专利名称：脑膜炎球菌荚膜多糖多价结合疫苗，其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种脑膜炎球菌荚膜多糖多价结合疫苗，其制备方法和应用。
背景技术：
脑膜炎球菌是世界上细菌性脑膜炎最常见的病因之一，是唯一能引起脑膜炎大规 模流行的细菌。脑膜炎球菌病的迅速发展经常在发病后1或2天内导致患者死亡，或造成 严重后遗症，甚至在受到最佳医疗的病例中也是如此。化学预防可在密切接触者中防止继 发病例发生，但因为继发病例仅占全部脑膜炎球菌病的 2%，所以化学预防对控制大 多数地方性和流行性疾病价值甚小。因此，用安全有效的疫苗免疫接种是控制脑膜炎球菌 病的唯一合理的方法。在脑膜炎球菌的13个血清群中，A群、B群、C群、Wl35群和Y群可引起95%的病 例(朱展鹰等，2005)。目前国内外已有A群、C群、A+C群、A+C+Y+W135群等多种单价、二价及四价脑膜炎 多糖疫苗和结合疫苗。这些疫苗在接种人群中已证明是非常安全和有效的。不论是多糖疫苗或结合疫苗的制备过程中，荚膜多糖的制备是关键的步骤。纯化 荚膜多糖，目前多采用沉淀法和凝胶层析法，或两者相结合的方法。凝胶层析法影响因素 少，纯化环境温和，因而多糖破坏少，但费时费力，每次分离量少；而且，在相对分子质量估 计不清楚时，凝胶的选择有一定困难。沉淀法多采用乙醇、丙酮、长链季铵盐类作沉淀剂，该 方法无凝胶层析法的缺点，但纯化环境不够温和，影响因素较多。50年代，Scott首先发现 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)对酸性多糖有较强的沉淀作用，能与多糖形成季铵络合物 而沉淀多糖。目前CTAB广泛用于各种细菌荚膜多糖的纯化制备。CTAB对酸性多糖沉淀作 用较强，但对中性多糖、核酸和蛋白质等物质亦有不同程度的沉淀作用。因此，要获得成分 均一、纯度较高的荚膜多糖，必须进一步去除参杂其中的核酸和蛋白质类。目前脑膜炎荚膜多糖的常规提取工艺为1)提取复合糖将已杀菌的培养液离心 去除菌体，收集上清液，加入CTAB，充分混勻，形成沉淀，离心后的沉淀物既为复合糖。2)除 核酸加入适量lmol/L氯化钙溶液，充分研磨和搅拌，使多糖与CTAB解离；加入乙醇至终 浓度为25%，低温静止1- 或静置过夜，离心收集上清液。幻提取粗糖在上述上清液中， 补加入冷却乙醇至终浓度为75% -80%，充分搅拌后，离心收集沉淀；沉淀物用无水乙醇和 丙酮至少各洗一次，干燥后即为粗糖。4)多糖纯化将粗糖溶解于适量1/10饱和中性醋酸 钠溶液中；按1 2容量用冷酚提取数次，离心收集上清液，并用0. lmol/L氯化钙溶液或 其他适宜溶液透析或超滤除酚；加入乙醇至终浓度为75% -80%，充分搅拌后，离心收集沉 淀；沉淀物用无水乙醇和丙酮至少各洗一次，干燥后即为精糖。该流程缺点是难以控制提取 物中的核酸含量和蛋白质含量，难以获得符合规范的脑膜炎球菌多糖提取物，所以在该工 艺上进行改进获得较高纯度的产物是有实际意义的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种脑膜炎球菌荚膜多糖多价结合疫苗，其制备方法和应用。本发明提供的脑膜炎球菌荚膜多糖多价结合疫苗，包含至少两种A群、C群、Y群或 W135群脑膜炎球菌荚膜多糖与霍乱毒素B亚单位的偶联物。其中，所述的至少两种A群、C群、Y群或W135群脑膜炎球菌多糖与霍乱毒素B亚 单位的偶联物含量按多糖含量计算为4 8士4 8Χ30%μ g/ml。本发明提供的脑膜炎球菌荚膜多糖多价结合疫苗，还可包含药学上可接受的赋形 剂，赋形剂优选为乳糖，其中所述乳糖的含量为60 80mg/ml疫苗。本发明提供的脑膜炎球菌荚膜多糖多价结合疫苗，还可包含佐剂，所述佐剂为铝 盐佐剂，优选为氢氧化铝、磷酸铝或硫酸铝。其中所述的铝盐佐剂的含量(以铝含量为准) 优选为0. 2mg/ml疫苗。本发明提供的脑膜炎球菌荚膜多糖多价结合疫苗的制备发明，包括如下步骤1)往A群、C群、Y群或W135群脑膜炎球菌的培养液中加入甲醛溶液杀菌，离心去 除菌体，收集上清液；2)将步骤1)制备的上清液在8 32°C，10 2000rpm下，加入絮凝剂，pH调至 5. 0-7. 0，在电场强度为5 30v/cm的电场中进行絮凝10 120min，固液分离获得粗制荚
