预防和治疗高渗透性的方法

专利名称：预防和治疗高渗透性的方法
预防和治疗高渗透性的方法本发明涉及预防和治疗内皮细胞和上皮细胞中的高渗透性的方法。内皮细胞和上皮细胞在人类和动物体的所有组织和器官中具有重要的功能。内皮由内皮细胞的薄层组成。内皮细胞的层尤其形成血管(如静脉和毛细血管)的内表面，以及在血液和血管外壁之间的屏障。内皮细胞内衬整个血液系统，从大的血管到最小的毛细血管。上皮细胞形成单层或多层的细胞层，其覆盖人类和动物器官的所有内部和外部体表。上皮细胞相互紧邻，有丰富的细胞接触。对于上皮细胞，朝向外部或腔的外侧、 顶面以及基底面可以产生区别。此外，上皮细胞具有粘附复合物(连接复合物)，由闭锁小带 (紧密连接)、附着小带(附着连接)和桥粒(斑点附着)组成，其一方面呈现出物理化学的屏障，另一方面互连相邻的上皮细胞。对于所有动物和人类器官和细胞器的生理功能，完整性，特别是限制细胞和细胞层的完整性是极其重要的。如果，例如，存在着内皮细胞的损伤或血管的内皮的损伤，液体可以逃离血管，引起整个生物体的生命力的大的扰动。如果，例如，存在着上皮细胞的损伤或器官的上皮的损伤，液体可以逃离器官，或者液体可能穿透，因而严重破坏器官的功能性。内皮和上皮的损伤可以导致所谓的高渗透性(Hyperpermeabilit^it)，S卩，液体从血管到生命重要器官和组织的不受控制的穿过。除了机械原因之外，感染或毒素的影响可能引起高渗透性。微生物毒素是结合胆固醇的成孔分子，其由革兰氏阳性细菌释放。由于毒素的作用，首先在细胞膜中形成孔洞， 然后是形成大孔。因而，细胞层变为对于液体和其中含有的物质是可透过的。已知的毒素由，尤其是，来自单核细胞增多性利斯特氏^Listeria ffloflc^j^ogefles)的禾Ij其jf特菌素，以及来自月市炎链球菌("ire/ 如⑶⑶狀腫的月市炎球菌溶血素。这些毒素可以引起细胞中反应性氧分子的形成。由毒素引起的反应性氧分子然后引起对内皮和上皮的损伤，尤其是由于细胞的屏障功能被破坏的事实。为了保留内皮细胞层和上皮细胞层的屏障功能，细胞通过蛋白质纤维相互连接。 这样的蛋白质纤维的成分有，例如，肌球蛋白轻链。然而，由于肌球蛋白轻链的磷酸化，在细胞和细胞-细胞连接中产生压力，并形成细胞间的空隙，从而液体可以以不受控制的方式流入和流出。在上皮细胞和内皮细胞的屏障功能的调节中进一步的成分是蛋白激酶C。对于蛋白激酶C，已知多种同工酶，例如，蛋白激酶α和ζ。这些蛋白激酶C同工酶被反应性氧分子、过氧化氢、微生物毒素如肺炎球菌溶血素和利斯特菌素以及亲水性冠状病毒蛋白质活化。活化的蛋白激酶C另外引起上皮的钠通道(ENaC)表达的降低，其对上皮细胞中钠和液体转运负责，因而，活化的蛋白激酶C实质上促进高渗透性的形成。在肺中高渗透性的形成的另一原因是，例如，病毒，如流感病毒、严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARS-C0V)或呼吸道合胞体病毒，它们可以引起内皮和上皮的高渗透性，以及非典型性肺炎。已知的是，SARS-CoV蛋白质由于蛋白激酶C同种型的活化引起上皮钠通道的大小和活性的降低，其促使高渗透性发生。还已知的的是，对于这些肺部病毒疾病，经常使用的β 2-肾上腺素能的激动剂不显示效果。因而，总起来说，已知的是，微生物毒素引起内皮和上皮细胞中反应性氧分子的提高的水平。这导致肌球蛋白轻链的磷酸化，其进而引起细胞-细胞相互作用的紊乱以及高渗透性的形成。微生物毒素、反应性氧分子以及病毒蛋白质引起蛋白激酶C同工酶的活化。蛋白激酶C的活化然后引起上皮钠通道(ENaC)的表达的降低以及它的活性的抑制。这些机制也引起内皮和上皮中高渗透性的形成。肺组织的高渗透性是肺部各种疾病的重要部分，例如，急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、肺炎(Pneumonie)。