)在96孔培养板各孔中加入10 μ L的ΜΤΤ，重新放入培养箱继续培养4小时。仔 细吸去上清，每孔加入150 μ L DMS0，轻轻振荡使甲溶解，用酶标仪检测570nm处的OD值。4)细胞处理取H印G 2215细胞一瓶，用胰酶消化后制备成单细胞悬液。调节细胞浓度至 2X104cell/mL，加入24孔细胞培养板中(lmL/well)。放入细胞培养箱，37°C、5 % CO2培 养过夜。取出24孔细胞培养板，吸出上清后依次加入不同浓度的药物。药物浓度分别为100 μ g/mL，50 μ g/mL，25 μ g/mL，12. 5 μ g/mL，6. 25 μ g/mL 以及 3TC 20 μ g/mL (阳性对照)。 放入细胞培养箱，37°C、5%C02培养。分别于第3、6、9天更换新鲜培养基，并将各孔上清液 收集至1. 5mL的离心管中冻存备用。5)上清 HBsAg，HBeAg 的检测采用科华ELISA试剂盒进行检测，操作按照试剂盒的使用说明进行。最后用酶标 仪读取波长450nm处的OD值。6)病毒基因组DNA 的分离(CASsuper Virus Genomic DNA Isolation Kit)取药物 作用第9天的细胞培养上清200 μ L于1.5mL离心管中，然后加入200 μ L Binding Buffer, 立即混勻，室温孵育lOmin。加入IOOyL异丙醇，混勻。将混合液转移到一个已经套入收集 管的吸附柱内，于12000rpm离心lmin。弃去收集管中的废液，将吸附柱放入同一个收集管 中。加入500 μ L WBl，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入同一收集管 中。加入500 μ L WB2，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入同一收集管 中。12000rpm离心2min。将吸附柱放入一个干净的1. 5mL离心管中，室温放置数分钟以确 保乙醇完全挥发干净。在吸附柱的膜中央小心加入100 μ L Elution Buffer (65°C水浴预热 可有效提高得率)，室温或37°C水浴静置2min。12000rpm离心lmin，得到洗脱液，-20°C保 存。7)荧光定量 PCR 反应(ICycler)依次序在0. 2mL PCR管中加入以下成分 混勻后短暂离心，放入PCR仪的样品孔上，进行反应；反应设置如下95 0C 90s, 95 0C 5s, 55 °C 15s，72°C 20s，5 个循环；95°C 5s，60°C 30s, 40 个循环； 95°C 60s, 55°C 60s, 55°C 10s, 80 个循环；4°C保存。8)数据处理数据表示为means士SD ；采用t_test检验，当P < 0. 05时认为具有显著意义。五、实验结果1.药物毒性实验不同稀释倍数的药物加于单层H印G 2215细胞上，每日观察细胞生长形态，检测 有无病变；并以MTT法测定细胞的活力(表4)。
表4. GP-I对IfepG 2215的生长抑制作用 药物作用48小时，MTT法测定细胞活力。χ士s，η = 4.结果表明，GP-I (0. 01 100 μ Μ)作用下，用药组和未用药组均未见到明显的细胞 形态异常及细胞破碎等毒性变化。2.病毒抗原抑制试验HepG 2215在24孔培养板上生长至单层，加入不同稀释倍数的GP_1，同时设细胞 对照组和药物对照组，培养3、6、9天分别取上清液测定HBsAg和HBeAg，并与细胞对照组比 较，计算抑制率、IC50以及TI。对HBsAg的抑制情况如表5，对HBeAg的抑制情况如表6。表5. GP-I对H印G2215分泌HBsAg的抑制作用
实验重复两次，X士S，η = 3，**Ρ < 0. 01，compared with control.
