增强血管通路的方法和组合物的制作方法

专利名称：增强血管通路的方法和组合物的制作方法
增强血管通路的方法和组合物相关申请资料2005年12月6日提交的本非临时专利申请按照美国法典35章节(35U. S. C. Section) 119(e)要求 2004 年 12 月 8 日提交的临时专利申请 U. S. S. N. 60/634，155， 2005年3月21日提交的临时专利申请U. S. S. N. 60/663，859，2005年5月19日提交的 临时专利申请U. S. S. N. 60/682，054的权益；并且按照美国法典35章节120，363和/或 365要求2005年12月6日提交的共同待决的国际专利申请PCT/US2005/044090 (也称 作代理人案号ELV-008PC)，以及2005年12月6日提交的共同待决的国际专利申请PCT/ US2005/043844(也称作代理人案号ELV-009PC)的优先权；上述每一个专利申请的全部内 容均引入本文作为参考。
背景技术：
血管通路失败是向患者提供血液透析护理以治疗晚期肾病(ESRD)时的主要并发 症。自1980年以来，美国现有ESRD病例的比例每年都在增加。在2001年，患病率达到了 每一百万人中有大约1400名患者，比前一年增长2. 4%。以年龄、人种、种族和糖尿病状态 的人口统计学变化为基础，预计美国患ESRD的人口到2030年将增加至130万。目前，大约 65%的ESRD患者采用血液透析进行治疗(约264，710名患者)。在1997年至2001年间， 血液透析人口每年增长4. 5%。通过医疗保险数据发现，到2001年为止，ESRD的总花费达 到了 155. 5亿美元，占整个医疗保险预算2420亿美元的6. 4% (所有来源的总花费达到了 228亿美元)。实际上，在美国，每年与血管通路相关病症的年花费超过了 10亿美元。血管通路失败是血液透析人群最重要的单一发病因素。最近的一份报告在分析 美国肾病数据系统(USRDS)的数据时发现，1年的总体初次无辅助通路通畅率(primary unassisted access patency rate)仅为53%。1年的初次无辅助通路通畅率对于血管通 路结构，如动静脉移植物包括ePTFE 假体桥为49%，对动静脉(AV)瘘为62%。1、3、5年 的累计初次通路通畅率分别为下臂瘘54%、46%和36%，AV移植物54%、28%和0%。目 前在美国，移植物包括ePTFE假体桥的使用占所有血液透析通路程序的70%，国家肾病基 金会(National Kidney Foundation)目前推荐AV瘘为血管通路的首选方法。预计将来在 美国，新的AV瘘的比例将会增加。自体动静脉瘘在历史上曾被认为是血液透析患者血管通路的最佳选择。当AV瘘 在手术制造后成功地成熟，其可以在并发症风险低和修正发生率低的同时运行数年。然而， 已报告的动静脉瘘未成熟率变化范围很大，但保持在约20-50%。未成熟通常定义为不能允 许为透析反复进行瘘管插管，或者不能在手术制造后12周内获得充足的透析血流。AV瘘未 成熟的发生部分地依赖于用来形成AV瘘的脉管的质量和大小。术前对脉管特性的评价已 经显示，鉴别适于动静脉造瘘的血管具有有益作用。血管通路结构失败可归结于各种独特的急性和慢性现象的累积效应，尤其是在所 谓的吻合“趾”及其下游周围。例如，动静脉移植物可能在静脉吻合端的吻合口逐步形成与 移植相关的狭窄和与移植相关的闭塞。在一篇已发表的报道中，对取自移植相关吻合口狭 窄患者的片段的组织学检查揭示，内膜增生由平滑肌细胞和细胞外基质组成。移植物的血
4栓形成同样可促进ePTFE透析移植物的血管通路功能失败。此外，分离动脉和静脉，然后将 静脉段暴露于动脉血流和血压下，通常可以导致不可避免的局部缺血和再灌注损伤。手术 操作如缝合也可以导致动脉和静脉中层的内皮细胞及平滑肌细胞的直接损伤。制造自体或 移植吻合口时对动脉和静脉内皮的伤害可以影响通畅率和闭塞率。除了形成血管通路结构 时与切开和缝合静脉及动脉相关的物理损伤之外，增加的壁应力和剪切力也可以导致对内 皮的物理和/或生化损伤。已有建议称，动脉压力可能改变内皮生长调节化合物的正常产 生，并在静脉中层中产生形态学和生化改变。目前对血管通路失败的治疗方法是手术修正，或者是用或不用支架的血管成形 术。手术治疗对通常多病症的患者(multimorbid patient)存在风险，血管成形术和支架 术的长期结果通常因其故障率而令人失望。因此，为血液透析的目的和由此的外周循环改 善血管通路的目标是，维持原始移植部位的解剖学完整性，使血流速率支持透析治疗，或者 在外周旁路部位具有有充足的血流。其他促成新造血管通路结构成功成熟，或者使已有血管通路结构延长成熟的因素 仍难以捉摸。此外，在血管通路失败预防领域已进行了相对较少量的随机临床试验。评价 血管通路失败起因的研究得到了不同的结论。事实上，目前，不管这个问题如何巨大，临床 医生都没有可用的延长功能性透析通路漏管存活的有效手术性、治疗性或药理学方法。明 显地，该重大的患者护理区域存在着向前发展的需求。发明概述本发明利用了这样的发现包含细胞和生物可相容性基质的可植入材料，当局部 应用于血管通路结构时，可以促进该结构的形成和/或增强该结构的成熟，并延长该结构 的成熟、功能状态。根据本发明，可植入性材料位于血管的外表面，该血管位于血管通路结 构上或与血管通路结构相邻或在血管通路结构附近。本发明可以有效促进新造血管通路结 构整合和/或增强其成熟；促进并维持已存在的功能性结构的功能寿命；以及辅助抢救已 失败或失败中的结构。一方面，本发明是处理患者血管通路结构的方法，包括将包含细胞和生物相容性 基质的可植入性材料定位于血管通路结构或其相邻位置或其附近的步骤，其中的可植入性 材料可以有效提升所述结构的功能性。根据下文所述某些实施方案，血管通路结构是用于 透析的。根据不同的实施方案，血管通路结构是动静脉自体瘘、动静脉移植物、外周移植 物、静脉导管或留置端口。在一个实施方案中，动静脉移植物包括假体桥。在其它实施方案 中，导管是留置的双腔导管，并且处理留置双腔导管提高了足以允许血液透析的临床稳定 性。在一个实施方案中，处理血管通路结构促进了正常或接近正常的血液通过并流向 该结构的下游。例如，正常或接近正常的血流是在血液透析中速率足以预防再循环的血流。 根据其它实施方案，处理血管通路结构促进了正常或接近正常的管径，并减少了血液透析 中的血流再循环。在动静脉自体瘘的情况下，处理动静脉自体瘘增强了足以允许血液透析的临床成 熟，减少了动静脉自体瘘成熟的延迟，并促进了重复插管。在动静脉移植物的情况下，处理 动静脉移植物提高了足以恢复正常或接近正常的循环的临床稳定性。在多种实施方案中，
5可植入性材料减少了具通路结构患者的修正的发生率。在一个实施方案中，增强成熟的特征在于为透析重复进行瘘管插管的能力。根 据另一个实施方案，增强成熟的特征在于在透析中获得充足血流的能力。优选充足血流 包括约350ml/min的速率。根据多个实施方案，对动静脉瘘应用生物相容性材料在治疗 剂给药、物理扩张或支架术之后或同时进行。动静脉瘘是桡头(radiocephalic)瘘，头臂 (brachiocephalic)瘘，臂贵要(brachiobasilic)瘘。在一个优选实施方案中，本发明是预防人动静脉瘘成熟失败的方法，包括将包含 生物相容基质和血管内皮细胞的可植入性材料定位于瘘管、瘘管相邻位置或瘘管附近的步 骤，从而预防瘘管成熟失败。在一个实施方案中，成熟失败的特征在于不能为透析重复进行 瘘管插管，或者不能在透析中获得充足的血流，其中充足的血流包括约350ml/min的速率。 在其它实施方案中，成熟失败的特征在于动静脉瘘在造瘘后至少2个月、至少3个月或至少 4个月都不能插管。在另一实施方案中，本发明是维持动静脉移植物的血流速率足以允许透析的方 法，包括提供包含细胞和生物相容基质的可植入性材料的步骤，其中所述可植入性材料以 有效维持移植物的血流速率足以允许透析的量，布置在所述动静脉移植物的外表面，位于 所述动静脉移植物的静脉流出区域的假体桥、假体桥相邻位置或假体桥附近处。在一个实 施方案中，所述动静脉移植物的静脉流出区域的血流速率基本上与所述流出区域上游的血 流速率相似。在另一实施方案中，本发明是维持外周旁路移植物的正常血流足以维持外周循环 的方法，包括提供包含细胞和生物相容基质的可植入性材料的步骤，其中所述可植入性材 料以有效维持旁路移植物的血流速率足以维持外周循环的量布置在所述旁路移植物的外 表面上，位于假体桥上、假体桥相邻位置或假体桥附近处。在一个实施方案中，流入血液流 速与流出血液流速大体相似。在另一个实施方案中，本发明是维持动静脉移植物血压足以允许透析的方法，包 括提供包含细胞和生物相容基质的可植入性材料的步骤，其中所述可植入性材料以有效维 持血压足以允许透析的量，布置在所述动静脉移植物的外表面，位于所述动静脉移植物的 静脉流出区域的假体桥、假体桥相邻位置或假体桥附近处。在一个实施方案中，所述动静脉 移植物的静脉流出区域的血压基本上与所述流出区域上游的血压相似。假体桥选自由下列 假体桥隐静脉，牛异种移植物，脐静脉，涤纶，PTFE，ePTFE,聚氨酯，牛肠系膜静脉和冷冻股 静脉同种异体移植物。根据优选实施方案，假体桥是ePTFE。在另一个实施方案中，本发明是促进动静脉移植物或外周旁路移植物假体桥的组 织整合的方法，包括提供包含细胞和生物相容基质的可植入性材料的步骤，其中所述可植 入性材料以有效促进所述桥体的组织整合的量布置在所述动静脉移植物或所述外周旁路 移植物的外表面上，位于假体桥、假体桥相邻位置或假体桥附近处。在某些实施方案中，可 植入性材料促进平滑肌细胞在所述假体桥内腔表面内或内腔表面附近的增殖或迁移，或者 促进内皮细胞在所述假体桥内腔表面内或内腔表面附近的增殖或迁移。在某些其它实施方 案中，可植入性材料促进移植物中、移植物相邻位置或移植物附近的平滑肌细胞和/或内 皮细胞增殖。在另一个实施方案中，本发明是预防或减少动静脉瘘或动静脉移植物裂开的发生的方法，包括提供包含细胞和生物相容基质的可植入性材料的步骤，其中所述可植入性材 料以有效预防或减少裂开的发生的量，布置在所述瘘管或动静脉移植物的外表面，位于所 述动静脉移植物的静脉流出区域的假体桥上、假体桥相邻位置或假体桥附近。根据其它实施方案，提供的步骤在自体动静脉瘘失败之后，或者自体或隐静脉外 周旁路失败之后作为介入疗法完成。另一方面，本发明是适于处理血管通路结构的包含细胞和生物相容基质的可植入 性材料。细胞是内皮细胞或有具有内皮样表型的细胞。生物相容基质是柔性的平面形式或 易流动性组合物。在尤其优选的实施方案中，细胞是血管内皮细胞。柔性的平面形式为在 血管通路结构、血管通路结构相邻位置或血管通路结构附近植入而设计。在某些实施方案 中，该形式具有狭槽。根据易流动性组合物的一个实施方案，易流动性组合物是形状保持不 变的组合物。在其它实施方案中，本发明是适用于通过预防动静脉瘘成熟失败来增强动静脉瘘 成熟的方法的、包含细胞和生物相容基质的可植入性材料。细胞是内皮细胞或具有内皮样 表型的细胞，并且生物相容性基质是柔性的平面形式或易流动性组合物。在一个实施方案 中，柔性的平面形式为在自体瘘、自体瘘相邻位置或自体瘘附近植入而设计。在某些实施方 案中，该形式被设计为具有狭槽或一系列狭槽。关于易流动性组合物，其为形状保持不变的 组合物。在另一个实施方案中，本发明是包含细胞和生物相容基质的可植入性材料，其中 的可植入性材料布置在假体桥上的、假体桥相邻位置或假体桥附近的血管外表面。假体桥 位于或接近动静脉移植物的静脉流出区域，或者位于或接近外周旁路移植物的流出区域。附图简述在附图中，类似的图标通常涉及所有不同试图的相同部分。同样地，附图中的刻度 或比例不是必然的，其重点通常放在图解本发明的原则上。