当前，对于治疗内皮和上皮的高渗透性没有标准的疗法。US 2003/0185791 Al、EP 2009023 Al、WO 2006/013183 Al、EP 1264559 Al 和 Marquardt 等人(J. Pept. Sci. 13 (2007) 803-810)公开了用于治疗水肿的 TNF-衍生的肽。因而本发明的目的是提供手段和方法，通过所述手段和方法，在治疗中防止上皮细胞和内皮细胞的高渗透性起到重要作用的那些疾病，特别是肺部疾病，如急性肺损伤、 ARDS或病毒性肺部疾病可以被预防或治疗。特别地，本发明提供了生物学有效的分子，用于内皮和上皮的高渗透性的预防和治疗，以及用于急性肺损伤和肺炎的结果的预防和治疗。因而，本发明涉及一种肽，其由7-17个相邻的氨基酸组成，并且包含六聚体 TX1EX2X3E,其中W和\能够是任何天然或非天然氨基酸，其中所述肽没有TNF受体结合活性，并且是环化的，用于上皮细胞和内皮细胞的高渗透性的预防和治疗。优选地，本发明涉及一种肽，其由7-17个相邻的氨基酸组成，并且包含六聚体 TPEGAE (SEQ ID NO. 4)，其中所述肽没有TNF受体结合活性，并且是环化的，用于上皮细胞和内皮细胞的高渗透性的预防和治疗。本发明的一个特别优选的实施方案涉及由选自以下以及其至少7个氨基酸的片段构成的组的连续氨基酸的序列组成的环化的肽
-QRETPEGAEAKPffY (SEQ ID No. 5) -PKDTPEGAELKPffY (SEQ ID No. 6) -CGQRETPEGAEAKPffYC (SEQ ID No. 1)禾口 -CGPKDTPEGAELKPffYC (SEQ ID No. 7)
所述片段包含六聚体TPEGAE，用于制造用于预防和治疗上皮细胞和内皮细胞的高渗透性的药物。根据本发明的肽优选地被用于预防肺炎、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征 (ARDS)或细菌或病毒性肺部疾病，特别是单核细胞增多性利斯特氏菌、肺炎链球菌、流感病毒、SARS或RSV的感染的爆发，或用于治疗它们。根据本发明可以被治疗或预防的肺炎的病因与肺炎的病因无关，并且与它是急性还是慢性炎症无关。因而，根据本发明，优选的，由细菌、病毒、支原体、原生动物、蠕虫或真菌的感染引起的肺炎可以被治疗，还有毒性地(例如， 通过有毒物质的吸入)或免疫性地引起肺炎，或由辐射引起的肺炎(例如，X-射线、在癌症患者中放射治疗)。特别是对于由有毒物质的吸入或辐射引起的肺炎，本发明的预防性的方面是特别关键的，然而，对于卧床不起的人，特别是老年人或免疫受损的人，如HIV患者或移植患者也是一样。特别地，根据本发明，当在χ-射线上还未能识别到损伤时可以对抗或预防肺炎。原发性肺炎病原体大多数是肺炎球菌、葡萄球菌、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、支原体、衣原体、军团菌(嗜肺性军团病杆菌(Legionella pneumophila)) 和病毒如流感病毒、腺病毒和副流感病毒。对于继发性肺炎，病原体的谱移动到疱疹病毒 (CVM, HSV)、真菌、耶氏肺孢子虫(Pneumocystis jirovecii)、原生动物(弓形体病)以及厌氧细菌。特别地，根据本发明，由这些病原体引起的肺炎分别是特别优选的可治疗或(特别是对于继发性肺炎)可预防的。根据本发明的肽例如是根据欧洲专利EP 1264599 Bl已知的，在现有技术中被提出用于液体积存(肺水肿)的治疗，特别是用于这些液体积存的重吸收，其中水肿液体从肺组织的肺泡返回到毛细血管，即，泵出肺泡。根据本发明，完全地令人惊讶地展现的是，这些肽还影响通过毛细血管的内皮进入肺部上皮的反向的液体流动，然而，是以相反的方式对于水肿的治疗来说，液体的运出需要开放和完全活性的泵送机制，根据本发明，液体进入肺部的通路被停止；因而首先阻止了流入(Zustrom)。