专利名称：一种蛋白质组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质纯化和生物医药领域。具体而言，本发明涉及绝经期促性腺素 及其稳定剂的组合物，它具有良好的稳定性。
背景技术：
绝经期促性腺素(Human Menopausal Gonadotropins，简称HMG)含有卵泡刺激素 (Follicle-stimulating hormone,简禾尔 FSH)禾口黄体生成激素(leuteinizing hormone,简 称LH)两种活性成分，是由垂体产生的糖蛋白激素，它由α链和β链两个亚基组成。FSH的 α亚基与黄体生成激素(leuteinizing hormone，简称LH)和绒毛膜促性腺素(chorionic gonadotropin，简称CG)的α亚基完全相同，具有92个氨基酸，分子量约为14500D，第52 和78位置上的天冬酰胺是发生N-糖基化的氨基酸。FSH的β亚基由111个氨基酸组成， 分子量约为18000 D，其中第7和M位置上的天冬酰胺是发生N-糖基化的氨基酸。而LH 的β亚基由121个氨基酸组成，分子量约为14800 D ；CG的β亚基则有145个氨基酸，分 子量22000-39000 DH。HMG中FSH和LH的生物效价比例为10 1至1 10之间，通常为 2 1 至 1 1。监床上HMG主要用于治疗不育症以及体外的辅助生殖。HMG可以从绝经期妇女的 尿液中提取出来，也可通过DNA重组技术分别制备FSH和LH。HMG的制剂形式通常为冻干粉针，使用方式为肌肉注射。高纯度绝经期促性腺素 (PHMG)是HMG的后继产品，它是将HMG进行进一步的纯化，去除大量杂蛋白而获得的纯度 高、杂质少的产品，因此不会造成人体的过敏反应，并且由于这些优点它可以用于皮下注 射，提高患者的顺应性，方便患者的使用、减轻痛苦，PHMG的制剂形式可以为冻干粉针，也可 以是水针。在HMG和pHMG制剂的研制方面，获得一种稳定性良好、使用方便、安全性高的剂型 是患者、医生所需要的以及各制造厂商致力于开发的方向。但目前的现有技术并不稳定，对 于制剂的运输过程、储存过程的温度控制都要求较苛刻，稍有不慎就容易导致产品失去活 性或降解，特别是在高纯度绝经期促性腺素领域，这个问题尤其突出。US5650390公开了一 种含有HMG，蔗糖和甘氨酸的制剂配方。W020041U^6A1公开了含有HMG，蔗糖和表面活性 剂吐温(Tween)以及L-蛋氨酸的制剂配方。W02004087213公开了含有HMG，蔗糖和表面活 性剂普流尼克(Pluronic)以及L-蛋氨酸的制剂配方。虽然上述三种制剂配方还算比较稳 定，但由于添加了多种表面活性剂及赋形剂给制剂的安全性带来了很大的隐患。因此本领域迫切需要开发出一种具有良好稳定性、使用方便、安全有效的绝经期 促性腺素的制剂形式。
发明内容
本发明旨在提供一种含有绝经期促性腺素包括高纯度的绝经期促性腺素的药物 组合物。
在本发明的第一方面，提供了一种蛋白质组合物，所述的组合物包含绝经期促性 腺素(HMG)和/或其变体，和蔗糖。在另一优选例中，所述的组合物是液体形式或固体形式。在另一优选例中，所述的固体形式是冷冻干燥粉末。在另一优选例中，以FSH生物效价计，所述固体形式的组合物中含有0. 1-200FSH 国际单位/mg组合物。在另一优选例中，以FSH生物效价计，所述固体形式的组合物中含有0. 5-50FSH国 际单位/mg组合物。在另一优选例中，以FSH生物效价计，所述固体形式的组合物中含有1-20 FSH国 际单位/mg组合物。在另一优选例中，以FSH生物效价计，所述液体形式的组合物中含有1-2000FSH国 际单位/mL组合物。在另一优选例中，以FSH生物效价计，所述液体形式的组合物中含有30-1000FSH 国际单位/mL组合物。在另一优选例中，所述组合物所含有的绝经期促性腺素中，卵泡刺激素(FSH)与 黄体生成素(LH)的生物效价比例范围为10 1至1 10之间；较佳地，为3 1至1 2 之间；更佳地为2 1至1 1之间。在另一优选例中，所述组合物所含有的绝经期促性腺素是高纯度绝经期促性腺素 (pHMG)，其比活不低于5000FSH国际单位/mg蛋白；较优选为比活不低于6000FSH国际单位 /mg蛋白；更优选为比活不低于8000FSH国际单位/mg蛋白。在另一优选例中，所述组合物所含有的绝经期促性腺素来自人尿来源的绝经期促 性腺素和/或其变体。在另一优选例中，所述组合物还可以包含药学上可接受的载体；所述的药学上可 接受的载体，可以选自以下物质中的一种或一种以上pH调节剂、非离子表面活性剂、防腐
