专利名称：一种基因ns1缺陷型呼吸道合胞病毒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及呼吸道合胞病毒(RSV)，具体地说是一种基因NSl缺陷型呼吸道合 胞病毒(ANSI RSV)及其应用。
背景技术：
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，据资料统计，发病率占全身各种恶性肿 瘤的7-10%。它的发病常与遗传有关，以及40-60岁之间、绝经期前后的妇女发病率 较高。通常发生在乳房腺上皮组织的恶性肿瘤。是一种严重影响妇女身心健康甚至危 及生命的最常见的恶性肿瘤之一。乳腺癌常见于妇女，据估计全世界每年新增病例超过 一百万，仅2009年，美国有192370人新诊断为乳腺癌，大约有40170人因此死亡。对 于诊断为无淋巴结转移的乳腺癌的病人，大约24%-30%复发，而对于已有淋巴结转移 的乳腺癌病人，其复发率可高达50-60%。根据病灶是否局限于局部还是有转移的不同， 其中5年存活率分别为26%和80%。目前，尚无较理想的药物及方法治疗乳腺癌。呼吸道合胞病毒属于副黏液病毒科(Paramyxoviridae)，肺病毒亚科 (Pneumovirinae)中的肺炎病毒(Pneumovirus)，病毒的R N A全长大约为15kb，3'端为 前导序列，5'端为尾端结构，病毒全序列大约有10个病毒基因序列。目前，尚无运用 基因工程改造的呼吸道合胞病毒来治疗乳腺癌报导。
发明内容
所要解决的技术问题本发明目的是提供一种通过基因工程改造的呼吸道合胞 病毒用于治疗乳腺癌。技术方案一种基因NSl缺陷型呼吸道合胞病毒，其特征是所述基因NSl缺陷 型呼吸道合胞病毒是用Vero细胞合成、Vero细胞经用携带有NSl-缺陷病毒cDNA、病毒 N，M2-1，P和L基因的质粒共转染而形成。所述基因NSl缺陷型呼吸道合胞病毒，是用反向基因策略删除呼吸道合胞病毒 中的基因NSl。所述基因NSl缺陷型呼吸道合胞病毒应用，是应用于治疗乳腺癌，杀伤乳腺癌 细胞。所述经过基因工程改造的呼吸道合胞病毒可为其他病毒，所说的其他病毒带有 类似RSVNSl基因，该基因被删除，从而具有杀伤癌症的效果。本发明有如下显著效果1、本发明基于杀瘤病毒疗法.该发明中，呼吸道合胞病毒的NSl基因被删除， 改良后的该病毒只杀死癌症细胞，而对正常细胞没有任何影响。2、呼吸道合胞病毒全序列大约有10个病毒基因序列，NSl基因序列为肺炎病毒 独有，该基因紧接于3'端启动子之后，相对其它病毒基因其mRNA含量最多。因为N S 1蛋白不存在呼吸道合胞病毒的颗粒中而只见于受感染细胞故被称为非结构蛋白。研究证实，NSl能阻断一型干扰素信号通路，表明NS 1能直接抑制宿主的免疫放应。通过 去掉NSl基因，NSl缺陷型呼吸道合胞病毒感染细胞后不再抑制干扰素(IFN)生成，从 而降低该病毒对正常细胞的感染性，因而NSl缺陷型呼吸道合胞病毒可变为非常安全。 但肿瘤细胞中IFN系统不完善，而且瘤细胞对IFN相对不太敏感，因此该病毒可在瘤细胞 中大量增殖而杀死肿瘤细胞。本发明创造性地删除NSl基因，生成的N S 1基因缺陷呼吸道合胞病毒(ANSI RSV)具有选择性杀伤癌症细胞，而不影响正常细胞的特性。