图1是根据本发明的例证性实施方案，向管状解剖学结构外表面施用的柔性平面 形式的可植入性材料的示意透视图。图2A是根据本发明的例证性实施方案，向管状解剖学结构外表面施用的赋形的、 柔性平面形式的可植入性材料的示意透视图。图2B，2C，2D，2E，2F和2G是根据本发明的各种例证性实施方案，包括狭槽的赋形 的、柔性平面形式的可植入性材料的示意透视图。图3A和3B是根据本发明的例示性实施方案的代表性细胞生长曲线。图4A，4B和4C根据本发明的例示性实施方案，从顶部透视图说明将多个柔性平面 形式的可植入性材料向血管吻合口外表面施用的一系列步骤。图5是根据本发明的例示性实施方案，向血管吻合口外表面施用赋形的可植入性 材料的顶部透视图。图6是根据本发明的例示性实施方案，向管状解剖学结构施用的柔性平面形式的 可植入性材料的顶部透视图。发明详述正如本文所解释的那样，本发明基于这样的发现基于细胞的治疗可以用于处理 血管通路结构。下面列出的教导为制造和使用本发明的材料和方法提供了充分的指导，并进一步为确定适于测试、测量和监控本发明的材料和方法的性能的标准和对象提供了充分 的指导。因此，用于临床上控制血管通路并发症和/或失败的基于细胞的治疗方法已经开 发出来。本发明的例示性实施方案包括适用于本文所述治疗范例的生物相容性基质和细 胞。具体地，在一个优选实施方案中，可植入性材料包括生物相容性基质和内皮细胞或内皮 样细胞。在一个实施方案中，可植入性材料为柔性的平面形式，并且包括内皮细胞或内皮样 细胞，优选人主动脉内皮细胞以及生物相容性基质Gelfoam 明胶海绵(Pfizer，New York, NY,以下称“Gelfoam基质”)。根据另一个优选实施方案，可植入性材料为易流动的形式，并 且包括内皮细胞或内皮样细胞，优选人主动脉内皮细胞以及生物相容性基质Gelfoam 明 胶粒子或粉末(Pfizer，New York，NY，以下称“Gelfoam粒子”)。本发明的可植入性材料包括移植于生物相容性基质之上、之中和/或之内的细 胞。移植的意思是指经细胞对细胞和/或细胞对基质的相互作用牢固地附着，以使细胞能 承受住本文公开的制备性操作的苛刻条件。如本文别处解释的那样，可植入性材料的操作 实施方案包括具有优选表型的接近融合细胞群、融合细胞群或融合后细胞群。可以理解的 是，在制备性操作期间，可植入性材料的实施方案很可能脱落细胞和/或某些细胞不象其 它细胞那样牢固地附着。所有必需的条件是，可植入性材料包括的细胞应符合本文所述功 能或表型的标准。本发明的可植入性材料根据组织工程学原理开发，并代表了寻求上述临床需求的 新方法。本发明的可植入性材料的独特之处在于，移植于生物相容性基质之上、之中和/或 之内的活细胞，可以在生理反馈控制下向血管通道结构及相关血管系统提供处于生理比例 的基于多种细胞的产物。如本文别处所述的那样，适用于可植入性材料的细胞是内皮细胞 或内皮样细胞。由这些细胞进行的多种化合物的局部递送及生理动力学给药为维持功能性 血管通路结构和减少血管通路并发症和/或失败提供了更有效的调节方法。重要的是，例 如本发明的可植入性材料的内皮细胞，由于其被放置在血管的非腔表面例如外膜，或与血 管外表面接触，而避免了血管腔内的侵蚀性血流的破坏。当本发明的可植入性材料包裹、沉 积或以其它方式与这样一个外部靶部位，即吻合口和/或其周围接触时，其起到重建内环 境稳态的作用。那就是，本发明的可植入性材料可以提供模拟支持性生理的环境，并有助于 血管通路结构形成、成熟、整合和/或稳定。对于本发明的目的，接触的意思是直接或间接地与本文别处所定义的腔外或非腔 表面相互作用。在某些优选实施方案的情况下，实际物理接触并非效力所必需。在其它实 施方案中，优选实际物理接触。所有实施本发明所必需的条件是，可植入性材料以有效治疗 受损或患病部位的量在受损或患病部位、其相邻位置或其附近进行腔外或非腔沉积。在某 些疾病或损伤的情况下，患病或受损部位可以在临床上表现于内腔表面。在其它疾病或损 伤的情况下，患病或受损部位可以在临床上表现于腔外或非腔表面。在一些疾病或损伤中， 患病或受损部位可以在临床上表现于内腔表面及腔外或非腔表面。本发明可以有效治疗任 何一种前述临床表现。例如，内皮细胞可以释放多种药剂，这些药剂联合起来可以抑制或缓解制造血管 通路结构后的与急性并发症相关的不良生理事件。如本文例示的那样，重演正常生理的组 合物和使用方法以及给药可以增强血管通路结构的形成、成熟、整合和/或稳定，并促进该
8血管通路结构的长期通畅率。通常地，治疗包括将本发明的可植入性材料放置在血管通路 结构部位、其相邻位置、或其附近，例如该操作所涉及的动脉和静脉腔外面的血管周隙。当 包裹、环绕、沉积或以其它方式与受损、受创或患病血管接触时，可植入性材料的细胞可以 向血管系统，例如血管内的底层平滑肌细胞，提供生长调节性化合物。预计当位于腔外部位 时，可植入性材料的细胞可以提供能穿透血管组织并到达血管腔的多种调节性化合物的持 续供应，而细胞却避免了血管内血流的不良机械作用。如本文所述的那样，优选腔外部位是 血管的外表面。用本发明的优选实施方案治疗可以促进正常或接近正常的康复和正常生理。相比 之下，在不用本发明的优选实施方案治疗的情况下，正常生理康复受损，例如，在制造血管 通路结构后，自体内皮细胞和平滑肌细胞可以以极快或失控的速度异常生长，从而导致不 良临床结果，包括血管通路结构失败。因此，如本文预计的那样，采用本发明的可植入性材 料的治疗能改善吻合部位自体组织的恢复，以维持血管通路结构的畅通。为了本发明的目的，血管通路结构可以形成各种构型。血管通路结构可包括自然 产生或手术造成的动静脉瘘、动静脉移植物、外周旁路移植物、留置静脉导管、留置血管端 口或其它制造出来用于改善患者血管通路的血管吻合结构。另外，多种构型形成的血管通 路结构的不同实施方案包括侧侧吻合、端侧吻合，端端吻合和侧端吻合。血管通路结构也可 以放置在多种解剖学位置中。本发明的可植入性材料可以以多种构型放置在待治疗血管通路结构中。根据某些 实施方案，本发明的可植入性材料既可以置于吻合口远端的吻合结合点，也可以置于吻合 口远端的近静脉段。在其它实施方案中，本发明的可植入性材料可以置于动脉段上、近静脉 段上、远静脉段上和/或桥接血管通路结构。在另一个实施方案中，可植入性材料也可以置 于吻合结合点的移植材料或部分移植材料上。血管可以全部或部分地接触，例如，本发明的 可植入性材料可以沿圆周方向或以弧形构造应用于脉管。脉管和/或血管通路结构仅需要 与足以改善血管通路结构的形成、成熟、整合和/或稳定的量的可植入性材料接触。动静脉瘘根据某些实施方案，为血管通路制作的动静脉瘘(“AV瘘”)可以用本 发明的可植入性材料处理。AV瘘可以置于患者的多种部位，包括例如置于颈部、腕部、上臂 和下臂。临床用AV瘘的构造包括桡头瘘(在桡动脉和头静脉之间)，Brescia-Cimino瘘 (腕内的桡动脉和头静脉侧侧吻合)，头臂瘘(在臂动脉和头静脉之间)，臂肘瘘(在臂动脉 和肘前静脉之间)，臂贵要瘘(转位的贵要静脉)，尺头瘘(在尺动脉和头静脉之间)和隐 静脉环瘘(隐静脉和股动脉右侧)。AV瘘手术的并发症通常发生在三个阶段。这三个阶段是常常以血栓形成为特征的 急性阶段，临床信号为瘘成熟失败的中间阶段，以及最后，由于例如进行性静脉狭窄引起的 已建立的功能性瘘的更慢性衰竭阶段。AV瘘成熟的特征包括，例如为透析反复进行瘘管插管的能力。AV瘘成熟的另一个 特征是获得足够用于血液透析的透析血流的能力。合适的血流具有至少适于支持用透析机 透析的流速，这样不会发生回流。为了本发明的目的，充足的透析血流是在造瘘后不超过24 周，优选超过20周，更优选16周，最优选12周的时间点时，至少约350mL/min的血流。目 前已了解的AV瘘成熟失败的机制包括，例如瘘管早期血栓形成，吻合口或近吻合口狭窄， 副脉的存在(包括侧支或静脉侧支)，静脉大小不适当(包括静脉内径不足)，及后期由进
9行性狭窄引起的瘘失败。副脉通过转移血流和不允许与瘘相连的静脉具有足以允许插管的 大小而阻止瘘的发展。目前人们普遍认为，副脉可能相应瘘内出现的狭窄而发展。AV瘘成 熟的机制是多模式的，并通常要求评价多种临床标记。仅仅狭窄缺失通常不足以表明AV瘘 成熟。此外，认为足以满足透析目的的AV瘘既要求瘘管成熟，即那些发生在瘘管静脉段 的使瘘管可以反复插管的变化；也要求足以支持透析的血流。AV瘘即使在血流量很少的情 况下也能保持通畅，但是通畅的AV瘘可能对临床透析并不足够。为了本发明的目的，透析 用临床充足血流为约150-500mL/min，优选约300-500mL/min，最优选约350-400mL/min ；适 宜的血压是约50-180mmHg，优选约50_120mmHg。为了本发明的目的，我们相信，用本发明的可植入性材料治疗可以提供有益的内 环境稳态，使得不管在造瘘时还是后期阶段，当本发明的可植入性材料置于与瘘管相邻的 位置或瘘管附近时，可以减少AV瘘成熟时常见的并发症，例如血栓形成、狭窄、凝血和/或 副脉的生长。这类有益的环境使得AV瘘发展至成熟和/或保持在成熟状态。例如，当AV 瘘静脉变厚并能传导高流量、高压力血流时，即在功能上建立了 AV瘘成熟。用本文所提供 的可植入性材料处理AV瘘增强了瘘管的成熟和/或预防了瘘管成熟失败。对于本发明的 目的要了解的是，AV瘘成熟的增强包括任何瘘管功能的改善，包括其形成、达到功能状态所 需要的时间以及瘘管在成熟状态的维持。 术后即时的血栓形成可以阻止通畅AV瘘的形成并导致瘘管早期失败。如本文解 释的那样，手术时用本发明的可植入性材料处理可以预防AV瘘因为术后血栓形成而导致 的即刻失败。例如，可植入性材料释放能减少血栓形成的抗血栓介导剂，并能在整个瘘管形 成和成熟阶段维持瘘管通畅。手术时在AV瘘部位或其附近放置可植入性材料也能通过减少瘘管吻合口或其附 近的狭窄，使瘘管变为具有足以提供充足血流来支持透析的大小、促进静脉和动脉扩张、减 少寄生副脉的形成、维持自体附脉以增强瘘管成熟、和改进静脉尺径。此外，AV瘘需要比AV移植物更长的时间达到成熟。在瘘管成熟期间，通常用经皮 或留置导管进行血液透析，这导致了感染风险增加，并危害了中央静脉的畅通性。在造瘘时 将可植入性材料置于AV瘘的部位可以减少瘘管成熟所需要的时间，从而减少相关的感染 和危害中央静脉畅通性的风险。将可植入性材料置于留置导管的部位可以减少与留置导管 相关的血栓形成、内膜增生和再狭窄的风险，从而减少了相关的感染和危害中央静脉畅通 性的风险。最后，本文所述可植入性材料的使用可以降低成熟AV瘘的晚期失败。成熟瘘管可 能会由于晚期进行性狭窄而经历血流减少和静脉狭窄增加。瘘管狭窄或闭塞到足以使血流 减少至低于透析所必需的水平的程度时，可能需要介入性血管成形术或瘘管支架术来恢复 充足的血流水平。这些介入治疗增加了静脉狭窄和闭塞的风险，从而进一步阻止了成熟瘘 管的形成。而且，支架术可以导致所治疗血管在支架远端和近端血管处发生闭塞性血栓形 成或再狭窄，即通常所说的边缘效应。可植入性材料的应用可以导致正性重塑(血管扩张与同时发生的静脉新生内膜 增生抑制的联合)，从而阻止晚期进行性狭窄，增加成熟瘘管血流，减少对复原性血管成形 术或闭塞瘘管支架术的需求，预防支架相关的边缘效应，以及延长成熟瘘管的寿命和可用性。本发明的可植入性材料可以在许多不同阶段的任何一个阶段向瘘管提供。例如， 手术时的处理可以预防AV瘘成熟失败和/或可以增强瘘管成熟。可植入性材料通常还可以 在初次手术后提供以促进康复，以及在成熟瘘管形成后提供以使其维持在临床稳定状态。 此外，可植入性材料还可以挽救随后发生失败的成熟瘘管和/或延长成熟瘘管的寿命。这 些情形是增强AV瘘成熟的非限制性例子。因此，预计可植入性材料不仅可以在开始手术时 使用以制造AV瘘，而且还可以在随后的时间点使用(例如，维持成熟瘘管或挽救失败中的 成熟瘘管)。随后的给用可以手术或无创完成。动静脉移棺物根据其它实施方案，为血管通路制造的动静脉移植物(“AV移植 物”)可以用本发明的可植入性材料处理。AV移植物可以是前臂直式移植物、前臂环形移植 物或上臂移植物。动脉流入部位包括但不限于颈总动脉、腕部桡动脉、肘窝臂动脉、下臂臂 动脉、腋窝下臂动脉、腋动脉和股动脉。静脉流出部位包括但不限于中肘前静脉、近端头静 脉、远端头静脉、肘部水平的贵要静脉、上臂水平的贵要静脉、腋静脉、颈静脉和股静脉。其 它适于形成AV移植物的动脉和静脉位置包括胸壁(腋动脉至锁骨下静脉)、下肢(股动脉 /静脉、隐静脉或胫(前)动脉)、主动脉至腔静脉、腋动脉至股静脉或股动脉至腋静脉。对于本发明的目的，适于透析的包括假体桥的功能性AV移植物能传导高流量、 高压力血液通过假体桥。在这样的AV移植物中，移植物的静脉流出区域的血流速率基本 上与移植物流出区域上游的血流速率相似。适于透析的血流速率为约150-500mL/min， 优选约300-500mL/min，最优选约350-400mL/min ；适宜的血压是约50-180mmHg，优选约 50-120mmHgoAV移植物失败通常是因为移植物相关的内膜增生及随后在静脉移植物吻合口或 近静脉段的移植物相关血栓形成。AV移植物也由于自体血管和假体桥之间的组织整合性 差，桥体材料最终从血管裂开而容易失败。为了本发明的目的，不管在移植物产生时还是后期阶段，用本发明的可植入性材 料处理都提供了有益的内环境稳态，因此减少了与AV移植物整合和成熟相关的并发症，例 如血栓形成、狭窄、凝血和/或裂开。这类有益的环境使AV移植物相关的血管与假体桥材 料完全整合。例如，当AV移植物整合并能传导高流量、高压力血液时，即在功能上建立了 AV 移植物成熟。如本文证明的那样，用可植入性材料处理AV移植物增强了移植物的整合和成 熟。为了本发明的目的，应理解AV移植物整合和/或成熟的增强包括任何移植物功能的改 善，包括其形成、达到功能状态所需要的时间以及移植物功能形态的维持。术后即时的移植物相关血栓形成可以阻止组织整合及最终形成畅通的AV移植 物，并可以导致移植物早期失败。如本文解释的那样，手术时的处理可以防止AV移植物由 于术后血栓形成而发生即刻失败。例如，可植入性材料释放能减少血栓形成的抗血栓介导 剂，并在整个移植物整合和成熟阶段维持移植物通畅。手术时将可植入性材料置于AV移植物吻合口、该吻合口相邻位置或附近；移植物 静脉流出区域、该区域相邻位置或附近；和/或移植物上、移植物相邻位置或附近也可以通 过减少移植物吻合口处或附近即刻血栓形成和进行性狭窄而增强整合和成熟。该治疗效果 使移植物有充足的时间变得与假体桥材料充分整合，使血管血栓形成和闭塞最小化，并维 持足够的血管内径以支持足以透析的血流。
