专利名称：：ω芋螺毒素的制作方法
技术领域：
：本发明涉及新的co-芋螺毒素肽，更具体而言，涉及新的co-芋螺毒素肽和其用途以及提高co-芋螺毒素与N-型钙通道的结合可逆性的方法。
背景技术：
：鸡心螺(conesnail)代表使用毒液来猎食的海洋软体动物的多样家族。各种类的毒液包含超过100种肽的独特组合，其药物潜力在很大程度上依旧是未被开发的。不同种类的芋螺毒素已进化成靶离子通道和受体，用于成功捕获鱼、软体动物或虫[1-6]。重要的一类，从食鱼物种中分离的co-芋螺毒素，抑制在哺乳动物中发现神经元电压敏感钙通道(VSCC)。co-芋螺毒素具有N-型或P/Q-型VSCC的选择性，这样广泛使用它们作为研究工具来阐明神经元VSCC的分布和作用[7]。除它们作为研究工具的用途之外，动物实验已显示靶向N-型VSCC的co-芋螺毒素在缺血性脑损伤和疼痛方面具有临床潜力。然而，尽管co-芋螺毒素的选择性和潜力以及突触处的N-型VSCC在脊髓中传递伤害性信息的显著作用，但是目前可用的co-芋螺毒素不是理想的治疗剂。例如，强N-型VSCC选择性阻断剂，GVIA，从N-型VSCC缓慢分离，并因此难以在临床环境中施用[8]。另一种co-芋螺毒素MVIIA引起多种原因不明的神经副作用[9-11]。已报道，与对外周N-型亚型相比，MVIIA对中枢N-型亚型的特异性更高，尽管外周N-型亚型直接作用于疼痛信号。与对中枢亚型相比，CVID对外周亚型的选择性更高，因此，CVID的副作用比MVIIA的副作用少[12-14]。其它的co-芋螺毒素对N-型VSCC的选择性较低并且不被认为是有用的治疗候选者。在N-型VSCC阻断剂的残基扫描实验时，Tyr13、Lys2、Arg，Leu11、Arg21、N末端和C末端酰胺对与通道的亲和性是重要的[7,15]。近来，已报道，Arg"对分子的可逆性具有重要作用。用Lys"替换Arg^显著降低可逆性[14]。虽然可逆性与亲和性密切相关，但是这两种性质的分离是可能的[16]。并且可逆性的改进使其能够成为更好的止痛药。贯穿本申请，各种专利和出版物作为参考并且在括号内给出引用出处。为了更加全面地描述本发明以及本发明所属
技术领域：
的状况，在此通过引用方式将这些专利和出版物的公开内容全部并入本申请。
发明内容本发明人己进行了深入研究以开发出克服与常规co-芋螺毒素有关的问题(尤其是与N-型钙通道的低特异性以及低可逆性)的新的co-芋螺毒素。结果，我们已经从韩国紫霞芋螺(Com^F/"W^^)中分离出了新的co-芋螺毒素，这种新的co-芋螺毒素完全没有常规芋螺毒素的两个缺点并且还显示出作为N-型钙通道的阻断剂的显著活性。另外，我们已经进行了进一步的研究以揭示新的co-芋螺毒素的结构和功能，从而阐明co-芋螺毒素的可逆性的关键氨基酸残基。因此，本发明的一个目的是提供一种提高co-芋螺毒素与N-型钙通道的结合可逆性的方法。本发明的另一目的是提供一种分离的、合成的或重组的co-芋螺毒素肽。本发明的还一目的是提供一种编码co-芋螺毒素肽的核酸分子。本发明的又一目的是提供一种预防或治疗与N-型钙通道活性有关的疾病、障碍或状态的药物组合物。本发明的再一目的是提供一种在被试者中预防或治疗与N-型钙通道活性有关的疾病、障碍或状态的方法。本发明的另一目的是提供co-芋螺毒素用于制备预防或治疗与N-型钙通道活性有关的疾病、障碍或状态的药物的用途。连同所附权利要求书和附图，从以下详述的说明中，本发明的其他目的和优点将变得明显。图1A和1B表示线性、环化的(图1A)以及纯化的FVIA(图1B)的反相HPLC色谱图。环化条件线性肽0.02mM，GSSG0.1mM，GSH1mM，1mMEDTA,50mMNH4OAc,以及1M(NH4)2S04(pH7.8)。图2A和2B表示FVIA(图2A)及其类似物(图2B)的CD光谱。以包括a6螺旋、反平行的卩折叠、平行的P折叠、(3转角和无规则的五个主要二级结构的二级结构光谱为基础，FVIA具有P转角结构或反平行的卩折叠。氧化折叠适当形成FVIA的二级结构[18]。在图2B中，D类似物、LM类似物、FM嵌合体和MF嵌合体分别对应于表4中的FVIA[N14D]、FVIA[I11L,A12M]、嵌合体-FMFF和嵌合体-MFMM。图3为MVIIA(A幅)和FVIA(B幅)的剂量抑制曲线。剂量范围为0.1nMlpM。两幅图都显示S形曲线并且在O.lpM饱和。各肽的ICso值分别为7.96±1.59nM和11.5±1.4nM。图4为MVIIA(A幅)和FVIA(B幅)的电流电压曲线。这些图显示电流抑制而没有水平曲线移位。图5为FVIA和MVIIA的恢复曲线。实线箭头表示1芋螺毒素施用而虚线箭头表示用缓冲液洗出。图6表示在FVIA中观察到的连续和中间范围NOE连通(NOEconnectionvities)、4顺.0^偶合和缓慢交换主链NH质子的概括。这些结构参数用于co-芋螺毒素FVIA中的二级结构元件的序列特异性排布和鉴定。根据实心带(filledbar)的高度，NOE分为强、中、弱和非常弱。实心圆(filledcircle)^8Hz)和开环(openedcircle)5.5Hz)符号表示3JNH.Ca偶合常数的值。值为-l、0和+l的三进制指数表示化学移位指数。-1和+1的值分别表示在高磁场和低磁场下从无规巻曲值的移位偏差大于0.1p.p.m.，而在无规巻曲值的范围内的那些表示为0。图7A和7B表示FVIA与MVIIA主链结构比较(A幅)以及FVIA和MVIIA在可逆性方面有效的残基的位置(B幅)。在图7B中，长方形表示MVIIA的主要活性残基。图8A和8B表示通过甩尾试验(A幅)和足底痛觉试验(B幅)检测的FVIA的镇痛作用。记录观察到退缩行为的时间。图9A、9B和9C表示FVIA对谷氨酸盐(A幅)、物质P(B幅)或乙酸(C幅)诱发的疼痛的镇痛作用。柱，平均值的标准误差；*，与对照相比的P值(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。图10A和10B表示FVIA对5。/。福尔马林注射诱发的疼痛的镇痛作用。图IOB表明FVIA的剂量依赖效应。柱，平均值的标准误差；*，与对照相比7的P{t(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。图11A和11B表示FVIA在腿神经损伤的神经性疼痛模型中的镇痛作用。鞘内注射0.1ngFVIA。图IIB是对应于图11A的结果的n/。MPE曲线图。图12A、12B和12C表示FVIA在尾神经损伤的神经性疼痛模型中的镇痛作用。在神经损伤操作14天之后，评价FVIA对机械性痛敏(A幅)、冷痛敏(B幅)和热痛敏(C幅)的镇痛作用。如果P值与FVIA注射前的值相比小于0.05，则用符号*表示。右方曲线图是对应于图12A12C的结果的。/。MPE曲线图。图13表示在静脉内施用100吗FVIA或MVIIA之后测量的平均动脉压(MAP)。柱，平均值的标准误差；*，与对照相比的P值C^P〈0.05,^P〈0.01，***P<0.001)。具体实施例方式在本发明的一个方面，提供一种提高co-芋螺毒素与N-型钙通道的结合可逆性的方法，该方法包括制备第11和/或12位氨基酸为lie和/或Ala残基的o)-芋螺毒素，所述残基分别位于下列通式I所示的co-芋螺毒素的第2半胱氨酸残基与第3半胱氨酸残基之间的第二环内，以使所制备的co-芋螺毒素与N-型钙通道具有提高的结合可逆性通式Is-Cys-Xaaio-Xaa)!-Xaai2-Cys-Xaai3-Xaa'4-Xaa,5-Xaa,6-Cys其中，XaaiXaa16表示任意氨基酸残基。本发明人已进行了深入研究以开发出克服与常规co-芋螺毒素有关的问题(尤其是与N-型钙通道的低特异性以及低可逆性)的新的o)-芋螺毒素。结果，我们已经从韩国紫霞芋螺中分离出了新的co-芋螺毒素，这种新的co-芋螺毒素完全没有常规芋螺毒素的两个缺点并且还显示出作为N-型钙通道的阻断剂的显著活性。另外，我们已经进行了进一步的研究以揭示新的co-芋螺毒素的结构和功能，从而阐明co-芋螺毒素的可逆性的关键氨基酸残基。虽然此处用一种提高co-芋螺毒素与N-型钙通道的结合可逆性的方法表达本方法，但是可以用一种制备与N-型钙通道的结合可逆性提高的co-芋螺毒素的方法来替代表达它。8本文所用术语"可逆性"或"结合可逆性"用来表示co-芋螺毒素与N-型钙通道的解离速率。通常通过如实施例中所述的洗出实验分析CO-芋螺毒素的可逆性。术语"可逆性"与"恢复"之间没有区别并且这些术语将交替在本文中使用。虽然已经提出了强烈抑制N-型钙通道的CO-芋螺毒素，但是它们通常显示出与N-型^通道较差的结合可逆性，从而在向哺乳动物施用时很可能诱发副作用或不良作用，这样严重限制向人施用他们。本发明旨在通过提供具有极大增强了的可逆性的新的co-芋螺毒素来克服常规芋螺毒素(例如，GVIA和MVIIA)的这些缺点。另外，本发明的(D-芋螺毒素对N-型钙通道具有优异的阻断能力和特异性。同样地，本发明的(D-芋螺毒素在可逆性和离子通道抑制活性两方面的优越性的理论基础是以下科学发现虽然结合可逆性与亲和性密切相关，但是这两种性质可以被分开[16]。对本发明的co-芋螺毒素的可逆性至关重要的氨基酸残基位于通式I中第11和12位氨基酸。如在实施例中清楚显示，只有当co-芋螺毒素的第ll和12位氨基酸分别为lie和/或Ala残基时，它们才与N-型钙通道显示出显著高的可逆性。例如，在用相似的含有R基的Leu和Met分别替换Ile和Ala的情况下，co-芋螺毒素显示极大降低的可逆性。