本发明特点之一为反向基 因策略(利用逆向分子生物学方法)去除NSl基因(病毒正链RNA上122到630碱基序 列).ANSI RSV营救则通过用携带有NSl-缺陷病毒cDNA，病毒N，M2_l，P和L基 因的质粒共转染Vero细胞呼吸道合胞病毒NSl蛋白为一型I F N拮抗剂，而ANS1RSV 能生成更多的IFN，从而阻止病毒在正常细胞中的复制，从而选择性地抗肿瘤。3、本发明也可以通过其他的方式，去除NSl基因，从而实现类似的功能.在临 床治疗上，可以通过静脉注射基因工程的NSl基因缺陷呼吸道合胞病毒，或直接肿瘤局 部运用该病毒，达到治疗的效果.4、本发明特别是对治疗乳腺癌具有很好的效果，通过基因工程改良病毒，选择 性地杀死癌症细胞，而保护正常组织不受伤害，从而达到治疗乳腺癌的目的。杀瘤病毒 在肿瘤细胞中不断的复制，从而致使癌细胞裂解，或者诱导癌症细胞凋亡。本发明改良 过的NSl基因缺陷呼吸道合胞病毒，具有这样的功能。
图1是呼吸道合胞病毒的基因序列。图2A是免疫印迹确定病毒NSl蛋白。图2B是病毒感染24小时后，细胞株MDA-MB_231and CCD-1059SK的显微镜
下形状。图2C是病毒感染24小时后，病毒空斑实验检测病毒滴度。图2D是抗瘤体内实验，裸鼠两侧后褪皮下注射MDA-MB-231癌细胞，待形成 肿瘤块后局部注射杀瘤病毒及相应对照，测量并记录肿瘤的大小每组数据代表6个测量 及标准误。图2E是病毒体内实验统计，对照鼠被注射了等量的混悬病毒所用试剂或者 PBS,实验后测量了肿瘤的大小.每组数据代表6个测量及标准误。图2F是不同组织来源勻浆液中，病毒滴度的测试。图2G是RT-PCR检测同一个体，不同组织中病毒F基因的表达，以确定病毒治 疗的安全性。图3A是MDA-MB-231和CCD-1059SK细胞株病毒感染后20小时，48小时检
测细胞凋亡的变化。图3B是病毒感染MDA-MB-231细胞，或添加IFN-β中和抗体后20小时或48
小时后，其细胞凋亡的变化。图3C是Vero细胞感染病毒后其细胞凋亡的变化。图4是细胞病变测试检测Δ NSl RSV选择性地杀伤不同株人乳腺癌细胞。
具体实施例方式本发明呼吸道合胞病毒(RSV)，采用逆向分子生物学方法去除NSl基因(病毒 正链RNA上122到630碱基序列)，被去除NSl基因的呼吸道合胞病毒称为基因NSl缺 陷型呼吸道合胞病毒(ANSI RSV)。 ANSI RSV营救则通过用携带有NSl-缺陷病毒 cDNA，病毒N，M2-1，P和L基因的质粒共转染Vero细胞。NSl基因也可以通过其 他的方式，而达到同样目的。为确认生成的病毒ANSI RSV是否缺乏NSl基因，本发明人用野生wt RSV和 ANSI RSV分别感染Vero细胞(一种IFN-β基因缺陷细胞)，NSl蛋白用免疫印迹检 测，图2Α显示，NSl蛋白只现于野生RSV，而未见于ANSI RSV.该结果表明，ANSl RSV缺乏NSl基因。为验证ANSI RSV能否选择性地杀伤人乳腺癌细胞，MDA_MB_231乳腺癌细 胞系和正常细胞系CCD_1059SK(人正常乳房纤维细胞)按ATCC (American Type Culture