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给予可植入性材料还可以使成熟AV移植物晚期失败最小化。成熟移植物可能会 由于晚期进行性狭窄而经历血流减少和静脉狭窄增加。可植入性材料的应用可以导致正性 静脉重塑(血管扩张与同时发生的静脉新生内膜增生抑制的联合)，从而阻止晚期进行性 狭窄，增加成熟移植物的血流，以及延长成熟移植物的寿命和可用性。如本文证明的那样，用本发明的可植入性材料处理AV移植吻合口促进了适于透 析的功能性AV移植物的形成。可以进一步理解的是，为了本发明的目的，功能性AV移植物 的形成包括移植物临床功能性的任何改进、或是对移植物吻合口形成或假体桥整合的过程 的改进、和/或移植吻合口在成熟形态的维持的改善，包括裂开的发生率减少。如临床从业者公认的那样，AV移植物的适用性(AV graft adequacy)要求移植物 支持并维持足够的血流。在适于血液透析的AV移植物的情况下，足够的血流是至少足以支 持透析机透析的流速，以使不发生再循环。临床失败的AV移植物是不能支持足以支持透析 的血流的移植物。预计本发明的优选实施方案将通过促进可以支持透析用足够血流的功能 性移植物的形成，从而延迟AV移植物失败的发作，或减少AV移植物失败。外周旁路移棺根据其它实施方案，为旁通失败的外周血管而制造的外周移植物 可以用本发明的可植入性材料处理。外周旁路移植物可以置于多种解剖位置，包括四肢，例 如腿部膝盖上方或下方区域。外周旁路移植物可以用来旁通阻塞的外周血管，包括外周动 脉或静脉阻塞。外周旁路移植物可以用来恢复和/或维持四肢的正常血流，例如，足以维持 正常或近正常外周循环的血流速率。根据某些实施方案，外周旁路移植物形成于阻断区域 上方至阻断区域下方。在某些实施方案中，本发明可以用于改善具有桥体(包含自体材料) 的外周旁路的功能性、整合、成熟和/或稳定性；在某些其它实施方案中，移植物具有假体 桥。在外周旁路移植物的情况下，可植入性材料可以置于移植物一端或两端的血管外 表面，和/或移植材料的外表面。在某些实施方案中，可植入性材料可以与外周旁路移植接 合点的一端或两端接触。在某些其它实施方案中，可植入性材料可以置于外周旁路移植物 上游的血管外部。手术时将可植入性材料的优选实施方案置于外周旁路移植物的流入或流出区 域或其附近，也可以增强功能性移植物的形成，促进整合和/或预防裂开。为了本发明 的目的，功能性外周旁路移植物能在正常压力下传导正常血流。膝盖下方旁路移植物的 正常血流速率为约50-150mL/min，优选约80-100mL/min ；膝盖上方约50_150mL/min，优 选约80-100mL/min ；足部移植物约25_30mL/min。适宜的血压为约50-180mmHg，优选约 50-120mmHgo在按本文所述方法处理的外周旁路移植物的情况下，流出速率基本上与流出速率 相似。本发明恢复对下肢的足够血流，并减少与下肢血流不足相关的症状。本发明的优选 实施方案通过促进具有足以维持外周循环的血流的功能性外周旁路移植物的形成，来延迟 外周旁路移植物失败发作，或减少外周旁路移植物失败。为了本发明的目的，任何假体桥材料适于制造血管通路结构，前提条件是，其在AV 移植物的情况下支持血液透析所需血流速率和压力，和在外周旁路移植物的情况下支持外 周循环所需血流速率和压力。通常地，假体桥优选为柔性的，与细胞整合相容的，并且具有 支持所需血流速率的适当尺寸。一个优选实施方案使用了 PTFE或ePTFE聚四氟乙烯桥，另一个使用了Dacron (Ε. I. duPont de Nemours and Co.)。假体桥也可以由改性的PTFE材 料、聚氨酯、碳涂布的PTFE和复合移植物制成。PTFE移植物可以制成多种物理构型，包括锥 形的、条状的(stretch)、有棱纹的、平滑的，并包括多种PTFE水平。假体移植物还可以包 括远端修饰，包括介于动脉和瘘管之间的静脉补片、颈圈和套管。其它实施方案包括自体材 料，例如隐静脉移植物、脐静脉移植物、股静脉同种异体移植物及生物异种移植物，包括牛 颈动脉和牛肠系膜静脉移植物。包括任一种前述物的复合移植物也包括在本发明内。熟练 从业者能认知合适的等同体。此外，重要的是，在AV移植物或外周旁路移植物的情况下，正常或接近正常速率 的康复促使内皮细胞占据假体桥的腔表面，从而促进了移植物与相关血管系统的整合。由 可植入性材料的细胞提供的治疗因子扩散至血管壁内，以促进整合。在合成的移植材料的 情况下，合成材料的多孔性也可以影响治疗因子到达在合成移植物腔表面增殖的细胞的能 力。PTFE移棺物在某㈣优诜实施方案中，用长15-25cm，内径6mm的PTFE管形成移 ^ (Atrium Advanta VS Standard Wall PTFE6mm, Atrium Medical Corp, Hudson, NH)。PTFE是特别优选的移植材料，其是柔性的聚合体，现已证实其在用于手术程 序时是不致凝血的。预计具有与PTFE类似性质的替代的聚合体材料，例如Dacron ，也可 以用作移植材料。移植物可以切成需要的长度，以方便其在特定患者内的准确放置。移植物可以是 前臂环形移植物或直式移植物。移植物的末端可以切成一定的角度，具有凸缘，或者为其它 构型，足以增加移植物末端缝合用表面积，或足以提高特定患者对移植物的适应性。移植物 末端也可以是粗糙的或以其它方式改良，以方便细胞粘附。此外，移植材料可以包被以明 胶、白蛋白或其它治疗剂。最后，向要失败或已失败的AV移植物或外周旁路移植物提供可植入性材料可以 导致初始移植物的复原，从而恢复移植物的功能性。在相关情形下，失败的自体AV瘘可以 用AV移植物联合的本发明的可植入性材料作为介入治疗替代。血管通路导管根据某㈣实施方案，为血管通路制造的留置静脉导管可以用本发 明的可植入性材料处理。导管可以置于患者体内的多种位置，包括例如，置于颈部，胸部及 腹股沟。对于血液透析的目的，当瘘管正在成熟中或移植物处于术后整合中时，可以植入双 腔导管作为临时性血管通路。血管通路导管过早失败通常是因为在静脉导管吻合口或近静脉段发生了导管相 关内膜增生及随后的导管相关血栓形成。为了本发明的目的，不管在导管置入时还是后期阶段，用本发明的可植入性材料 处理都提供了有益的内环境稳态，因此减少了导管处与血管通路导管功能相关的并发症， 例如血栓形成，狭窄和/或凝血。为了本发明的目的，要理解的是，血管通路导管功能的增 强包括任何导管功能的改善，或导管在功能形态的维持。血管通路端口 根据某㈣实施方案，为血管通路制造的留置端口可以用本发明的 可植入性材料处理。端口可以置于患者内的多种位置，包括例如，置于臂部、胸部或腹股沟 的静脉或动脉位置。血管通路端口过早失败通常是因为在静脉端口吻合口或近静脉段发生了端口相关的内膜增生及随后的端口相关的血栓形成。为了本发明的目的，不管在端口置入时还是后期阶段，用本发明的可植入性材料 处理都提供了有益的内环境稳态，因此减少了端口处与血管通路端口功能相关的并发症， 例如血栓形成、狭窄和/或凝血。为了本发明的目的，要理解的是，血管通路端口功能的增 强包括任何端口功能的改善，或端口在功能形态的维持。总体考虎在本发明的某㈣实施方案中，在给予可棺入件材料之前、同时和/或之 后给予了额外的治疗剂。例如，可以给予预防或减少血液凝块形成、血小板凝集或其它类似 阻塞物的药剂。例示性的药剂包括，例如硫酸乙酰肝素和TGF-β。根据需要植入物的临床适 应症，还可以向可植入性材料中加入其它细胞因子或生长因子，包括促进再内皮化的VEGF 以及促进移植物整合的b-FGF。其它类型的治疗剂包括但不限于抗增殖剂和抗肿瘤剂。例 子包括雷帕霉素、紫杉醇和E2FDec0y药剂。任何前述药剂均可以局部或全身给药；如果为 局部给药，某些药剂可以包含在可植入性材料内或由细胞提供。此外，介导正性组织重塑的药剂也可以与本文所述可植入性材料的实施方案联合 给药。例如，某些药剂可以促进血管损伤部位包括手术部位的正常或似正常血管腔再生或 血管腔组织重塑。同样，这些药剂可以包含在可植入性材料内或者由细胞提供。如临床从业者公认的那样，适于血液透析的血管通路要求血管通路结构成熟和充 足的血流。如本文别处解释的那样，成熟涉及发生在静脉中的允许透析时重复插管的解剖 学变化。某些允许重复插管的变化涉及脉管大小和/或脉管壁增厚和/或腔径。而且，如 本文所述，这些变化中的某些也允许足以支持透析的血流速率。此外，如本文别处解释的那 样，临床失败的血管通路结构是不能为透析进行重复插管和不能支持足以支持透析的血流 的血管通路结构。这些临床失败可直接与上述解剖学参数的功能障碍有关。因此，本发明还提供实现血管通路相关临床终点的方法，临床终点包括提高插管 频率、增加血管通路结构血流，增加脉管壁厚度，维持腔径和/或前述的组合，其中该方法 包括将可植入性材料以有效实现一个或多个前述终点的量定位于血管通路结构处、该结构 相邻位置或附近的步骤。此外，本发明还提供成功鉴别成熟血管通路结构的方法，其中该方法包括监控任 何一种下列临床参数的步骤重复插管、足以防止透析时再循环的血流、血管壁增厚、足以 允许透析时血流的腔径，其中成功成熟的血管通路结构表现至少一种前述参数。本发明的可植入性材料可以应用于任何需要介入治疗以维持内环境稳定的管状 解剖学结构。管状解剖学结构包括血管系统、生殖系统、泌尿系统、胃肠道系统、肺系统、呼 吸系统以及脑和脊髓的脑室系统。本文考虑的管状解剖学结构是具有内腔表面和腔外表面 的结构。为了本发明的目的，腔外表面可以是但不限于管状结构的外表面。在某些结构中， 内腔表面是内皮细胞层；在某些其它结构中，内腔表面是非内皮细胞层。细胞来源如本文描述的那样，本发明的可植入性材料包括细胞。细胞可以是同种 异体的、异种的或自体的。在某些实施方案中，活细胞的来源可以得自适当的供体。在某些 其它实施方案中，细胞的来源可以得自尸体或细胞库。在一个目前优选的实施方案中，细胞是内皮细胞。在一个尤其优选的实施方案中， 这些内皮细胞获自血管组织，优选但不限于动脉组织。如下文例示的那样，一种适用的血管 内皮细胞类型是主动脉内皮细胞。另一种适用的血管内皮细胞类型是脐静脉内皮细胞。又一种适用的血管内皮细胞类型是冠状动脉内皮细胞。其它适用于本发明的血管内皮细胞类 型包括肺动脉内皮细胞和髂动脉内皮细胞。在另一个当前优选的实施方案中，适宜的内皮细胞可以获自非血管组织。非血管 组织可以得自任何本文别处所述的管状解剖学结构，或者可以得自任何非血管组织或器官。在另一个实施方案中，内皮细胞可以得自内皮祖细胞或干细胞；在另一个实施方 案中，内皮细胞通常可以得自祖细胞或干细胞。在其它优选实施方案中，细胞可以是得自血 管或非血管组织或器官的同种异体、异种或自体的非内皮细胞。本发明还包括任何经基因 改造、基因修饰或基因工程制造的前述细胞。在进一步的实施方案中，将两种或两种以上类型的细胞共培养，以制备本发明的 组合物。例如，可将第一种细胞导入生物相容性可植入性材料中，并培养至融合。第一种细 胞类型包括，例如平滑肌细胞、成纤维细胞、干细胞、内皮祖细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞 的组合、其它任何适于产生益于内皮细胞生长的环境的所需细胞类型或所需细胞类型的组 合。一旦第一种细胞类型达到融合，则将第二种细胞类型接种在位于生物相容性基质之中、 之上或之内的第一种融合细胞类型上，并培养至第一种细胞类型和第二种细胞类型均达到 融合。第二种细胞类型可包括，例如内皮细胞或其它任何理想细胞类型或细胞类型的组合。 预期第一和第二种细胞类型可以逐步导入，或者作为单一的混合物导入。还预期可以改变 细胞的密度以改变平滑肌细胞对内皮细胞的比例。为预防有过度增殖倾向的平滑肌细胞或其它细胞类型的过度增殖，可以改变培养 程序。例如，在第一种细胞类型融合之后，在导入第二种细胞类型之前，可以先将培养物用 适合于第二种细胞类型的附着因子涂覆。例示性的附着因子包括用明胶涂覆培养物，以提 高内皮细胞的附着性。根据另一个实施方案，在第二种细胞类型培养期间，可以向培养基中 加入肝素以减少第一种细胞类型的增殖，优化第一种细胞类型对第二种细胞类型的期望比 例。例如，在平滑肌细胞的初始生长之后，可以给予肝素以控制平滑肌细胞的生长，从而达 到较大的内皮细胞对平滑肌细胞的比例。在一个优选实施方案中，通过首先将平滑肌细胞接种至生物相容性可植入性材料 中以产生血管结构，从而产生共培养物。一旦平滑肌细胞达到融合，则将内皮细胞接种于可 植入性材料上培养的平滑肌细胞上，以产生模拟血管。该实施方案可以根据本文所述方法 施用于例如AV移植物或外周旁路移植物，以促进假体移植材料的整合。所有本发明组合物的细胞所必需的条件是，它们显示一种或多种优选的表型或功 能特性。如本文之前描述的那样，本发明基于这样的发现具有易识别表型的细胞与优选基 质(在本文别处描述)结合时，可以促进、修复和/或以其它方式调节与处理血管通路结构 如动静脉瘘或动静脉移植物相关的血管内皮细胞生理和/或腔内环境稳定。为了本发明的目的，代表本发明细胞的一种优选、易识别的表型是通过下文所述 体外分析法测量时，能抑制或以其它方式干扰血管平滑肌细胞增殖的能力。本文称之为抑 制性表型。由本发明组合物的细胞显示的另一个易识别的表型是抗血栓形成或能抑制血小 板粘附和凝集。抗血栓形成的活性可以用下文所述体外硫酸乙酰肝素分析法和/或体外血 小板凝集分析法测定。
