专利名称：中国南海线纹芋螺毒素S21a的制备及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种多肽及其编码基因序列、其制备方法和应用。尤其涉及一种芋螺毒素多肽及其编码基因序列、其制备方法和应用。
背景技术：
芋螺(cone snail)是一种生活在海洋浅水域的肉食动物，有毒，属于软体动物门腹足纲((Gastropoda)、前鳃亚纲(Prosobranchia)、芋螺科(Conidae)、芋螺属(Conus)。目前估计全球有约500-700种芋螺，它们分布于热带海域的浅水区域，主要是印度洋和太平洋海域。芋螺按其食性可分为三大类食鱼性芋螺(piscivorous)，食软体动物性芋螺 (molluscivorous)和食虫性芋螺(vermivorous)。其中食虫性芋螺种类最多，占全部芋螺种类的70%左右，而食鱼性芋螺虽然占芋螺总数最少，但毒性最强，至今为止报道的芋螺致死事件基本上是该类芋螺造成的。芋螺毒素(C0n0t0Xin，CTX)是一类来源于芋螺(Conus)毒液的活性多肽.对芋螺自身而言，CTx主要用于捕食与防御.近几十年来的研究表明，它主要作用于细胞膜上各种离子通道和神经递质/激肽的受体，有很强的生物学活性。芋螺毒素有如下特点分子质量小，富含二硫键；前导肽高度保守而成熟肽具有多样性；作用靶点广且具有高度组织选择性芋螺毒素常被作为探针用于各种离子通道和受体的类型及亚型的分类和鉴定，也极有望直接开发成药物或作为先导化合物用于新药的研发。目前，国内外已明确功能的芋螺毒素只占了整个毒素库的很小一部分，但是对它们的生理功能已经有了较为清晰的认识。芋螺毒素二硫键骨架和结构的不同，决定了它们功能靶位的差异，已经清楚的靶位主要包括配体门控的离子通道、电压门控的离子通道及G 蛋白偶联的受体。芋螺毒素可用作神经递质受体或离子通道研究的分子探针。乙酰胆碱受体是一个庞大的受体家族，10种α亚基和3种β亚基以不同的组合构成乙酰胆碱受体的各种亚型广泛分布神经系统和肌肉等各组织，它的生理和病理意义日益受到关注。在中枢神经系统中，不同突触前nAChRs调节不同神经递质的释放，如海马区的去甲肾上腺素和纹状体内的多巴胺。由于缺乏选择性配体这些nAChRs的亚基组成还不能清楚阐明。最近利用亚型特异性的α芋螺毒素和敲除小鼠解析了参与纹状体中多巴胺释放的主要乙酰胆碱受体亚型是 α 6 β 2 β 3 (ffhiteaker, 2002)。芋螺毒素有许多已经被开发成药物或者药物先导物。如ω -CVID，GVIA，MVIIA在治疗疼痛方面显示极大的应用价值(Smith, 2002 ；Scott, 202 ；Adams, 2003)。2005年12月， 美国FDA正式批准ω-MVIIA (也叫Ziconotide，或I^railt)作为一个治疗严重慢性疼痛的药物。ω-CVID也特异作用于N型VSCC，显示出治疗神经性疼痛的前景，现处于临床II期试验中。我国科学家从南海线纹芋螺中分离的S03与ω-MVIIA具有很高的同源性，只有7 个不同的残基，动物实验证明具有显著的镇痛效果，有望开发成我国具有自主知识产权的治疗药物(Wen，200 。这些镇痛药物与吗啡相比具有特异性好、不成瘾的优点。缺氧缺血引起的神经元病理损伤是由于突触前后大量钙内流引起的，能阻断突触前后钙离子内流的 ω -MVIIA和NMDA受体拮抗剂conantokin能起到显著的神经保护功能。癫痫是由于中枢神经系统谷氨酸能神经传导失调造成的，Conantokins特异阻断NMDA受体亚型，可开发成抗惊厥、抗癫痫药物。
发明内容
