中国南海线纹芋螺毒素s4.3的制备及应用的制作方法

专利名称：中国南海线纹芋螺毒素s4.3的制备及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的中国南海线纹芋螺神经毒素基因及其编码的多肽S4. 3和该 多肽的制备技术，以及该多肽在制备促细胞生长工具药中的应用。
背景技术：
芋螺(Genus Conus)是一类分布广、种类多的海洋生物。芋螺亦称鸡心螺，但由于 其外壳呈圆锥形且具有美丽花纹，成芋头状而得名“芋螺”。在分类学上，芋螺属于软体动物 门，腹足纲，前腮亚纲，新腹足目，芋螺超科，芋螺科。芋螺多数生活在太平洋和印度洋等热 带海洋中的浅水区，少数在水深几米至200余米的深水区。白昼或退潮后在海藻下或珊瑚 洞中栖息，夜晚外出觅食，春夏繁殖。目前全世界发现的芋螺超过700种，其中我国热带和亚热带海域目前已经有详细 记录的芋螺有70余种，主要分布在南沙群岛、西沙群岛、海南岛南部及台湾海域，少数在广 东、广西及海南沿海，其中部分种类为我国首次记录。芋螺按其食性可分为三大类食鱼性芋螺(piscivorous)，食软体动物性芋螺 (molluscivorous)和食虫性芋螺(vermivorous)。其中食虫性芋螺种类最多，占全部芋螺 种类的70%左右，而食鱼性芋螺虽然占芋螺总数最少，但毒性最强，至今为止报道的芋螺致 死事件基本上是由该类芋螺造成的。芋螺毒素(conotoxin，CTX)是一类来源于芋螺毒液的活性多肽，对芋螺自身而 言，这些毒素主要用于捕食和防御。一般来说，每一种芋螺体内都含有50-200种不同的芋 螺毒素，整个自然界中大约存在50，000-100, 000种不同的芋螺毒素。而迄今为止，只有很 少一部分的芋螺毒素被人类所发现，而具有确定功能的毒素则不足200个。芋螺毒素一般 具有以下几个特点(1)序列短分子量小。80%以上的毒素序列在7-41个氨基酸之间，分 子量在5kDa以下。(2)结构致密稳定。由于芋螺毒素富含半胱氨酸，半胱氨酸的配对成键 决定了芋螺毒素的基本构型，并使芋螺毒素形成致密而稳定的结构。(3)在一级结构上，半 胱氨酸之间的序列是高度可变的。(4)靶点广泛但特异性强。芋螺毒素的靶点主要包括各 种电压门控的离子通道(如钠、钾、钙等离子通道)和神经递质受体(乙酰胆碱受体、NMDA 受体及G蛋白偶联受体等)，而一种毒素一般只作用于某受体的一到几个亚型，特异性强。早在20世纪早期，人们就已经开始对芋螺的毒管装置进行解剖学方面的研究。而 随着之后60多年的深入探索，人们发现了越来越多的具有不同生物活性的芋螺毒素。当人 们对这些毒素进一步研究后惊奇地发现，芋螺毒素本身就是一个天然的庞大的药源宝库， 各种芋螺毒素在治疗慢性顽固疼痛、急性疼痛、癫痫、神经保护、心血管疾病、精神失常、运 动失调、痉挛症、癌症及中风等疾病方面都具有广阔应用前景和潜在开发价值。因此，开展 我国南海芋螺毒素的生化、生理、药理、尤其是分子生物学和基因工程领域的探索研究，以 及开展芋螺毒素体外表达技术的研究，对于推动我国多肽科学的发展，促进多肽药物的开 发，具有不容忽视的理论价值和应用价值。

发明内容
本发明的目的在于提供一种新的中国南海线纹芋螺毒素基因及其编码的多肽 S4. 3。本发明的另一个目的是提供一种新的重组表达载体PTRX-S4. 3。本发明的再一个目的是提供一种新型的多肽高效表达方法，从表达、分离和纯化 几个方面对原有的多肽表达方法进行改良。本发明的第四个目的在于提供该多肽在制备促细胞生长药物中的应用。
本发明使用的线纹芋螺采自中国海南省三亚市。本发明通过构建cDNA文库和测序的方法，从中国南海线纹芋螺毒管中分离得到 新的A-超家族芋螺毒素基因。本发明将上述目的基因的cDNA序列分拆为3对互补序列，作为模板母链使用六段 引物通过PCR扩增出全长的线纹芋螺毒素基因，并在该基因的5’端和3’分别加入了限制 性内切酶Kpn I和Not I的酶切位点(TAA)，另外在5’端加入了肠激酶Enterokinase的识 别位点，在3’端还加入了两个终止密码子。目的基因的核苷酸序列如序列表中<400>1序 列所示。上述基因所编码的多肽S4. 3，其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示。