专利名称：中国南海线纹芋螺神经毒素S10a及其编码序列和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种多肽及其编码序列和应用，尤其涉及一种线纹芋螺毒素多肽及其编码序列和应用。属于生物领域。
背景技术：
芋螺(Cone snails),分类学上属软体动物门(Mollusca)、腹足纲(Gastropoda)、 新腹足目(Neogastropoda)、芋螺科(Conidae)、芋螺属(Conus)。据估计,现存芋螺约有700 多种，广泛分布于全球的各个热带和亚热带海域中，其中以印度洋-太平洋区域最多。芋螺多栖息在暖温带和热带海域的珊瑚礁，浅滩，潮浸地带等区域，少数栖息在水深几米至200 余米的深水区，白昼或退潮后在海藻下或珊瑚洞中栖息，夜晚外出觅食，春夏繁殖。芋螺的外型很容易辨认，螺体呈倒锥形，极其的坚实，有长沟形壳口。芋螺壳或重或轻，色彩及花纹斑斓多彩，有横带、细斑点、斑纹带等。有些芋螺的壳顶扁平，另一些芋螺则有一个伸出的螺塔部。近30年的研究表明，每种芋螺个体含有50-200种毒液成分，并将其命名为芋螺多肽。芋螺多肽是一类非常短小的多肽分子，一般含有7-40个氨基酸，比蛇、蝎、蜘蛛及海葵等物种的多肽毒素(40-80个氨基酸)要短。芋螺多肽是由单一基因直接编码而来，芋螺多肽从mRNA翻译出50-120个氨基酸残基的片段,称为前体肽(prepropeptide)。前体肽由三部分构成，即靠近N-末端的19-27个氨基酸组成的高度保守的信号肽(signal peptide), 中间的20-40个氨基酸组成的较为保守的前导肽(pro-region)和C-末端的7_40个氨基酸组成的高度变异的成熟肽(mature peptide)。芋螺多肽作为一个整体，具有超乎想象的多样性作用靶点。到目前为止，已经阐明的芋螺多肽作用的神经靶点主要分为离子通道受体，包括Na+、Ca2+、 K+通道以及神经递质受体，包括乙酰胆碱受体、5-羟色胺受体(5-HT3R)、NMDA受体(N-methyl-D-aspartateReceptor)、去甲肾上腺素相关受体(NA transporter> a I-adrenoceptor)等。从芋螺多肽的单个个体来看,则具有位点专一'丨生的特点，能特异性的区分各种受体，甚至各种受体的亚型，这使其成为神经生物学研究的有效工具和新药开发的重要资源库。ω-MVIIA专一性的作用于N型电压门控钙离子通道，其鞘内注射较吗啡更具效力而不必担心药物的耐受及成瘾性，因此2004年被美国FDA批准用于治疗严重慢性疼痛。来源于不同芋螺物种的其他ω-芋螺毒素，尽管它们氨基酸序列不同，但在结构上的差异都不是很大，如来自地纹芋螺(C. geographus)的GVIA、GVIC、GVIIA和GVIIB等，和来自幻芋螺MVIIA、MVIIC、以及来自线纹芋螺(C. striatus)的S03等ω-芋螺毒素，在药理学方面有相似的作用。我国现今发现了约有80多种芋螺，主要分布于南沙群岛、西沙群岛、海南岛及台湾附近海域，少数分布在广东、广西沿海。大多数芋螺物种的毒素学研究还未展开。由于不同的芋螺毒素都有其特定的药理学作用范围和生物学活性，因而使得芋螺毒素具有重要的理论研究价值和应用价值。多样性的芋螺毒素既可直接作为天然药物，又可以作为设计新药(用于治疗重大疑难杂症)的先导化合物。深入研究芋螺毒素及其生理学功能，不仅对海洋制药业具有重要意义，而且可为我国海洋芋螺物种资源的开发保护及利用提供重要理论依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种中国南海线纹芋螺毒素基因S10. I。本发明另一目的是提供上述芋螺毒素基因S10. I编码的芋螺毒素多肽SlOa。本发明再一目的是提供上述芋螺毒素多肽SlOa在制备神经生物学研究的工具药和镇痛药物中的应用。本发明所选择的线纹芋螺(Conus striatus),采自海南省三亚市。本发明采用构建CDNA文库的方法，从中国南海线纹芋螺毒管中克隆得到芋螺毒素基因S10. I。中国南海线纹芋螺毒管cDNA文库的构建分离毒管，提取总RNA反转录合成cDNA 第一链产物；再以T超家族的信号肽和3’ UTR为引物，以cDNA —链为模板，通过PCR进行基因克隆，将PCR产物与pGEM-T Easy Vector相连，连接产物转化后，分别涂平板，从平板上挑取单克隆进彳丁测序。得到中国南海线纹宇螺毒素基因S10. I，其DNA序列如序列表中序列I所示核苷酸序列。利用工具软件SEQT00L对上述芋螺毒素基因S10. I的碱基序列进行分析，获得其最大读码框，长度189bp，可编码62个氨基酸残基的芋螺毒素前体肽。通过进一步分析，确定芋螺毒素基因S10. I编码的毒素多肽SlOa的前体肽和推测的成熟肽氨基酸序列如序列表中序列2、3所示氨基酸序列上述毒素多肽SlOa的成熟肽由13个氨基酸组成，理论分子量为1429. 54道尔顿，具有典型芋螺毒素多肽一级结构的特征，分子内具有两对二硫键，第一个和第四个半胱氨酸成一对二硫键，第二个和第三个半胱氨酸成另一对二硫键。本发明利用固相化学合成法合成上述毒素多肽SlOa。采用仪器合成策略，运用 FmocPHOBtPDCC方法，Rink树脂及Fmoc-氨基酸，偶联剂为DCC-H0BT，哌啶脱Fmoc-基，合成步骤参考仪器合成手册进行。肽-树脂裂解试剂组成及肽回收方法与手工合成方法相同。通过固相化学合成线性多肽，然后交叉环化成具有两对二硫键以及C末端酰胺化修饰的成熟肽，经HPLC鉴定通过固相化学合成法合成的神经毒素多肽SlOa纯度达到99%， MALDI-T0F鉴定其分子量正确。本发明提供的芋螺毒素多肽SlOa在小鼠热板法测定生理模型上的中枢镇痛药效实验中，表现出明显的中枢镇痛效果，且药效优于阳性对照药盐酸哌替啶。因此，本发明提供的毒素多肽SlOa可应用于制备神经生物学研究的工具药和镇痛药物。