本发明的目的是提供一种中国南海线纹芋螺毒素基因S21. 1，其基因序列如序列表<400>1所示。本发明的另一个目的是提供上述线纹芋螺毒素基因S21. 1编码的多肽S21a，其氨基酸序列如序列表<400>2所示。本发明的另一个目的是提供一种重组表达载体PTRX-S21. 1。本发明的再一个目的是提供一种多肽的表达方法，从表达、分离和纯化几个方面对原有的多肽表达方法进行改良。本发明的再一个目的是提供上述芋螺毒素多肽S21a在神经生物学研究及镇痛药物开发中的应用。本发明使用的线纹芋螺采自中国海南省三亚市。本发明通过构建cDNA文库和测序的方法，从中国南海线纹芋螺毒管中分离得到中国南海线纹芋螺毒素基因S21. 1。本发明提供一种重组表达载体PTRX-S21. 1，通过以下方式合成首先，将芋螺毒素基因S21. 1的cDNA序列分拆为两对互补序列作为模板母链，在该母链基因的5’端和3’端分别加入限制性内切酶Kpn I和Not I的酶切位点；另外，在 5’端加入了 3C酶的识别位点，而在3'端还加入了两个终止密码子(TAA)，上述该两对引物经PCR扩增后分为互补配对的两组分别进行磷酸化与退火，合成出全长的芋螺毒素基因 S21. 1。其次，通过限制性内切酶Kpn I和Not I双酶切法对载体pTRX(载体pTRX为申请人自行构建并申请中国专利，专利名称为一种高效原核表达载体；专利号CN001M832.4， 授权公告号CN1189565)进行酶切后得到线性化的载体pTRX。最后，利用T4DNA连接酶连接上述芋螺毒素基因S21. 1和上述线性化的载体pTRX， 得到重组表达载体PTRX-S21. 1。本发明还提供一种多肽的表达方法，具体实施步骤为(1)将重组表达质粒pTRX-S21· 1转化大肠杆菌BL21 (DE3)；(2)培养转化后的大肠杆菌BL21(DE3)；(3)对培养后的大肠杆菌BL21 (DE3)进行超声裂解，收集上清；上清液经亲和层析纯化，得到重组融合蛋白；(4)重组融合蛋白经3C酶酶切，酶切的产物经层析过滤和HPLC纯化得到目的蛋白——多肽S21a。上述多肽的表达方法使用重组表达载体pTRX-S21. 1作为表达质粒，表达效率较高，且优化了培养条件和纯化分离方式，有效提高了多肽S21a的表达量。
本发明通过青蛙坐骨神经-腓肠肌标本肌肉收缩实验和小鼠热板法实验发现，一定浓度的多肽S21a具有阻断神经递质传递和镇痛性能，因此，多肽S21a可用于制备神经生物学研究及镇痛药物。
图1表达质粒pTRX的物理图谱和多克隆位点图2重组表达载体pTRX-S21. 1合成过程示意3重组表达载体pTRX-S21. 1的菌落PCR阳性克隆琼脂糖凝胶4重组融合蛋白分离纯化亲和层析5重组融合蛋白的诱导表达及纯化的SDS-PAGE电泳图谱图6酶切后的多肽S21a反相高效液相色谱7多肽S2Ia的MALDI-TOF质谱8多肽S21a蛙坐骨神经_腓肠肌标本肌肉收缩抑制实验结果分析9多肽S21a对小鼠热板法的痛阈改变结果
具体实施例方式以下结合具体实施例，来进一步说明本发明的技术方案。应理解，以下实施例只用于说明本发明而不以任何形式限制本发明。实施例1 线纹芋螺毒管组织总RNA的提取及毒素cDNA克隆总RNA的提取参照Gibcol BRL公司的TRIZOL LS试剂说明书进行。Taq DNA聚合酶、10XPCRBuffer和dNTP购自鼎国公司；PCR引物由hvitrogen公司合成；其他有机试剂均为国产分析纯试剂，购自广州化学试剂厂。取活螺体，用石工锤破碎螺壳，暴露出螺肉，冰上小心并快速分离毒管组织，称重后迅速放入液氮并充分研磨，加入15倍重量体积的TRIZOL LS试剂(即Ig组织中加入15ml)，冰浴中充分勻浆，-80°C冰箱中保存以备提取总RNA。取50_100mg组织样品，用 0. 