本发明利用Kpn I和Not I双酶切法对pTRX_IL10质粒进行线性化制备，切除ILlO 片段，得到线性化的PTRX载体，同时将上一步PCR扩增得到的目的基因的Oligo片断进行 磷酸化、退火与互补配对，然后将配对好的目的基因与PTRX载体进行连接，构建出重组表 达载体PTRX-S4.3并将其转入大肠杆菌DH5ci中进行扩增。将扩增后测序正确的重组表达 载体PTRX-S4. 3转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达。通过对培养条件的探索和优化， 得到的重组融合蛋白的表达量较高，表达量为10mg/L菌液。本发明还优化了重组融合蛋白的酶切和纯化方法，表达产物的超声裂解液采用 QIAGEN公司的Ni-NTA Superflow填料，以Ni2+为配体进行亲和层析，得到融合蛋白粗提产 物，该粗提产物再经EK酶酶切、层析过滤和反相高效液相层析纯化，可得到高纯度的多肽 S4. 3。本发明获得的多肽S4. 3具有促进细胞生长的生物学活性。原核表达的多肽 S4. 310 μ M刺激实验肿瘤细胞3株系及乳腺上皮细胞1株系作为对照，经MTT法检测细胞生 存率结果证实，在作用36h后实验组细胞的数量与对照组相比有明显增加。因此，本发明的 多肽S4. 3可用于制备促进细胞生长药物。


图1线性质粒载体pcDNA3-SfiI的制备图2线纹芋螺毒管双链cDNA 1. 琼脂糖凝胶电泳结果图3线纹芋螺毒管cDNA文库总质粒PCR扩增1 %琼脂糖电泳结果
图4线纹芋螺毒管cDNA文库部分重组子PCR分析结果图5线纹芋螺毒管cDNA文库可读序列长度分布图6线纹芋螺毒管cDNA文库基因簇中所含有的ESTs数目的分布情况图7线纹芋螺毒管cDNA文库ESTs分类
图8线纹芋螺毒管cDNA文库中毒素序列分类图9表达质粒pTRX的物理图谱和多克隆位点
图10重组表达载体pTRX-S4. 3构建程序示意IlHPLC纯化中国南海芋螺毒素多肽S4. 3实验12线纹芋螺毒素多肽S4. 3质谱13为10 μ M S4. 3作用于Hela细胞36h的细胞形态图。图13a为正常Hela细 胞培养36h图，图13b为加IOuM S4. 3后Hela细胞培养36h图。图14MTT检测细胞生存率图
具体实施例方式下面通过实施例，对本发明的技术方案作进一步说明实验例1 中国南海线纹芋螺毒管cDNA文库的构建和鉴定1)材料11组织样品线纹芋螺(Conus Straitus)采自中国海南三亚。1. 2质粒和菌株质粒载体pcDNA3购自Invitrogen公司大肠杆菌(Escherichia coli)DH5a由中山大学生命科学学院医药分子生物学实 验室保存，其基因型为DH5a :SupE44A lac U169 ( Φ 801acZ Δ M15) hsdR17recAlendAlgyrA96thi-lrelAl1.3RNA提取试剂DEPC水每IOOOml去离子水中加入Iml DEPC，终浓度为0. 1 %，充分混勻，37°C过 夜后，高压灭菌。1. 4缓冲液1. 4. 1碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA所用缓冲液溶液I :50mM 葡萄糖，IOmM EDTA, 25mM Tris-HCl (ρΗ8· 0)；溶液II 0. 2Ν NaOH，1. 0% SDS，使用前配制；溶液III :60ml 5M乙酸钾，11. 5ml冰乙酸，28. 5ml H2O,所配成的溶液中钾离子的 浓度为3M，乙酸根的浓度为5M ；TE IOmM Tris-HCl (ρΗ7· 4、ρΗ7· 6、ρΗ8· 0)，ImM EDTA (ρΗ8· 0)；STE :50mM Tris-HCl(pH 8. 0)，5mM EDTA(pH8. 0)，50mM NaCl ；STE (含溶菌酶)50mM Tris-HCl (pH8. 0), 5mM EDTA (ρΗ8. 0), 50mMNaCl, 70 μ g/ml 溶菌酶；10% SDS 在900ml水中溶解IOOg电泳级SDS，加热至68 °C助溶，加水定容至 1，OOOml分装备用；1. 4. 2PEG法提取质粒所用缓冲液5M LiCl 30. 205g LiCl · H2O 溶于水，定容至 100ml，高压灭菌。13% PEG8000 含 13% (w/v)PEG8000 的 1. 6M NaCl 溶液，过滤除菌。IOM乙酸铵把770g乙酸铵溶解于800ml水中，加水定容至1，OOOml后，过滤除菌。