表6. GP-I作用不同的时间对H印G2215分泌的HBeAg的抑制作用 实验重复两次，χ士s，η= 3，*P < 0. 05，**P < 0. 01, compared with control.结果表明高浓度GP-1与阳性药3TC效果相当，对H印G 2215细胞分泌乙肝s抗 原、e抗原具有明显的抑制作用。3.病毒核酸抑制实验从细胞培养上清中提取HBV DNA，用荧光定量PCR进行定量。使用的引物序列为 5，-AACTGA AAG CCA AAC AGT G-3，和 5，-CCT CTT CAT GCT GCT-3，。如表 7 禾口图 3。表7. HBV DNA 定量 结果表明GP_1在各个浓度上对细胞分泌HBV DNA有较好的抑制作用。
权利要求
一种抗乙肝病毒的银杏叶聚戊烯醇活性组合物及其制备方法，其特征在于由以下步骤组成第一步、聚戊烯醇类化合物粗品的脱色以聚戊烯醇含量低于40％的银杏叶脂溶物为原料，按固液比(g/mL)为1∶(1～30)溶解于石油醚中，采用活性炭与凹凸棒土作为混合脱色剂，质量比为1∶(1～20)，脱色剂与聚戊烯醇粗品质量比为(10～150)∶100，在50～120℃下搅拌脱色10～80min，过滤，二次，合并脱色清液，室温真空回收溶剂，制备脱色聚戊烯醇；第二步、柱纯化将脱色聚戊烯醇与硅胶按质量比1∶(15～50)吸附，洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯＝100∶(1～30)混合溶剂，硅胶柱柱长20～300cm，柱直径2～30cm，柱压为0.3～3MPa，检测波长199～220nm，流速2～200mL/min，富集聚戊烯醇部位，室温真空回收溶剂，制备90％以上聚戊烯醇；第三步、制备抗乙肝病毒制剂基于100g原料中含有4～8g 90％聚戊烯醇、10～15g银杏黄酮、2～6g银杏萜内酯、15～20g植物油、3～5g日本木蜡、5～10g卵磷脂、0.5～3gVE、3～5g吐温 80、1～5g脱水山梨醇、3～10g丙二醇、18～56.5g去离子水，在室温下超声波乳化10～30min，4℃以下保存，使用前用去离子水稀释到所需浓度，搅拌均匀，制成聚戊烯醇活性组合物。
2.根据权利要求1所述的一种抗乙肝病毒的银杏叶聚戊烯醇活性组合物及其制备方 法，其特征在于第一步中银杏叶脂溶物来源于银杏叶，经石油醚、正己烷、溶剂汽油非极性 溶剂浸提，皂化，萃取等工艺处理，得到聚戊烯醇含量低于40%的软膏。
3.根据权利要求1所述的一种抗乙肝病毒的银杏叶聚戊烯醇活性组合物及其制备方 法，其特征在于第三步中银杏叶黄酮和萜内酯来源于银杏叶提取物，其中银杏黄酮> 24%， 萜内酯> 6%，银杏酚酸< lppm。
4.根据权利要求1所述的一种抗乙肝病毒的银杏叶聚戊烯醇活性组合物及其制备方 法，其特征在于所述的聚戊烯醇活性组合物可制备胶囊，口服液，滴丸，乳液和注射剂。
5.根据权利要求1所述的一种抗乙肝病毒的银杏叶聚戊烯醇活性组合物及其制备方 法，其特征在于所述的聚戊烯醇活性组合物用于治疗乙肝病毒药物的应用。
全文摘要
一种抗乙肝病毒的银杏叶聚戊烯醇活性组合物及其制备方法，是以聚戊烯醇含量低于40％的银杏叶脂溶物为原料，采用活性炭与凹凸棒土作为混合脱色剂，质量比为1∶(1～20)，脱色剂与聚戊烯醇粗品质量比为(10～150)∶100，50～120℃下搅拌脱色10～80min。脱色后的聚戊烯醇再经过中压柱层析分离，纯度达到90％以上，辅以银杏黄酮和萜内酯，制备的银杏叶聚戊烯醇活性组合物，具有抗乙肝病毒的作用，可用于抗乙肝药物开发。
文档编号A61K36/16GK101890059SQ20101022184
公开日2010年11月24日 申请日期2010年7月9日 优先权日2010年7月9日
发明者叶建中, 杨兰, 王成章, 陈虹霞 申请人:中国林业科学研究院林产化学工业研究所