多种先前发表的报告已提出Leu位于co-芋螺毒素的第11位氨基酸是造成其离子通道抑制活性较强的原因。相反，根据本发明，第ll位氨基酸为Ile而不是Leu的(o-芋螺毒素不仅显示出与常规co-芋螺毒素相似的阻断活性,而且显示出比常规co-芋螺毒素高得多的可逆性。关于这一点，本发明在o芋螺毒素技术方面提供新的范例取得了巨大进步。在通式I中，六个Cys残基是co-芋螺毒素的决定因素。另外，所示的Lys2、Gl/和Tyr"残基对于co-芋螺毒素的离子通道抑制活性是重要的。根据优选的实施方式，六个Cys残基全部形成三个二硫键。更优选地，二硫键形成于第一Cys与第四Cys残基之间、第二Cys与第五Cys残基之间以及第三Cys与第六Cys残基之间。这些二硫键结构是co-芋螺毒素代表性的并且对co-芋螺毒素的活性至关重要。co-芋螺毒素的结构代表性描述具有四个环9<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>下划线显示四个环。本发明意在提供一种有趣的发现，位于第11和/或12位氨基酸的lie和/或Ala残基与co-芋螺毒素与N-型钙通道的可逆性有关，所述残基分别位于第2个半胱氨酸残基与第3个半胱氨酸残基之间的第二环内。根据优选的实施方式，位于第11和12位氨基酸的两个残基分别是Ile和Ala。根据优选的实施方式，Xaa,是Gly、Ala或Ser;Xaa2是Thr、Ala、Lys或Arg;Xaa3是Lys或Ala;Xaa4是Ser、Pro、羟脯氨酸或Lys;Xaas是Ser或Arg;Xaa6是Arg或Lys;Xaa9是Asn或Asp;Xaa10是Thr或Ser;Xaa,是Gly、Ala或Ser;Xaa12是Ser、Gly、Ala或Thr;Xaa13是Arg或GIy-Arg;Xaa"是Ser或Arg;Xaa。是Gly、Ala或Ser;以及Xaa16是Lys或Arg。更优选地，Xaag是Arg，Xaa，3是Arg。根据更加优选的实施方式，Xaa,是Gly或Ser;Xaa2是Thr或Lys;Xaa3是Lys或Ala;Xaa4是Ser或Lys;Xaa5是Ser或Arg;Xaa6是Arg;Xaa9是Asn或Asp;Xaa10是Thr;Xaan是Gly;Xaa,2是Ser;Xaa13是Arg;Xaa!4是Ser;Xaa15是Gly;以及Xaa16是Lys或Arg。根据更加优选的实施方式，Xaa2是Thr或Lys;Xaa3是Lys或Ala;Xaa4是Ser或Lys;Xaa5是Ser或Arg;Xaa6是Arg;Xaa9是Asn或Asp;Xaaio是Thr;Xaau是Gly;Xaa!2是Ser;Xaa^是Arg;Xaa^是Ser;Xaais是Gly;以及Xaa16是Lys或Arg。在本发明的具体实施例中，与N-型钙通道具有提高的结合可逆性的co-芋螺毒素包含SEQIDNO:1、2或3所述的氨基酸序列。具体地，根据本发明，用Ile和Ala分别替换MVIIA的第ll和12位氨基酸残基制备具有SEQIDNO:2所述的氨基酸序列的co-芋螺毒素。如实施例中所示，该类似物不仅显示似乎可能的钙通道抑制活性，而且显示比MVIIA高约2倍的恢复。根据最优选的实施方式，与N-型钙通道具有提高的结合可逆性的co-芋螺毒素包含SEQIDNO:l所述的氨基酸序列。根据优选的实施方式，通式I中的CO-芋螺毒素具有酰胺修饰的C-末端(Cys残基)。在本发明的另一方面，提供分离的、合成的或重组的①-芋螺毒素肽，其中，该co-芋螺毒素肽的第2个半胱氨酸残基与第3个半胱氨酸残基之间的第二环包含下列通式II:通式IIXaa5-Xaa6-Ile-Ala-Tyr-Xaa9其中，XaasXaa6和Xaa9表示任意氨基酸残基。基于我们的发现位于第二环的lie和Ala残基对增强与N-型钙通道的结合可逆性是重要的，提供本发明的co-芋螺毒素。优选地，本发明的(D-芋螺毒素的第一、第三和第四环各自对应于天然产生的co-芋螺毒素肽的环。根据优选的实施方式，Xaa5是Ser或Arg;Xaae是Arg或Lys;以及Xaa9是Asn或Asp。更优选地，Xaa5是Ser;Xaa6是Arg;以及Xaa9是Asn。根据优选的实施方式，本发明的O)-芋螺毒素肽包含下列通式III所示的氨基酸序列通式IIICys-Lys-Xaai-Xaa2-Gly-Xaa3-Xaa4-Cys-Xaa5-Xaa6-Ile-Ala-Tyr-Xaa9-Cys-Cys-Xaa,。-Xaa,)-Xaai2-Cys-Xaa!3-Xaa!4-Xaa，5-Xaa，6-Cys其中，Xaa,是Gly或Ser;以及Xaa2Xaa6和Xaa9Xaa16是任意氨基酸残基。根据优选的实施方式，通式III中的六个Cys残基全部形成三个二硫键。更优选地，二硫键形成于第一Cys与第四Cys残基之间、第二Cys与第五Cys残基之间以及第三Cys与第六Cys残基之间。这些二硫键结构是co-芋螺毒素代表性的并且对co-芋螺毒素的活性至关重要。根据优选的实施方式，Xaa2是Thr、Ala、Lys或Arg;Xaa3是Lys或Ala;Xaa4是Ser、Pro、羟脯氨酸或Lys;Xaa5是Ser或Arg;Xaae是Arg或Lys;Xaag是Asn或Asp;Xaa,o是Thr或Ser;Xaan是Gly、Ala或Ser;Xaa,2是Ser、Gly、Ala或Thr;Xaa,3是Arg或Gly-Arg;Xaa14是Ser或Arg;Xaa15是Gly、Ala或Ser;以及Xaa16是Lys或Arg。更优选地，Xaa6是Arg;以及Xaa^是Arg。根据优选的实施方式，Xaa2是Thr或Lys;Xaa3是Lys或Ala;Xaa4是Ser或Lys;Xaa5是Ser或Arg;Xaa6是Arg;Xaa9是Asn或Asp;Xaa10是Thr;Xaan是Gly;Xaa,2是Ser;Xaau是Arg;Xaa]4是Ser;Xaa^是Gly;以及Xaa"是Lys或Arg。根据更优选的实施方式，Xaa2是Thr或Lys;Xaa3是Lys或Ala;Xaa4是Ser或Lys;Xaa5是Ser或Arg;Xaa6是Arg;Xaa9是Asn或Asp;Xaa10是Thr;Xaau是Gly;Xaa^是Ser;Xaa、3是Arg;Xaa4是Ser;Xaai5是Gly以及Xaa]6是Lys或Arg。根据还更优选的实施方式，co-芋螺毒素包含SEQIDNO:1、2或3所述的氨基酸序列。更优选地，本发明的co-芋螺毒素包含SEQIDNO:1所述的氨基酸序列。本发明的co-芋螺毒素包括其中一个或多个氨基酸具有侧链修饰的肽。侧链修饰的实例包括氨基的修饰，如被还原垸基化；使用乙亚氨酸甲酯的脒基化(amidination);使用乙酸酐的酰化；使用氰酸盐的氨基甲氨酰化；使用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)的三硝基卞化；使用琥珀酸酐和四氢化邻苯二甲酸酐的氨基酰化；以及使用吡哆醛-5-磷酸的赖氨酸吡哆醛化(pyridoxylation)并接着使用NaBH4还原。使用如2,3-丁二酮、苯甲酰甲醛和乙二醛的试剂通过形成杂环縮合产物可以修饰精氨酸残基的胍基。经由O-酰基脲(O-acylisourea)形成随后衍生化(derivitisation)通过碳二亚胺活化可以修饰羧基，例如修饰成相应的酰胺。通过以下方法可以修饰氢硫基(Sulphydrylgroup):例如，使用碘乙酸或碘乙酰胺的羧甲基化作用；过甲酸氧化成磺基丙氨酸；与其它硫醇化合物形成混合的二硫化物；与马来酰亚胺、马来酸酐或其它取代的马来酰亚胺反应；使用4-氯汞苯甲酸、4-氯汞苯磺酸、苯基氯化汞、2-氯汞基-4-硝基酚和其它汞制剂形成汞的衍生物；在碱性pH下使用氰酸盐的甲氨酰化作用。半胱氨酸残基的任何修饰必须不影响肽形成必需的双硫键的能力。还可以用硒等效物替代半胱氨酸的氢硫基以使该肽形成二硒键(diseleniumbond)代替一个或多个双硫键。例如，通过使用溴代琥珀酰亚胺的氧化或者使用2-羟基-5-硝基苄基溴化物或磺酸苯基卤化物(sulphenylhalide)的吲哚环的垸基化可以修饰色氨酸残基。另一方面，通过使用四硝基甲垸硝化可以将酪氨酸残基改变形成3-硝基酪氨酸衍生物。通过使用碘乙酸衍生物的烷基化或者使用焦碳酸二乙酯的N-乙酰基化作用可以实现组氨酸残基的咪唑环的修饰。例如，通过在第4位的羟基化可以修饰脯氨酸残基。本发明的co-芋螺毒素与N-型钙通道特异结合以阻断离子通道。离子通道阻断剂分为孔阻断剂和闸门调节物。本发明的Q)-芋螺毒素属于孔阻断剂。本发明的co-芋螺毒素可以根据多种方法制备。例如，它可以通过基因克隆方法或固相合成技术制成。更具体而言，将编码co-芋螺毒素的核苷酸序列转化到适合的宿主细胞中并表达产生co-芋螺毒素肽(参见Sambrook，J.etal.，Mo/ecw/arC/om'"g.爿丄"6orato^jM朋wa/，3rded.ColdSpringHarborPress(2001》。或者，根据本领域技术人员已知的固相合成技术可以制备本发明的co-芋螺毒素(Merrifield，/^merC7ze肌5bc85:2149-54(1963);Stewart,etal"尸/zose/ep"VfeSyw^ew's,2nd.ed.,PierceChem.Co.:Rockford,111(1984》。根据优选的实施方式，通式I中的co-芋螺毒素具有酰胺修饰的C-末端(Cys残基)。本发明的①-芋螺毒素对N-型钙通道的阻断活性和特异性显示出似乎可能的性质，并且极大提高了与N-型钙通道的结合可逆性。'本发明的Q)-芋螺毒素对发炎性和神经性疼痛具有优异的治疗效果。