一种NovQ芳香族异戊烯基转移酶催化合成维生素K₂的方法

一种NovQ芳香族异戊烯基转移酶催化合成维生素K₂的方法
【专利摘要】本发明公开一种NovQ芳香族异戊烯基转移酶催化合成维生素K2的方法，(1)维生素K3溶解于乙醇水溶液中，加入NaBH4，在N2保护下，控制温度不超过50℃，搅拌反应至体系呈淡绿色透明液体，中和至pH4.0后，用乙酸乙酯萃取产物，浓缩后冷冻结晶，过滤除清液得到维生素K3氢醌；(2)将维生素K3氢醌和DMAPP加入酶促反应体系中，反应在密闭和N2保护条件下进行，反应完成后，加入Fe3+，去除N2保护，充分氧化后，使用乙酸乙酯萃取得到产物。本发明核心环节为生物酶催化工程技术，利用廉价的维生素K3催化合成高值的维生素K2。本发明生产工艺简单，生产成本低廉，生产过程绿色环保。CCTCC M 201610520160311
【专利说明】
-种NovQ芳香族异戊烯基转移酶催化合成维生素 K2的方法
技术领域
[0001] 本发明属于芳香族异戊締基转移酶催化合成精细化学品领域，具体设及一种NovQ 芳香族异戊締基转移酶催化合成维生素 K2的方法。
【背景技术】
[0002] 维生素 K2是维生素 K家族中的一员，其分子结构特征为2位被多聚异戊二締侧链取 代的3-甲基-1,4-糞酿。根据其多聚异戊二締侧链聚合单元数目，可W分为MKi、MK2、MK4等14 种。在自然界中，维生素 K2主要存在于原核生物中，为细胞膜上电子传递链组成成分，同时 也是各种维生素 K在人体内被利用的最终活性形式。
[0003] 维生素 K最早被人们所认知是因为其凝血活性，它是凝血因子丫一簇化酶的辅酶， 同时也是凝血因子7、9、10合成的必需条件。缺乏维生素 K会导致凝血时间延长，严重者甚至 无法凝血。在防止新生儿出血疾病，预防内出血及持疮，减少女性生理期大量出血，促进血 液正常凝固方面具有重要作用。随后人们发现维生素 K2对治疗和预防骨质疏松有明显效 果，可W促进成骨细胞巧化，增加骨密度，防止骨折。近些年来，维生素 K2在抗肝癌方面的作 用逐渐显现出来，研究证实了其对人肝癌细胞的生长增殖抑制作用和诱导调亡作用。最近 神经科学方面的研究表明，维生素 K2能恢复受损神经细胞线粒体功能，可能在帕金森症治 疗方面具有重要意义。
[0004] 维生素 K2目前可W通过化学合成法和微生物发酵法来合成，现阶段国内W化学法 为主。化学法合成的维生素 K2产品存在异构体、副产物多、产率低、带来环境污染等问题，且 受化学前体原料来源限制。利用微生物发酵法制备维生素 K2,发酵原料易得、条件溫和、环 境压力低，同时因为本身来源于生物，制备的维生素 K2具有高生物活性和高生物相容性，易 于人体吸收与利用。然而微生物发酵制备维生素 K2代谢过程非常冗长，且分支节点多，受多 种代谢物抑制，整体合成效率低下，后续纯化工艺复杂，目前难W满足大规模生产需要。目 前国内外利用单酶体外催化法合成维生素 K2还未见有报道。

【发明内容】

[0005] 本发明的目的在于提供一种使用NovQ芳香族异戊締基转移酶催化合成维生素 K2 的方法。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用了 W下方案:一种NovQ芳香族异戊締基转移酶催化 合成维生素 K2的方法，包括W下步骤：
[0007] (1)维生素 K3溶解于乙醇水溶液中，加入化B也，在化保护下，控制溫度不超过50°C， 揽拌反应至体系呈淡绿色透明液体，中和至PH4.0后，用乙酸乙醋萃取产物，浓缩后冷冻结 晶，过滤除清液得到维生素 K3氨酿；