因而根据EP 1264599 Bl通过根据本发明的肽的水肿再吸收的活化看起来与根据本发明的高渗透性的降低相比是基于完全不同的机制，——按照相反的方向和以调节的方式运动，本发明基于内皮和上皮层的损伤，从而通过避免液体转移到肺泡中防止了水肿。因而，使用本发明，对于根据本发明的肽打开了全新的和令人惊讶的适应症，——除了根据EP 1264599 Bl的水肿治疗之外的(其仅在疾病进程的后期阶段出现)。因而，本发明基于这样的状况，其也在本发明的起作用过程内出现，在EP 1 264 599 Bl中定义的根据本发明使用的肽影响毒素、反应性氧分子的作用、蛋白激酶C的活化、 肌球蛋白轻链的磷酸化以及上皮钠通道的表达。这是根据关于这些肽的现有知识不可预计的。根据本发明的非常特别优选的肽由氨基酸序列CGQRETPEGAEAKPWYC组成，并且通过C残基(处在位置1和17的)环化。根据本发明的肽的环化可以通过用N和C末端处的两个C残基之间的二硫键直接环化，或通过通过这两个半胱氨酸偶联到载体物质上来实现。因此，在根据本发明的肽中，半胱氨酸残基优选地提供在分子的开头和结尾。也可以使用实现肽的环化的其他官能团，例如，用与胺或醇产生酰胺或酯环闭合的酸基团(对于这些，例如，氨基酸天冬氨酸和谷氨酸可以与丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或赖氨酸优选地分子内环化)。因而，根据本发明的进一步优选的肽是，例如，CGQKETPEGAEAKPffYC (SEQ ID NO. 8), CGQRETPEGAEARPffYC (SEQ ID NO. 9)、CGQRETPEGAEAKPC (SEQ ID NO. 10)、 CQRETPEGAEAKPffYC (SEQ ID NO. 11)或 CGQRETPEGAEAKFWYC (SEQ ID NO. 12)。作为载体物质，可以使用所有常见的药学上可用的物质，例如，其能够与半胱氨酸的SH基团形成共价键，其中常见的载体蛋白，如钥孔戚血蓝素(KLH)、破伤风毒素等等是特别适合的。也可以在载体上提供相邻的双功能残基(例如，在胺或醇基团旁边的酸基团)。在这一点上，重要的是“环化”包含分子内的环闭合，以及载体的整合(从结合的肽从所述载体上突出(肽的N和C末端结合到载体上))，其中以这样的方式环化的肽显示了环状的空间结构，并且被相应稳定化。根据本发明的肽可以优选地用于保护上皮细胞和内皮细胞对抗由反应性氧分子或由细菌毒素引起的高渗透性。根据本发明的肽还可以用于抑制肌球蛋白轻链的磷酸化，抑制所述蛋白激酶C的活化或提高上皮钠通道的表达。这一点上，根据本发明的肽可以用于治疗由反应性氧分子、微生物毒素、革兰氏阳性微生物或肺部的病毒感染引起的高渗透性。根据进一步的方面，本发明涉及含有根据本发明的肽(或根据本发明的各种肽的混合物)和药物载体的药物组合物。根据本发明，这种药物组合物被用于预防和治疗高渗透性，如上所述，特别是用于预防和治疗肺炎、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)或病毒性肺部疾病，特别是单核细胞增多性利斯特氏菌、肺炎链球菌、SARS、RSV或流感病毒，特别是A型流感病毒的感染。术语“药物组合物”是指包含上文定义的肽的任何组合物，所述肽防止、增强或治愈在此描述的状况。特别地，术语“药物组合物”是指具有如上所述的肽和药学上可接受的载体或赋形剂(两个术语可互换地使用)的组合物。技术人员已知的适合的载体或赋形剂是食盐水溶液、林格液、葡萄糖溶液、Hank-溶液、不挥发油类、油酸乙酯、 5%葡萄糖食盐水溶液、改善等渗性和化学稳定性的溶液、缓冲液和防腐剂。进一步适合的载体包括任何载体，其不诱导自身抗体的产生，所述抗体对于接受组合物的个体是有害的， 例如，蛋白质、多糖、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚氨基酸和氨基酸共聚物。