1. 4. 3琼脂糖凝胶电泳缓冲液50 X TAE :242g Tris，57. Iml 冰乙酸，18. 6g EDTA，定容至 1，OOOml。EB溶液100ml水中加入Ig溴化乙锭，磁力搅拌数小时至完全溶解，分装，室温避
光保存。 DNA加样缓冲液0. 25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，50%甘油(w/v)。RNA甲醛变性胶加样缓冲液0. 25%溴酚蓝，0. 25%二甲苯青，ImM EDTA(pH8. 0)， 50%甘油(w/v)，用DEPC水配制，高压灭菌备用。5 X 甲酸变性胶电泳缓冲液0· IM MOPS (ρΗ7· 0)，40mM 乙酸钠，5mM EDTA (ρΗ8· 0)， 用DEPC水配制，过滤除菌，室温避光保存。淡黄色缓冲液可正常使用，深黄色应弃用。甲醛变性胶的制备0. 336g琼脂糖溶于20ml DEPC水中，冷却至60°C，加入5ml 5X甲醛变性胶电泳缓冲液和5. 5ml的甲醛，在通风橱内灌注凝胶，冷却30min后使用。甲醛变性胶RNA样品的制备适量RNA，5X甲醛变性胶电泳缓冲液0. 5 μ 1，甲醛 0. 7 μ 1，甲酰胺2μ 1，65°C加热15min，迅速冰浴，加1μ 1上样缓冲液和少量ΕΒ。1.4.4转化缓冲液IOOmM CaCl2 :1.47g CaCl2 · 2H20 溶于去离子水，定容至 100ml，过滤除菌，4°C保存。1. 5培养基LB 液体培养基:Tryptone (蛋白胨)10g，Yeast Extract (酵母提取物)5g, NaCl 10g，加入800ml去离子水，用5M NaOH调节pH至7. 2-7. 5，定容至1，000ml，分装高压灭菌，
4°C保存。LB固体培养基在LB液体培养基中加入菌用琼脂粉至终浓度为1. 3-1. 5%，高压 灭菌，灌注平板后4°C保存。SOB 培养基Tryptone 20g, Yeast Extract 5g，NaCl 0. 5g，力口入 800ml 去离子水， 加入250mMKCl溶液10ml，用5M NaOH调节pH至7. 2-7. 5，定容至1，000ml，高压灭菌，4°C保 存，使用前加入5ml灭菌的2M MgCl2溶液。SOB固体培养基含20mM MgSO4及1. 3-1. 5%的琼脂粉的SOB培养基，高压灭菌， 灌注平板后4°C保存。SOC培养基S0B培养基高压灭菌后，当温度降至60°C以下时，加入20ml过滤除菌 的IM葡萄糖溶液，4°C保存。2X YT =Tryptone 16g, Yeast Extract 10g，NaCl 5g，力口入 800ml 去离子水，用 5M NaOH调节pH至7. 2-7. 5，定容至1，000ml，高压灭菌，4°C保存。1. 6试剂和酶TRIZOL LS 试剂购自 Gibcol BRL 公司；SMART cDNA Library Construction
Kit 为 CL0NTECH 公司产品；Gel Extraction Kit 和 Plasmid Miniprep Kit 购自 OMEGA BIOTEK 公司；Vitagene 96-easy plasmid Mini-prep Kit 购自 Vitagene Biochemical Technique 公 司；ABIPRISM Big-DyeTM Terminator v3. OReady Reaction Cycle Sequencing Kit购自 Applied Biosystems 公司；Bacto tryptone禾口Bacto yeast extract 购自OXOID公司；dNTP、RNaseA、DEPC、M0PS、重蒸酚和氨苄青霉素钠盐购自上海生工生物工 程公司；Taq DNA聚合酶、各种限制性内切酶和T4DNA Ligase购自^ffiB公司；DNA ladder购自 Promega 公司；T7promoter sequencing primer、SP6promoter sequencing primer 等引 物由上海博亚公司合成；其它试剂均为国产分析纯试剂。1. 7其它溶液