在本发明的典型有效实施方案中，细胞不需显示出多于一种的前述表型。在某些 实施方案中，细胞可以显示多于一种的前述表型。虽然前述表型各自代表功能性内皮细胞，例如但不限于血管内皮细胞，但从本发 明的目的考虑，显示这种表型的非内皮细胞被认为是内皮样细胞，因此适用于本发明。本文 也将内皮样细胞称作内皮细胞的功能性类似物，或内皮细胞的功能性模拟物。因此，仅作为 例子，适用于本文中公开的材料和方法的细胞还包括产生内皮样细胞的干细胞或祖细胞； 起源为非内皮细胞但用本文提出的参数判定，在功能上类似于内皮细胞的细胞；任何起源 的经工程改造或以其它方式修饰后，经本文所述参数判定具有内皮样功能性的细胞。通常地，当存在于融合、近融合或融合后细胞群中，并与优选的生物相容性基质例 如本文所述的那些结合时，本发明的细胞显示一种或多种上述表型。本领域技术人员应了 解的是，融合、近融合或融合后细胞群可以通过多种技术容易地识别，其中最常见并被广泛 接受的技术是直接显微镜观察。其它技术包括采用标准细胞计数技术，例如但不限于血细 胞计数器或库尔特计数器，来评估每个表面积的细胞数。此外，为了本发明的目的，内皮样细胞包括但不限于用本文所述参数测量时，在功 能和表型上仿效或模拟融合、近融合及融合后内皮细胞的细胞。因此，利用下文所述详细说明和指导，本领域技术人员的从业者将了解如何制造、 使用、测试和识别本文公开的可植入性材料的有效实施方案。那就是，本文提供的教导公 开了所有制造和使用本发明的可植入性材料所必需的条件。此外进一步，提供的教导公开 了所有有效识别、制造和使用等同的含细胞组合物所必需的条件。实质上，所有必需的条件 是，等同的含细胞组合物依照本文公开的方法可以有效处理血管通路结构。如熟练从业者 所了解的那样，本发明组合物的等同实施方案可以仅采用常规实验连同本文提供的教导来 识别。在某些优选实施方案中，用于本发明的可植入性材料的内皮细胞分离自人尸体供 体的主动脉。每批细胞均得自单个或多个供体，并广泛测试其内皮细胞纯度、生物学功能、 以及细菌、真菌、已知人病原体及其它外来试剂的存在。将细胞用公知技术冷冻保存和库 存，待以后培养扩展，用于后序配制入生物相容性可植入性材料中。细胞制备如上所述，适宜的细胞可以获自多种组织类型和细胞类型。在某些优选 实施方案中，用于可植入性材料的人主动脉内皮细胞分离自尸体供体的主动脉。在其它实 施方案中，猪主动脉内皮细胞(Cell Applications, San Diego，CA)通过与分离人主动脉内 皮细胞类似的操作从正常猪主动脉中分离。每批细胞均得自单个或多个供体，并广泛测试 其内皮细胞存活率、纯度、生物学功能、以及支原体、细菌、真菌、酵母菌、已知人病原体及其 它外来试剂的存在。用公知技术将细胞进一步培养扩展、表征和冷冻保存，以形成第3至第 6代的工作细胞库，待以后培养扩展，用于后序配制入生物相容性可植入性材料中。人或猪主动脉内皮细胞在T-75烧瓶中制备，每瓶加入内皮细胞生长培养基约 15ml预处理。人主动脉内皮细胞在内皮细胞生长培养基(Endothelial Growth Media, EGM-2, Cambrex Biosciences, East Rutherford, NJ)中制备。EGM-2 由内皮细胞基础培 养基(Endothelial Basal Media, EBM-2，Cambrex Biosciences)补充含有 2% FBS 的 EGM-2Singlequots组成。猪细胞在加有5% FBS和50 μ g/ml庆大霉素的EBM-2中制备。 将烧瓶置于孵化器中，在约37°C、5% C02/95%空气及90%湿度的条件下维持最少30分钟。将一瓶或两瓶细胞从-160°C至-140°C冰库中取出，在约37°C下解冻。每瓶解冻后的细胞以 约3X IO3个/cm3，优选，但不小于1.0X103个/cm3且不大于7. OXlO3个/cm3的密度接种 至两个T-75烧瓶中；然后将含有细胞的烧瓶放回孵化器中。约8-24小时后，除去用过的培 养基，换上新鲜培养基。此后，每2-3天更换一次培养基，直至细胞达到优选约85-100%，但 不小于60%且不大于100%的融合度。当可植入性材料打算用于临床时，则仅将无抗生素 的培养基用于人主动脉内皮细胞的解冻后培养及本发明的可植入性材料的制造。然后除去内皮细胞生长培养基，细胞单层用IOml HEPES缓冲盐水(HEPES)漂洗。 除去HEPES，加入2ml胰蛋白酶以使细胞从T-75烧瓶壁上脱离。一旦脱离发生，加入3ml 胰蛋白酶中和溶液(TNS)以终止酶反应。另外加入5ml HEPES，细胞用血细胞计数器计数。 将细胞悬浮液离心，在人细胞的情况下，用无抗生素的EGM-2调节密度至约1. 75 X IO6个细 胞/ml，或在猪细胞的情况下，用加有5% FBS和50 μ g/ml庆大霉素的EBM-2调节密度至约 1. 50X IO6 个细胞/ml。牛物相容件基质根据本发明，可棺入件材料包括牛物相容件基质。基质允许细 胞生长并附着于基质上或基质内。基质是柔性的和顺应性的。基质可以是固体、半固体或 易流动性多孔组合物。对于本发明的目的，易流动性组合物是指可以用注射或注射型递送 装置例如但不限于针、注射器或导管施用的组合物。其它采用挤出、喷射或排出的递送装置 也包括在本发明中。优选多孔基质。优选易流动性组合物是形状保持不变的。基质也可以 是柔性的平面形式。基质还可以是凝胶、泡沫、悬浮体、粒子、微载体、微胶囊或纤维性结构。 目前优选的基质为微粒形式。当植入例如血管外表面时，基质可以在其被生物侵蚀之前停留在植入部位至少约 56-84天，优选约至少7天，更优选约至少14天，最优选约至少28天。一种优选基质是可吸收的明胶海绵Gelfoam (Pfizer Inc.，New York, NY,以下 称“Gelfoam基质”)。Gelfoam基质是由特殊处理并纯化的猪皮明胶溶液制备的多孔、柔性 手术用海绵。根据另一个实施方案，生物相容性基质材料可以是改性基质材料。可对基质材料 的改性进行选择，从而在细胞与基质结合时，可优化和/或控制细胞的功能，包括上文所述 细胞的表型(例如，抑制性表型)。根据一个实施方案，对基质材料的改性包括用附着因子 或粘附肽涂覆基质，该附着因子或粘附肽可以增强细胞抑制平滑肌细胞增殖、减少炎症、增 加硫酸乙酰肝素的产生、增加前列环素的产生和/或增加TGF-B1的产生的能力。例示性的 附着因子包括，例如纤连蛋白、纤维蛋白胶和采用标准水性碳二亚胺化学法共价结合的细 胞粘附配体(包括例如RGD)。其它细胞粘附配体包括具有细胞粘附识别序列的肽，包括但 不限于 RGDY、REDVY, GRGDF, GPDSGR、GRGDY 和 REDV。根据另一个实施方案，基质是除Gelfoam之外的基质。其它例示性基质材料包括， 例如纤维蛋白胶、藻酸盐、聚苯乙烯磺酸钠微载体、胶原涂布的葡聚糖微载体、PLA/PGA和 pHEMA/MMA共聚物(每个共聚物的聚合体比例在1-100%之间)。根据优选实施方案，这些 其它基质经改性后包括上文列举和描述的附着因子或粘附肽。例示性附着因子包括，例如 明胶、胶原、纤连蛋白、纤维蛋白胶和采用标准水性碳二亚胺化学法共价结合的细胞粘附配 体(包括RGD)。其它细胞粘附配体包括具有细胞粘附识别序列的肽，包括但不限于RGDY、 REDVY, GRGDF, GPDSGR, GRGDY 和 REDV。
根据另一个实施方案，对生物相容性基质材料进行物理改性，以促进细胞向基质 的附着。根据一个实施方案，使基质交联以增强其机械性能，并促进其细胞附着和生长性 能。根据优选实施方案，藻酸盐基质先用硫酸钙进行第一次交联，然后用氯化钙和常规方案 进行第二次交联。根据另一个实施方案，对生物相容性基质的孔径进行改性。优选基质孔径为约 25 μ m至约100 μ m,优选约25 μ m至约50 μ m,更优选约50 μ m至75 μ m，更加优选约75 μ m 至100 μ m。其它优选孔径包括约25 μ m以下的孔径和约100 μ m以上的孔径。根据一个实 施方案，对孔径的改性采用盐浸取技术进行。将氯化钠混合入基质材料和溶剂的溶液中，然 后将溶液倒进模具中，并使溶剂蒸发。接着将基质/盐块浸入水中，使盐浸出，留下多孔结 构。对溶剂进行选择，以使基质在溶液中而盐不在。一种例示性的溶液包括PLA和二氯甲 焼。根据替换性的实施方案，将二氧化碳气泡加至非固体形式的基质中，然后用适当 的表面活性剂使之稳定。随后用真空除去气泡，留下多孔结构。根据另一个实施方案，采用冷冻干燥技术控制基质的孔径，用冰微粒的冷冻速率 形成不同大小的孔。例如，将约0. 1-2%的猪或牛明胶的明胶溶液倒进模具或盘中，在多种 不同温度下预冻，然后冻干一段时间。随后可优选用紫外光(254nm)或者通过加入戊二醛 (甲醛)使材料交联。预冻温度(例如-2(TC，-8(TC或-180°C )、冻干温度(在约-50°C冷 冻干燥)和明胶浓度(0. _2.0%，孔径通常与溶液中明胶的浓度成反比)的改变都可以 影响所得基质材料的孔径，并可以将其改性以制造优选材料。熟练技术人员将了解，适宜的 孔径是能促进并保持具有本文别处所述表型的最佳细胞群的孔径。柔件的平面形式如本文教示的那样，牛物相容件基质的平面形式可以设计成多 种形状和大小，优选形状和大小适合在瘘管、移植物、外周移植物或其它血管通路结构及其 周围，或前述通路结构的相邻位置，或前述通路结构附近植入，并能顺应该通路结构及其相 关血管的赋形表面。根据优选实施方案，为了应用于待处理的特定血管通路结构，单片基质 具有一定的大小和构造。根据一个实施方案，生物相容性基质被设计为柔性的平面形式。为施用于管状结 构例如但不限于血管给药，或施用于血管通路结构例如但不限于血管吻合口而设计的例示 性实施方案见图1。图1中长度、宽度、厚度以及表面积的特征未按刻度或以成比例的方式 图示；图1是非限制性的例证性的实施方案。参照图1，柔性平面形式20由一片适宜的生物相容性基质形成。所有必需的条件 是，柔性平面形式20是柔性的、顺应性的和/或可适于管状结构例如血管的外部赋形表面。 柔性平面形式20可以与血管外表面接触，可以覆盖外表面或者可以在外表面卷绕。根据图2A所示的一个例示性实施方案，赋形的柔性平面形式20’可被设计成含有 可限定区域例如主体30，其与桥50相连，与翼片40相连。尽管几个区域形成了一个连续 的整体，但翼片40可由桥50从主体30分离开来。根据一个例示性实施方案，这几个区域 的内边缘被布置成在赋形的柔性平面形式20’中限定出内部狭槽60。根据优选实施方案， 限定内部狭槽60的这几个区域进一步限定出在赋形的柔性平面形式20’内部的第一终点 62、在赋形的柔性平面形式20’外边缘上的第二终点64、及宽度66。在该特定的例示性实 施方案中，第一终点62在翼片40和桥50的分界线上，第二终点64在翼片40和主体30的
18分界线上。在某些实施方案中，由上述翼片40、主体30和桥50限定的狭槽60的宽度66优 选为约0. 01至约0. 04英寸，更优选约0. 05至0. 08英寸，最优选约0. 06英寸。优选的是， 柔性平面形式20’中狭槽60的宽度66具有足够的尺寸，从而阻碍移植细胞形成越过狭槽 60的宽度66的连续融合层或细胞桥。但是预计，即使细胞跨越了宽度66，限定狭槽60和 狭槽宽度66的实施方案还是可以通过仅切断或以其它方式中断该细胞层或细胞桥后按本 文所述方法使用。本发明进一步预计，仅仅通过指导熟练从业者用解剖刀或其它切断工具部分地切 断该平面形式，从而限定狭槽的方式，即可在临用前即刻将图1的柔性平面形式20’改造以 限定狭槽60。本文公开的本发明部分基于这样的发现赋形的和/或顺应性柔性平面形式允许 可植入性材料在不破坏植入物或移植到植入物上的细胞的完整性的条件下最理想地应用 于管状结构。一个优选实施方案优化与手术治疗脉管的解剖结构的接触，顺应手术治疗脉 管的解剖结构，并控制可植入性材料的重叠程度。可植入性材料在外膜隙内的过度重叠可 以在被处理的脉管上产生压力点，从而潜在地限制了通过脉管的血流，或者产生其它能延 迟和/或抑制内环境稳定和正常康复的破坏。熟练从业者必须意识到植入时的过度重叠， 并意识到重新放置或改变(例如修整)可植入性材料的需要。此外，在其它实施方案中，可 植入性材料的重叠可以导致分散在可植入性材料中的治疗剂的过量给药。如本文别处描述 的那样，化学药品或其它外源性供给的治疗剂可以任选加入至植入物中。在某些其它实施 方案中，这些药剂可以加入至生物相容性基质中，并在没有细胞的情况下给药；以这种方式 使用的生物相容性基质任选限定了狭槽。相反，可植入性材料未充分接触靶管状结构，可导致未充分接触到移植细胞所提 供的临床益处，或不充分给予加入到可植入性材料中的治疗剂。熟练从业者必须认识到，植 入时的欠佳接触需要重新放置和/或额外的可植入性材料。易流动件组合物在本文的某㈣实施方案中，本发明的可棺入件材料是包括牛物 相容性微粒基质的易流动性组合物。任何用于可注入型递送装置的非固体易流动性组合物 均可考虑，其中的装置能通过顺着血管内长行进而实施腔内(血管内)给药，或者经由皮肤 实施局部给药。优选易流动性组合物是形状保持不变的组合物。因此，本文考虑含有位于 易流动性微粒基质之中、之上或之内的细胞的可植入性材料，可被配制用于任何可注射用 递送装置，该装置内径范围为约22号标准尺寸(gauge)至约26号标准尺寸，能递送约50mg 的包括微粒材料的易流动性组合物，该微粒材料优选在约1至约3ml中含有约1百万个细 胞。根据当前的优选实施方案，易流动性组合物包括生物相容性微粒基质，例 如得自猪皮明胶的产品Gelfoam 粒子、Gelfoam 粉末或粉碎状Gelfoam (Pfizer Inc. , New York，NY)(以下称“Gelfoam粒子”)。根据另一种实施方案，微粒基质是 Cytodex-3 (Amersham Biosciences, Piscataway，NJ)微载体，由与交联的葡聚糖基质偶联 的变性胶原组成。根据另一个实施方案，生物相容性可植入性微粒基质是改性的生物相容性基质。 改性包括上文所述对可植入性基质材料进行的改性。