图I中国南海线纹芋螺毒管基因S10. IPCR扩增凝胶电泳图。图2中国南海线纹芋螺毒素基因S10. I编码的成熟肽与T超家族(骨架X)芋螺毒素成熟肽的比较结果；图3连接载体pGEM-T Easy Vector环形图谱及相关的序列位点；图4固相化学合成芋螺毒素多肽SlOa的HPLC分析4
图5鉴定固相化学合成芋螺毒素多肽SlOa分子量的MALDI-T0F质谱图；图6MTT法测定芋螺毒素多肽SlOa对细胞存活率影响结果分析图；图7芋螺毒素多肽SlOa在小鼠生理模型上的镇痛药效实验结果图。
具体实施例方式以下结合具体实施例，来进一步说明本发明的技术方案。应理解，以下实施例只用于说明本发明而不以任何形式限制本发明。实施例I :线纹毒管组织总RNA的提取及毒素cDNA克隆总RNA的提取参照Gibcol BRL公司的TRIZOL LS试剂说明书进行。LA Taq DNA 聚合酶、10 XPCR Buffer、DNA ladder 购买自 TaKaRa 公司；dNTP mix 购自 Promega 公司； PCR引物由Invitrogen公司合成；其他有机试剂均为国产分析纯，购自广州化学试剂厂。取活螺体，用石工锤破碎螺壳，暴露出螺肉，冰上小心并快速分离毒管组织，称重后迅速放入液氮并充分研磨，加入15倍重量体积的TRIZOL LS试剂(即Ig组织中加入15ml)，冰浴中充分匀浆，-80°C冰箱中保存以备提取总RNA。取50_100mg组织样品，用
O.75ml TRIZOL LS试剂匀浆，15_30°C静置5min。然后加入O. 2mL氯仿，剧烈振荡15秒后，15-30°C静置2-15min。4°C、12，OOOrpm离心15min，取上层水相。加入O. 5ml异丙醇， 15-30°C静置IOmin后，4°C、12，OOOrpm离心lOmin，弃上清。再加Iml 75%乙醇漂洗沉淀， 5，OOOrpm离心5min,弃上清,真空干燥去除样品中痕量的乙醇，加入适量无RNase的去离子 /K。取I μ I进行I %琼脂糖胶电泳，I μ I用紫外分光光度计估算RNA的浓度与纯度，-20°c 保存备用。l)cDNA第一链的合成cDNA第一链的合成使用 Clontech 公司的 SMART PCR cDNA Synthesis Kit，按照说明书进行试验。在5 μ I反应体系中加入下列组分(于冰上操作)1 μ g螺毒管总RNA， SMARTI11 olignucleotide和CDS 111/3，PCR引物各I μ 1，以超纯水补齐体积，混匀，短暂离心。72°C温育2min,冰浴2min,短暂离心，使混合物集于管底。再依次加入2 μ I 5 X First Strand Buffer、I μ I 20mmol/L 的 DTT、1μ I lOmmol/L 的 dNTP Mix 和 I μ I PowerScript RT后轻弹管壁，混匀并短暂离心。置PCR仪42°C反应Ihr逆转录合成第一链，冰浴终止反应，-40°C保存。2) T-超家族芋螺毒素的cDNA克隆PCR引物序列上游引物5，ATGCGCTGYYTCCCAGTCTT 3，下游引物 5 ’ AACAACACGCTGCCACTTGC 3 ’PCR体系及PCR程序如下表I所示表I
PCR体系PCR程序组分体积(μ D95°C预变性3min
权利要求
1.一种中国南海线纹芋螺毒素基因，其特征在于序列如序列表中序列I所示核苷酸序列。
2.一种由根据权利要求I所述的芋螺毒素基因编码的多肽，其特征在于该多肽的前体肽序列如序列表中序列2所示氨基酸序列。
3.一种由根据权利要求2所述的芋螺毒素基因编码的多肽，其特征在于该多肽的成熟肽序列如序列表中序列3所示氨基酸序列。
4.由权利要求3所述多肽在制备神经生物学研究的工具药和镇痛药物中的应用。
全文摘要
本发明提供一种中国南海线纹芋螺毒素基因S10.1及其编码的多肽S10a，以及上述多肽S10a在制备神经生物学研究的工具药和镇痛药物中的应用。本发明采用构建cDNA文库的方法，从中国南海线纹芋螺毒管中克隆得到的芋螺毒素基因S10.1，通过工具软件SEQTOOL对碱基序列进行分析，确定上述芋螺毒素基因S10.1编码的多肽S10a的前体肽氨基酸序列如序列表中序列2所示。本发明提供的多肽S10a具有较好的镇痛作用，可用于制备神经生物学研究的工具药和镇痛药物。
文档编号C12N15/12GK102604960SQ201210081408
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月23日 优先权日2012年3月23日
发明者任政华, 吴赟, 周茂军, 唐炜, 徐安龙, 王磊, 罗绍楠, 覃梦颖 申请人:中山大学