[000引（2)将维生素 K3氨酿和DMAPP加入酶促反应体系中，反应体系包含NovQ芳香族异戊 締基转移酶，pH缓冲液，Mg2+，抗氧化剂;反应在密闭和化保护条件下进行，反应完成后，加入 化 3+，去除化保护，充分氧化后，使用乙酸乙醋萃取得到产物；
[0009] 所述的NovQ芳香族异戊締基转移酶为重组NovQ芳香族异戊締基转移酶或天然 NovQ芳香族异戊締基转移酶(来源自雪白色链霉菌Str邱tomycesniveus)，浓度为0.1~4g/ L。
[0010] 优选地，步骤(1)所述乙醇水溶液乙醇与水的体积比为1~3:1。
[00川优选地，步骤（1)加入化BH4浓度为600~150(Mmol/L，维生素 K3浓度为750~ 800mmol/L，NaBH4与维生素拉摩尔比为2:1~3:4，反应时间为6~1她。
[0012]优选地，步骤(1)所述浓缩倍数为4.5~5.5倍，冷冻结晶溫度为-20~-80°C。
[001引优选地，步骤（2)所述维生素 K3氨酿加入浓度为5~20mmol/L，DMAP巧日入浓度为5 ~10mmol/L0
[0014]优选地，pH缓冲液为化i S-HCl、憐酸盐缓冲液、巧樣酸盐缓冲液中的一种，pH范围 6.5~7.5，浓度 50~200mmol/l;所述 Mg2+由MgCl2 或MgS〇4提供，Mg2+浓度为 5~20mmol/l;抗 氧化剂为还原型谷脫甘肤、抗坏血酸、Q-生育酪中的一种，浓度为5~20mmol/L;
[0015] 优选地，步骤(2)反应条件为25~4(TC，反应时长24~4她。
[0016] 优选地，步骤(2)加入的化由FeCl3或化2(S〇4)3提供，Fe3+加入浓度为7~20mmol/ L。
[0017] 优选地，NovQ芳香族异戊締基转移酶其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO:7所示。
[0018] 本发明相比于现有技术具有如下的优点：
[0019] 本发明核屯、环节为生物酶催化工程技术，利用廉价的维生素 K3催化合成高值的维 生素 K2。本发明生产工艺简单，生产成本低廉，生产过程绿色环保。在维生素 K3氨酿和DMAPP 底物浓度均为IOmmo 1/L情况下，30°C反应24h，反应液中维生素 K2含量可达0.989g/L，转化 率为41.2%。本发明对维生素 K2工业生产具有重要意义。
【附图说明】
[0020] 图1为HPLC维生素 K3谱图
[0021] 图2 HPLC反应液谱图
[0022] 图3为novQ基因片段电泳图
[0023] 图4为novQ基因改造修饰电泳图
[0024] 图5为巧ic9酶切线性化电泳图 [00巧]图6为巧ic9-novQ重组质粒电泳图 [00%] 图7为NovQ蛋白western-blot检测图谱
【具体实施方式】
[0027] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0028] 实施例1
[0029] 将5.17g(30mmol)维生素 K3溶解于40mL乙醇水溶液（1:1，v/v)中，分次加入1.13g (30mmol)化肌4，在化保护下，控制溫度不超过50°C揽拌反应12h至体系呈淡绿色透明液体。 用lOOmmol/L稀盐酸中和至抑4.0后，用120mL乙酸乙醋分S次萃取产物，萃取液在氮气保护 下浓缩至约8mL，-8(TC冷冻结晶，过滤保留晶体，清液再浓缩至1.6mL，-8(TC冷冻结晶，过 滤，合并两次过滤的晶体得到4.73g维生素 K3氨酿，产率89.5 %。空气中氧化后，经HPLC检 巧Ij，其出峰特征如图1所示（出峰时间3.19min，检测器A248nm)。
[0030] 实施例2.