适用于这种方式的易流动性组合物的例子公开于，与本申请同一天提交的共同待
决的申请PCT/US_(还已知代理人案号ELV-008PC)，其全部内容引入本文作
为参考；以及，与本申请同一天提交的共同待决的申请PCT/US_(还已知代理人
案号ELV-009PC)中，其全部内容引入本文作为参考。牛物相容件基质的细胞接种适宜的生物相容性基质的预切块或适宜的生物相 容性易流动性基质的等份，在约37°C、5% C02/95%空气的条件下，通过加入无抗生素的 EGM-2，从而进行再水合12至24小时。然后将可植入性材料从其再水合容器中取出，置于 独立的组织培养皿中。生物相容性基质以约1. 5-2. OX IO5个细胞(1. 25 X IO5至1. 66 X IO5 个细胞/cm3基质)的优选密度被接种，然后置于孵化器中，在约37°C、5% C02/95%空气、 90%湿度的条件下保持3-4小时，以促进细胞附着。接种后的基质然后置于单独的容器 (American Master Tech, Lodi, CA)培养管中，每管均配有含0. 2 μ m滤膜的帽及EGM-2，并 在约37°C和5% C02/95%空气的条件下孵育。此后每2-3天更换一次培养基，直至细胞达 到融合。在一个优选实施方案中，细胞优选传代6次，但传代次数更少或更多的细胞都可以
使用。根据本发明的其它实施方案，可植入性材料的其他制备方案公开于_提交
的共同待决的申请PCT/US_(也称作代理人案号ELV-009PC)，其全部内容均引
入本文作为参考。细胞牛长曲线和融合分别在第3或4天、6或7天、9或10天及12或13天或者 上述时间左右，取可植入性材料样品进行细胞计数，评价细胞存活率，建立细胞生长曲线并 分析，以评定细胞的生长特征，并确定是否达到融合、接近融合或融合后。含有猪主动脉内 皮细胞植入批次的可植入性材料的两种制剂，其代表性的生长曲线见图3A和3B。在这些实 施例中，可植入性材料为柔性的平面形式。通常地，本领域技术人员应了解在早、中、晚时间 点时可接受的细胞生长指标，例如在早期时间点(对于图3A而言，在约第2-6天之间)观 察到细胞数的增长，然后是近融合相(对于图3A而言，在约第6-8天之间)，接着是细胞达 到融合后细胞数的平稳期(对于图3A而言，在约第8-10天之间)以及细胞融合后期细胞 数的维持期(对于图3A而言，在约第10-14天之间)。为了本发明的目的，优选在平稳期至 少72小时的细胞群。细胞计数通过将可植入性材料等分试样用0. 8mg/ml胶原酶的胰蛋白酶-EDTA溶 液完全消化来完成。测量消化的可植入性材料的体积后，已知体积的细胞悬浮液用0.4%台 盼蓝稀释(细胞对苔盼蓝的比为4 1)，并用台盼蓝拒染法测定存活率。用血细胞计数器 对活细胞、失活细胞及总细胞计数。以活细胞数对培养的天数作图建立生长曲线。达到融 合后，细胞被转送并植入。为了本发明的目的，融合的定义为在柔性平面形式的可植入性材料 (1.0X4.0X0. 3cm)中时存在至少约4 X IO5个细胞/cm3，并优选在柔性组合物中时每等份 (50-70mg)存在约7X IO5至IX IO6个总细胞。对于这两者，细胞存活率为优选至少约90% 但不低于80%。如果细胞到第12或第13天时仍未融合，则更换培养基，继续孵育一天。持 续该过程，直至达到融合，或者直至接种后约14天。在第14天，如果细胞未融合，则弃去该 批细胞。如果进行巡检后确定细胞已融合，则进行最后的培养基更换。最后的培养基更换 用无酚红无抗生素的EGM-2进行。培养基更换后，立即将培养管安上无菌塞密封帽用于转 送。
功能件评价为了本文所沭本发明的目的，可棺入件材料在棺入之前讲一步对功 能性指标进行测试。例如，在培养期间收集条件培养基，以确定由培养的内皮细胞产生的硫 酸乙酰肝素、转化生长因子β JTGF-β》、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)和一氧化氮的 水平。在某些优选实施方案中，当总细胞数为至少约2X 105，优选至少约4X IO5个细胞/ cm3柔性平面形式；活细胞百分数为至少约80-90%，优选> 90%,最优选至少约90%；且条 件培养基中的硫酸乙酰肝素为至少约0. 5-1. 0，优选至少约1. 0μ g/ΙΟ6个细胞/天时，可植 入性材料可以用于本文所述目的。条件培养基中的TGF-^1为至少约200-300，优选至少约 300pg/ml/天；条件培养基中的b-FGF在约200pg/ml以下，优选不超过约400pg/ml。硫酸乙酰肝素的水平可采用常规二甲基亚甲基蓝_硫酸软骨素裂解酶ABC消化分 光光度法进行定量。总硫酸化粘多糖(GAG)水平用二甲基亚甲基蓝(DMB)染料结合分析测 定，该方法通过用收集培养基(collection media)稀释已知量的纯硫酸软骨素得到标准曲 线，然后将未知样品与标准曲线进行比较。在加入DMB色素之前，将条件培养基的其它样品 与硫酸软骨素裂解酶ABC混合，以消化软骨素和硫酸皮肤素。所有吸光值均在混有GAG标 准品的DMB染料的最大吸收波长——一般为515-525nm左右测定。通过用条件培养基样品 中的总硫酸粘多糖浓度减去软骨素和硫酸皮肤素的浓度，计算每IO6个细胞每天的硫酸乙 酰肝素水平。硫酸软骨素裂解酶ABC的活性通过消化纯硫酸软骨素的样品来确证。如果消 化的纯硫酸软骨素低于100%，则适当校正条件培养基样品。硫酸乙酰肝素的水平还可以用 单克隆抗体采用ELISA分析进行定量。TGF-β工和b-FGF的水平采用ELISA分析，用单克隆抗体或多克隆抗体，优选多克 隆抗体进行定量。收集培养基(collection media)的对照同样可以用ELISA法进行定量， 并为了对照培养基中的TGF-β工和b-FGF水平，适当校正样品。一氧化氮(NO)水平用标准Griess反应分析进行定量。一氧化氮的瞬变及挥发性 使其不适合于大多数检测方法。然而，一氧化氮的两个稳定的降解产物——硝酸盐(NO3)和 亚硝酸盐(NO2)可以用常规光度法检测。Griess反应法在硝酸还原酶存在下将硝酸盐经酶 法转化为亚硝酸盐。亚硝酸盐以有色偶氮染料产物的形式，经比色法检测，吸收约540nm范 围处的可见光。系统中存在的一氧化氮的水平的测定，是通过将所有硝酸盐转化为亚硝酸 盐，测定未知样品中的亚硝酸盐总浓度，然后将得到的亚硝酸盐浓度与用已知量硝酸盐转 化为亚硝酸盐后产生的标准曲线进行比较。前述优选的抑制性表型用上述硫酸乙酰肝素、TGF- β ρ NO和/或b_FGF的定量分 析，以及下面的平滑肌细胞生长和血栓形成抑制的体外定量分析进行评定。为了本发明的 目的，当一种或多种这些可替换性的体外分析证明，可植入性材料显示的是优选的抑制性 表型时，该可植入性材料可以准备用于植入。为体外评价对平滑肌细胞生长的抑制，测定了与培养的内皮细胞相关的抑制值。 将猪或人主动脉平滑肌细胞稀疏接种于24孔组织培养板中的平滑肌细胞生长培养基中 (SmGM-2, Cambrex Bioscience)。使细胞附着24小时。然后将培养基用含有0. 2% FBS的 平滑肌细胞基础培养基(SmBM)替换，培养48-72小时，使细胞生长停滞。从融合后的内皮 细胞培养物制备条件培养基，用2X SMC生长培养基按1 1稀释，加至培养物中。每次分 析均包括抑制平滑肌细胞生长的阳性对照。3-4天后，用Coulter计数器对每份样品中的细 胞数进行计数。通过比较临加入条件培养基之前和暴露于条件培养基及对照培养基(加或不加生长因子的标准生长培养基)下3-4天后的每孔平滑肌细胞数，确定条件培养基对平 滑肌细胞增殖的作用。将与条件培养基样品相关的抑制值与阳性对照相关的抑制值进行比 较。根据优选实施方案，如果条件培养基的抑制率达到肝素对照抑制率的约20%，则认为该 可植入性材料具有抑制性。为体外评价对血栓形成的抑制率，测定了与培养的内皮细胞相关的硫酸乙酰肝素 的水平。硫酸乙酰肝素具有抗增殖和抗血栓形成性能。采用上文详细描述过的常规二甲基 亚甲基蓝-硫酸软骨素裂解酶ABC分光光度法或ELISA分析法，计算每IO6个细胞的硫酸乙 酰肝素浓度。当条件培养基中的硫酸乙酰肝素为至少约0. 5-1. 0，优选至少约1. 0μ g/106 个细胞/天时，则该可植入性材料可以用于本文所述目的。另一个评价对血栓形成抑制率的方法包括在体外测定富血小板血浆相关的血小 板凝集的抑制值。在室温下向猪血液样品中加入柠檬酸钠，得到猪血浆。柠檬酸化的血浆 在温和转速下离心，以使红细胞和白细胞成团，留下血小板悬浮在血浆中。用融合后内皮细 胞培养物制备条件培养基，并加至富血小板血浆的等分样品中。向血浆中加入血小板凝集 剂(激动剂)作为对照。血小板激动剂一般包括花生四烯酸、ADP、胶原、肾上腺素和瑞斯西 丁素(ristocetin，获自 Sigma-Aldrich Co.，St. Louis，M0)。另一等份未加入血小板激动 剂或条件培养基的血浆样品用来测定基线自发血小板凝集。每次试验还包括抑制血小板凝 集的阳性对照。例示性的阳性对照包括阿司匹林、肝素、阿昔单抗(ReoPro ，Eli Lilly公 W], Indianapolis, IN)( Aggrastat , Merck & Co. , Inc. ,Whitehouse Station, NJ)或埃替非巴肽(Integrilin ,Millennium Pharmaceuticals, Inc.，Cambridge, MA))。
然后用凝集仪测量所有测试条件下得到的血小板凝集。血小板凝集仪通过监测光密度来测 量血小板凝集。当血小板凝集时，有更多光线可以通过样品。血小板凝集仪报道的结果以 血小板凝集速率的函数“血小板凝集单位”表示。加入激动剂后6分钟后，凝集被评价为是 最大凝集。通过比较富血小板血浆在加入条件培养基之前的基线血小板凝集和暴露于条件 培养基及阳性对照之后的血小板凝集，确定条件培养基对血小板凝集的作用。结果以基线 的百分数表示。将与条件培养基样品相关的抑制值与阳性对照相关的抑制值进行比较。根 据优选实施方案，如果条件培养基的抑制率为阳性对照抑制率的约20%，则可认为该可植 入性材料具有抑制性。当准备植入时，包括柔性平面形式的可植入性材料在最终产物容器中供应，每个 容器在约45-60ml，优选约50ml无酚红无抗生素的内皮细胞生长培养基(例如，内皮细胞生 长培养基EGM-2)中，优选含有1X4X0. 3cm(l. 2cm3)的无菌片，具有优选含有约5_8X IO5 个，优选至少约4X IO5个细胞/cm3，并至少约90%活细胞每立方厘米，例如得自单一的尸 体供者源的人主动脉内皮细胞。当使用猪主动脉内皮细胞时，生长培养基也是不含酚红的 EBM-2，但添有5% FBS和50 μ g/ml庆大霉素。在其它优选实施方案中，包括易流动性微粒形式的可植入性材料在最终产物容器 中供应，该容器包括例如经滤帽或预载注射器改良的密封组织培养容器，每个在每等份约 45-60ml，优选约50ml的内皮细胞生长培养基中，优选含有植入的内皮细胞总数为约7 X IO5 至约1 X IO6个的约50-60mg微粒材料。可植入性材料的贮存期包括融合、近融合或融合后细胞群的可植入性材料可以 在室温下维持稳定和存活状态至少两周。这类可植入性材料优选在约45-60ml，更优选约50ml的含或不含额外FBS的运输培养基中保存。运输培养基包括不含酚红的EGM-2培养 基。运输培养基中可以加入FBS，直至达到FBS以体积计约10%，或者达到FBS总浓度为约 12%。然而，由于在植入之前，FBS必须从可植入性材料中去除，因此优选限制运输培养基 中使用的FBS的量，以减少移植前需要的漂洗时间。可棺入件材料的冷冻保存包括融合细胞群的融合性可植入性材料可以冷冻保 存以贮藏和/或运输至临床机构，而在最后的解冻后不减小其临床效力或完整性。可植入 性材料优选在 15ml 冷冻管(Nalgene ，Nalge Nunc Int' 1，Rochester, NY)中，在含有 约 10% DMS0、约 2-8%葡聚糖和约 50-75% FBS 的约 5ml CryoStor CS-10 溶液(BioLife Solutions, Oswego, NY)中冷冻保存。