不同的是，本发明的co-芋螺毒素更少涉及对伤害性疼痛的镇痛作用。因为伤害性疼痛是对抗外部有害刺激的防御机制之一，所以过分抑制伤害性疼痛是不合乎需要的。本领域技术人员通常已知优异的止痛药物候选物显示出对病理疼痛之一的发炎性和神经性疼痛的选择性缓解疼痛能力。在这些方面，本发明的co-芋螺毒素可突出成为有前途的的止痛药物候选物。除此之外，如在实施例中所示，本发明的CO-芋螺毒素副作用小或无副作用，在这些方面，其极大提高了与N-型钙通道的结合可逆性而对心血管系统的影响更小。在本发明的还一方面，提供一种包含编码SEQIDNO:l的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸分子。本文中所用术语"核酸分子"指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚体(包括gDNA、cDNA和mRNA)，除另外指出外，包括已知的天然核苷酸的类似物(Scheit,A^c/eo^/e爿"a/ogs，JohnWiley,NewYork(1980);UhlmanandPeyman,ChemicalReviews,90:543-584(1990))。根据优选的实施方式，编码本发明的(D-芋螺毒素的核酸分子包含SEQIDNO:4所述的核苷酸序列。在本发明的另一方面，提供一种携带包含编码SEQIDNO:l的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸分子的载体。根据如Sambrook等人，分f克虔，实邀手I，冷泉港实验室出版物(2001)所述的本领域已知方法，可以构建本发明的载体系统，将其通过引用方式并入本申请。通常，可以构建用于克隆或表达的载体。另外，可以构建在原核或真核宿主细胞中使用的载体。例如，在构建用于原核细胞中表达的载体时，它通常携带用来起始转录的强启动子(例如，尸/启动子、尸/启动子、rac5启动子、kUV5启动子、/p/启动子、化;？启动子、amp启动子、red启动子、SP6启动子、/ac启动子、toc启动子和T7启动子)、核糖体结合位点或者翻译起始以及转录/翻译终止序列。尤其，在使用￡.co/!'作为宿主细胞时，可以利用五.co//中色氨酸生物合成操纵子中的启动子和操纵基因(Yanofsky，C.,J5a"m'o/.，158:1018-1024(1984))和A噬菌体的左向启动子(尸/promoter，Herskowitz,I.andHagen,D.,爿wiZev.14:399-445(1980))作为控制序列。本领域技术人员己知用于原核细胞的很多常规载体，并且合适载体的选择只是挑选问题。本发明中使用的常规载体包括pSC101、pGV1106、pACYC177、ColEl、pKT230、pME290、pBR322、pUC8/9、pUC6、pBD9、pHC79、pIJ61、pLAFRl、pHV14、pGEX系列、pET系列、pUC19、Agt4AB、A-卡隆、义Azl和M13，但不限于此。例如，在构建用于真核宿主细胞(特别是动物细胞)的表达载体时，可以使用源于哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或者源于哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒后期启动子；痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒启动子和HSV汰^动乃。载体通常包含转录物的多腺苷酸化位点。商用的基于病毒的载体的实例包括pcDNA3(Invitrogen;包含巨细胞病毒启动子和多腺苷酸化信号)、pSI(Promega;包含SV40启动子和多腺苷酸化信号)、pCI(Promega;包含巨细胞病毒启动子和多腺苷酸化信号)和pREP7(Invitrogen;RSV启动子和SV40多腺苷酸化信号)。另外，本发明的表达载体进一步包含方便纯化所表达的融合蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包括但不限于谷胱甘肽S-转移酶(Pharmacia,USA)、麦芽糖结合蛋白(NEB，USA)、FLAG(IBI，USA)禾B6XHis(六组氨酸；Quiagen,USA)。根据本发明的优选实施方式，用亲合色谱法纯化融合蛋白。例如，在使用谷胱甘肽S-转移酶的情况下，采用包含谷胱甘肽的洗脱缓冲液，而在使用6XHis的情况下，通常采用Ni-NTAHis结合树脂(Novagen,USA)以快速可行的方式纯化目的融合蛋白。优选地，本发明的表达载体携带一个或多个能够筛选转化的宿主的标记，例如，带有对如氨苄西林、庆大霉素(gentamycine)、氯霉素、链霉素、卡那霉素、新霉素、遗传霉素和四环素的抗生素抗性的基因；URA3基因；带有对如某金属离子的任意其它有毒化合物抗性的基因。在本发明的还一方面，提供一种包含所述载体的转化体。本领域技术人员已众所周知用于制备转化体的宿主。例如，作为原核宿主，可以采用￡co//JM109、￡.coZ/BL21、五.co"RR1、￡.co//LE392、￡.co//B、五.co/ZX1776、co//W3110、棍教藩、i云金芽逸/f蘑、氏^"、/^^沙^^慮和各种假单胞菌属、^^/f，卩^"^^W。作为真核细胞，可以使用酵母(J^^",钩、昆虫细胞、人细胞(例如，CHO、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、3T3、RIN和MDCK细胞系)和植物细胞。本领域技术人员已知的许多方法可以进行宿主细胞的转化。例如，在使用原核细胞作为宿主的情况下，可以使用CaCl2方法(Cohen,S.N.etal.,Ato/.Jcac.Sc/.9:2110-2114(1973))、Hanahan方法(Cohen,S.N.etal.，Ato/.y4cac9:2110-2114(1973);和Hanahan,D.,/Mo/,S/o/.,166:557-580(1983))和电离子透入法(Dower,W丄etal.,A^c/e/c.fAi仏，16:6127-6145(1988))进行转化。同样，在使用真核细胞作为宿主的情况下，可以使用显微注射(Capecchi,M.R.,Ce〃，22:479(1980))、磷酸钙沉淀(Graham,F丄.etal,,P7ra/ogy,52:456(1973))、电离子透入法(Neumann,E.etal.,EMSOJ,1:841(1982))、脂质体介导的转染(Wong,T.K.etal"G匿,10:87(1980))、DEAE-葡聚糖处理(Gopal,M/.Ce〃5/o/.，5:1188-1190(1985))和粒子轰击(Yangetal.,A^/.Jew/.Sc/.，87:9568-9572(1990))进行转化。宿主细胞中的表达载体表达目的"-芋螺毒素。例如，如果表达载体携带启动子，可以使用IPTG(异丙基-e-D-硫代半乳糖苷(is叩ropyl-e-D-thiogalactopyranoside))诱导表达。在本发明的另一方面，提供一种预防或治疗与N-型钙通道活性有关的疾病、障碍或状态的药物组合物，该组合物包含(a)治疗有效量的本发明的co-芋螺毒素和(b)可药用载体。在本发明的又一方面，提供一种在被试者中预防或治疗与N-型钙通道活性有关的疾病、障碍或状态的方法，该方法包括向需要这种治疗的被试者施用包含(a)治疗有效量的本发明的Q)-芋螺毒素和(b)可药用载体的药物组合物。在本发明的另一方面，提供本发明的co-芋螺毒素用于制备预防或治疗与N-型钙通道活性有关的疾病、障碍或状态的药物的用途。因为本药物组合物包含上述本发明的co-芋螺毒素，所以省略它们之间的一般说明从而避免过度冗余而导致本说明书太复杂。本发明的药物组合物可以用于预防或治疗与N-型钙通道活性有关的各种疾病、障碍或状态。N-型钙通道的障碍或不合需要的活性引起与N-型钙通道活性有关的各种疾病、障碍或状态。根据优选的实施方式，本药物组合物预防或治疗的疾病、障碍或状态为慢性疼痛状态，例如神经性疼痛、糖尿病外周神经病变、疱疹后神经痛、三叉神经痛、AIDS有关的神经病变、肿瘤疼痛、发炎性疼痛、骨关节炎疼痛、类风湿性关节炎疼痛和纤维肌痛；急性疼痛；术后疼痛；心境障碍；焦虑障碍，例如泛发的焦虑障碍、社会性焦虑障碍、惊恐性障碍、强制性障碍和创伤后紧张综合病征；抑郁；成瘾障碍，例如可卡因依赖和戒断症状、类阿片依赖和戒断症状、酒精依赖和戒断症状以及尼古丁依赖和戒断症状；胃肠疾病，例如肠炎疾病和过敏性肠综合征；以及生殖泌尿疾病，例如尿失禁、间质性大肠炎和性功能障碍；与低氧、缺氧或局部缺血有关的神经毒性损伤，例如与中风、脑血管意外、脑或脊髓外伤、心肌梗塞、物理外伤、溺、窒息、产期昏厥或血糖过低事件有关的神经毒性损伤。最优选地，本发明的药物组合物用于缓解各种疼痛。特别是，针对发炎性或神经性疼痛施用所述药物组合物强于伤害性疼痛。在本发明的药物组合物中包含的可药用载体是通常在药物配方中使用的，其包括但不限于乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯橡胶(rubberarable)、磷酸钾、精氨酸盐(arginate)、明胶、硅酸钾、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖桨、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。