75ml TRIZOL LS试剂勻浆，15_30°C静置5min。然后加入0. 2mL氯仿，剧烈振荡15秒后，15-30°C静置2-15min。4°C、12，OOOrpm离心15min，取上层水相。加入0. 5ml异丙醇， 15-30°C静置IOmin后，4°C、12，OOOrpm离心lOmin，弃上清。再加Iml 75%乙醇漂洗沉淀， 5，OOOrpm离心5min，弃上清，真空干燥去除样品中痕量的乙醇，加入适量无RNase的去离子水。取1 μ 1进行琼脂糖胶电泳，1 μ 1用紫外分光光估算RNA的浓度与纯度，_20°C保存l)cDNA第一链的合成cDNA第一链的合成使用 Clontech 公司的 SMART PCR cDNA Synthesis Kit，按照说明书进行试验。在5 μ 1反应体系中加入下列组分(于冰上操作)1 μ g芋螺毒管总RNA， SMARTI11 olignucleotide和CDS 111/3，PCR引物各1 μ 1，以超纯水补齐体积，混勻，短暂离心。72°C温育2min，冰浴2min，短暂离心，使混合物集于管底。再依次加入2 μ 1 5 XFirst Strand BufferU μ 120mmol/L 的 DTTU μ 1 10mmol/L 的 dNTP Mix 禾口 1 μ 1 PowerScript RT(CLONTECH)后轻弹管壁，混勻并短暂离心。置PCR仪42 V反应Ihr逆转录合成第一链， 冰浴终止反应，-40°C保存。
2) A-超家族芋螺毒素的cDNA克隆PCR引物序列上游引物5，ATGGGCATGCGGATGAT 3，下游引物5，TGGACGATGTAATAACAGCAAG 3，
权利要求
1.一种中国南海线纹芋螺毒素基因S21. 1，其特征在于基因序列如序列表400<1>所示。
2.一种由根据权利要求1所述的芋螺毒素基因S21. 1编码的多肽S21a，其特征在于 氨基酸序列如序列表400<2>所示。
3.—种重组表达载体PTRX-S21. 1，其特征在于由载体pTRX和根据权利要求1所述的芋螺毒素基因S21. 1连接组成。
4.一种多肽的表达方法，其特征在于实施步骤为(1)将重组表达载体PTRX-S21.1转化宿主菌BL21 (DE3)；(2)培养转化后的宿主菌BL21(DE3)；(3)对培养后的大肠杆菌BL21(DE!3)进行超声裂解，收集上清；上清液经亲和层析纯化，得到重组融合蛋白；(4)重组融合蛋白经3C酶酶切，酶切的产物经层析过滤和HPLC纯化得到目的蛋白—— 多肽S21a。
5.根据权利要求2所述的多肽S21a在神经生物学研究及镇痛药物开发中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种中国南海线纹芋螺毒素基因S21.1及其编码的多肽S21a的制备方法和应用。本发明通过构建cDNA文库，从中国南海线纹芋螺的毒管中克隆得到芋螺毒素基因S21.1。本发明提供一种多肽的制备方法，通过将芋螺毒素基因S21.1与载体pTRX连接得到重组表达载体pTRX-S21.1，将重组表达载体pTRX-S21.1转化宿主菌并在宿主菌中培养表达，表达产物重组融合蛋白经分离纯化得到目的蛋白——多肽S21a。本发明提供的多肽S21a具有阻断神经递质传递和中枢镇痛作用，可用于制备神经生物学研究的工具药和镇痛药物。
文档编号A61P25/04GK102154301SQ20101062013
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月31日 优先权日2010年12月31日
发明者任政华, 吴赟, 强媛媛, 徐安龙, 王磊, 覃梦颖 申请人:中山大学