氨苄青霉素溶液用无菌去离子水配成100mg/ml，分装，-20°C保存，工作浓度为 ΙΟΟμ g/ml。RNaseA 溶液将 RNaseA 溶于 IOmM Tris-HCl (ρΗ7· 5)，15mM NaCl 溶液中，配成 10mg/ml的贮存浓度，100°C加热15min，缓慢冷却至室温，分装后在_20°C保存备用。50%甘油用去离子水配制50% (w/w)甘油，高压灭菌后备用。dNTP 用灭菌超纯水配制，分别含IOmM的dATP、dTTP、dCTP、dGTP，分装后在_20°C 保存备用。T7和SP6引物用灭菌超纯水将引物配成50ρπιΟ1/μ 1的溶液，分装后在-20°C保
存备用。2)方法2. 1线纹芋螺毒管组织的处理取活螺体，使用喉闸破碎螺壳，暴露出螺肉，冰上小心并快速分离毒管组织，称重 后迅速放入液氮并充分研磨，加入15倍重量体积的TRIZOL LS试剂(即Ig组织中加入
15ml)，冰浴中充分勻浆，-80°C冰箱中保存以备提取总RNA。2. 2总RNA的提取参照Gibcol BRL公司的TRIZOL LS试剂说明书进行。取50_100mg组织样品，
用0. 75ml TRIZOL LS试剂勻浆，15-30°C静置5min。然后加入0. 2mL氯仿，剧烈振荡15 秒后，15-30°C静置2-15min。4°C、12，OOOrpm离心15min，取上层水相。加入0. 5ml异丙醇， 15-30°C静置IOmin后，4°C、12，OOOrpm离心lOmin，弃上清。再加Iml 75%乙醇漂洗沉淀， 5，OOOrpm离心5min，弃上清，真空干燥去除样品中痕量的乙醇，加入适量无RNase的去离子 水。取1 μ 1进行1 %甲醛变性胶电泳，1 μ 1用紫外分光光度计分别测定样品在260nm、280nm 波长上的光密度及初步估算RNA的纯度，_20°C保存备用。2. 3 RNA甲醛变性胶电泳加样前，甲醛变性胶先预电泳5min，电压降为5v/cm ；随后将样品加至凝胶孔，可 用已知大小的RNA作分子量标准参照物，按3-4v/cm的电压进行电泳；紫外灯下观察电泳结^ ο2. 4碱裂解法提取质粒DNA从平板中随机挑选转化DH5 α单菌落于含Amp (终浓度为100 μ g/ml)的LB液体培 养基中，37°C、225rpm振荡培养过夜。取1. 5ml菌液于离心管中，4°C、12，OOOrpm离心lmin， 弃上清，用Iml STE溶液悬浮细菌沉淀，4°C、12，OOOrpm离心lmin，弃上清，加100 μ 1预冷 的溶液I重新悬浮菌体，室温放置5min，加入200 μ 1现配的溶液II，轻缓混勻，冰上放置 5min，再加入150 μ 1溶液III，温和颠倒震荡10s，冰上放置3_5min，4°C、12，OOOrpm离心 5min，取上清，用等体积酚/氯仿/异戊醇(25 24 1)及氯仿/异戊醇(24 1)各抽提 一次；水相加1/10体积3M NaAc (pH5. 2)和2倍体积预冷的无水乙醇，颠倒混勻，室温放置 IOmin, 12，OOOrpm离心5min，弃上清，再加Iml 75%乙醇漂洗沉淀，12，OOOrpm离心5min，弃上清，室温干燥lOmin，加适量含RNaSeA(20ii g/ml)灭菌去离子水或TE缓冲液溶解，_20°C保存。2. 5PEG沉淀法纯化质粒DNA随机挑取转化菌落接种于50ml含Amp (终浓度为100 u g/ml)的LB液体培养基中， 37°C震摇培养过夜；取50ml细菌培养物，5，000rpm，4°C离心5min ；用10ml STE重新悬浮菌 体；5, 000rpm，4°C离心5min ；菌体重悬于3ml的溶液I中，加入6ml新配的溶液II，颠倒混 和均勻，冰浴5min ；加入4. 5ml溶液III，温和地颠倒5次，冰浴15min ；5, 000rpm，4°C离心 30min ；将上清转移至新的离心管中，加入0. 6倍体积的异丙醇，室温放置lOmin ；5, OOOrpm, 室温离心20min ；去上清，用75%乙醇洗涤沉淀，5，OOOrpm，室温离心lOmin ；去乙醇残液，沉 淀于室温干燥后，用1.5ml TE溶解；转移至7ml离心管中，加入等体积预冷的5M LiCl溶液， 充分混勻；10，OOOrpm，4°C离心lOmin ；将上清转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇， 混和均勻后室温放置lOmin ；室温10，OOOrpm离心lOmin ；去上清，用75%乙醇洗涤DNA沉 淀；室温10，OOOrpm离心lOmin ；去除乙醇残液，沉淀在室温干燥；DNA沉淀用700 u 1TE溶解 后转移到1. 