根据本发明的药物组合物可进一步包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、混悬剂和防腐剂。根据本发明的药物组合物可经口或肠胃外给药。对于非口服给药，可以使用静脉内注射、皮下注射、鞘内注射、腹膜内注射、大脑内注射和肌内注射。本发明的药物组合物的适合的剂量可根据药物配制方法，给药方法，患者的年龄、体重、性别、发病状态、饮食，给药时间，给药途径，排泄率及对所用药物组合物的敏感性而变化，并且本领域的普通技术医师可以确定所需治疗的药物组合物的有效量。通常，用于人宿主的合适的剂量单位为以0.0001100mg/kg(体重)的量施用药物组合物。本文连同co-芋螺毒素使用的术语"治疗有效量"指预防或治疗上文所述的与N-型钙通道活性有关的疾病、障碍或状态的足够的剂量。根据本领域技术人员己知的常规技术，根据本发明的包含重组腺病毒的药物组合物可以用如上所述的可药用载体和/或赋形剂配制，最终提供几种形式的单剂量型和多剂量型。所述制剂的非限定性实例包括但不限于在油或水介质中的溶液剂、混悬剂或乳剂，浸膏剂，酏剂，粉剂，颗粒剂，片剂和胶囊剂，并且可进一步包含分散剂或稳定剂。本发明的药物组合物具有似乎可能的对N-型钙通道的阻断活性和对N-型钙通道的特异性，并且极大提高与N-型钙通道的结合可逆性。此外，该药物组合物对与失调的N-型钙通道活性有关的许多障碍和状态(优选地，疼痛)具有极好的治疗效果。除此之外，如实施例中所述，本发明的药物组合物具有很小的副作用或没有副作用，在这些方面，其极大提高了与N-型钙通道的结合可逆性而对心血管系统的影响更小。关于这些，本发明的药物组合物可突出成为有前途的药物的候选物，尤其是止痛药物候选物。现将通过实施例更加详细描述本发明。对本领域技术人员显而易见的是，这些实施例用来更加具体地解释本发明在所附权利要求书中所述的范围而不限于实施例或被实施例限制。实施例材料和方法从韩国济州岛的海岸收集紫雳^^凝。用30%乙酸/水提取毒液管、齿舌囊和壶腹内容物并离心。使用前将上清液冻干并在-20°C储存。在使用线性梯度为1%的溶剂B超过65分钟(溶剂A100%H20，溶剂B包含0.1%三氟乙酸的100%乙腈)以14ml/分钟洗脱的半制备的RP-HPLC柱(25X250mmC18,shimpack)上分馏一部分毒液粗提物。将毒液粗提物分成8部分，并且用RP-HPLC进一步纯化第三和第五部分。使用MALDI-MS(Shimadzu)测定肽的分子质量。使用a-氰基-4-羟基肉桂酸作为基质制备样品。使用血管紧縮素进行外部校准。在加入1M4-乙烯吡啶存在的烷基化(RT进行1小时)之前，在40mMDTT禾B50mM碳酸氢铵pH7.5存在下还原该纯化的肽(5(TC进行30分钟)。通过Edman化学在Procise491蛋白测序系统(AppliedBiosystem)上序列分析之前，用RP-HPLC再纯化该烷基化肽。基鄉腦游分庸将chelyconusfulmen的冷冻组织(O.lg)加入到1ml细胞裂解缓冲液和硫氰酸胍(guanidiumthiocyanate)/EDTA/肌氨酰(GES)试剂中并且用玻璃匀桨器研磨。在室温下在13,000rpm离心该混合物15分钟并且将上清液用酚抽提一次且用氯仿抽提一次。由此得到的提取物在4°C在13,000rpm离心15分钟。将无色的上部水相移至新试管中，用相同体积的异丙醇沉淀DNA以及在微量离心机内以13,000rpm离心10分钟。用70%乙醇洗涤并干燥片状沉淀。然后，通过加入50微升10mMTris-HCl(pH8.5)再悬浮该片状沉淀。使用作为模板的基因组DNA和引物通过T叫DNA聚合酶扩增芋螺毒素肽基因。引物中，基于在co-芋螺毒素前多肽原的毒素区域之前的内含子3'端设计5，引物5'-CTCTCTCTCTCTCTGCTGGAC-3'。基于co-芋螺毒素前多肽原的3'UTR序歹U设计3'引物5'-CAGAAAAGGATAGAGCACAGAAGG-3'。PCR条件为94°C，30秒；55°C，30秒；和70。C,45秒，进行35个循环。使用高纯PCR产物纯化试剂盒(RocheDiagnostics)纯化扩增的DNA片段。将纯化的PCR产物克隆到pGEMT-easy载体(Promega)上并通过电穿孔导入(JM109)。将转化的细胞平铺到包含氨节西林的LB培养皿上并在37。C培养24小时以筛选克隆。从培养的克隆中分离质粒并使用￡CORI消化来制备用于测序的300400bpDNA片段。靜使用ABIPRISM377自动DNA测序仪(PERKINELMER)分析上述克隆的芋螺毒素cDNA的核苷酸序列。测序后，将没有载体序列和引物序列的核苷酸序列翻译成氨基酸序列。我们确定了编码w-芋螺毒素-特异半胱氨酸排布的核苷酸序列为chelyconusfulmen的芋螺毒素基因。,会成在AppliedBiosystem模型433A肽合成仪上进行肽合成。通过起始于FmOC-NH2-Alko树脂并且使用多种用于氨基酸保护的保护基团的固相Fmoc化学合成FVIA的线性前体。在用三氟乙酸分裂后，用2M乙酸提取粗的线性肽，稀释至最终肽浓度为在用NH4OH水溶液调节至pH8.0的0.33M乙酸铵、0.5M胍-HCl和2mM还原的/0.2mM氧化的谷胱甘肽的溶液中20uM，并且在4'C缓慢搅拌5天。用HPLC监控折叠反应。通过用CM-纤维素CM-52的连续色谱法和具有d8二氧化硅柱子的制备级HPLC纯化粗的氧化产物。通过分析级HPLC和MALDI-TOF-MS测量法确定FVIA的纯度。在JASCOJ-710分光旋光计上使用路径长度1mm的石英皿，在190250nm在浓度为0.05mM的20'C溶液(水中0.01M磷酸钠，pH7.0)中测量CD光谱。所得的光谱为在20nm/分钟的扫描速度下4次扫描的平均值。光谱以deg.cmldmor1表示成分子椭圆率(molecularellipticity)[8][18,19]。^遞遭冶魔游给f遝记录在室温使用全细胞膜片钳技术完成电生理记录。将具有34MQ电阻的硼硅玻璃电极拔出并用Sylgard涂敷。对于N-型(^2+电流的记录，采用标准全细胞膜片钳方法。对于N-型Ca^电流的记录，内溶液的组成包含(以mM):130KC1、11EGTA、10Hepes和5Mg-ATP(pH7.4)，而外溶液包含140NaCl、2CaCl2、IO葡萄糖和10Hepes(pH7.4)。使用EPC-9放大器和Pulse/Pulsefit软件程序(HEKA,德国)得到电流记录[20]。鍵,懂通过从-80mV的保持电位至OmV的200-ms电压阶跃引起电流。在2m1/分钟的速度下灌流稀释的肽毒素。进行在洗出过程中的电流测量并继续直到电流稳定达5分钟的时间。恰好在第一痕迹(^A鄉之前加入肽毒素。在毒素洗出过程中在相同的细胞内记录电流。以15秒间隔得到电流记录。層i^懂在BrukerAVANCE600谱仪上记录NMR波谱。用于NMR实验的样品是在pH3.5溶于90%H20/10%2H20或者99.96%21120(对于同位素效应未校正的)中的7mMFVIA。在288K和298K的温度下使用标准脉冲序列和相位循环进行全部二维核磁共振实验{即DQF-COSY、E-COSY、HOHAHA和NOESY}[21,22]。用80ms和100ms的混合时间记录HOHAHA波谱。用100ms、150ms禾卩250ms的混合时间记录NOESY波谱[23,24]。使用WATERGATE方案[25]完成在NOESY和TOCSY二者测量中的溶剂共振的抑制。记录DQF-COSY[26]和PE-COSY[27]波谱分别得到扭转角约束和立体特异性排布。在这种情况下，在松弛延迟时间期间通过选择性辐射抑制溶剂共振。用于采集的数据大小对于DQF-COSY和PE-COSY为512(tl)X8192(t2)，而对于其它为512X2048。通过在时间量程为2小时30分钟、5小时、7小时30分钟、10小时和24小时时在99.96%2H20中记录的TOCSY波谱分析鉴定缓慢交换主链酰胺质子。化学移位参考用作内标准的TSP的甲基共振。在288K和298K(pH3.5)下记录二维波谱的完全集。使用BrukerXWIN-NMR软件处理和分析波谱。在傅立叶变换(Fouriertransformation)之前应用相位移正弦平方的窗函数。除PE-COSY以外，最终矩阵尺度为2048X2048实点。高分辨率DQF-COSY和PE-COSY波谱为转换成1024X8192的带。魏A嫌赠餅,交叉峰强度的定量测定基于等值线(contouringlevel)。观察到的NOE数据分成四个距离范围，1.82.7、1.83.5、1.85.0禾B1.86.0A，分别相对于强、中、弱和非常弱NOE值。假原子用于甲基质子或非立体特异性排布的亚甲基质子。将假原子使用的矫正因素加入到距离约束中[28]。另外，将0.5a加入到涉及甲基质子的距离约束中[29]。对于每个二硫键，分别使用靶值设为2.02(±0.02)、2.99(土0.5)和2.99(±0.5)A的三个距离约束，S(i)-S①、S(i)-Ce(j)和S(j)-C、i)[30]。主链NH-CotH偶合常数从DQF-COSY波谱中评价并且根据下列规则变换成主链扭转角①约束对于3丽《^小于5.5Hz，①角限制在-65±25°范围内；对于、H-caH大于8.0Hz，其限制在-120±40°范围内[31，32]。主链二面角约束不适用在5.5与8.0Hz之间的3j,-CaH值。使用与残基内的NH-CPHNOE结合的3J。