膜多糖；3)将步骤2)制备的粗制荚膜多糖溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中；用2倍体 积的冷酚至少提取一次，离心收集上清液，再将上清液透析或者超滤去除酚；超速离心去除 内毒素后加入乙醇至终浓度为75% -80%，充分搅拌后，离心收集沉淀；沉淀物用无水乙醇 和丙酮至少各洗一次并干燥，获得精制荚膜多糖；4)以步骤3)制备的精制荚膜多糖为半抗原，以霍乱毒素B亚单位为载体蛋白，利 用溴化氰(CNBr)活化多糖，以己二酰胼(ADH)为间隔剂，以碳二亚胺(EDAC)为连接剂偶联 获得A群、C群、Y群或W135群脑膜炎球菌多糖与霍乱毒素B亚单位的偶联物；5)将至少两种步骤4)制备的偶联物进行混合，即得脑膜炎球菌荚膜多糖多价结
合疫苗。其中，所述的絮凝剂为具有活性氨基和羟基的阳离子型絮凝剂，所述的阳离子型 絮凝剂为苯乙烯磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠、磺甲基化聚丙烯酰胺、壳聚糖和改性淀粉中的 一种或几种。根据本发明，加入的絮凝剂的量优选为10 lOOOppm，更优选为100 450ppm。本发明提供的脑膜炎球菌荚膜多糖多价结合疫苗可应用于治疗或预防脑膜炎球 菌引起的疾病的药物中。本发明对脑膜炎球菌多糖的提取工艺进行改进，提高了荚膜多糖收率和纯度，并 减低成本，适合于规模生产要求。用该方法提取的脑膜炎荚膜多糖用于和霍乱毒素B亚单 位(CTB)偶联形成偶联物，制备成2价、3价、4价脑膜炎结合疫苗可用于预防结合疫苗所含 菌群引起的流行性脑膜炎。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1提取A、C、Y、W135群脑膜炎球菌粗制多糖将低温保存的A、C、Y、W135群冻干菌种分别启开，并用普通肉水复苏后，接种至 10%羊血普通琼脂培养基，置8% CO2环境中，于37°C培养Mh。转接种至改良半综合固体培 养基，置8% CO2环境中，于37°C培养12h。继续转接种至300ml改良半综合液体培养基中， 于37°C，转速200rpm摇床里培养4h。将培养物转接至已加入半综合液体培养基的发酵罐 内，压力0. 03Mpa、通气10L/min、搅拌速度IOOrpm, pH7. O条件下，于37°C培养6 9h。于 生长对数生长期后期，加入终浓度为的甲醛杀菌。对发酵罐培养物以50L/h、12，OOOrpm 离心收集培养物上清液，测定多糖含量，低温保存。取IL上清液于带圆筒型电极的搅拌容 器中，调节温度为25°C，调pH至7. 0，先加入200ppm的主絮凝剂壳聚糖，再加入150ppm的辅 絮凝剂聚苯乙烯磺酸钠搅拌容器中电场强度为lOv/cm，作用时间20min，先以IOOOrpm转速 快速搅拌5min，再以30rpm搅拌30min，然后静置60min，离心收获沉淀，获得粗制多糖，进行 多糖含量测定，结果其荚膜多糖回收率为90. 3% (A群)、88.4% (C群)、84.9% (Y群)、 79. 4% (W135 群)。实施例2提取A、C、Y、W135群脑膜炎球菌粗制多糖上清液为实施例1中所得，提取A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖的方法与步骤 同实施例1，不同之处在于主絮凝剂的加入量为400ppm，不加辅絮凝剂，絮凝提取温度为 180C，调pH至6. 