5ml离心管中，加入RNaseA至终浓度为20ii g/ml，室温放置30min ；加入等体积 的13% PEG8000溶液，充分混勻，室温放置lOmin ；室温12，OOOrpm离心lOmin ；去上清，沉 淀用500 yl TE充分溶解，经等体积的酚氯仿异戊醇(25 24 1)及氯仿异戊醇 (24 1)各抽提一次后，将水相转移至新的离心管中，加入1/4体积的10M乙酸铵和2倍体 积预冷的无水乙醇，颠倒混勻后室温放置lOmin ；室温，12，OOOrpm，4°C离心lOmin ；去上清， 沉淀用1ml 75%乙醇洗涤；4°C 12，OOOrpm离心5min ；去除乙醇残液，沉淀室温干燥片刻， 加入适量的灭菌去离子水或TE缓冲液，-20°C保存备用。2. 6线性质粒载体pcDNA3_SfiI的制备pcDNA3-SfiI质粒是经过本实验室改造的载体，改造过后在pcDNA3载体中引入了 新的Sfil酶切位点(图1)。PEG沉淀法提取并纯化pcDNA3-SfiI质粒，经限制性内切酶 Sfil酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳。按0MEGABI0TEK公司的Gel Extraction Kit说明书操 作，胶回收上述酶切线性载体DNA。重复酶切和回收操作各一次，线性载体DNA以50ng/ia 浓度保存备用。2. 7线纹芋螺毒管CDNA的合成按CL0NTECH 公司 SMART cDNALibrary Construction Kit 说明书操作。其原理 是利用真核生物mRNA 5’端的甲基化G(m7G)且5’ -5’三磷酸键连接的特殊的帽子结构和 3’端的PolyA尾的特点设计锚定引物，分别进行第一链合成，LD PCR cDNA高保真扩增，酶 切消化和柱回收cDNA，从而实现富集全长cDNA的目的。2. 7. lcDNA 第一链的合成在5 ill反应体系中加入下列组分(冰上操作)1 P g总RNA，SMART III olignucleotide和CDS 111/3，PCR引物各lu 1,以超纯水补齐体积，混勻，短暂离心。 72 °C温育2min，冰浴2min，短暂离心，使混合物集于管底。再依次加入2 ill 5 X Fir st Strand Buffer>1 U 1 20mmol/L 的 DTTU U 1 lOmmol/L 的 dNTP Mix 禾口 1 ii 1 PowerScript RT(CLONTECH)后轻弹管壁，混勻并短暂离心。置PCR仪42。C反应lhr逆转录合成第一链， 冰浴终止反应，-40°C保存。2. 7. 2LD PCR 扩增 cDNA 第二链
在lOOiil的反应体系中加入下列组分2iU第一链产物，10 X Advantage 2PCR Buffer 10 u l,50XdNTPs Mix 2 ii 1，20 ii mol/L 上下游锚定引物各 2 ii 1，50XAdvantage 2Polymerase Mix 2u 1和超纯水80 u 1补齐体积，混勻，放入预热至95°C的PCR仪，运行如 下反应程序95°C变性lmin后，继续循环程序95°C 15sec、68°C 6min共18个循环，冷却至 4°C后取5 ill PCR产物用1 %琼脂糖凝胶电泳检测。剩余PCR产物于-20°C保存。2. 7. 3蛋白酶K消化在50iU 上一步的 PCR 产物(2-3 iig dscDNA)中加入 蛋白酶 K(20 y g/yl) 灭活DNA聚合酶，45°C温育20min，再经酚/氯仿/异戊醇(25 24 1)和氯仿/异戊 醇(24 1)混合液各抽提一次，取上清，加入10 iU3M乙酸钠，1.3 ill糖原(20 yg/ill)， 260 ill室温放置的95%乙醇，室温14，OOOrpm离心20min，用80%乙醇洗涤沉淀，空气干 燥，加入79 yl去离子水充分溶解沉淀。2. 7. 4SfiI 酶切消化在100iil 酶切体系中加入下列组分79ii 1 的 dscDNA，10 ii 1 lOXSfil Buffer, lu 1 100XBSA和lOiil Sfil内切酶。充分混勻，短暂离心。50°C温育2hr后，加入2iil