将冷冻管置于冷异丙醇水浴中，转移至_80°C冰库中 4小时，然后转移至液氮(-150至-165°C )中。然后将冷冻保存的可植入性材料等份在室温下缓慢解冻约15min，接着在室温水 浴中再解冻约15分钟。然后将材料用约15ml洗涤用培养基(wash media)洗涤约3次。洗 涤用培养基包括含50 μ g/ml庆大霉素的无酚红EBM。最初两次漂洗程序在室温下进行约5 分钟。最后一次漂洗程序在37°C、5% CO2的条件下进行约30分钟。在解冻和漂洗程序之后，使冷冻保存的材料在约IOml的恢复液中静置约48小时。 对于猪内皮细胞，恢复液是37°C下在5% CO2中的、加有5% FBS和50 μ g/ml庆大霉素的 EBM-2。对于人内皮细胞，恢复液是无抗生素EGM-2。进一步的解冻后调节可以在使用和/ 或包装用于贮藏或运输之前另外进行至少24小时。临植入前，轻轻倒出培养基，可植入性材料用约250_500ml无菌盐水(美国药典， USP)漂洗。最终产物中的培养基含有少量的FBS，以在必要时向临床机构运输的过程中 维持细胞活力。根据联邦法规法典(CFR)第9篇动物和动物制品(Animal and Animal Products), FBS已经过对存在细菌、真菌和其它病毒剂的广泛检验。临植入前使用漂洗程 序，将转移的FBS的量减少，优选减少至每植入物中含0-60ng。每位人类患者的总细胞载量为优选约1. 6-2. 6 X IO4个细胞/kg体重，但不小于约 2 X IO3且不大于2 X IO6个细胞/kg体重。如本文所预期，本发明的可植入性材料包括细胞，优选血管内皮细胞，所述细胞优 选具有约90%的存活率，密度优选为约4X IO5个细胞/cm3可变形平面形式，并且当融合时， 产生的条件培养基包含硫酸乙酰肝素至少约0. 5-1. 0，优选至少约1. 0 μ g/106个细胞/天， 包含TGF- β ！至少约200-300，优选至少约300pg/ml/天，包含b_FGF在至少约210pg/ml以 下，优选不超过约400pg/ml。柔性平面形式中可植入性材料的递送总体考虎可棺入件材料可以以各种形式向血管通路施用。根据一个优选实施方 案，可植入性材料是柔性平面形式，其被切成一定形状和大小并适于向邻近瘘管、移植物、 外周移植物或其它血管通路及其周围的位置植入，并且可以顺应该通路结构及其相关血管 的赋形表面。根据优选实施方案，单片可植入性材料具有适于向被处理的血管通路结构施用的 大小。根据另一个实施方案，可以向单个血管通路部位施用超过一片的柔性平面形式的可 植入性材料，例如2、3、4、5、6、7、8片或更多片基质材料。此外，沿着血管通路结构的长度方 向上的超过一个部位可以用一片或多片可植入性材料处理。例如，在动静脉移植物的情况下，各近静脉吻合口、远静脉吻合口和远静脉段可以用一片或多片可植入性基质材料处理。根据一个非限制性实施方案，可植入性材料被设计成顺应血管的外表面。例示性 非限制性平面形式见图1。参照图1，例示性柔性平面形式20具有长度12、宽度14和高度 16。根据一个优选实施方案，柔性平面形式20的长度12为约2cm至约6cm，柔性平面形式 20的宽度14为约0. 5cm至约2cm，以及柔性平面形式20的高度16为约0. Icm至约0. 5cm。根据另一个实施方案，柔性平面形式20可以设计成顺应血管或血管通路结构的 外表面的解剖学赋形的形式。为向血管通路结构施用而设计的例示性的解剖学赋形的柔性 平面形式20’见图2A，并在下文中详细讨论。如本文别处解释的那样，图2A的赋形的柔性平面形式20’可以设计成多种几何形 状。例如，根据一个实施方案，赋形的柔性平面形式20’包括几个限定内部狭槽60的区域。 根据其它实施方案，赋形的柔性平面形式20’的边缘和/或内部狭槽60的边缘是成角的或 弯曲的。根据另一个实施方案，赋形的柔性平面形式20’的高度16’在长度12’和/或宽 度14’上变化。此外，根据其构型和预期目的，赋形的柔性平面形式20’可以有一个或多个 翼片40、桥50和/或狭槽60。关于狭槽的特征，狭槽可以限定在赋形的柔性平面形式20’ 之中、之上或之内的任何地方。狭槽可以限定为宽度一致或变化。狭槽可以限定为直线的、 非直线的或弯曲的。参照图2B、2C、2D和2E，其描述了含有至少一个狭槽60的本发明的赋形的柔性平 面形式20’的多个实施方案，在某些实施方案中，赋形的柔性平面形式20’可以限定一个或 多个狭槽，并可以依照本文所公开的方法使用。限定于赋形的柔性平面形式20’之上或之 内的狭槽60可以顺着赋形的柔性平面形式20，的任何边缘排列，或者可以穿透入赋形形式 20’的内部。现在参考图2E，赋形的柔性平面形式20’之中或之内的狭槽的宽度66或整体 形状可以限定成宽度一致或宽度变化，并且可以定义为直线的、非直线的或弯曲的。参照图2F和2G，赋形的柔性平面形式20’可以分别限定具有不同宽度66和66’ 的狭槽。如上所述，图2G的狭槽60’和宽度66’是一种实施方案的典型，在该实施方案中， 从业者在植入时切断本文别处提到的柔性平面形式20’，从而将其转变为图2G所示的赋形 的柔性平面形式20’。根据一个实施方案，端侧式血管吻合连接物，例如动静脉瘘，可以用本发明的可植 入性材料处理。向端侧式血管吻合口递送柔性平面形式的可植入性材料的例示性方法的步 骤见图4A、4B和4C。参照图4A，向血管通路结构提供第一片可植入性材料22的过程通过将第一片可 植入性材料22的一端34或另一端36在吻合段110下传送，直至第一片可植入性材料22的 中部32到达血管110和110相遇的接合点112来完成。然后末端34、36在接合点112缠 绕缝合线，使可植入性材料集中在缝合线114上。根据一个实施方案，第一片可植入性基质 材料22的末端34、36可以彼此重叠，刚好能使第一片可植入性基质材料22确保就位。根 据另一个实施方案，第一片可植入性基质材料22的末端34、36彼此没有重叠。第一片可植 入性基质材料22的末端34、36，或任何其它可植入性基质材料片不必要彼此会合、彼此重 叠或缠绕脉管100或110的整个圆周。根据一个优选实施方案，第一片可植入性材料22的 末端34、36在不拉伸或撕裂的条件下尽可能地缠绕吻合接合点112。所有必需的条件是达到对脉管的足够覆盖。熟练技术人员应体会何时能正确完成可植入性材料的施用。参照图4B，根据另一个实施方案，任选施用第二片可植入性材料24，使第二片可 植入性材料24的中部42集中在吻合接合点112处或其相邻位置或其附近。第二片可植入 性材料24的末端44、46缠绕在脉管100周围。如关于图4A中的第一片可植入性材料22 的描述那样，第二片可植入性基质材料24的末端44、46可以但不必需接触、重叠或缠绕脉 管100或110的整个圆周。参照图4C，根据另一个实施方案，第三片可植入性材料26任选置于被处理的脉管 100的近脉管段116，在吻合接合点112的远端。根据一个实施方案，第三片可植入性材料 26顺着脉管100的长度纵向放置，使第三片可植入性材料26的第一个末端54位于吻合接 合点112处或其相邻位置或其附近，第三片可植入性材料26的第二个末端56位于吻合接 合点112远端。如关于图4A中的第一片可植入性材料22的描述那样，第三片可植入性基 质材料26的末端54、56可以但不必需接触、重叠或缠绕脉管100的整个圆周。根据替换性实施方案，向血管通路结构例如端侧吻合口提供单片限定狭槽60的 赋形的柔性平面形式20’，例如图2A所示的例示性赋形形式。限定狭槽60的赋形的柔性 平面形式20’的可植入性材料向端侧吻合口或其相邻位置或其附近的植入见图5。当可植 入性材料以缠绕方式使用时，预计单片可植入性基质材料足以处理吻合口及邻接的血管系 统。每个赋形的柔性平面形式20’被加工成适合向特定血管通路结构施用的大小和形状， 因此被预制成能提供足够覆盖度和充足水平的内皮细胞因子和/或治疗剂，以产生特定血 管通路结构和邻近血管系统的稳态内环境。参照图5，根据一个实施方案，限定狭槽的单个赋形20’通过将主体30从翼片40 分离而向吻合口提供。主体30顺着第一脉管100的表面放置。桥50放置于第一脉管100 的表面，并位于第二脉管110的分支下方。然后将翼片40引至分支脉管110周围，并沿着 分支脉管110的上表面放置。根据图5，单片赋形的柔性平面形式20’含有两个参照点70和80 (也见图2A)。当 如图5所示向端侧吻合口给予时，两参照点70和80对齐。第一个参照点70位于翼片40 上，第二个参照点80位于桥50上(也见图2A)。在赋形的柔性平面形式20’的一个实施方 案中，参照点70和80在植入之前被分开约0. 5英寸，优选小于约1英寸，更优选约1英寸， 最优选不超过1.5英寸的距离。当赋形的柔性平面形式20’向吻合部位给予时，由狭槽特 征许可的赋形的柔性平面形式20’绕分支脉管110旋转导致了参照点70和80对齐。根据一个实施方案(并再次参考图4A、4B和4C)，例如，处理动静脉移植物时，第一 片可植入性材料22和第二片可植入性材料24各自施用于近静脉吻合口和远静脉吻合口。 此外，第三片可植入性材料26可被放置于远静脉吻合口下游的远端静脉。根据图6所示的另一个例示性实施方案，柔性平面形式20中的单片可植入性材料 被施用于管状结构例如脉管100。预计可植入性材料可以施用于管状结构例如不包括血管 通路结构的脉管。例如，血管通路结构下游的静脉部分可能经历由血管通路结构形成或针 刺被处理的静脉部分上游的血管通路结构导致的炎症、血栓形成、再狭窄或闭塞增加。在这 种情况下，本发明的可植入性材料可以处理、控制和/或缓解这些发生于远离血管通路结 构的位置的病症。易流动性组合物中可植入性材料的递送
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总体考虎在为易流动件组合物时，本发明的可棺入件材料包括牛物相容件微粒 基质和细胞，优选内皮细胞，更优选血管内皮细胞，所述细胞的存活率为约90%，优选密度 为约0. 8 X IO4个细胞/mg，更优选约1. 5 X IO4个细胞/mg，最优选约2 X IO4个细胞/mg，并 且产生的条件培养基可含有硫酸乙酰肝素至少约0. 5-1. 0，优选至少约1. 0 μ g/106个细胞 /天，含有TGF-β 至少约200-300，优选至少约300pg/ml/天，含有b_FGF约200以下，优 选不超过约400pg/ml，并且显示前述抑制性表型。对于本发明的目的，易流动性微粒材料的施用通常局限于血管通路结构处或其相 邻位置或附近。可植入性材料的沉积部位是腔外。如本文所考虑，局部腔外沉积可以按照 下文完成。在尤其优选的实施方案中，使用适宜的针、导管或其它适宜的经皮注射型递送装 置，易流动性组合物首选经皮施用，进入血管周隙，然后沉积在腔外部位上。或者，用针、导 管或其它适宜的递送装置结合识别步骤促进向预期腔外部位的递送，用来经皮递送易流动 性组合物。识别步骤可以发生在经皮递送之前或同时进行。识别步骤可以用血管内超声、 其它常规超声、荧光透视和/或内窥镜检查等方法完成。识别步骤是任选进行的，并且不是 实施本发明的方法所必需的。易流动性组合物也可以在腔内给予，S卩，血管内施用。例如，组合物可以通过任何 能插入血管内的装置递送。在这种情况下，这种腔内递送装置装备有横穿或穿透装置，该装 置穿过血管腔壁并到达血管的非腔表面。然后易流动性组合物在血管通路结构部位的相邻 位置、或在该部位附近的血管的非腔表面上沉积。本文预计，非腔(也称做腔外)表面可以包括血管的外表面或血管周围的表面，或 者可以在血管的外膜、中膜或内膜内。为了本发明的目的，非腔或腔外是除了腔的内表面之 外的任何表面。本文考虑的穿透装置可允许例如单个递送点，或者以所需的几何构型布置的多个 递送点，从而在不破坏血管通路结构的条件下完成易流动性组合物向血管的非腔表面的递 送。多个递送点可以按例如圆形、牛眼形(bulls-eye)或者线阵等形式排列。穿透装置还 可以是支架穿孔器的形式，例如但不限于包括多个递送点的球囊支架。根据本发明的优选实施方案，穿透装置由血管通路结构部位的近端或远端的血管 内腔表面插入。在一些临床受试者中，在血管通路结构部位插入穿透装置可能破坏血管通 路结构和/或导致动静脉移植物或外周移植物裂开。因此，在这些受试者中，应小心地将穿 透装置插在与血管通路结构有一定距离的位置上，优选距离由临床医生根据眼前的特定情 况来确定。易流动性组合物优选沉积在血管的血管周围表面上，该表面位于要处理的血管通 路结构部位上，或在该血管通路结构部位的邻近处或附近。组合物可以在与血管通路结构 部位相关的各种位置沉积，例如，在近端吻合口，在远端吻合口，邻近任一吻合口，例如在吻 合口上游，在吻合口的反向血管外表面上。根据优选实施方案，相邻部位是离血管通路结构 部位约2mm至20mm内的位置。在另一个优选实施方案中，沉积部位在约21mm至40mm内。 在另一个优选实施方案中，沉积部位在约41mm至60mm内。在另一个优选实施方案中，沉积 部位在约61mm至IOOmm内。或者，相邻部位是任何由临床医生确定的其它相邻位置，在该 位置沉积的组合物能对接近血管通路结构的血管表现出预期效果。