5，搅拌容器中电场强度为20v/cm，作用时间30min，先以IOOOrpm转速快速 搅拌5min，再以30rpm搅拌lOmin。其荚膜多糖回收率为78. 3% (A群)、75.9% (C群)、 71. 8% (Y 群)、60.2% (W135 群)。实施例3提取A、C、Y、W135群脑膜炎球菌粗制多糖上清液为实施例1中所得，提取A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖的方法与步 骤同实施例1，不同之处在于主絮凝剂为十二烷基苯磺酸钠，加入量为50ppm，辅絮凝剂的 加入量为50ppm，絮凝提取温度为32°C，调pH至6. 0，搅拌容器中电场强度为30v/cm，作用 时间20min，先以IOOOrpm转速快速搅拌5min，再以30rpm搅拌lOmin。其荚膜多糖回收率 为 59. 9% (A 群)、52.1% (C 群)、50.3% (Y 群)、43.6% (W135 群)。实施例4提取A、C、Y、W135群脑膜炎球菌粗制多糖上清液为实施例1中所得，提取A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖的方法与步 骤同实施例1，不同之处在于辅絮凝剂为磺甲基聚丙烯酰胺，加入量为50ppm，絮凝提取温 度为22°C，调pH至6.0，搅拌容器中电场强度为lOv/cm，作用时间20min，先以1500rpm转 速快速搅拌5min，再以30rpm搅拌30min。其荚膜多糖回收率为92. 7% (A群)、90. 2% (C 群)、89· 0% (Y 群)、82. 5% (W135 群)。实施例5提取A、C、Y、W135群脑膜炎球菌粗制多糖上清液为实施例1中所得，提取A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖的方法与步 骤同实施例1，不同之处在于主絮凝剂加入量为250ppm，辅絮凝剂为磺甲基聚丙烯酰胺， 加入量为150ppm，絮凝提取温度为8°C，调pH至7. 0，搅拌容器中电场强度为20v/cm，作用 时间30min，先以1500rpm转速快速搅拌5min，再以30rpm搅拌50min。其荚膜多糖回收率 % 94. 6% (A 群)、93.1% (C 群)、92.0% (Y 群)、80.7% (W135 群)。
实施例6提取A、C、Y、W135群脑膜炎球菌粗制多糖上清液为实施例1中所得，提取A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖的方法与步骤 同实施例1，不同之处在于主絮凝剂为150ppm的改性淀粉，辅絮凝剂的加入量为lOOppm， 絮凝提取温度为12°C，调PH至7. 0，搅拌容器中电场强度为20v/cm，作用时间20min，先以 IOOOrpm转速快速搅拌5min，再以30rpm搅拌50min。其荚膜多糖回收率为83. 5% (A群)、 81. 7% (C 群)、79.4% (Y 群)、71.8% (W135 群)。实施例7提取A、C、Y、W135群脑膜炎球菌粗制多糖上清液为实施例1中所得，提取A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖的方法与步 骤同实施例1，不同之处在于主絮凝剂为磺甲基化聚丙烯酰胺，加入量为300ppm，絮凝提 取温度为15°C，调pH至5. 0，搅拌容器中电场强度为30v/cm，作用时间20min，先以1500rpm 转速快速搅拌5min，再以30rpm搅拌50min。其荚膜多糖回收率为65. 3% (A群)、63.