的二甲苯腈蓝混勻。2. 7. 5cDNA的分部柱回收将上一步酶切消化好的dscDNA上样到预处理好的CHR0MASPIN-400柱，分管收 集大小不一的dscDNA，每管1滴，当收集完16滴后，盖上柱子上盖；从每支收集管中取出 5ul样品进行电泳检测，琼脂糖凝胶电泳确定符合要求的收集管号，集中后加入0. 1倍 体积的3M NaAc (pH4. 8)U. 3u 1的20mg/ml糖原及2. 5倍体积的95%乙醇，-20°C放置 沉淀过夜；室温14，OOOrpm离心20min ；吸去上清，沉淀用80%乙醇洗涤，室温14，OOOrpm 离心5min，吸去上清，沉淀在空气中干燥lOmin左右；用去离子水溶解干燥后的 dscDNA, -20°C保存备用，也可直接与载体连接。2. 7. 6dscDNA与载体的连接建立如下三个连接反应体系经Sfil酶切的pcDNA3_SfiI载体DNA(50ii g/ ill)各取 1 yl，dscDNA 分别取 0.5、1.0、1.5iil，10X 连接缓冲液 lyl，T4DNA 连接酶 (lOOunits)O. 5iU，加无菌去离子水至体积为lOiU，设定自连对照反应体系，16°C连接 16hr，以确定最佳比例。2. 7. 7线纹芋螺毒管CDNA文库的电转化DH5a电转化感受态细胞的制备37°C划线活化的E. coli DH5 a，挑取1个单菌 落，接种到LB培养基中37°C剧烈震荡培养过夜。次日取新鲜LB液体培养基，按1 100的 比例扩大培养至0D_ = 0. 6。将菌液迅速冰浴，30min后，4°C、4，800rpm离心lOmin收菌， 弃上清，分别用等菌液体积和一半体积的超纯水洗涤菌体一次，每1升菌液以300 yl 10% 甘油重悬，按每管40iU分装。连接产物电转化DH5a感受态细胞每40iU菌液加入1 yl连接产物或对照质 粒溶液，混勻，转入电转化杯，冰浴不超过5min，用卷纸擦干外壁，马上置于BioRad电穿孔 仪进行电转化，电转化参数电压2. OkV ；电流25 ii F ；电阻200 Q ；电激时间4. 5mS。电击 后立刻与800 yl 37°C预热的SOB培养基混合，用枪混勻，尽量吸出杯内菌液，装于干净无 菌的离心管中。37°C、225rpm复苏细胞lhr，涂布于Amp+的LB平板上，37°C培养箱中倒置培养12-16hr。转化产物则被分为两部分，其中一部分作为cDNA文库总库保存于25%甘油 中，_80°C冻存；另一部分涂平板，4°C存放备用。2. 7. 8cDNA克隆序列测定
随机挑取单克隆菌于96孔培养板中(孔中加有含Amp的培养基Iml)，塑料粘纸封 住板口，于摇床中37°C震荡培养过夜。次日取100 μ 1菌液加100 μ 1 50%的甘油于96孔 细胞培养板中保种，每板两份。一份用于测序，另一份_20°C保存备用。利用Vitagene 96-easy plasmid Mini-prep Kit 提取线纹芋螺毒管 cDNA 文 库质粒。操作过程依照试剂盒说明书进行。琼脂糖凝胶电泳检测质粒浓度，以T7序列 (5，-TAATAC GAC TCA CTA TAG GGA-3，)为测序引物，依照 Applied Biosystems 公司提供 白勺 ABI PRISM Big-DyeTM Terminator v3. OReady Reaction Cycle Sequencing Kit 10M 书进行5’端单向序列测定。在10μ 1的反应体系中加入下列组分5XSequencing Buffer 2μ 1, Reaction Mix 1 μ 1，质粒模板 200ng，T7 引物(3. 2pmol/μ 1) 1 μ 1 和灭菌去离子水 补齐体积，混勻反应物，放入预热至96°C的PCR仪，运行如下反应程序96°C 10s, 50°C 5s, 60°C 4min，循环30次，冷却至4°C后取出反应产物。将反应产物转入96孔PCR纯化板，力口 入70 %乙醇90 μ 1，封上粘膜，震荡器上震荡混勻，室温避光放置20min，4°C、4，OOOrpm离 心40min，弃上清，再倒置PCR板(PCR板下垫有纸巾)，4°C、300rpm离心30sec，去掉痕量乙 醇。避光室温干燥30min，用10 μ 1灭菌去离子水溶解沉淀。采用Perkin Elmer公司的ABI PRISM 3700自动测序仪进行序列测定。2. 7. 9序列分析和同源检索测序结果输入实验室数据库，利用计算机程序去除各测序结果所含的载体 序列，对确定的序列进行拼接，并将相同的EST序列聚类。然后，分别应用BLASTX 禾口 BLASTN(http://www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)搜索 National Center for Biotechnology Information(NCBI)的核酸和蛋白序列数据库，进行序列相似性分析和检 索同源序列。利用CLUSALW进行序列比较，及DNAT00LS 6. 0分析序列开放读码框。通过网 站http://WWW. cbs. dtu. dk/services/SignalP并结合文献分析预测蛋白信号肽序列。3)结果与分析3. 1线纹芋螺毒管RNA的提取用TRIZOL LS试剂提取的线纹芋螺毒管总RNA，1 %甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检