剂、盐、二糖、甘露醇。在另一优选例中，所述的pH调节剂是磷酸盐。在本发明的第二方面，提供了一种用于制备上述的本发明提供的蛋白质组合物的 方法，所述的方法包括步骤(1)制备含绝经期促性腺素和蔗糖的水溶液；(2)将水溶液分装到瓶中；和(3)压塞、密封或进行冷冻干燥后再压塞、密封，得到上述的本发明提供的组合物。在另一优选例中，所述的步骤(1)中的水溶液的PH为6. 0-8. 5 ；优选6. 5-8. 0。在本发明的第三方面，提供了一种上述的本发明提供的蛋白质组合物在制备治疗 不育综合症的药物中的用途。据此，本发明提供了一种具有良好稳定性、使用方便、安全有效的绝经期促性腺素 的制剂形式。
具体实施例方式发明人经过广泛而深入的研究，惊奇地发现绝经期促性腺素与合适的稳定剂一蔗糖组合后，可以得到稳定的组合物。发明人发现，此时蔗糖不仅起稀释剂和赋形剂的作用，更重要的是起保护剂的作 用，它可以保护糖蛋白分子在冷冻干燥过程中和以后的储存过程中可能发生的构象变化所 导致的变性失活，另外一方面，它对产品的稳定性也有很大的提高。在此基础上，发明人完 成了本发明。如本文所用，“绝经期促性腺素”、“尿促性素”和“HMG”可以互换使用，都是指一类 由垂体产生的糖蛋白激素或其变体，含有FSH和LH两种活性成分。可以是重组的绝经期促 性腺素或其变体、或是人尿来源的绝经期促性腺素或其变体。如本文所用，“卵泡刺激素”和“FSH”可以互换使用，都是指一类用于促进精子或卵 泡产生、促进卵巢发育的激素或其变体，其可在天然情况下由垂体前叶分泌，可从绝经期妇 女的尿液中提取或可通过重组技术获得的。如本文所用，“黄体生成激素”和“LH”可以互换使用，都是指是由脑垂体前叶嗜碱 性细胞分泌的，作用于成熟的卵胞，能引起排卵并生成黄体的一类激素或其变体。如本文所用，“杂质”是指除了绝经期促性腺素之外的其它物质，是指除FSH、LH以 外的杂蛋白，如降解亚基、聚合亚基等。在探索改进现有技术方法的过程中，发明人注意到将绝经期促性腺素与蔗糖进行 适当的配比，特别是绝经期促性腺素和蔗糖的浓度在一个合适范围内，那么此时蔗糖会起 到保护剂的作用，防止糖蛋白分子在冷冻干燥过程中和以后的储存过程中可能发生的构象 变化所导致的变性失活。本发明提供的组合物中含有绝经期促性腺素；蔗糖；和/或药学上可接受的载体。 以组合物的总重量计，蔗糖和绝经期促性腺素的重量之和是组合物总重量的6-100%，较佳 地是80-99 %，更佳地是90-98 %。剂型为冻干粉针的情况下，在每毫克本发明提供的组合物中，以FSH生物效价计， 含量在0. 1-200 FSH国际单位，较佳地为0. 5-50FSH国际单位，更佳地为1_20 FSH国际单 位。剂型为水针的情况下，在每毫升本发明提供的组合物中，以FSH生物效价计，含量 在1-2000 FSH国际单位，较佳地为30-1000 FSH国际单位。在本发明提供的组合物中，绝经期促性腺素和蔗糖的重量比为 0.00001 1-1 1，较佳地为 0.0001 1-0.01 1。在本发明提供的组合物中，所述的绝经期促性腺素中，卵泡刺激素(FSH)与黄体 生成素(LH)的生物效价比例为10 1至1 10之间；较优选为3 1至1 2之间；更 优选为2 1至1 1之间。如本文所用，“高纯度绝经期促性腺素(purified Human Menopausal Gonadotropins,pHMG) ”是指比活在5000 FSH国际单位(IU)/mg蛋白以上的HMG，优选比活 在6000 FSH IU/mg蛋白以上，更佳地为比活在8000 FSH IU/mg蛋白以上。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种 赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体它们本身并不是必要的活性成分，且施 用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’ s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co.，N. J. 1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。在组合物中药学上可接受的载体可包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另 外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如崩解剂、润湿剂、乳化剂、PH缓冲物质等。