(C 群)、58.9% (Y 群)、50.3% (W135 群)。实施例8提取A、C、Y、W135群脑膜炎球菌精制多糖将脑膜炎球菌粗制多糖以5-20mg/ml量溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中；用2 倍体积的冷酚提取1-3次，离心收集上清液，并用0. lmol/L氯化钙溶液透析或超滤除酚；经 超速离心法去除内毒素；加入乙醇至终浓度为75% -80%，充分搅拌后，离心收集沉淀；沉 淀物用无水乙醇和丙酮至少各洗一次，干燥后即为精制多糖。用灭菌注射用水溶解精制多 糖，再用0. 22 μ m滤器除菌过滤后分别获得A、C、Y、W135群多糖原液，保存于-20°C以下。 按《中华人民共和国药典》位010年版)规定方法测定固体总量、蛋白含量、核酸含量、磷或 唾液酸含量、0-乙酰基含量、分子大小KD ( 0. 5、KD < 0. 5的多糖回收率、鉴别试验、内毒 素含量及无菌试验等项目。结果获得A、C、Y、W135群多糖原液均符合欧洲药典标准。实施例9 A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖单价偶联物的制备分别将A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖用注射用水稀释，多糖溴化氰以质 量比1 1在pHIO 11之间活化1小时，调pH8 9之间，加入0. lmol/L己二酰胼反应 10 20min后4°C静置过夜。第2天，超滤换液，衍生后的多糖与载体蛋白CTB按质量比 1 1混合，调pH5 6加入碳亚二胺反应2 4小时。用kpharose 4FF凝胶层析，纯化 多糖-CTB偶联物，收集VO峰，再经0. 22 μ m滤器除菌过滤，获得A-CTB偶联物、C-CTB偶联 物、Y-CTB偶联物、W135-CTB偶联物。按《中华人民共和国药典》(2010年版)规定方法检 定蛋白含量、磷或唾液酸含量、多糖含量、多糖/蛋白比值、游离多糖含量、游离蛋白含量、 分子大小KD ( 0. 2、KD < 0. 2的多糖回收率、鉴别试验、内毒素含量及无菌试验等，项目合 格后储存于2-8°C备用。实施例10脑膜炎球菌结合疫苗的制备原材料包括A-CTB偶联物、C-CTB偶联物、Y-CTB偶联物、W135-CTB偶联物、氯化 钠、乳糖溶液、注射用水。(1)2价结合疫苗用注射用水稀释脑膜炎多糖-CTB偶联物(A-CTB偶联物、C-CTB偶联物、Y-CTB偶 联物、W135-CTB偶联物中任选两种)，加入氯化钠，使得成品组分及含量为各型多糖-CTB 偶联物按多糖含量计算均为4士4X30% μ g/ml，氯化钠含量为9mg/ml，乳糖含量为60mg/ ml，调 ρΗ7· 0。
(2) 3价结合疫苗用注射用水稀释脑膜炎多糖-CTB偶联物(A-CTB偶联物、C-CTB偶联物、Y-CTB偶 联物、W135-CTB偶联物中任选三种)，加入氯化钠和氢氧化铝佐剂，使得成品组分及含量 为各型多糖-CTB偶联物按多糖含量计算均为8士8X30% yg/ml，氯化钠含量为8.5mg/ ml，铝含量为0. 2mg/ml，乳糖含量为80mg/ml，调pH7. 0。4价结合疫苗用注射用水稀释A-CTB偶联物、C-CTB偶联物、Y-CTB偶联物、W135-CTB偶联物，加 入氯化钠和乳糖溶液，使得成品组分及含量为=A-CTB偶联物、C-CTB偶联物、Y-CTB偶联物、 W135-CTB偶联物按多糖含量计算均为8士8X30% μ g/ml，氯化钠含量为9mg/ml，乳糖含量 为70mg/ml，调pH7. 0，进行低温真空干燥。实验例1以幼儿的剂量免疫12_14g的小鼠，免疫2次于第1、14天皮下注射免疫，21天经 眼眶后静脉采血，以ELISA法测定脑膜炎抗体。其中，免疫组分别实施例1制备的A、C、Y、 W135各群脑膜炎球菌多糖；实施例9制备的A、C、Y、W135群各型单价结合物；实施例10制 备的4价结合疫苗；阴性生理盐水组。 结果表明，经A、C、Y、W135各群脑膜炎球菌多糖二次免疫后，小鼠血清IgG的浓度 (0D值)除A群外与生理盐水组无显著差异(P > 0. 