测，显示样品总RNA完整性良好。测得OD260 = 0. 100，OD280 = 0. 056，根据公式总RNA浓度 (μ g/ml) = A26tl X 30 (稀释倍数)X 40，计算出总RNA的浓度约为120μ g/ml ；总RNA样品 的A26tlA28ci比值为1. 78，位于1. 7-2. 0之间，说明总RNA的纯度较高。3. 2cDNA 的合成取约1 μ g总RNA直接进行逆转录合成第一链，取2 μ 1的第一链产物用LD PCR法 扩增富集cDNA，cDNA的一半经酶切消化和柱回收得到双链cDNA 7 μ L· LD PCR产物电泳结 果呈现从大到小均勻的smear分布，大小在0. 3-2. Okb范围内，且主要集中于500bp以上， 但未见特征性亮带(见图2)。表明线纹芋螺毒管的成分多样而且转录的mRNA较为复杂。3. 3线纹芋螺毒管cDNA文库的构建和鉴定取cDNAl μ 1用于连接反应，反应体系5 μ 1，转化其中1 μ 1，取1/100体积转化菌 液涂板，其余用于摇总库菌落；隔日记数平板的平均单菌落数为949个。
通过计数平板的单菌落数，计算得到7ul线纹芋螺毒管双链cDNA可获得的cDNA 文库克隆数为:949X 100X7X5/3 = 1. 107X 106。通过文库总质粒PCR分析结果，表明利用载体多克隆位点两端的T7和SP6引物扩 增的PCR产物电泳也出现呈现0. 3-2. Okb的均勻分布(见图3)，这与cDNA的大小相互吻 合。随机挑取50个单克隆，通过载体自连片段的特异引物PCR扩增鉴定，重组率超过95% (48/50)。对已确定的重组子，利用载体多克隆位点两端的T7和SP6引物扩增后发现，大部 分的插入片段大于250bp(22/24)，平均插入片段长度约为600bp (见图4)。减去上下游无 关序列，线纹芋螺毒管cDNA文库平均插入子长度为405bp。考虑到芋螺毒素分子的长度较小(7-41个氨基酸)，因此文库中所包含的cDNA插 入序列也会相对较短。以上结果和分析可以显示我们构建的线纹芋螺毒管cDNA文库在文 库重组子数、重组率和插入片段大小等方面均符合良好文库的质量标准。3. 4线纹芋螺毒管cDNA文库的序列测定和分布对500个随机cDNA克隆使用T7引物进行了单向的序列测定。将测序结果输入本 实验室建立的生物信息学平台的数据库，通过质检去掉载体序列和不确定的模糊序列，并 对确定的序列进行拼接，进一步根据序列的相似性聚类为cluster，并与公共数据库进行序 列同源性比较，其结果初步显示了线纹芋螺毒管中所蕴涵的基因信息可读序列。根据质检的结果，有效的EST总数为429条，长度分布见图5。得到的429个 EST序列被聚成137个基因簇(cluster)，其中，有21个基因簇包括两个以上的EST序列 (contig)，116个基因簇由唯一的EST序列组成(singleton)。由于线纹芋螺毒管cDNA文 库是非均一化的原始文库，所以其基因簇的分布在一定程度上能有效地反映相关mRNA的 多样性。根据所含EST的数量，基因簇主要分五大类(如图6所示)(1)有2个基因簇包含30个以上的EST序列，占总基因簇数的1. 46% (2/137)，总 克隆数的20. 74% (89/429)。它们是线纹芋螺毒管cDNA文库中表达量最高的两种基因，分 别比对上芋螺毒素A-超家族的两种前体序列。(2)有2个基因簇包含20至29个的EST序列，占总基因簇数的1. 46% (2/137)， 总克隆数的11. 42% (49/429)。分别与线纹芋螺毒素《_SVIA突变体1的前体和线纹芋螺 毒素kA-SIVA前体具有较高的相似性。(3)有7个基因簇包含10至19个的EST序列，占总基因簇数的5. 11% (7/137)， 总克隆数的22. 14% (95/429)。分别比对上线纹芋螺毒素《-SVIA突变体2的前体，线纹芋 螺毒素a -SII前体，线纹芋螺毒素S06前体，线纹芋螺毒素S05前体，以及18S核糖体RNA 和16S核糖体RNA序列。(4)有10个基因簇包含2至9个的EST序列，占总基因簇数的7. 30% (10/137)， 总克隆数的6. 06% (26/429)。它们分别比对上线纹芋螺毒素《-SVIB的前体，织锦芋螺毒