[0031] 将107.44g(780mmol)维生素 K3溶解于SOOmL乙醇水溶液（3:l，v/v)中，分次加入 45.40g(1200mmol)NaBH4，在化保护下，控制溫度不超过50°C，揽拌反应化至体系呈淡绿色透 明液体。用lOOmmol/L稀盐酸中和至抑4.0后，用2.化乙酸乙醋分S次萃取产物，萃取液在化 保护下浓缩至约0.17化，-20°C冷冻结晶，过滤保留晶体，清液再浓缩至约0.03化，-20°C冷 冻结晶，过滤，合并两次过滤的晶体得到96.07g维生素 K3氨酿，产率90.9 %。
[0032] 实施例3.
[0033] 将68.87g(400mmol)维生素 K3溶解于SOOmL乙醇水溶液（2:l，v/v)中，分次加入 11.35g(300mmol)NaBH4,在化保护下，控制溫度不超过50°C，揽拌反应1她至体系呈淡绿色透 明液体。用IOOmmo 1 /L稀盐酸中和至pH4.0后，用1 SOOmL乙酸乙醋分S次萃取产物，萃取液在 化保护下浓缩至约91mL，-5(TC冷冻结晶，过滤保留晶体，清液再浓缩至约16.5mL，-5(TC冷 冻结晶，过滤，合并两次过滤的晶体得到57.85g维生素 K3氨酿，产率82.1 %。
[0034] 实施例4
[00巧]将0.2g的重组NovQ芳香族异戊締基转移酶(来源自专利菌种CCTCC M2016105,地 址:湖北省武汉市武昌区塔挪山八一路299号，中国典型培养物保藏中屯、），溶解于IOOmL的 Tris-肥 1 缓冲液中（50mmol/L，pH 7.5)，加入0.20g( Immol)的MgCl2.細2〇,0.25g( Immol)的 DMAPP锭盐，充分溶解后，在化保护下加入0.18g( Immol)实施例1中获取的维生素 K3氨酿， 0.15g(0.5mmol)还原型谷脫甘肤。化保护下密闭反应2地，反应溫度40°C。酶促反应结束后， 撤去化保护，加入0.19g(0.7mmol )FeCl3.6出0,30°C下震荡反应地。使用200mL乙酸乙醋，分 S次萃取，合并有机相，得到维生素 K2与维生素 K3的混合物溶液。使用HPLC检测反应产物含 量，参数为C18柱，流动相为4:l(v/v)的甲醇/二氯甲烧，流速ImL/min，柱溫25°C，检测波长 248nmdHPLC检测出峰特征如图2所示（维生素 K3出峰时间3 . 19min，维生素 K2出峰时间 3.49min，检测器A248nm)。检测结果萃取液中维生素 Ks(MKi)浓度为0.495g/L，换算为反应液 中维生素 K2(MKi)浓度为0.989g/L。维生素拉氨酿和DMAPP转化率为41.2%，全过程维生素1(3 转化率为36.9%。
[0036] 实施例5
[0037] 将8 g的天然N O V Q芳香族异戊締基转移酶（来源自雪白色链霉菌 Streptomycesniveus)溶解于化的憐酸钢盐缓冲液中（IOOmmo 1/L，pH 7.0)，加入9.86g (40mmo 1)的MgS〇4.7出0，394g(16mmol)的DMAPP锭盐，充分溶解后，在化保护下加入7.04g (40mmol)实施例2中获取的维生素拉氨酿，3.52g(20mmol)抗坏血酸。N2保护下密闭反应4她， 反应溫度25°C，酶促反应结束后，撤去化保护，加入加入10.81g(40mmol )FeCl3.6出0，25°C下 震荡反应4h。使用化乙酸乙醋，分四次萃取，合并有机相，得到维生素 K2与维生素 K3的混合物 溶液。使用HPLC检测反应产物含量，参数为C18柱，流动相为4:1 (v/v)的甲醇/二氯甲烧，流 速1血/min，柱溫25°C，检测波长248nm。检测结果萃取液中维生素 K2(MKi)浓度为0.582g/L， 换算为反应液中维生素 Ks(MKi)含量为1.46g/L。维生素 K3氨酿转化率为30.3% ,DMAPP转化 率为60.6%，全过程维生素 K3转化率为27.5 %。