p偶合常数得到x1侧链扭转角约束的范围和前手性的P-亚甲基质子的立体特异性排布[33]。在2H20中从PE-COSY波谱中确定3j。J禺合常数。对于在cr-ce键周围的tY、g^s和gY构象，x"则链扭转角限制在-60±30°、60±30°禾H180±30°范围内[34]。通过分析初步计算的结构鉴定对于缓慢交换的酰胺质子的氢键受体[35,36]。将氢键的距离限制分别加入作为对于NH(i)-O(j)的1.8-2.3A的靶值和对于N(i)-O(j)的2.8-3.3A的靶值。使用X-PLOR3.851程序使用在SGI02工作站运行的X-PLOR3.1程序完成全部计算[37]。基于起始于具有随机化的主链O和W扭转角的模板结构的动态模拟退火实验设计在实验上导出的距离和扭转角约束，计算三维结构。纷鄉伊份选择具有最低能量和最小兰纳德-琼斯范德华能量(Lennard-JonesvanderWasslsenergy)的最终20种结构。根据结构参数评价所计算的结构的趋同。与实验距离和二面角约束，与和能量相关的统计(FNOE、Ft。nF叫e,和EL.j)，以及与理想化几何位置存在RMS偏差。使用PROCHECK一NMR[38]、PROMOTIF—NMR[39]和MOLMOL程序[40]分析结构。通过Ramachandran二面角图的描述评价在最终聚合的结构中主链二面角的分布，该图表示与允许的(①，W)角的限度的偏差。使用角序参数迸一步评价在聚合的结构中的角变化的度[5，41]。使用1.4A的溶剂半径计算对于氨基酸残基侧链的溶剂可进入表面面积。厢见射辩激,/雄游赠、腦娜激微复藩以上述方法合成具有表5的氨基酸序列的FVIA的位点特异性类似物。根据上文描述的方法分析FVIA类似物的钙通道阻断能力和恢复。鎮離鹏动激微入微动激使用重量为2325g的ICR小鼠(IcrTacSam:ICR,MJCo.，首尔，韩国)。将分成每笼五只小鼠的小鼠在受控温度(22士2。C)和湿度(3050。/。)下适应24小时并且无限制地供给水和固体饲料。在疼痛实验前2小时使全部实验小鼠习惯于周围环境。在白天(AM10:00-PM17:00)进行使用小鼠的实验以减小误差。2游激膽浙根据先前报道的方法[50,51]使用具有30规格注射针头的25pl哈密尔顿注射器进行鞘内注射毒素肽。通过观察用1。/。亚甲蓝染色的脊(spine)确定毒素肽的剂量。对于我们的实验，鞘内注射5pl浓度为0.01|ig/5|il的FVIA肽。3.腦微在试验前，用5|ilFVIA肽(O.OlMl)鞘内处理小鼠5分钟。对照组仅用生理盐水处理。使用模型TF6甩尾设备(EMDIEInstrumentCo.,MaidensVA)进行甩尾试验。将小鼠身体用手固定而其尾巴平坦安置，随后用强度为3.8mWatt/cm2的光照射尾巴下部来施加热刺激。记录使小鼠甩其尾巴花费的时间。4赢微微在试验前，用5^FVIA肽(0.01吗/5pl)鞘内处理小鼠5分钟。使用足底加热设备(足底试验仪7371，UgoBasile,意大利)进行足底痛觉试验以测量热痛阈。在实验前，将小鼠置于小室中并适应周围环境。通过用强度为90mWatt/cm2的光照射脚爪的足底进行热刺激。测量脚爪退縮的反应时间。5.微微舰,裙鄉在试验前，用5piFVIA肽(O.Olpl)鞘内处理小鼠5分钟而后向腹膜内注射250^1.0%于盐水(0.9%NaCl)中的乙酸，然后计算扭体反应30分钟。6.各、M^^A诱导游伤茅丝试殺在试验前，用5FVIA肽(O.Olpl)鞘内处理小鼠5分钟。然后，在谷氨酸盐(20吗/5pl)注射前，使小鼠习惯在小室内至少30分钟。鞘内注射谷氨酸盐(SigmaChemicalCo.,St.Louis，MO,美国)之后，观察在透明观察小室(丙烯酸塑料，高20cm,直径20cm)中的小鼠的伤害性行为(舔、咬或抓)。7.激廣尸诱导游伤夢丝试验在试验前，用5plFVIA肽(O.Olpl)鞘内处理小鼠5分钟。然后，在物质P(0.7pg/5nl)注射前，使小鼠习惯在小室内至少30分钟。鞘内注射物质P(TocrisCooksonLtd.,Bristol,英国)之后，观察在透明观察小室(丙烯酸塑料，高20cm,直径20cm)中的小鼠的伤害性行为(舔、咬或抓)。7.根据先前报道的Hunskaar方法[52]进行福尔马林试验。简言之，在试验前，用5i!lFVIA肽(0.01^ig/5^U)鞘内处理小鼠5分钟。然后，向小鼠左后爪的足底表面皮下注射10W5。/。于盐水(0.9。/。NaCl)中的福尔马林。在全部持续40分钟的第一阶段(0-5分钟)和第二阶段(20-40分钟)注射之后立即记录在透明观察小室(丙烯酸塑料，高20cm,直径20cm)中小鼠的行为活动的计数。叙赠丝鄉方鹏鎮虜/嫌。疆週摔经銜资微,实殺动激稀经餅蘇发微全部实验遵照疼痛研究国际协会(InternationalAssociationfortheStudyofPain)的道德指南和韩国首尔大学牙科医学学院的动物实验道德指南。在群体笼中容纳重量为150200g的斯普拉-道来雄性大鼠(Sprague-Dawleymalerat)(OrientBioCo.,首尔,韩国)并且无限制地供给标准实验室的食物和水。采用12小时/12小时光暗循环，全部处理在循环的光照期期间(AMIO:OO-PM17:00)进行。在受控温度(20-24。C)和湿度(40-60。/。)下进行疼痛行为的检测。根据Kim和Chung方法[53]产生神经性疼痛模型。简言之，使用23vol%恩氟垸麻醉大鼠并且削刮从背腰到臀区域的区域。沿中线切开所刮区域，然后，从L4-S2位置处的额蝶突切除脊柱旁左侧肌肉。在除去蝶骨翼突以便于能够看到L4-L6脊神经之后，L5和L6脊神经显露并且将两个位置各自使用缝合丝线No.5-0绑扎牢固。在用生理盐水灌流后，缝合肌肉和皮肤。在手术后第1、4、7和14天后，进行疼痛反应试验来选择显示出对于鞘内导管插入不超过2.0g的50。/。回避阈值(avoidancethreshold)的大鼠。采用Yaksh等报道的方法[54]进行鞘内导管插入。简言之，用恩氟烷麻醉大鼠并且在立体定位架内在两个外耳道口处固定其头部，随后进行硬膜切开。然后，将导管(PE-10)插入至腰部膨大而另外的5-cm长度紧闭用来作为药物注射的路径。在开始试验之前，使动物从外科手术中恢复。只有在鞘内导管插入5天后没有神经缺陷以及在后腿处l(Hil注射1。/。利多卡因后具有运动麻痹的大鼠用于实验。利多卡因注射的第一天开始，向大鼠施用芋螺毒素。3.教滅W層鄉藩通过在具有不锈网底的透明观察小室(丙烯酸塑料，8X8X8cm)中容纳大鼠并且使大鼠习惯大约30分钟测量机械刺激的回避反应(avoidanceresponse)。然后，根据Up&Down方法[55,57]，使用vonFray细丝法(vonFrayfilament)(弯曲力:0.41、0.70、1.20、2.00,、3.63、5.50、8.50和15,14g)刺激每只大鼠的腿的中央部来对大鼠进行刺激。只有在神经结扎前在三个独立的疼痛反应试验中显示出不超过15.14g的50%回避阈值的大鼠用于本实验。在浙经餅盧方鹏麟歸//。凝赠微微,魏动靜诱发鹏餅鄉條,在群体笼中容纳重量为150200g的斯普拉-道来雄性大鼠并且无限制地供给标准实验室的食物和水。采用12小时/12小时光暗循环，全部处理在循环的光照期期间进行。在受控温度(22-25。C)和12小时/12小时光暗循环下进行疼痛行为的检测。".//層经棘颜发使用4%恩氟烷和95%氧气的混合气体麻醉大鼠。为了诱发尾部的神经性疼痛，使存在于大鼠尾内的高位和低位的尾部躯干暴露、谨慎地从外围组织分离并且在Sl与S2脊神经之间的位置处横切。为了防止已切断的躯干的近端与远端的可能的再结合，从近端移除躯干的2-mm的一块。该手术通过高位与低位尾干排除了尾部的Sl脊神经神经分布[56]。7.2#经丝^"#"疗力^^澄#辟艮据没有药物施用知识的研究者的单盲试验(blindstudy)，进行行为试验。教縱微断f力微如Up-Down方法[55,57]在用弗莱毛(vonFreyhair)(弯曲力0.4、0.6、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0禾t)15.0g)刺尾部之后，通过确定诱发50%回避反应的弗莱毛劲度(克)评价机械性痛敏。与神经损伤操作之前的那些相比，确定在统计学上显著降低的回避反应阈作为机械性痛敏的出现。丄".冷微游/f力微通过将尾巴浸入冷水(4。C)中并记录尾退縮时间进行冷痛敏的试验。在尾巴浸入之后，在15秒的截止时间内测量尾退縮的反应时间。以5分钟间隔重复五次冷痛敏试验。与操作前相比较快的退縮被视为归因于冷痛敏。入".滅敏做K邀除了使用热水(40。C)之外，以与上述用于冷痛敏的那些方式进行热痛敏的试验。在明显确定与操作前相比较快的退縮的情况下，其被视为归因于热痛敏。在上述行为试验中，在神经损伤之后，在统计学上显著的回避反应被确定为归因于疼痛诱导。2秀激蕭为了验证FVIA和MVIIA对慢性神经病变的镇痛作用，在神经损伤操作后的14天期间进行行为试验并且选择显示出疼痛诱导的大鼠用于药物施用。将药物悬浮于生理盐水中并如下鞘内施用。使用恩氟垸轻微麻醉大鼠并使用具有30规格注射针头的25-|il哈密尔顿注射器给药。将药物经由L5与L6脊神经之间的硬膜注射到蛛网膜下隙。药物的剂量为6.5、20、65或200ng/kg。到注射后1小时为止以15分钟的时间间隔、到注射后3小时为止以30分钟的时间间隔、在注射后5小时以及在注射后24小时分别监控对机械性痛敏的镇痛作用。