所述药物组合物可以根据不同给药途径而制备成各种剂型。这些剂型以下面方式 之一施用口服、喷雾吸入、直肠用药、鼻腔用药、颊部用药、局部用药、非肠道用药，如皮下、 静脉、肌肉、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内和颅内注射或输入，或借助一种外植储器用药。其 中治疗时优选皮下或肌肉给药方式。另外需要指出，本发明药物组合物中有效成分的使用剂量和使用方法取决于诸多 因素，包括患者的年龄、体重、性别、自然健康状况、营养状况、有效成分活性强度、服用、代 谢速率、病症的严重程度以及诊治医师的主观判断。建议安全有效量，以FSH生物效价计通 常至少约30 FSH国际单位/天，而且在大多数情况下不超过约600 FSH国际单位/天，较 佳地该剂量是约75-450 FSH国际单位/天。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康 状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。本发明提供的组合物具有良好的稳定性。本发明的稳定的药物组合物可以这样制备将磷酸盐、蔗糖先用水溶解，然后加入 绝经期促性腺素，搅拌均勻，压塞、密封或进行冷冻干燥后再压塞、密封。本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示 的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、 均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特 征的一般性例子。本发明的主要优点在于1、提供了一种绝经期促性腺素的组合物，便于保存和运输；2、本发明方法获得的绝经期促性腺素的药物组合物，具有良好的稳定性。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件、或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所 述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。生物效价的测定方法按照中国药典2005版附录XII M、附录XII N的方法测定 FSH、LH生物效价。蛋白质含量测定方法按Lowry法进行测定。液体中FSH比活的计算方法比活=每毫升液体中FSH生物效价(IU/mL) +每毫 升液体中的蛋白含量(mg蛋白/mL)。固体中FSH比活的计算方法比活=每毫克固体中FSH生物效价(IU/mg) +每毫 克固体中的蛋白含量(mg蛋白/mg)实施例1实施例1和对照例1所用原料中，绝经期促性腺素(HMG)购自上海天伟生物制药 有限公司，其FSH生物效价为330国际单位/mg，FSH比活为475国际单位/mg蛋白，LH生 物效价为306国际单位/mg，LH比活为440国际单位/mg蛋白。
每支含75IU FSH和75IU LH的配方1 HMG250 μ g蔗糖30mgNaH2PO4 ‘ H2O 0. 69mgNa2HPO4 · 2H20 0. 8mg制备过程按上述配方1计算出实际生产规模所需的各个原辅料的量，先在容器中加入注射 用水，然后加入NaH2PO4 · H2O, Na2HPO4 · 2H20和蔗糖，搅拌10分钟至完全溶解；测定pH是否在7.0 士 0.2，若不在此范围则用IM NaOH溶液或IM HCl溶液调pH至 7. 0 士 0.2 ；将HMG加入上述溶液，搅拌10分钟至完全溶解；测定pH是否在7.0 士0.2，若不在此范围则用IM NaOH溶液或IM HCl溶液调pH至 7. 0 士 0.2 ；用0.22μπι Durapore膜进行无菌过滤，滤过液分装至抗生素瓶中，半加塞，装盘放 入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，冷冻干燥程序如下a、搁板温度为+4°C维持20分钟；b、搁板温度降至-40 °C以下维持3小时；C、开启冷阱，冷阱温度降至_45°C以下；d、开启真空度，真空度降至IOOmTor以下；e、搁板温度升至-10°C维持10小时；d、搁板温度在2小时内从-10°C升至+35°C，然后在+35°C维持5小时；f、干燥结束后充氮气，压塞，出箱，轧盖。对照例1每支含75IU FSH和75IU LH的对照例配方1 HMG250g甘露醇IOmgNaH2PO4 · H2O 0. 69mgNa2HPO4 ‘ 2H20 0. 8mg制备方法同实施例1。上述2个配方在40 士 2°C，RH75 士 10%下的稳定性结果如下