在另一个实施方案中，易流动性组合物直接向手术暴露的腔外部位递送，该部位 与血管通路结构相邻，或在血管通路结构上，或在血管通路结构附近。在这种情况下，递送 的引导和指引通过直接观察该部位来完成。同样在这种情况下，可以同时使用上文所述识 别步骤对递送进行辅助。同样，识别步骤是任选的。腔外给予对于本发明的目的，易流动件组合物的施用局限于需处理的部位相邻 位置、该部位附近或该部位。如本文所考虑，局部腔外沉积可以按照下文完成。易流动性组合物用针、导管或其它适宜的递送装置经皮递送。或者，经皮递送易流 动性组合物结合使用引导方法可以使向需处理部位的递送更加容易。进入血管周隙后，临 床医生将易流动性组合物沉积在腔外部位，该腔外部位在需处理的该部位上、或与该部位 相邻、或在该部位附近。最理想地，经皮递送可以由常规超声法、荧光透视法、内窥镜检查法 等引导和指引。在另一个实施方案中，易流动性组合物向手术暴露的腔外部位局部递送，该部位 与需处理部位相邻，或在该部位上，或在该部位附近。在这种情况下，递送的引导和指引通 过直接观察需处理部位来完成。同样在这种情况下，可以同时使用上文所述其它引导方法 对递送进行辅助。适用于这种方式的易流动性组合物的例子公开于和本申请同一天提交的共同待
决的申请PCT/US_(也称作代理人案号ELV-008PC)中，其全部内容引入本文作为
参考；以及，与本申请同一天提交的共同待决的申请PCT/US_(也称作代理人案
号ELV-009PC)中，其全部内容引入本文作为参考。吻合口密封剂在某㈣其它实施方案中，本发明的易流动件组合物还可以作为特 定的吻合口密封剂或一般的手术密封剂。在这样一个双重目的的实施方案中，当与结构的 外表面接触时，或者以弧形应用于外表面，或者沿圆周方向使用时，该组合物还可以有效密 封两个或两个以上管状结构的接合点，或者密封管状结构中的空隙。这样的密封剂可以消 除对缝合的要求，所述缝合可以例如进一步损害血管组织，例如促使腔内皮损伤。这样的密 封剂还可以在吻合口附近提供额外的稳定性，从而加固任何缝合修补。所有必需的条件是， 该双重目的组合物的密封剂型性能不干扰或损害细胞的所需表型及该组合物基于细胞的 功能性的同时表达。为了某些密封剂实施方案的目的，易流动性组合物包括生物相容性基质，该基质 自身包括具有密封剂性能的组分，例如但不限于纤维蛋白网，同时还具有支撑内皮或内皮 样细胞群所需要的性能。还有，生物相容性基质本身可以同时具有密封剂性能和支撑细胞 群所需要的性能。在其它实施方案的情况下，密封剂功能可以至少部分地由细胞提供。例 如，预计与组合物结合的细胞产生能修饰底物的物质，从而使底物获得密封剂性能，同时还 显示/维持其必需的细胞功能性。某些细胞可以自然产生该类物质，而其它细胞可以通过 工程化产生该类物质。
实施例实施例1 人AV瘘研究本实施例提供了测试和使用包括血管内皮细胞的可植入性材料的优选实施方案 以增强瘘管成熟和/或预防瘘管成熟失败的实验方案。使用标准手术程序，在需要的解剖学位置制造动静脉瘘。然后将柔性平面形式的可植入性材料沉积在邻近手术制造的瘘管的 血管周隙；一个例示性程序的详细情况在下文中阐述。如前所述，可植入性材料的放置和构 型可以改变以适合临床情况。在本研究中，优选例示性柔性平面形式至少图示于图1或2A。下述实验和方案提供充分的指导1.评价动静脉瘘在3个月时的成熟失败。对于本研究，将成熟失败定义为，在造瘘后约12周内不能允许为透析进行重复瘘 管插管，和不能获得范围为35-500mL/min，优选至少350mL/min的充足的透析血流。实验中 必须使用标准临床试验管理规范。2.在5天、2周、1、3、6个月以及随后的时间点，用彩色血流多普勒超声术评价通路 流速和解剖学(狭窄面积百分数)。用彩色血流多普勒超声术测量在基线测量日(手术后第5天)和术后6个月时之 间绝对通路血流的减少量。以在6个月时用多普勒超声术测定与基线值(术后5天时的 值)的比较确定狭窄值。实验中必须使用标准临床试验管理规范。3.评价与使用同种异体细胞产物相关的HLA抗体反应。在术后5天、2周、1、3、6个月对供者HLA抗体的存在进行定量免疫学评价，并与术 前水平进行比较。实验中必须使用标准临床试验管理规范。具体地，本研究包括10位接受动静脉瘘手术的人尿毒症患者。手术后立即向这些 已经历AV瘘手术的患者施用两片(2) 1X4X0. 3(1. 2cm3)的柔性平面形式的实施方案；一 片(i)放置于吻合接合点，另一片纵向放置于吻合口远端的近静脉段。另外5位纳入本研 究的患者不接受植入物。这5位患者用于与标准护理进行比较。临床随访在第5天、2周以及在1、3、6个月进行。在第5天用彩色血流多普勒超声 术进行通路血流测量以建立基线水平，然后在术后2周、1个月、3个月和6个月时进行血流 测量。对表现出绝对血流小于约350mL/min，或血流比先前测量值减少大于25%，或狭窄面 积大于50% (用多普勒超声术测量)的患者行血管造影术。允许对经血管造影术确定狭窄 性病变大于50%的患者进行治疗性临床介入例如血管成形术。对12周内瘘管成熟失败的 患者进行影像诊断。允许用标准治疗性临床介入，包括血管成形术和手术结扎分支血管或 修正瘘管，对12周内成熟失败的瘘管的功能性成熟进行辅助。每位患者参与研究的期限为 6个月。因此，本试验总共入选15位患者。10位患者各接受两片植入物，另5位患者接受 标准护理，作为比较。接受血液透析用AV瘘置入的患者也可以入选本研究。根据下述研究设计，10位用本发明的可植入性材料处理的患者各自接受标准AV 瘘置入、药物处理、治疗和植入物。这些患者中的前5位接受两片柔性平面形式的植入物， 一片放置于吻合部位，另一片纵向放置于吻合口远端的近静脉段。在该第一组的最后一位 患者得到治疗之后，在治疗下一组之前，进行为期1个月的观察。从前5位患者的1个月的 数据中得到满意的评论之后，再开始后5位患者的处理。5位患者将入选本临床试验并接受标准AV瘘置入、药物处理和治疗，但不接受植 入物。这些患者用于与标准护理的比较，并接受与植入物处理的患者相似的影像术和免疫 学随访。根据标准手术技术进行常规AV瘘手术程序。在完成造瘘之后，植入之前，对流出静脉的直径进行测量。用无齿镊轻轻将平面形式的可植入性材料从漂洗杯中取出。在通路手术完成，通 过瘘管的血流建立，并且所有基线测量都已完成之后，施用可植入性材料。放置可植入性 材料之前，控制所有出血，使被处理区域尽可能地干燥。移植物放置之后，不冲洗该被治疗 区域。使用一片或两片可植入性材料处理吻合部位。另一片植入物用于处理吻合口远端的 近静脉段。在某些实施方案中，对端侧血管连接的处理通过将植入物的一端在吻合段下传 送，直至植入物的中部到达血管相遇的点来完成。然后两个末端缠绕缝合线，使可植入性材 料集中在缝合线上。对近静脉段(静脉-动脉吻合口远端)的处理通过将可植入性材料从 吻合部位开始顺着静脉的长度纵向放置来完成。可植入性材料不需要完全缠绕该静脉的圆 周。在AV瘘手术之后的医院康复过程中，对患者实施标准护理程序。密切监控生命体 征。记录伴随用药。告知患者必须在术后5天、2周以及1、3、6个月接受随访。在术后5天(基线日)、2周以及此后的1、3、6个月记录通路血流。在术后5天用 多普勒超声术测定狭窄度，建立基线水平，然后在术后2周、1、3、6个月再次测量，以进行比 较。在术后5天、2周以及1、3、6个月获取5cc全血样品，以提供用于测定抗HLA抗体水平 的血清。在术后5天(士24小时)用彩色血流多普勒超声术测定通路血流，确定基线测量 值，然后在术后2周(士2天)、1个月(士4天)、3个月(士7天)和6个月(士7天)再次 测定。对表现出绝对血流小于约350mL/min，或血流比其先前测量值减少大于25%，或狭窄 面积大于50% (用多普勒超声术测量)的患者行血管造影术。对经血管造影术确定狭窄性 病变大于50%的患者允许进行治疗性临床介入例如血管成形术。对12周内瘘管成熟失败 的患者进行影像诊断。允许用标准治疗性临床介入，包括血管成形术和结扎分支血管或修 正瘘管的手术，对12周内成熟失败的瘘管的功能性成熟进行辅助。这类介入术完成之后， 可以植入可植入性材料，以增强被修正瘘管的成熟和/或维持被修正瘘管的功能性，以及 抢救失败中或已失败的瘘管。AV瘘研究的预期结果预期经上文所述本发明的可植入性材料处理的患者将显 示出一种或多种增强瘘管成熟和/或预防瘘管成熟失败的指标。具体地，被治疗患者个体 将显示例如，血流量增加至足以适合透析的流量(例如，在35-500mL/min范围内，优选至少 350ml/min的血流)和/或反复为透析进行瘘管插管的能力得到提高。另一个瘘管成熟的 指标是静脉壁厚度，一个成功成熟或成熟中的瘘管显示静脉壁增厚。根据标准临床试验规 范，用血管内超声术(IVUS)测量静脉壁厚度。简而言之，用IVUS测量静脉壁厚度，并描述 内膜和中膜之间的厚度。向被处理的瘘管或对照瘘管插管，在靶静脉和动脉内放置超声探 针。又一个功能性瘘管的指标是足够的腔径。预计本发明的可植入性材料将允许维持足够 腔径，从而允许速率适合有效透析的不受阻血流，即，速率稍微大于透析机泵速的血流；或 者血流速率至少足以预防透析时再循环。在造瘘后第5天以及术后至少3个月时，分别用 血管造影术监控腔径。用标准多普勒超声方案将术后腔变窄与血流速率联系起来。预计可 植入性材料将预防或延迟阻止血流速率低于本文所述适于透析的速率的变窄。作为失败瘘 管的特征的腔变窄可能因为狭窄和相关内膜增厚而发生，或者可能由未发生任何相关增厚 的血管的收缩和/或挛缩所引起。在实际增厚的情况下，血管成形介入术是目前标准的临床手段，在例如由负性组织重塑引起的收缩和/或挛缩的情况下，扩张术是目前标准的临 床介入术。预计植入物处理的瘘管将不需要血管成形术或扩张术。预期被治疗患者组与对照组相比，在至少一种前述成熟的指标显示出至少增量式 的差异。实施例2 =AV移棺物动物研究本实施例提供了在动物试验对象中测试和使用本发明的优选实施方案以促进功 能性AV移植物形成的实验方案。使用标准手术程序，在颈动脉和颈静脉间制造AV移植物。 然后将可植入性材料设置在邻近各手术制造的AV移植物吻合口的血管周隙；一个例示性 程序的详细情况在下文中阐述。如前所述，可植入性材料的放置和构型可以改变。在本研 究中，柔性平面形式的可植入性材料图示于图4A、4B和4C中。具体地，本研究包括26只接受AV移植术的猪试验对象。传统的AV移植术按照标 准操作技术进行。在完成移植术，并建立通过移植物的血流后，将可植入性材料如下文所述 应用于AV移植吻合口及周围。对于每个接受AV移植术的试验对象，在试验对象的左颈总动脉和右颈外静脉之 间放置一个6毫米内径的PTFE移植物。用6-0的聚丙烯纤维缝线连续缝合，在移植物的各 端形成斜形端侧吻合口。所有试验对象均在手术中接受肝素，并在手术后每天给予阿司匹 林。10只试验对象在手术当日接受包括主动脉内皮细胞的可植入性材料。各试验对象 接受5片这样的植入物。两个吻合部位各缠绕2片植入物。在这种情况下，可植入性材料 的一端在吻合段下通过，直至植入物的中部到达导管和移植物接触的点。然后将两端缠绕 缝合线，使可植入性材料集中在缝合线上。使两端的重叠达最低限度，以确保材料就位。另 外的单片植入物从各试验对象的吻合口开始顺着近静脉段的长度纵向放置。该可植入性材 料不完全缠绕静脉的整个圆周。用可植入性材料缠绕吻合部位，例如，如图4A和4B所示的那样。此外，通过将可 植入性材料从吻合部位开始顺着静脉的长度纵向放置，从而处理近静脉段(静脉_动脉吻 合口的远端)，例如，如图4C所示的那样。10只试验对象在手术当日接受不含细胞的植入物对照，使该对照缠绕吻合部位并 放置在移植物的近静脉段上，例如，如图4A、4B和4C所示的那样。另外6只试验对象不接 受任何类型的植入物。这6只试验对象用于与标准护理的对照。总细胞载量根据体重为约 2. 5 X IO5个细胞/kg。预计该细胞载量约为下文所述人临床研究所用估计细胞载量的至少 6-10 倍。手术程序在颈部形成15cm的中线纵切口，分离左颈总动脉，然后分离右颈外静 脉。从周围组织中分离出8cm的静脉段，将该段静脉的所有属支用3-0的丝线结扎。夹闭左 颈动脉，行7mm直径的圆周动脉切开术。用6-0的聚丙烯纤维缝线连续缝合，在动脉和6mm 内径的PTFE移植物间形成斜形端侧吻合口。一旦吻合口形成，则去除动脉夹钳，用肝素-盐 水溶液冲洗移植物。确认有血流通过动脉进入移植物。然后在胸锁乳突肌下形成隧道，将 移植物送至右颈外静脉近端。直接在颈外静脉行7mm直径的圆周静脉切开术。然后用6_0的聚丙烯纤维缝线连 续缝合，在PTFE移植物和右颈外静脉间形成斜形端侧吻合口，完成动静脉移植术(移植物长度在15-25cm之间，置入时记录)。除去所有夹钳，确认有血流通过移植物。PTFE吻合口 远端的左颈动脉用3-0的丝线双重结扎。完成吻合术后，放置PTFE动静脉移植物以防止扭曲(kinking)。用23号蝴蝶针恰 好在颈动脉-移植物吻合口远端行PTFE动静脉移植物经皮插管。为确认已置入，用IOcc 注射器向该系统注入血液。然后用IOcc盐水冲洗该系统。然后将C型臂荧光镜置于研究 用动物的颈部上方，使静脉_移植物吻合口和静脉流出道显像。在连续的荧光镜透视下，注 入10-15CC碘化对比剂(Renograffin，全浓度)。