o(5)有116个基因簇包含唯一的EST序列，即被称为singletons，占总基因簇数的 84. 67% (116/137)，总克隆数的 27. 04% (116/429)。3. 5线纹芋螺毒管cDNA的序列分类
将137个基因簇的序列提交到GenBank进行BLAST X和BLAST N同源性分析。结 果表明，有对应于300个克隆的63个基因簇(占总基因簇的45. 98% )与已知的功能蛋白 基因具有高度的同源性(E value < 10_4)。上述基因簇主要被分成三类(见图7)。第一类 为毒素蛋白基因类，其成员最多，占到了总基因簇的一半以上。第二类为看家基因，例如，线 粒体RNA、核糖体蛋白基因等等。另有129个克隆与任何已知蛋白均无明显相似性，缺乏足 够的信息确定其功能，被列为第三类基因。这些未知基因可能是线纹芋螺毒管中特异表达 的基因，它们的多样性揭示了线纹芋螺毒管中mRNA转录结果的复杂性。由于线纹芋螺毒管是高度特性的组织，文库主要研究 的对象是在其表达量中居于 主导地位的毒素蛋白序列(共计221个克隆)，又考虑到文库测序中出现较多的重复序列， 因此，已有的测序数量已经可以使得我们对线纹芋螺毒管组织中毒素的基因表达概况有一 个大致的了解。从图8中我们可以看到A-超家族成员芋螺毒素和0-超家族成员芋螺毒素 在线纹芋螺毒素序列中占有相当大的比例。其中，前者共有132个克隆，占毒素序列克隆总 数的59. 7 %，后者共有80个克隆，在毒素序列总数中所占的比例为36. 2 %。其它，如T-超 家族、M-超家族、S-超家族以及含有一对二硫键的Contryphan等芋螺毒素成员在文库中也 有发现(见表1)。表1线纹芋螺毒管cDNA文库中毒素序列主要代表
权利要求
一种从中国南海线纹芋螺毒管中分离得到的A 超家族芋螺毒素基因，其核苷酸序列如序列表<400>1中序列所示。
2.一种由权利要求1中所述基因编码的多肽S4. 3，其特征在于该多肽的氨基酸序列 如序列表<400>2所示。
3.一种重组表达载体PTRX-S4. 3，其特征在于由pTRX载体和权利要求1所述的基因 融合重组而成，其中所述的PTRX载体经Kpn I和Not I双酶切法切除pTRX_IL10质粒中的 ILlO片段并进行线性化制备后得到。
4.权利要求2所述的多肽S4.3的制备方法，按照以下步骤进行(1)将权利要求1中所述基因克隆到原核融合表达载体PTRX上，构建出重组表达载体 PTRX-S4. 3并将其转化大肠杆菌BL21 (DE3)；(2)对转化后的大肠杆菌BL21(DE3)进行培养；(3)对经培养后的大肠杆菌BL21(DE3)进行超声裂解，将离心分离出的包含表达产物 的裂解液进行亲和层析，得到重组融合蛋白；(4)重组融合蛋白经EK酶酶切、层析过滤和反相高效液相层析纯化，得到多肽S4.3。
5.权利要求2所述的多肽S4.3在制备促细胞生长药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种中国南海线纹芋螺毒素基因及其编码的多肽S4.3，该多肽的制备方法及其应用。本发明通过构建cDNA文库的方法，从线纹芋螺毒管中克隆得到A-超家族芋螺毒素基因，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。该基因编码的多肽S4.3的氨基酸序列如序列表<400>2所示。该多肽的制备方法是构建了重组表达载体pTRX-S4.3，并对培养方法和条件进行探索和优化，提高多肽S4.3的表达量。本发明的多肽S4.3的制备方法可用于改良现有的多肽生产方法。而本发明的多肽S4.3能促进细胞快速生长，可用于制备促细胞生长类药物。
文档编号A61P43/00GK101979572SQ201010535309
公开日2011年2月23日 申请日期2010年11月8日 优先权日2010年11月8日
发明者任政华, 吴寿海, 徐安龙, 朱威, 王磊, 王菲菲, 陈尚武, 齐麟 申请人:中山大学