这一点上，根据本发明的肽可以通过直接共价键环化到这些载体上。这种药物组合物可以(作为药物)使用技术人员已知的任何适合的方法来施用。优选的施用途径是胃肠外的，特别是通过吸入(用气雾剂)或静脉内的施用。对于胃肠外施用，本发明的药物与上文定义的药学上可接受的赋形剂一起被配制在可注射的单位剂型中，如溶液、悬浮液或乳剂。然而，剂量和施用类型取决于个体。一般地，如此施用药物，使得本发明的肽以1 yg/kg和10 mg/kg之间、更优选的10 yg/kg和5 mg/kg、最优选的0. 1和2 mg/kg之间的剂量施用。优选的，它作为推注剂量 (Bolus-Dosis)来施用。也可以使用连续的输注。在这种情况下，药物可以以5和20 μ g/ kg/分钟之间、更优选的7和15 μ g/kg/分钟之间的剂量输注。根据本发明，根据本发明的特别优选的肽具有以下氨基酸序列SEQ ID NO. 1 (NH2 ) Cys-Gly-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala-Lys-Pro-Trp-Tyr-Cys (COOH)0培养的肺部的内皮细胞中反应性氧分子浓度的测定表明，在21%的标准氧含量 (含氧量正常的气体混合物)下内皮细胞的培养时，仅有反应性氧分子的少量形成。然而，缺少氧时(0. 1%的氧，低氧含量气体混合物)，存在着3倍高的反应性氧分子形成。然而，如果根据本发明的肽，特别是SEQ ID NO. 1的肽被添加给在缺少氧(氧含量0.1%，低氧含量气体混合物)下培养的内皮细胞，令人惊讶地，内皮细胞没有形成反应性氧分子。进一步的分析通过在添加微生物毒素肺炎球菌溶血素和利斯特菌素之前、期间和之后的电学的细胞-底物阻抗分析的方式，确定了人类内皮和上皮细胞的细胞层的电阻。 实验表明，向培养的人类内皮细胞添加125 ng/ml和250 ng/ml的利斯特菌素，启动了高渗透性的形成。这个过程通过250 ng/ml的利斯特菌素毒素浓度进一步增强。向培养的人类内皮细胞添加62. 5 ng/ml的肺炎球菌溶血素也引起高渗透性的形成。这个过程通过125ng/ml的肺炎球菌溶血素毒素浓度进一步增强。然而，令人惊讶地发现，添加根据本发明的肽，特别是50 yg/ml的肽SEQ ID NO. 1，肺炎球菌溶血素诱导的以及利斯特菌素诱导的高渗透性被抑制。进一步的分析表明，高渗透性也可以通过微生物毒素在人上皮细胞中诱导。因而， 人上皮细胞与ι μ g/mi利斯特菌素的孵育引起明确的高渗透性。然而，令人惊讶地发现的是，添加根据本发明的肽，特别是50 μ g/ml的肽SEQ ID NO. 1，高渗透性被抑制。进一步的分析表明，向人类内皮肺细胞添加125 ng/ml的毒素利斯特菌素引起磷酸化的肌球蛋白轻链的含量的提高。这个效应通过250 ng/ml的利斯特菌素毒素浓度进一步增强。向人类内皮肺细胞添加62. 5 ng/ml的毒素肺炎球菌溶血素也引起磷酸化的肌球蛋白轻链的相对含量的提高。这个效应通过125ng/ml的肺炎球菌溶血素毒素浓度进一步增强。然而，令人惊讶地发现的是，添加根据本发明的肽，特别是50 μ g/ml的肽SEQ ID NO. 1，抑制了由毒素利斯特菌素和肺炎球菌溶血素引起的肌球蛋白轻链的磷酸化。进一步的分析表明，在小鼠中毒素的气管内施用，小鼠肺部的高渗透性被触发，通过从血管进入肺组织的伊文思蓝染料的穿过所证实。然而，令人惊讶地发现的是，根据本发明的肽的气管内的施用，特别是50 yg的肽SEQ ID NO. 1，导致对毒素引起的高渗透性的抑制。进一步的分析表明，通过触发小鼠肺部的高渗透性，由毒素例如250 ng肺炎球菌溶血素的气管内施用所触发，在支气管肺泡的液体中存在提高数量的白细胞。然而令人惊讶地发现的是，根据本发明的肽的气管内施用，特别是50 μ g的肽SEQ ID NO. 1，高渗透性的毒素相关的形成被抑制，并且在小鼠的肺部中支气管肺泡液中存在明显更少的白细胞。