[003引实施例6
[0039] 将O . Ig的天然No V Q芳香族异戊締基转移酶（来源自雪白色链霉菌 Sheptomycesniveus)溶解于IL的巧樣酸钢盐缓冲液中（200mmol/L，pH 6.5)，加入1.02g (5mmol)的MgCl2.細2〇，1.23g(5mmol)的DMAPP锭盐，充分溶解后，在化保护下加入0.86g (5mmol)实施例3中获取的维生素 K3氨酿，8.61g(20mmol)生育酪。化保护下密闭反应36h，反 应溫度37°C，酶促反应结束后，撤去化保护，加入3.04g( 11.25mmol )FeCl3.6出0，37°C下震荡 反应4h。使用化乙酸乙醋，分四次萃取，合并有机相，得到维生素 K2与维生素 K3的混合物溶 液。使用HPLC检测反应产物含量，参数为C18柱，流动相为4:1 (v/v)的甲醇/二氯甲烧，流速 ImL/min，柱溫25°C，检测波长248nm。检测结果萃取液中维生素 K2(MKi)浓度为0.129g/L，换 算为反应液中维生素 Ks(MKi)含量为0.387g/L。维生素拉氨酿转化率为21.5% ,DMAPP转化率 为32.25%，全过程维生素 K3转化率为17.7%。
[0040] 实施例7
[0041] 将4g的重组NovQ芳香族异戊締基转移酶(来源自专利菌种CCTCC M2016105,地址： 湖北省武汉市武昌区塔挪山八一路299号，中国典型培养物保藏中屯、)溶解于化的憐酸钢盐 缓冲液中（1 OOmmo 1 /L，pH 7.0)，加入4.06g(20mmo 1)的MgCl2.細2〇，4.92g(20mmo 1)的DMAPP 锭盐，充分溶解后，在化保护下加入3.52g(20mmol)实施例2中获取的维生素 K3氨酿，3.52g (20mmol)抗坏血酸。化保护下密闭反应4她，反应溫度40°C，酶促反应结束后，撤去化保护，加 入8.00g(20mmol)Fe2(S化)3,40°C下震荡反应地。使用化乙酸乙醋，分四次萃取，合并有机 相，得到维生素 K2与维生素 K3的混合物溶液。使用HPLC检测反应产物含量，参数为C18柱，流 动相为4:1 (v/v)的甲醇/二氯甲烧，流速ImL/min，柱溫25°C，检测波长248皿。检测结果萃取 液中维生素 Ks(MKi)浓度为0.348g/L，换算为反应液中维生素 Ks(MKi)含量为0.870g/L。维生 素 K3氨酿转化率为36.2 %，DMAPP转化率为36.2 %，全过程维生素拉转化率为32.9 %。
[0042] 本发明的重组NovQ芳香族异戊締基转移酶是通过重组的毕赤酵母菌的生产的。重 组的毕赤酵母菌(GS115-ppic9-novQ)，其于2016年3月11日保藏于中国典型培养物保藏中 屯、(CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区塔挪山八一路299号，中国典型培养物保藏中屯、），保 藏编号为CCTCC M 2016105。
[0043] 由W下步骤构建得到：
[0044] 步骤一:构建重组毕赤酵母表达载体ppic9-novQ:
[0045] (1)异戊締基转移酶novQ基因获取
[0046] 使用高氏一号培养基，50mL/250mL装液量，28°C，180巧m摇瓶培养雪白链霉菌(购 买于中国药学微生物菌种保藏管理中屯、）7化，过滤得到菌丝体，使用CTAB法提取菌丝体总 DNA。从當DNA为模板，使用NovQ基因正向引物沈Q ID No.巧P反向引物沈Q ID No.2进行PCR 扩增，扩增参数为95°C变性5min，95°C变性3〇3,52°(：退火3〇3,72°(：延长9〇3,72°(：延长 10min，32循环。获取含novQ基因完整开放阅读框的片段。该片段电泳结果如图3所示，DNA测 序结果为SEQ ID No.3。
[0047] (2)novQ基因片段改造修饰