权利要求
1.一种蛋白质组合物，所述的组合物包含蔗糖，和绝经期促性腺素(HMG)和/或其变体。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的组合物是液体形式或固体形式。
3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述的固体形式是冷冻干燥粉末。
4.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，以FSH生物效价计，所述固体形式的组合 物中含有0. 1-200 FSH国际单位/mg组合物。
5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，以FSH生物效价计，所述固体形式的组合 物中含有0. 5-50 FSH国际单位/mg组合物。
6.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，以FSH生物效价计，所述固体形式的组合 物中含有1-20 FSH国际单位/mg组合物。
7.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，以FSH生物效价计，所述液体形式的组合 物中含有1-2000 FSH国际单位/mL组合物。
8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，以FSH生物效价计，所述液体形式的组合 物中含有30-1000 FSH国际单位/mL组合物。
9.如权利要求1-8任一所述的组合物，其特征在于，所述的绝经期促性腺素中，卵泡刺 激素(FSH)与黄体生成素(LH)的生物效价比例范围为10 1至1 10之间。
10.如权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述的绝经期促性腺素中，卵泡刺激素 (FSH)与黄体生成素(LH)的生物效价比例范围为3 1至1 2之间；优选为2 1至 1 1之间。
11.如权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述的绝经期促性腺素是高纯度绝经期 促性腺素(pHMG)，其比活不低于5000 FSH国际单位/mg蛋白；较优选为比活不低于6000 FSH国际单位/mg蛋白；更优选为比活不低于8000 FSH国际单位/mg蛋白。
12.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的绝经期促性腺素来自人尿来源的 绝经期促性腺素和/或其变体。
13.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还可以包含药学上可接受的 载体。
14.如权利要求13所述的组合物，其特征在于，所述的药学上可接受的载体，可以选自 以下物质中的一种或一种以上PH调节剂、非离子表面活性剂、防腐剂、盐、二糖、甘露醇。
15.如权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述的pH调节剂是磷酸盐。
16.一种用于制备如权利要求1-15任一所述的蛋白质组合物的方法，其特征在于，所 述的方法包括步骤(1)制备含绝经期促性腺素和蔗糖的水溶液；(2)将水溶液分装到瓶中；(3)压塞、密封或进行冷冻干燥后再压塞、密封，得到如权利要求1-16任一所述的组合物。
17.如权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(1)中的水溶液的pH为 6. 0-8. 5 ；优选 6. 5-8. 0。
18.—种如权利要求1-15任一所述的蛋白质组合物在制备治疗不育综合症的药物中 的用途。
全文摘要
本发明公开了一种含有绝经期促性腺素的组合物，所述的组合物中含有作为稳定剂的蔗糖。本发明提供的组合物具有良好的稳定性。
文档编号A61K47/26GK102100908SQ20101061775
公开日2011年6月22日 申请日期2010年12月22日 优先权日2009年12月22日
发明者季斌, 季晓铭, 洪云海, 高霄梁 申请人:上海天伟生物制药有限公司