进一步的分析表明，细菌毒素引起肺部的人类内皮细胞中活化的蛋白激酶C α的含量的大幅度提高。然而令人惊讶地发现的是，根据本发明的肽的添加，特别是肽SEQ ID Ν0. 1，抑制了这种毒素介导的效应，因而引起上皮钠通道的表达的提高。令人惊讶地还发现的是，根据本发明的肽向人上皮的细胞添加，特别是肽SEQ ID N0. 1，引起了上皮钠通道 (ENaC)的表达的大幅度提高。现在将在以下的实施例和附图的基础上更详细地解释本发明，本发明不应限于所述实施例和附图。附图IA显示了具有氨基酸序列SEQ ID NO. 1的蛋白质的HPLC层析谱。单位y 轴“吸收，单位为mAU” ；χ轴“时间，单位为分钟”。附图IB显示了具有氨基酸序列SEQ ID N0. 2的蛋白质的HPLC层析谱。单位y 轴“吸收，单位为mAU” ；χ轴“时间，单位为分钟”。附图IC显示了具有氨基酸序列SEQ ID N0. 3的蛋白质的HPLC层析谱。单位y 轴“吸收，单位为mAU” ；χ轴“时间，单位为分钟”。附图2A显示了内皮细胞的电子顺磁共振(EPR)谱，它们是在21%氧气(含氧量正常的气体混合物)或0. 1%氧气(含氧量低的气体混合物)中培养的，分别有和没有肽SEQ ID NO. 1或肽SEQ ID N0. 3的添加。附图2B显示了内皮细胞中反应性氧分子(过氧化物)的相对含量，它们是在21%氧气(含氧量正常的气体混合物)或0. 1%氧气(含氧量低的气体混合物)下分别有和没有添加肽SEQ ID NO. 1培养的，或在0. 1%氧气(含氧量低的气体混合物)下有和没有添加肽SEQ ID N0. 3培养的。
附图3A显示了没有添加毒素利斯特菌素以及在添加125 ng/ml的利斯特菌素 (125 ng/ml的LL0)之后和在添加500 ng/ml的利斯特菌素(500 ng/ml的LL0)之后人类肺部上皮细胞的电阻的曲线。附图;3B显示了没有添加毒素肺炎球菌溶血素以及在添加62. 5 ng/ml的肺炎球菌溶血素(62. 5 ng/ml的PLY)之后和在添加250 ng/ml的肺炎球菌溶血素(250 ng/ml的 PLY)之后人类肺部上皮细胞的电阻曲线。附图3C显示了没有添加毒素肺炎球菌溶血素/肽SEQ ID NO. 1 (对照)以及在添加125 ng/ml的肺炎球菌溶血素(125 ng/ml的PLY)之后，和在添加125 ng/ml的肺炎球菌溶血素/50 μ g/ml 的肽 SEQ ID NO. 1 (125 ng/ml 的 PLY/50 μ g/ml 的肽 SEQ ID NO. 1)之后人类肺部上皮细胞的电阻曲线。附图3D显示了没有添加毒素利斯特菌素/肽SEQ ID NO. 1 (对照)以及在添加 500 ng/ml的利斯特菌素(500ng/ml的LL0)之后，和在添加500ng/ml的利斯特菌素/50 μ g/ml 的肽 SEQ ID NO. 1 (500 ng/ml 的 LL0/50 μ g/ml 的肽 SEQ ID NO. 1)之后人类肺部上皮细胞的电阻曲线。附图3E显示了没有添加毒素利斯特菌素/肽SEQ ID NO. 1 (对照)以及在添加1 μ g/ml的利斯特菌素(1 μ g/ml的LL0)之后，和在添加1 μ g/ml的利斯特菌素/50 μ g/ ml 的肽 SEQ ID NO. 1 (1 μ g/ml 的 LL0/50 μ g/ml 的肽 SEQ ID NO. 1)之后人类肺部上皮细胞的电阻曲线。附图4A显示了取决于毒素利斯特菌素的浓度(125 ng/ml的LL0，250 ng/ml的 LL0, 500 ng/ml的LL0)，人类肺部内皮细胞中磷酸化的肌球蛋白轻链的相对含量。附图4B显示了取决于毒素肺炎球菌溶血素的浓度(62. 5 ng/ml的PLY，125ng/ml 的PLY，250ng/ml的PLY)，人类肺部内皮细胞中磷酸化的肌球蛋白轻链的相对含量。