[004引 W含novQ基因完整开放阅读框的片段为模板，使用正向修饰引物SEQ ID No.4和 反向修饰引物SEQ ID No.5进行PCR，在novQ开放阅读框5'端接上ppic9质粒分泌信号肤a因 子C端基因同源片段，在3'端切除终止密码子，接上六聚组氨酸标签和ppic9质粒插入位点 下游同源序列片段。PCR参数为95°C变性5min，95°C变性303,48°(：退火303,72°(：延长903,3 循环，95°C变性30s，58°C退火30s，72°C延长90s，72°C延长10min，29循环。得到改造修饰后 的novQ基因片段。该片段电泳结果如图4所示。
[0049] (3)目的基因片段与载体连接
[0050] 使用限制性内切酶趾O I和Not I将ppic9质粒切割线性化后，琼脂糖凝胶电泳割 胶回收大片段，该片段电泳结果如图5所示。使用ez化Sion同源重组酶将改造修饰后的novQ 基因片段连入ppic9质粒，连接反应参数为25°C，40min。得到重组毕赤酵母表达载体ppic9- novQo
[0051 ] 步骤二：构建重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ:
[0化2] (1)重组载体卵ic9-novQ扩增
[0053]将毕赤酵母表达载体ppic9-novQ转入大肠杆菌D册a感受态细胞，使用含lOOmg/L 氨节青霉素的LB培养基筛选培养后，挑取阳性克隆。获得含ppic9-novQ的重组大肠杆菌D册 口。挑取重组大肠杆菌D册a单菌落接种到含50血LB培养基的250mLS角瓶中，200rpm，37°C震 荡培养1她，1000 Og离屯、IOmin，得到重组大肠杆菌D册a菌体。使用Axygen质粒中量抽提试剂 盒，中量抽提质粒，获取足量PPic9-novQ载体。该载体电泳结果如图6所示。
[0054] (2)ppic9-novQ转化毕赤酵母菌
[0055] ppic9-novQ载体经限制性内切酶Stu I线性化后，电转化转入毕赤酵母菌GS115感 受态细胞，转入参数为1.化V，25iiF，放电时间4.5ms。使用MGY组氨酸营养缺陷培养基平板筛 选，得到重组毕赤酵母菌GSl 15-ppic9-novQ。
[0化6] 重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ用于生产重组NovQ芳香族异戊締基转移酶，包 括W下步骤：
[0057] (1)挑取重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ单菌落，接种于盛有25血的MGY培养基 的250mLS角瓶中，28°C，250巧m震荡培养36h，得到活化的重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ菌液。
[0化引 （2)将活化的重组毕赤酵母菌65115可9；[。9-]1〇￥9菌液^体积比10%的接种量接入 盛有25mL BMGY培养基的250mLS角瓶中，28°C，250巧m震荡培养36h。将发酵液W4000g， 15min离屯、除去培养基，得到重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ菌体。
[0059] (3)将重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ菌体重悬于同离屯、前体积的BMMY培养基 中，25mL/250血装液量，25°C，250rpm震荡培养96h，培养期间每隔24小时加入0.25血甲醇诱 导剂。
[0060] (4)诱导培养结束后，4000g，15min离屯、发酵液，弃去沉淀。上清液通过Ni-NTA His Bind Resin儀柱挂柱吸附，10倍柱体积20mM咪挫溶液洗杂，8倍柱体积250mM咪挫溶液洗脱， 透析袋透析脱盐纯化，-70°C冷冻干燥，即可得到可溶性的重组芳香族异戊締基转移酶 NovQ。该蛋白western-blot检测结果如图7所示。