在注射之后，在1小时、3小时、5小时和24小时检测对冷和热痛敏的镇痛作用。W动嚴雄,僮在群体笼中容纳重量为150200g的斯普拉-道来雄性大鼠并且无限制地供给标准实验室的食物和水。它们保持在12小时/12小时光暗循环、温度(22土3。C)和湿度(40-60。/。)下。在用异氟垸麻醉下进行全部操作。将导管(PE-IO)插入到股动脉并且填充生理盐水，接着连接到病人监护仪(PhilipsMP30,Intellivue)上。向鼠侧面尾静脉施用MVIIA肽或FVIA肽。对于心电图，将不锈钢电极置于两膝和后退皮肤下的部分。统W藩全部实验数据为平均值±标准误差平均值(SEM)。使用单因子重复测量变异数分析法(one-wayrepeatedmeasuredANOVA)禾。Bonferronit检验比较和分析针对神经性疼痛的药物效应。p值小于0.05被认为是在统计学上有效的。在药物治疗之后退縮阈值的增量评价镇痛作用并且表示为最大可能作用的百分比(。/。MPE):%MPE=100x[(退縮阈值治疗后)-(退縮阈值操作后)/(退縮阈值操作前)-(退縮阈值操怖)]。结果猪毒微游分庸使用生物化学方法(毒液提取和HPLC)，我们的团队表示了几种芋螺毒素肽的特征。目前，我们使用DNA克隆从紫霞芋螺毒液管mRNA或gDNA中得到了另外的芋螺毒素肽。通过上述方法表示了约50种芋螺毒素肽的特征。这些包括O-超家族、A-超家族、M-超家族和其它超家族[l]。在具有特征的序列中，FVIA显示与众所周知的W-芋螺毒素肽MVIIA的高的序列同源性(76。/。)并且还具有保守残基Tyr13、Ly^和Arg、表1)。在整个序列中只有6个残基是不同的。FVIA的cDNA序列如SEQIDNO:4所述。表1.03-芋螺毒素FVIA与其它N-型转通道阻断剂的一级序列的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>进行FVIA的固相化学合成提供肽的丰富供给并且平稳进行受保护的线性肽的合成。在TFA分裂之后，从20%乙酸中提取全部保护基已被除去的FVIA的线性前体。粗制的肽的空气氧化提供作为主要产物的含有合适二硫键配对的肽，该肽通过离子交换色谱和反相HPLC纯化。FVIA是在中性pH净电荷为+5的强碱性肽，所以使用NH4OAc梯度缓冲液作为洗脱液，使用CM-纤维素CM52作为阳离子交换色谱。通过分析级HPLC、氨基酸分析和MALDI-TOF-MS测量(图l)确认最终纯化的产物。FVIA的CD光谱显示在约205nm的两个最小值(图2A)。预期基于包括a螺旋、反平行的(3折叠、平行的(3折叠、(3转角和无规则的五个主要二级结构的二级结构光谱[18]，FVIA具有p转角结构或反平行的(3折叠。已证实，通过氧化折叠适当形成FVIA的二级结构[19]。FVIA类似物、嵌合体-FMFF、嵌合体-MFMM、FVIA[N14D]和FVIA[I11L,A12M]的CD光谱显示它们的二级结构与FVIA的二级结构几乎相同，这说明它们的活性的差异归因于氨基酸残基的不同(图2B)。敬潘为了研究co-芋螺毒素的体外活性，进行电生理研究[20]。IC5。值指co-芋螺毒素的效能并且从剂量抑制(应答)曲线中计算出。剂量范围为0.1nM1^M。合成的MVIIA和FVIA阻断在人胚肾细胞中表达的人N-型转通道，它们具有相似效能(图3)。两个图显示S形曲线并且在O.lpM饱和。每种肽的ICso值分别为7.96土1.59nM和11.5±1.4nM。第二实验是co-芋螺毒素的电流电压测量。通道阻断剂的机制可以分为孔阻断和闸门修饰作用。众所周知，包括MVIIA的co-芋螺毒素是孔阻断剂并且结合到N-型钙通道孔区域的前庭(vestitubule)。FVIA还显示没有水平曲线移位的曲线抑制(图4)[42]。最后，我们验证从结合到N-型VSCC上的恢复。当用1pM浓度使阻断饱和时，洗出毒素。虽然FVIA显示比MVIIA快的阻断，与MVIIA洗出相比，FVIA显示更好的分离(图5)。層i力浙使用标准实验设计设置co-芋螺毒素FVIA的二维'HNMR波谱[43]。峰值分散良好并且在第2和4环中有一些重叠(表2)。氨基酸自旋系统的鉴定基于在DQF-COSY和TOCSY实验中观察到的标量偶合模式，其由NOESY测量结果补足。通过在NOESY波谱上观察到的碱基间顺序的NOE(interresidues叫uentialNOE)沿着FVIA的一级结构确定鉴定的自旋系统的次序。表3显示NOESY波谱的化学位移。表2,在298K和pH3.5FVIA的化学位移<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>ArglO8扁4.1051.665CYH1.860Hell7.618，.1841.888CYH21.352，U59;CYH30.085Alal27.6984.3551.233-Tyrl37.8464.6283.164C2,6H6.852;C3,5H7,129Asnl48.257产.779卩.672，2.832-Cysl58.3134細2.556,3.251-Cysl69.5904.4122.921,3.253-Thrl78.4414.472CYH1.119Glyl88.3603.820,4.097--Serl98.2014.7223.706,3.786-Cys208.7254.7112.829,2.899Arg218.6224.6441.841CYH1.634,1.544Ser229.3174,0473.900,4.127-Gly238,2244.152，3.786-—Lys247.7685.1201.632，1.520CYH1.260;CSH1.357Cys258.7124.8593.023,3.228—酰胺---NH28.441如图6中所示，FVIA包含三个短的由第68、21和24残基组成的卩链，其与几个转角以反平行的方式设置。使用标准规范确定在P折叠结构中(3链的范围及其相对取向大的、H-ca偶合常数(Lys6、Cys8、Ser9、Arg1Q、Ile11、Ala12、Tyr13、Cys15、Cys2Q、Arg21和Lys24)，强连续的daN，链间NH-NH和NH-C"H连通，以及缓慢交换酰胺质子(Lys6、Cys8、Ile11、Gly18、Gly23、Arg21和Lys24)。这些规范使在(3折叠内的外周和中枢链能够被识别。尸K"我们使用全部317个NMR实验约束计算FVIA的三维结构，其包括301个实验距离约束和16个二面角约束，其相当于每个残基的12.68个约束的平均值。在285个距离约束中，有128个残基内、156个残基间NOE距离约束，8个氢键约束(从氢-氘交换实验确定)和9个二硫键约束。涉及氢键的3个距29离约束为Gly5(NH)—Cys25(CO)、Lys6(NH)—Gly3(CO)、Cys8(NH)-Gly23(CO)、lie11(NH)—Ser9(OH)、Gly18(NH)—Cys15(CO)、Arg21(CO)-Lys24(NH)和Arg21(CO)-Lys24(NH)。我们进行了以IOO个无规则FVIA结构开始的模拟退火计算，并且选择了20个与NMR实验约束良好匹配的最终结构，其中，NOE距离和扭转角干扰分别小于0.3A和3°。根据结构参数评价聚合结构的统计(表3)。表3.20个最低能量结构的结构统计与实验距离约束的RMS偏差(A)a'(301)与实验二面角约束的RMS偏差(deg.)a(17)0.037士0.0080.037±0.008与能量相关的统计(kcal/mol)bFN0E0.245±0.165FtOT5.021士0.359Frepel4.109±1.475￡w-54.690±6.728与理想化几何位置的RMS偏差键(A)0.0033±0.0001角(deg)0.558±0.02不合适(deg)0.443±0.0156Ramanchandran分析(残基2-30)c最有利的(％)42.9额外允许(。/。)56.3非常允许(％)0.8不许区域(。/。)0.0平均配对RMS差(A丌主链(残基2-30)0.47±0.10全部重原子(残基2-30)1.36±0.21a在括号中给出计算中使用的每个实验约束的数目。bFN0E、和Kepe,分别是与NOE干扰、扭转角干扰和范徳华斥力项有关30的能量。用于这些项的力常数的值是在X-PLOR3.1手册中描述的标准值。五w是用CHARMM实验能量函数计算的兰纳德-琼斯范徳华能量，其不包括在模拟退火计算中。e程序procheck-nmr用于评价结构的立体化学特性。_与理想化共价几何位置的偏差非常小，并且兰纳德-琼斯范徳华能量很大并且是负的，这说明在保守结构中没有变形或非键合的不良接触。关于全部序列的平均配位位置的原子RMS偏差为对于主链原子(N,Ca，C)0.47士0.10a而对于全部重原子1.36±0.21a。在整个序列中完全定义了全部序列的主链结构；Ramachandran分析显示主链二面角落入|3折叠区域内或者通常允许的区域内。游好碧賴FVIA的分子结构由三链反平行的p折叠和四个链反转(chainreversal)组成。FVIA的全部|3折叠拓扑为+2x,-1，其常常与含有"抑制半胱氨酸节"折叠的毒肽和抑制肽有关[45]。三个卩链由残基Se,-CysS②链I)、残基Arg21((3链II)和残基Gly23-Lys24((3链III)形成，|3链I通过二硫键(Cys8-Cys,拴系到(3链II上并且以约45。角的反平行方式与中枢卩链III相互作用。在残基GlyS-Lys6处发生第一链反转，其形成II型卩-转角。