Collection)指导下培养，同时分别感染野生(wt)和基因工程ΔNSlRSV病毒，并对其形 态学改变，和病毒复制进行检测。图2Β显示ANSI RSV选择性的诱导MDA_MB_231 乳腺癌细胞病变，感染24小时后，癌症细胞中ANSI RSV的滴度明显高于正常细胞 CCD-1059SK(图2C)，说明癌症细胞MDA_MB_231有利于病毒的繁殖。为进一步验 证该结果，本发明人用ANSI RSV感染了乳腺癌细胞株T-47DandMCF_7，表格1显示 ANSI RSV选择性的杀伤乳腺癌细胞。本发明进一步测试了该病毒能否在动物体上杀伤癌细胞。癌细胞株 (MDA-MB-231)皮下注射到4_6周大的BALB/c裸鼠左右大腿外侧皮下，待其长成肿瘤 块.ANSI RSVaXlO"1 pfu/ml)分三次局部注射入肿瘤组织，同时测量癌症肿块治疗前后 的大小.图2C、图2D显示ANSI RSV可以致使癌症肿块萎缩，而对照组则没有观察到 该现象。为检验该病毒的安全性，感染鼠同一个体不同组织器官组织均浆，进行病毒空 斑实验，及RT-PCR检验，图2E、图2F显示病毒局限于肿瘤部位。ANSI RSV同时可以诱导肿瘤细胞凋亡，但对正常人乳房纤维细胞 CCD-1059SK没有作用。在实验中，癌症细胞株MDA-MB-231和正常细胞感染了 ANSI RSV,细胞凋亡用磷脂结合蛋白(araiexinV)结合技术检测。图3A结果显示，相对于正 常细胞，ANSI RSV选择性的诱导肿瘤细胞凋亡。以上的研究表明，RSV NSl基因诱导A549细胞产生IFN-β [9]。为进一步研 究IFN-β在病毒诱导凋亡中的作用，我们用特异性中和抗体中和IFN-β活性，结果发现 ANSI RSV同样诱导癌症细胞凋亡(图3B)。为进一步验证该结果，该实验在Vero细胞 (IFN-β基因缺陷细胞)上重复，细胞凋亡用磷脂结合蛋白(araiexinV)结合技术检测， 结果显示图3C。 ANSI RSV诱导了 Vero细胞的凋亡，该结果说明IFN可能没有参与病 毒诱导的凋亡。所述用反向基因策略(逆向分子生物学方法)删除呼吸道合胞病毒中的 基因NS1。具体是以全长病毒正链cDNA为模板，设计一对带有核酸内切酶的PCR引 物分别对位于NSl基因的起始前端和NS2基因的起始端，用PCR方法逆向扩增出一段已 不含有NSl基因的(即从核酸序列上去除了硷基122到630的一小段NSl基因)DNA片 段，然后克隆到质粒中。该质粒可用于后续的质粒共转染制备NSl缺陷型RSV病毒。
权利要求
1.一种基因NSl缺陷型呼吸道合胞病毒，其特征是所述基因NSl缺陷型呼吸道合胞 病毒是用Vero细胞合成、Vero细胞经用携带有NSl-缺陷病毒cDNA、病毒N，M2-1， P和L基因的质粒共转染而形成。
2.根据权利要求1所述的一种基因NSl缺陷型呼吸道合胞病毒，其特征是用反向基 因策略删除呼吸道合胞病毒中的基因NSl。
3.—种基因NSl缺陷型呼吸道合胞病毒应用，其特征是应用于治疗乳腺癌，杀伤乳 腺癌细胞。
全文摘要
本发明涉及一种基因NS1缺陷型呼吸道合胞病毒及其应用，其是由基因NS1缺陷型呼吸道合胞病毒是用Vero细胞合成、Vero细胞经用携带有NS1-缺陷病毒cDNA、病毒N，M2-1，P和L基因的质粒共转染而形成。所述基因NS1缺陷型呼吸道合胞病毒，是用反向基因策略删除呼吸道合胞病毒中的基因NS1。本发明应用于治疗乳腺癌，选择性地杀伤乳腺癌细胞。
文档编号A61P15/14GK102021148SQ20101024975
公开日2011年4月20日 申请日期2010年7月27日 优先权日2010年7月27日
发明者张卫东, 蒋礼先, 高利卫 申请人:张卫东, 蒋礼先, 高利卫