[0061] W上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用W限制本发明创造，凡在本 发明创造的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明创造 的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种NovQ芳香族异戊烯基转移酶催化合成维生素 K2的方法，其特征在于，包括以下步 骤： (1) 维生素 Κ3溶解于乙醇水溶液中，加入NaBH4,在犯保护下，控制温度不超过50°C，搅拌 反应至体系呈淡绿色透明液体，中和至PH4.0后，用乙酸乙酯萃取产物，浓缩后冷冻结晶，过 滤除清液得到维生素 K3氢醌； (2) 将维生素 Κ3氢醌和DMAPP加入酶促反应体系中，反应体系包含NovQ芳香族异戊烯基 转移酶，pH缓冲液，Mg 2+，抗氧化剂;反应在密闭和他保护条件下进行，反应完成后，加入Fe3+， 去除N2保护，充分氧化后，使用乙酸乙酯萃取得到产物； 所述的NovQ芳香族异戊烯基转移酶为重组NovQ芳香族异戊烯基转移酶或天然NovQ芳 香族异戊烯基转移酶，浓度为〇. 1~4g/L。2. 根据权利要求1所述的NovQ芳香族异戊烯基转移酶催化合成维生素 K2的方法，其特征 在于，步骤(1)所述乙醇水溶液乙醇与水的体积比为1~3:1。3. 根据权利要求1所述的NovQ芳香族异戊烯基转移酶催化合成维生素 Κ2的方法，其特征 在于，步骤（1)加入NaBH4浓度为600~1500mmol/L，维生素 Κ3浓度为750~800mmol/L，NaBH4 与维生素 K3摩尔比为2:1~3:4,反应时间为6~18h。4. 根据权利要求1所述的NovQ芳香族异戊烯基转移酶催化合成维生素 K2的方法，其特征 在于，步骤(1)所述浓缩倍数为4.5~5.5倍，冷冻结晶温度为-20~-80°C。5. 根据权利要求1所述的NovQ芳香族异戊烯基转移酶催化合成维生素 K2的方法，其特征 在于，步骤(2)所述维生素 Κ3氢醌加入浓度为5~20mmol/L，DMAPP加入浓度为5~lOmmol/ L〇6. 根据权利要求1所述的NovQ芳香族异戊烯基转移酶催化合成维生素 K2的方法，其特征 在于，pH缓冲液为Tri s-HCl、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液中的一种，pH范围6.5~7.5，浓 度50~200mmol/L;所述Mg2+由MgCh或MgSCU提供，Mg 2+浓度为5~20mmol/L;抗氧化剂为还原 型谷胱甘肽、抗坏血酸、α-生育酚中的一种，浓度为5~20mmol/L。7. 根据权利要求1所述的NovQ芳香族异戊烯基转移酶催化合成维生素 K2的方法，其特征 在于，步骤(2)反应条件为25~40 °C，反应时长24~48h。8. 根据权利要求1所述的NovQ芳香族异戊烯基转移酶催化合成维生素 K2的方法，其特征 在于，步骤⑵加入的Fe3+由FeCl3或Fe 2(S〇4)3提供，Fe3+加入浓度为7~20mmol/L。9. 根据权利要求6所述的NovQ芳香族异戊烯基转移酶催化合成维生素 K2的方法，其特征 在于，NovQ芳香族异戊烯基转移酶其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所 不。
【文档编号】C12P7/66GK105861582SQ201610392463
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月31日
【发明人】郑之明, 李哲敏, 赵根海, 刘会, 王鹏, 王丽, 吴荷芳, 尉鸿飞, 孙孝娟, 王晗, 孙小雯
【申请人】中国科学院合肥物质科学研究院