在残基Ser、Ala^与残基Cys'5-Gly18处发生第二和第三反转，其分别形成IV型(3转角和I型(3转角。在残基Arg21-Lys24处发生最后的反转并且在(3链II与(3链III之间形成颠倒主链方向的p发夹结构转角(IV型(3转角)。ffl4泣^特^欲/e游类叙激游沟建、齊遞道渐劍浙统复分叛为了验证对于FIVA活性和恢复至关重要的部分和残基，制备表4中所示的位点特异取代的类似物。表4.FVIA类似物肽氨基酸序列fviackgtgkscsriayncctgscrsgkc-nh2mviiackgkgakcsrlmydcctgscrsgkc-nh2嵌合体-fmffckgtgkscsrlmydcctgscrsgkc-nh2嵌合体-mfmmckgkgakcsriayncctgscrsgkc-nh2fvia[ni4d;ickgtgkscsriaydcctgscrsgkc-nh231FVIA[111L,A12M]CKGTGKSCSRLMYNCCTGSCRSGKC-NH2分析FVIA类似物揭示其钙通道阻断潜力和恢复。对于该实验，使用30nMFVIA类似物。分析结构总结于表5中。表5.FVIA类似物的钙通道阻断活性和恢复肽阻断活性(％)遂1FVIA94,7±2.169.7±6.5MVIIA81.5±2.439.5±6.8嵌合体-FMFF84.2±2.924.7±1.1嵌合体-MFMM93.4±1.970.3±10.6FVIA[N14D]54.4±8.787,7±7.8FVIA[I11L,A12M]84.3士4.739.0±5.7如表5中所理解的，嵌合体-MFMM具有用FVIA在第1115位的氨基酸残基替换的常规芋螺毒素MVIIA的主链，嵌合体-MFMM不仅显示出显著的钙通道阻断活性，而且显示出比未修饰的MVIIA高几乎2倍的恢复性能。因此，可以理解，第1115位范围内的氨基酸残基是造成FVIA的可逆性急剧增强的原因。为了得到更多信息，将FIVA的第11位氨基酸和第12位氨基酸的Ile和Ala残基分别突变成Leu和Met来分别制备FIVA[IllL,A12M]。分析该类似物具有与FIVA相似的钙通道阻断活性但却显示出显著降低的可逆性。在这点上，可以理解，FIVA的第ll位氨基酸和第12位氨基酸的Ile和Ala残基对于恢复(即可逆性)是至关重要的。辦柳游动激微本肽FVIA被试验显示对小鼠的镇痛作用。如对于甩尾试验和足底痛觉试验的图8A和8B所示，与对照相比，向小鼠施用的FVIA肽(O.Olpl)在提高退縮反应时间方面是没有效的。如在图9A和9B中所示，观察用谷氨酸盐(20昭/5pl)或者物质P(0.7昭/5pl)注射的对照小鼠发现敏锐的如舔、咬或抓30分钟的行为反应。相反，观察施用FVIA的小鼠显示明显下降的累积疼痛反应速率。对于施用生理盐水的对照小鼠，腹膜内注射250pl1.0%乙酸诱导70例扭体反应。如图9C中所示，比较起来，在施用FVIA的小鼠中的扭体反应计32数明显下降。如图10A中所示，对于皮下注射10Hl的5%福尔马林的小鼠，存在两个不同阶段第一阶段，在福尔马林注射后立即出现并且持续5分钟；和第二阶段，在福尔马林施用后大约20分钟出现并且持续2040分钟。观察小鼠显示如舔、咬、抓或摇的疼痛行为活动。与此相反，观察施用FVIA的小鼠显示在第一阶段和第二阶段都明显下降的累积疼痛反应速率。此外，揭示了FVIA在第二阶段比第一阶段更加有效。如图10B中所示，本发明的肽FVIA已被阐明具有剂量依赖方式的镇痛作用。FVIA的镇痛作用随着施用的FVIA的浓度的提高(3.2ng/5pl、10ng/5pl、32ng/5pl和100ng/5pl)而提高。有意思的是，施用100ng的FVIA完全阻止了第二阶段中的疼痛行为。上述结果引导我们推断FVIA肽成功地在动物中显示镇痛作用。詹经丝,麟鎮嬸鋪我们提出了两种类型的神经病变模型:L5和L6脊神经损伤的动物模型；和Sl和S2脊神经损伤的动物模型。观察神经损伤的动物模型以显示神经性疼痛和异常性疼痛。通过确定在用弗莱毛刺尾巴后诱发50%回避(退縮)反应的弗莱毛的劲度(克)评价机械性痛敏。如图11中所示，FVIA或MVIIA的施用经过一定的时间产生增加的50%退縮阈，然而，在注射后2小时之后，退縮阈下降。如图12A中所示，还阐明了FVIA肽以剂量依赖方式(6.5、20、65和200ng/kg)诱导提高50%退縮阈。此外，如图12B和12C所示，FIVA肽对冷和热痛敏显示出镇痛作用。这些结果显示，FIVA肽在两种类型的神经病变模型中显示出优异的镇痛作用。对循,微靜虔/柳在施用剂量为100^g/kg的FVIA或MVIIA之后，监测时间过程的平均动脉压(MAP)。如图13中所示，MVIIA肽在初期引起MAP的急剧下降而随着时间的过去引起MAP的缓慢恢复。然而还在施用了FVIA的组中观察到了在初期MAP的急剧下降，FVIA肽显示出MAP的好得多的恢复。进一步讨论33糊毒微微庳芋螺毒素肽由基于信号序列和Cys模式的不同家族组成。毒液成分宽泛地分成两类富含二硫化物的芋螺毒素和缺乏多个二硫化物交联的肽[l]。在这些家族中，本发明人发现的0和A超家族比其它超家族更加丰富。通过生物化学方法和基因克隆表示了26个O-超家族和18个A-超家族的特征。其它为五个M-超家族和没有二硫化物的肽。为了表示芋螺毒素肽序列的特征，使用生物化学方法和基因克隆。生物化学方法需要20多个鸡心螺和纯化单肽的实验步骤。通过Edman降解和大量信息能够识别新的翻译后修饰(posttranslationalmodification)。另外，应从天然的肽中确定原有的二硫化物结构。在基因克隆方面，仅一个鸡心螺就能满足cDNA文库克隆且产生出成熟的肽。两种丰富彼此互补。从韩国鸡心螺中识别了50多种肽。在这些肽中，本发明的FVIA是通过克隆基因组DNA得到的序列。/^X4潜教游谬布^7教菜序列对比用于得到完整的排布。通过COSY波谱中的对称排列立即识别Gly残基。并且在TOCSY波谱中也容易确认Thr4和Ala12残基。识别Asn14的NH2与Tyr13的3-质子和s-质子并用于排布。NH2，存在于TOCSY和COSY中，被定位于肽的酰胺化的C末端。但是存在峰重叠和加宽引起的困难。例如，Cys1、Lys2和Lys6的CaH(4.503ppm)与Thr17的NH和C末端的NH2(8.441ppm)重叠。Gly"和Gly23的峰加宽隐藏了环境峰。通过比较不同温度、pH和混合时间的NOESY波谱克服这些问题(表2)。在最终计算中使用的约束由128个残基内距离、72个序列距离、84个非序列距离、11个二面角约束和通过偶合常数测量得到的4^角约束组成。基于5C'角偶合常数和CpH与NH之间的NOE产生的距离的组合得到p-亚甲基质子的立体特异性排布。界經/"麟賴话丝关系N-型钙通道在控制来自神经末梢的神经递质释放方面起到重要作用并且是治疗疼痛和缺血性脑损伤的重要的药物靶子。己报道了不同的亚型[46-48]。这些亚型的功能和器官分布是不同的并且特别是外周形式与减少疼痛具有重要关系。不同的芋螺毒素选择性地阻断电压闸门的C^+通道并且它提供关于电压34敏感通道的功能多样性和结构决定因素的有用信息。其中，在结构域IIIS5-S6区域内，ca-芋螺毒素GVIA和MVIIA作为孔阻断剂选择性结合到N-型钙通道的外前庭[8,42,44]。MVIIA(SNXlll/齐考诺肽/Prialt;Elan)是众所周知的FDA批准的用于止痛的①-芋螺毒素。但是已报道了MVIIA的副作用并且澳地利研究组提出，基于洗出实验，与外周亚型相比，MVIIA与中枢亚型具有精密的特异性并且它是产生副作用的原因[14]。GVIA不可逆地结合到钙通道上，所以将其排除在讨论之外。因此，如果MVIIA获得较好的可逆性，则它将是比目前的药物更好的药物。我们开始研究关于这些见解的结构和功能研究。我们的团队己经通过基因克隆和毒液提取找到了具有C-C-CC-C-C基序的20多种O-超家族芋螺毒素。其中，FVIA是基因克隆最丰富的结果，所以在cDNA文库中重复发现相同的序列。提取FVIA与MVIIA高度相似。在MVIIA和FVIA的第1和2环内的六个残基是不同的而其它的正好相同。这些残基的差异预期是引起详细的结构差异和包括机制、效能和洗出之后的恢复的功能差异的原因。并且存在分别与效能和可逆性有关的分子决定因素。首先，我们检验电生理实验的效能。所用的HEK293细胞表达直接与人疼痛信号有关的人N-型钙通道并且通过剂量抑制(应答)曲线的IC5Q值表示效能。MVIIA和FVIA的IC5o值以nM级非常相似。在FVIA中，具有重要功能的Lys2、Tyr13、Arg"和Arg21残基是保守的(图3)，所以这些结果是预期的。其次，进行电流电压曲线实验。这些结果显示，HEK293中的钙通道正确表达并且MVIIA和FVIA的孔阻断机制是相同的(图4)。最后，在毒素注射之后进行洗出。继续洗出直到到达定态。图5显示MVIIA(35n/o)的恢复与FVIA(75%)的恢复是明显不同的。有意思的是，虽然效能相似，但是这些肽的可逆性是不同的。这些事实显示，效能与可逆性的分离是可以的并且存在不同的分子决定因素(此处指残基)(图5)。为了确定结构差异是否影响以上功能以及哪些残基对这些功能和结构是重要的，进行'HNMR实验。我们预期，微小的结构差异产生在第l环以及特别是第2环内，其是由一级序列差异引起的结合环。正如我们所预期的，虽然整个拓扑结构是相似的，但是第2环的局部结构是些微不同的。35所以，我们认为，第2环的结构差异整体影响可逆性，而不是通过一个残基的不同影响。通过3J,.ca偶合常数的不同数据预期结构差异。对于、H.c必大于8.0Hz，在FVIA和MVIIA中分别存在11和9[49]。