05)；各群多糖蛋白结合物和4价脑膜 炎球菌结合疫苗免疫的小鼠，第二次采血的血清IgG的浓度(0D值)比第一次采血的血清 IgG的浓度(0D值)显著提高(P <0.01)。说明各群单价多糖蛋白结合物以及4价脑膜炎 球菌结合疫苗有很好的免疫原性，并且有明显的免疫记忆。 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰 也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种脑膜炎球菌荚膜多糖多价结合疫苗，包含至少两种A群、C群、Y群或W135群脑 膜炎球菌荚膜多糖与霍乱毒素B亚单位的偶联物。
2.根据权利要求1所述的多价结合疫苗，其特征在于，所述的至少两种A群、C群、Y 群或W135群脑膜炎球菌多糖与霍乱毒素B亚单位的偶联物含量按多糖含量计算为4 8 + 4 8X30% μ g/mL·
3.根据权利要求2所述的多价结合疫苗，还包含药学上可接受的赋形剂。
4.根据权利要求3所述的多价结合疫苗，还包含佐剂，所述佐剂为铝盐佐剂，优选为氢 氧化铝、磷酸铝或硫酸铝。
5.制备权利要求1或2所述的多价结合疫苗的方法，包括如下步骤1)往A群、C群、Y群或W135群脑膜炎球菌的培养液中加入甲醛溶液杀菌，离心去除菌 体，收集上清液；2)将步骤1)制备的上清液在8 32°C，10 2000rpm下，加入絮凝剂，pH调至 5. 0-7. 0，在电场强度为5 30v/cm的电场中进行絮凝10 120min，固液分离获得粗制荚膜多糖；3)将步骤幻制备的粗制荚膜多糖溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中；用2倍体积的 冷酚至少提取一次，离心收集上清液，再将上清液透析或者超滤去除酚；超速离心去除内毒 素后加入乙醇至终浓度为75% -80%，充分搅拌后，离心收集沉淀；沉淀物用无水乙醇和丙 酮至少各洗一次并干燥，获得精制荚膜多糖；4)以步骤3)制备的精制荚膜多糖为半抗原，以霍乱毒素B亚单位为载体蛋白，利用溴 化氰活化多糖，以己二酰胼为间隔剂，以碳二亚胺为连接剂偶联获得A群、C群、Y群或W135 群脑膜炎球菌多糖与霍乱毒素B亚单位的偶联物；5)将至少两种步骤4)制备的偶联物进行混合，即得脑膜炎球菌荚膜多糖多价结合疫田ο
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的絮凝剂为具有活性氨基和羟基的 阳离子型絮凝剂。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的阳离子型絮凝剂为苯乙烯磺酸钠、 十二烷基苯磺酸钠、磺甲基化聚丙烯酰胺、壳聚糖和改性淀粉中的一种或几种。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的絮凝剂的加入量为10 lOOOppm。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的絮凝剂的加入量为100 450ppm。
10.权利要求1 4任一项所述的脑膜炎球菌荚膜多糖多价结合疫苗在治疗或预防脑 膜炎球菌引起的疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种脑膜炎球菌荚膜多糖多价结合疫苗，其制备方法和应用。本发明公开的多价结合疫苗，包含至少两种A群、C群、Y群或W135群脑膜炎球菌荚膜多糖与霍乱毒素B亚单位的偶联物。本发明改进了脑膜炎球菌荚膜多糖的提取方法，采用电场絮凝的提取方法，提高了荚膜多糖的收率和纯度。
文档编号A61K39/095GK102078604SQ201010624040
公开日2011年6月1日 申请日期2010年12月31日 优先权日2010年12月31日
发明者任涛, 何家琦, 唐秀丽, 张明华, 张美香, 曹欣, 王婷婷, 胡鹏, 郝倩, 韩菲, 魏文进 申请人:北京民海生物科技有限公司, 深圳康泰生物制品股份有限公司