记录并存储该血管造影，与处死前的血管 造影照片进行比较。完成血管造影术后，吻合部位用4" X4"的叠片纱布包裹。在移除叠片纱布并检 查吻合部位之前，维持吻合部位的压力约5分钟。如果由渗血证实仍未达到内环境稳态，则 再次包裹该部位5分钟。如果该部位出血严重，则在外科医生的判断下另外进行缝合。一 旦达到内环境稳态，则用无菌盐水充满颈部伤口，在远端静脉流出道用6mm的Transonic血 流探针进行血流探针分析。如果必要，则除去盐水，使吻合口尽可能干燥，并用包括主动脉 内皮细胞的可植入性材料或植入物对照处理吻合口。直到所有渗血得到控制，通过移植物 的血流得到证实，且该区域达到尽可能地干燥后，才用任一类型的可植入性材料对吻合部 位进行处理。上述处理完成后，分层缝合伤口，让动物从麻醉中苏醒过来。手术前，经团注给予肝素100U/kg，并经连续输注给予肝素35U/kg/h并持续至手 术结束。必要时给予额外的团剂量(bolus dose, 100U/kg)，以保持ACTs彡200秒。移棺物畅通率手术后立即用彩色血流多普勒超声和超声血流探针(Transonic Systems, Inc.，Ithaca, NY)进行通路流量测量，以证实AV移植物的通畅率，术后3-7天再 进行一次，此后每周进行一次。严密监控移植物的血流。病理学程序动物试验对象用戊巴比妥钠(65mg/kg，静脉注射)麻醉。暴露PTFE 移植物，对PTFE移植物及静脉吻合口进行数字摄像。然后用23号蝴蝶针在颈动脉-移植物 吻合口恰好远端行PTFE动静脉移植物经皮插管。为确认已置入，用IOcc注射器向该系统 注入血液。然后用IOcc盐水冲洗该系统。接着将C型臂荧光镜置于动物的颈部上方，使静 脉-移植物吻合口和静脉流出道显像。在连续的荧光镜透视下，注射10-15CC碘化对比剂 (Renograffin，全浓度)。在PTFE移植物的0°和90°记录血管造影。移植物通畅率和静 脉流出道的狭窄度通过盲读尸检血管造影照片，与置入后的血管造影照片进行配对比较来 确定。血管造影照片根据在血管造影照片观察到的狭窄度分成0-5级。采用的定级方案如 下0级=0%狭窄，1级=20%狭窄，2级=40%狭窄，3级=60%狭窄，4级=80%狭窄， 以及5级=100%狭窄。预计经本发明的可植入性材料处理的移植物在检查血管造影照片 后表现出与对照相比减小的狭窄百分数。组织学对半数的动物试验对象(5只细胞移植植入物的对象；5只对照植入物的 对象；3只未接受植入物的对象)在手术后3天实施安乐死。剩下的动物试验对象(5只细 胞移植植入物的对象；5只对照植入物的对象；3只未接受植入物的对象)在手术后1个月 实施安乐死。所有试验对象均进行有限的尸检，定义为施用部位的肉眼检查，包括所有吻合部 位和近静脉部位，以及周围组织包括引流淋巴结。对于所有术后1个月实施安乐死的试验 对象，收集并保存其主要器官包括脑、肺、肾、肝、心和脾的组织。只有当机体外表面的肉眼检查或施用部位及周围组织的显微镜检查中出现异常发现时，才对器官进行分析。任何出 现需要对主要器官进行进一步检查的异常发现的动物均不纳入本研究。将所有AV移植物吻合部位及周围组织，包括各吻合静脉和动脉的5cm段切除，用 10%福尔马林(或等同体)固定，并包埋在乙二醇甲基丙烯酸酯(或等同体)中。使用以 C型不锈钢刀(或等同体)切成约3μπι厚的切片，从至少三个区域制备该切片静脉-移 植物吻合口 ；移植物-动脉吻合口 ；以及静脉流出道。三个切片通过静脉-移植物吻合口横 切制备。五个切片通过静脉流出道制备(因此包括1.5cm的流出静脉)。三个切片通过移 植物-动脉吻合口以Imm间隔制备。将这些切片载于明胶涂布(或等同体)的载玻片上， 用苏木精和伊红或Verhoeff氏弹性蛋白染色剂染色。确定血管周围及血管腔炎症的急性(3天的对象)和慢性(1个月的对象)。急性 炎症的标志为粒细胞，主要是中性粒细胞，而慢性炎症的标志为巨噬细胞和淋巴细胞。此 外，切片也可以用下列特异性标记染色抗CD45用于识别白细胞，抗CD3用于识别T细胞， CD79a用于识别B细胞，以及MAC387用于识别单核细胞/巨噬细胞。检查染色后的玻片，对平滑肌细胞和内皮细胞的存在、以及动脉或静脉吻合口与 人工移植材料的整合的指标进行评分。对分离的组织的所有切片，包括每个静脉_移植物 吻合口、移植物_动脉吻合口及静脉流出道的移植材料、内膜/假性内膜、近血管腔的中膜 内部、近外膜的中膜外部以及外膜进行评价和评分。以微米为单位测量每个组织隔间例如 内膜、中膜和外膜的大小。各切片就下列各标准的存在和/或程度进行评价。炎症的评价 指标包括但不限于中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、巨细胞和浆细胞的存 在及程度。对移植物切片评价成纤维细胞、新生血管、钙化、出血、充血、纤维蛋白、移植物纤 维化和移植物渗透的存在。此外还对组织切片进行变性指标的评价，包括但不限于变性、弹 性蛋白缺失和/或组织部分缺失、平滑肌肌纤维空泡和/或组织钙化。还对组织切片评价 内皮细胞增殖、内膜下细胞增殖包括但不限于新生血管，以及平滑肌肌纤维、成纤维细胞和 纤维化的存在。每个被测量的组织切片还对组织坏死和异物的存在进行评价。每个变量均 按0-4的等级赋值(0 =无明显改变；1 =轻微；2 =轻度；3 =中度；以及4 =重度)。仅仅将来自1个月动物试验对象的其它动静脉移植物吻合口部位的切片载于载 玻片上并染色(Verhoeff氏弹性蛋白)，进行形态定量分析。采用计算机化的数字测面法 用视频显微镜和定制软件对每个切片的血管腔、中膜、内膜和血管总体积进行测量。测定每 个切片的内膜增生程度。一种量化内膜增生的方法是用血管壁总面积使内膜面积标准化 [(内膜，mm2)/(内膜+中膜，mm2)]，或者测定残余血管腔[(血管腔面积，mm2)/(血管腔+ 内膜，mm2)]。AV移植物动物对象的结果经上文所述本发明的可植入性材料处理的对象显示 出一种或多种临床功能性AV移植物形成的指标。按照本文公开的材料和方法处理的AV移 植物支持足以允许透析的血流速率。有效透析要求速率稍微大于透析机泵速的血流，或者 速率至少足以预防透析时再循环的血流。每个被处理的对象还显示出裂开(定义为吻合的 静脉或动脉从PTFE移植物分离)的发生减少，以及假体桥整合(定义为平滑肌细胞或内皮 细胞向假体桥腔内增殖和/或迁移)的改善。流出动静脉移植物静脉流出部位的血流与流 入移植物部位的血流是可比较的。本文用到的可比较的意思是就临床目的而言大体相似。 例如，需要的血流速率为约150-500mL/min，优选约300-500mL/min，更优选约350_400mL/mirio此外，将平滑肌细胞和/或内皮细胞向假体桥内的迁移作为整合的指标进行测 量。预计本发明的可植入性材料将促进平滑肌细胞增殖和内皮细胞增殖，以及这两者向桥 体内的迁移。通过PTFE移植物获取三个5 μ m的切片，对SMC肌动蛋白染色，识别SMC和因 子VIII(VOn Willebrands因子)和/或PECAM-I以识别内皮细胞。内皮细胞用显微镜检 查法/形态测定法和定制软件进行定量。又一个功能性AV移植物的指标是足够的腔径。本发明的植入物通过减少脉管狭 窄而能维持足够的腔径，从而能有速率适合有效透析的畅通血流，即，有效透析要求的速率 稍微大于透析机泵速的血流，或者速率至少足以预防透析时再循环的血流。在动静脉移植 术当日及恰在30天处死之前，用动静脉移植吻合口造影术监测腔径和狭窄百分比。用标准 多普勒超声方案将术后腔变窄与血流速率联系起来。与对照植入物相比，本发明的可植入性材料减少了受处理的吻合口狭窄的存在及 程度。本研究中每个被治疗试验对象的经血管造影术测定的狭窄百分比列于下表1中。平 均起来，由对照动物的46%到接受包含细胞的植入物的动物的2. 5%，可植入性材料平均 减少95%的狭窄([46-2. 5]/46X 100)。这些结果将从组织学上得到证实。这些研究表明， 本发明预防或延迟了使血流速率降低到低于适合透析的速率的窄化，从而提高了 AV移植 物吻合口的功能性。表IAV移植物研究总结
权利要求
包含细胞和生物相容性基质的可植入材料，用于治疗患者体内的动静脉瘘、动静脉移植物或者外周旁路移植物，所述治疗包括将所述可植入材料定位在所述瘘或移植物的外表面上的步骤，所述可植入性材料能够有效地促进所述瘘或移植物的正性重塑，由此实现血管扩张，同时抑制静脉新生内膜增生。
2.权利要求1的可植入材料，其中所述细胞是内皮细胞或具有内皮细胞样表型的细胞。
3.权利要求1或2的可植入材料，其中所述生物相容性基质是柔性的平面材料。
4.权利要求3的可植入材料，其中所述生物相容性基质设计成用于在吻合口植入。
5.权利要求4的可植入材料，其中所述生物相容性基质限定了狭槽或者设计成附图1 或2A中的形式。
6.权利要求1或2的可植入材料，其中所述生物相容性基质是易流动性组合物。
7.权利要求6的可植入材料，其中所述生物相容性基质是形状保持的易流动性组合物。
8.上述权利要求任一项的可植入材料，其中所述动静脉瘘是自体动静脉瘘。
9.上述权利要求任一项的可植入材料，其中所述动静脉瘘是桡头瘘、头臂瘘、或臂贵要瘘。
10.上述权利要求任一项的可植入材料，其中所述生物相容性材料向所述动静脉瘘或 移植物的施用在治疗剂给药之后或同时进行。
11.上述权利要求任一项的可植入材料，其中所述生物相容性材料向所述动静脉瘘或 移植物的施用在物理扩张之后进行。
12.上述权利要求任一项的可植入材料，包括将所述可植入材料布置在所述动静脉瘘 或移植物的外表面，位于所述动静脉瘘或移植物的静脉流出区域、静脉流出区域相邻位置 或静脉流出区域附近处的步骤。
13.包含细胞和生物相容性基质的可植入材料，用于治疗患者体内的动静脉瘘、动静脉 移植物或者外周旁路移植物，所述治疗包括将所述可植入材料定位在所述瘘或移植物的外 表面上的步骤，所述可植入性材料能够有效地促进所述瘘或移植物长期通畅率。
14.包含细胞和生物相容性基质的可植入材料，用于治疗患者体内的动静脉瘘、动静脉 移植物或者外周旁路移植物，所述治疗包括将所述可植入材料定位在所述瘘或移植物的外 表面上的步骤，所述可植入性材料能够有效地促进通过并流向所述瘘或移植物的下游的正 常或接近正常的血流速率。
15.权利要求14的可植入材料，其中所述血流速率是足以进行血液透析的速率。
16.权利要求14的可植入材料，其中所述血流速率是在血液透析中足以预防再循环的 速率。
17.权利要求14、15或16的可植入材料，其中在所述瘘或移植物的流出区域的血流速 率基本上与所述流出区域上游的血流速率相似。
18.权利要求14、15或16的可植入材料，其中所述血流速率是大约150-500ml/min。
19.权利要求14的可植入材料，其中所述外周旁路移植物的血流速率是足以维持外周 循环的速率。
20.权利要求13-19中任一项的可植入材料，其中所述细胞是内皮细胞或具有内皮细胞样表型的细胞。
21.权利要求13-20中任一项的可植入材料，其中所述生物相容性基质是柔性的平面 材料。
22.权利要求21的可植入材料，其中所述生物相容性基质设计成用于在吻合口植入。
23.权利要求22的可植入材料，其中所述生物相容性基质限定了狭槽或者设计成附图 1或2A中的形式。
24.权利要求13-20中任一项的可植入材料，其中所述生物相容性基质是易流动性组 合物。
25.权利要求24的可植入材料，其中所述生物相容性基质是形状保持的易流动性组合 物。
26.权利要求13-25中任一项的可植入材料，其中所述动静脉瘘是自体动静脉瘘。
27.权利要求13-26中任一项的可植入材料，其中所述动静脉瘘是桡头瘘、头臂瘘、或臂贵要瘘。
28.权利要求13-27中任一项的可植入材料，其中所述生物相容性材料向所述动静脉 瘘或移植物的施用在治疗剂给药之后或同时进行。
29.权利要求13-28中任一项的可植入材料，其中所述生物相容性材料向所述动静脉 瘘或移植物的施用在物理扩张之后进行。
30.权利要求13-29中任一项的可植入材料，包括将所述可植入材料布置在所述动静 脉瘘或移植物的外表面，位于所述动静脉瘘或移植物的静脉流出区域、静脉流出区域相邻 位置或静脉流出区域附近处的步骤。
全文摘要
本发明公开的是包含生物相容性基质和细胞的可植入性材料，当其向血管通路结构提供时，通常可以提高功能性。例如，本发明的可植入性材料可以增强动静脉自体瘘的成熟，并延长瘘管处于适合透析的成熟的功能性状态。此外，本发明可以促进适于透析的功能性动静脉移植物的形成，并促进功能性外周旁路移植物的形成。可植入性材料可以设计成适于在吻合口或动静脉移植物处、其相邻位置、或其附近植入的柔性的平面形式或者具有形状保持不变特性的易流动性组合物。根据本文公开的方法，可植入性材料向血管外表面提供。柔性平面形式的某些实施方案限定了狭槽。本发明的材料和方法包括细胞，优选内皮细胞或具有内皮细胞样表型的细胞。
文档编号A61L27/38GK101940801SQ20101027589
公开日2011年1月12日 申请日期2005年12月6日 优先权日2004年12月8日
发明者史蒂夫·博林杰, 埃拉扎尔·埃德尔曼, 斯科特·埃珀利, 海伦·玛丽·纽金特, 阿努帕姆·达拉尔 申请人:渗透治疗有限公司