其次，特异序列Asn"(Asp")和11eU(Leu")替换可引起功能差异。Asp"是带负电的，所以静电荷或局部电荷作用可以影响功能差异。MVIIA中的Leu"也是对活性重要的残基[7]。Leu"的甲基的微小移位可使结合变弱并且使其易于从通道依次释放。兩J纖潜條根据病因学机制，疼痛可以分为伤害性、发炎性和神经性疼痛。伤害性疼痛由外部刺激引起并且在自我防御外部有害刺激方面起作用。发炎性疼痛由促炎症反应分子引起而神经性疼痛由神经损伤引起。已经提出了大约50种动物模型用来获取这些疼痛。通过由热引起的急性伤害性疼痛发展的甩尾试验和足底痛觉试验，验证FIVA肽具有对伤害性疼痛的镇痛作用(图8A和8B)。谷氨酸盐和物质P是疼痛信号转导关键的神经递质之一。鞘内注射这些神经递质诱发疼痛。在使用谷氨酸盐和物质P的试验中，FVIA显示了在统计学上显著的镇痛作用(图9A和9B)。1。/。乙酸的腹膜内处理引起如扭体的伤害性行为。FVIA施用导致扭体计数的减少(图9C)。对于福尔马林试验，疼痛具有两个不同的阶段与伤害性疼痛有关的第一阶段和与发炎性疼痛有关的第二阶段。施用了FVIA的小鼠被观察显示出了对第一阶段和第二阶段两个阶段的明显的镇痛作用。此外，FVIA肽对与发炎性疼痛有关的第二阶段比第一阶段更加有效得多(图IOA)。如图10B中所示，FVIA肽显示了以剂量依赖方式的镇痛作用。有意思的是，施用100ng的FVIA完全阻止第二阶段的疼痛。L5和L6脊神经损伤或者Sl和S2脊神经损伤的大鼠被诱发具有神经性疼痛并且显示痛觉过敏和异常性疼痛症状。取决于浓度，FVIA提高对于神经损伤诱发的机械性痛敏的50。/。退縮阈(图11和12A)。同样，FVIA肽显示了对冷/热痛敏的镇痛作用，同时其浓度依赖方式比机械性痛敏的浓度依赖方式弱(图12B和12C)。己阐明6.5ngFVIA显示出与200ngFVIA相似的抵抗冷/热痛敏作用，这说明，与其抵抗机械性痛敏作用相比，FVIA的抵抗冷/热痛敏作用可以通过其它机制被显示，并且是更加敏感的。总之，可以理解，FVIA肽对伤害性疼痛具有相对较弱的镇痛作用，其可以通过甩尾试验、足底痛觉试验和福尔马林试验的第一阶段证实。不同的是，FVIA肽被证明是对于发炎性疼痛的重要的药物候选物，其通过福尔马林试验以及使用谷氨酸盐、物质p和乙酸的试验证实。在腿或尾神经损伤的动物模型中，阐明了FVIA肽对痛敏具有明显的镇痛作用。因为伤害性疼痛是对抗外部有害刺激的防御机制之一，所以过度抑制伤害性疼痛是不合需要的。通常本领域技术人员已知，优异的止痛药物候选物显示出选择性针对发炎性和神经性疼痛(病理疼痛之一)的缓解疼痛能力。基于上文中描述的实验结果，可以得出结论，源于韩国鸡心螺的FVIA肽或其类似物是有前途的止痛药物候选物。F「"脉虔微MVIIA是可商购的FDA于2004年批准的用于止痛的co-芋螺毒素之一(Prialt,Elan公司)。然而，MVIIA的严重副作用和给药方式使其施用受到限制。例如，已报道MVIIA具有与(i)由抑制中枢神经系统的N-型VSCC引起的神经系统和(ii)由抑制自主神经系统以影响血压和脉率的心血管系统有关的不良作用。在施用FVIA或MVIIA之后，我们监测平均动脉压(MAP)以获取对心血管系统的不良作用。两种肽被分析引起MAP在初期急剧下降。然而，随着时间的过去，施用了FVIA的组的MAP显示非常缓慢地到达最初的正常动脉压。相反，MVIIA肽显示了较差的恢复并且导致相对约60mmHg的较低的动脉压。MVIIA的这种归因于其低的可逆性。因此，这些结果激励我们得出结论，FVIA肽或其类似物是优异的止痛药物候选物，就此而论，它们具有与MVIIA相似的钙通道阻断能力以及比MVIIA少得多的副作用。已经描述了本发明的优选实施方案，应该理解的是，落入本发明实质内的变形和修改对于本领域技术人员是显而易见的，并且本发明的范围由所附权利要求及其等效技术方案所确定。37参考文献1.HeinrichTerlauandBaldomeroM.Olivera(2004)PhysiolRev84,41-682.WilliamR.Gray肌dBaldomeroM.Olivera(1988)Ann.Rev.Biochem.57,665-7003.RichardJ.LewisandMariaL.Garcia(2003)NatureDrugDisc.2,1-134.BaldomeroM.Olivera(1997)MolecularBiologyoftheCell8,2101-21095.BaldomeroM.Olivera(2002)A,.Rev.Ecol.Syst.33,25-476.D.AlonsoandB.G.Livett(2003)MiniReviewsinMedicinalChem.3，785-7877.KatherineJ.NielsenandRichardLewis(2000)J.Mol.Recognit.13,55-708.Zhong-PingFengandGeraldW.Zampoin(2003)丄Biol.Chem.278，20171-201789.Perm,R.D.andPaice，J.A.(2000)Pain.85,291-29610.Jain，K.K.(2000)Expert.Opin.lnvestig.Drugs9,2403-240111.Levin，TandBailine,S.(2002)Psychosomatics.43,63-6612.RichardJ.Lewis,KatherineJ.Nielsen,DavidJ.Craik,MarionL.Loughnan,DeniseA.Adams,IainA.Sharpe,TudorLuchian,DavidJ.Adams,TrudyBond,LindaThomas,AlunJones,Jodi-LeaMatheson,RogerDrinkwater,PeterR.Andrews,andPaulF.Alewood(2000)J.Biol.Chem.275,35335-3534413.DavidJ.Adams,AmandaB.Smith,ChristinaI.Schroeder,TakahiroYasuda,andRichardJ.Lewis(2003)J.Biol.Chem.278,4057-406214.JorgenMould,TakahiroYasuda,Christina1.Schroeder,AaronM.Beedle，Clinton丄Doering,GeraldW.Zamponi，DavidJ.Adams,andRichardJ.Lewis(2004)丄Biol.Chem.279，34705-3471415.LaszloNadasdiandJ.Ramachandran(1995)Biochemistry.34，8076-808116.H.JijakliandW.丄Malaisse(1996)PharmacologicalResearch.34,105-10817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是Ser;Xaa15是Gly;以及Xaa16是Lys或Arg。15、根据权利要求ll所述的CO-芋螺毒素肽，其中，所述CO-芋螺毒素包含SEQIDNO:1、2或3所述的氨基酸序列。16、一种核酸分子，其包含编码SEQIDNO:l的氨基酸序列的核苷酸序列。17、一种预防或治疗与N-型钙通道活性有关的疾病、障碍或状态的药物组合物，其包含(a)治疗有效量的权利要求715中任一项所述的co-芋螺毒素；和(b)可药用载体。18、根据权利要求17所述的药物组合物，其中，所述疾病、障碍或状态为慢性疼痛状态，急性疼痛，术后疼痛，心境障碍，焦虑障碍，抑郁，成瘾障碍，胃肠疾病，生殖泌尿疾病，与低氧、缺氧或局部缺血有关的神经毒性损伤，或精神分裂症。19、一种在被试者中预防或治疗与N-型钙通道活性有关的疾病、障碍或状态的方法，其包括向需要这种治疗的被试者施用包含(a)治疗有效量的权利要求715中任一项所述的co-芋螺毒素；和(b)可药用载体的药物组合物。20、根据权利要求19所述的方法，其中，所述疾病、障碍或状态为慢性疼痛状态，急性疼痛，术后疼痛，心境障碍，焦虑障碍，抑郁，成瘾障碍，胃肠疾病，生殖泌尿疾病，与低氧、缺氧或局部缺血有关的神经毒性损伤，或精神分裂症。21、权利要求715中任一项所述的co-芋螺毒素用于制备预防或治疗与N-型转通道活性有关的疾病、障碍或状态的药物的用途。22、根据权利要求21所述的用途，其中，所述疾病、障碍或状态为慢性疼痛状态，急性疼痛，术后疼痛，心境障碍，焦虑障碍，抑郁，成瘾障碍，胃肠疾病，生殖泌尿疾病，与低氧、缺氧或局部缺血有关的神经毒性损伤，或精神分裂症。全文摘要本发明涉及一种提高ω-芋螺毒素与N-型钙通道的结合可逆性的方法，该方法包括制备第11和/或12位氨基酸为Ile和/或Ala残基的ω-芋螺毒素，所述残基分别位于通式I所示的ω-芋螺毒素的第2半胱氨酸残基与第3半胱氨酸残基之间的第二环内，以使所制备的ω-芋螺毒素与N-型钙通道具有提高的结合可逆性。另外，本发明涉及一种新的ω-芋螺毒素和药物组合物，其对N-型钙通道的阻断活性和特异性具有似乎可能的性质，并且具有极大提高的与N-型钙通道的结合可逆性。文档编号A61P25/00GK101557820SQ200780040969公开日2009年10月14日申请日期2007年11月2日优先权日2006年11月4日发明者俞英在,尹正我,徐洪源,李承奎,林惠媛,罗兴植,金炫廷,金载一,鲁星勋申请人:安奈根株式会社