附图4C显示了取决于添加50 μ g/ml的肽SEQ ID N0. 1、250 ng/ml的毒素利斯特菌素(LL0)，50 μ g/ml 的肽 SEQ ID NO. 1/250 ng/ml 的毒素利斯特菌素(LL0)，50 μ g/ ml的肽SEQ ID NO. 3/250 ng/ml的毒素利斯特菌素(LL0)，人类肺部内皮细胞中磷酸化的肌球蛋白轻链的相对含量。附图4D显示了取决于添加50 μ g/ml的肽SEQ ID N0. 1、125ng/ml的毒素肺炎球菌溶血素(PLY)，50 μ g/ml的肽SEQ ID NO. l/125ng/ml的毒素肺炎球菌溶血素(PLY)， 50 μ g/ml的肽SEQ ID NO. 3/125ng/ml的毒素肺炎球菌溶血素(PLY)，人类肺部内皮细胞中磷酸化的肌球蛋白轻链的相对含量。附图5A显示了在以剂量250 ng肺炎球菌溶血素每小鼠(250 ng的PLY)和500 ng肺炎球菌溶血素每小鼠(500 ng的PLY)的毒素肺炎球菌溶血素气管内的施用之后5. 5 小时小鼠肺组织中伊文思蓝染料的含量。附图5B显示了在250 ng毒素肺炎球菌溶血素每小鼠的气管内的施用之后，以及 250 ng毒素肺炎球菌溶血素和50 μ g肽SEQ ID NO. 1每小鼠的气管内的施用之后5. 5小时，小鼠肺组织中伊文思蓝染料的含量。附图5C显示了在250 ng毒素肺炎球菌溶血素每小鼠的气管内施用之后，以及250 ng毒素肺炎球菌溶血素和50 μ g肽SEQ ID NO. 1每小鼠的气管内施用之后5. 5小时，肺部中支气管肺泡液中白细胞的含量。
附图6表明了取决于人类内皮肺细胞与250 ng/ml的毒素肺炎球菌溶血素(250 ng/ml的PLY)和由250 ng/ml毒素肺炎球菌溶血素和50 μ g/ml肽SEQ ID NO. 1组成的混合物(250 ng/ml的PLY/50 μ g/ml肽SEQ ID NO. 1)的孵育，相对于蛋白激酶C α的总体含量的，活化的蛋白激酶C α的含量。附图7显示了与没有进行添加，在添加50 μ g/ml的肽SEQ ID NO. 1之后，以及添加50 μ g/ml的肽SEQ ID NO. 3之后的细胞培养物条件相比，在人肺上皮细胞中上皮钠通道(ENaC)的表达。ENaC的mRNS的含量使用“实时PCR”测定。附图8显示了患有病毒性肺炎(组1 阴性对照(PBS);组2 阳性对照(通过鼻子的 A型流感)；组3:通过鼻子的A型流感+气管内的10 yg肽SEQ ID NO. 1)的测试动物的体重的改变。附图9显示了这些组1到3的测试动物的体温的改变。附

图10显示了这些组1到3的测试动物的存活率。
实施例实施例IA 具有氨基酸序列SEQ ID NO. 1的肽的合成
具有氨基酸序列SEQ ID NO. 1的肽使用Fmoc固相合成按照以下步骤完全自动化地合
成
步骤过程产物1氨基酸的偶联结合到固相的肽2从固相脱离在溶液中的肽3纯化作为TFA盐的纯化的肽4纯化/盐交换作为乙酸盐的纯化的肽5分析实验纯化的肽
随后，肽SEQ ID NO. 1通过氨基酸半胱氨酸(位置1)和半胱氨酸(位置17)的侧链之间二硫键的氧化形成来环化。随后，使用反相HPLC来检查所述肽，其中获得在附图IA中显示的结果。肽SEQ ID NO. 1的纯度高于95%。附图IB 具有氨基酸序列SEQ ID N0. 2的肽的合成 SEQ ID No. 2
(NH2) Lys-Ser-Pro-Gly-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala-Lys-Pro-Trp-Tyr-Glu (C00H)，
其中在赖氨酸Lys (1)的侧链的氨基基团与谷氨酸Glu (19)的侧链的羧基基团之间形成酰胺键。具有氨基酸序列SEQ ID N0. 2的肽使用Fmoc固相合成以以下步骤完全自动化地合成
步骤过程产物1氨基酸的偶联结合到固相的肽2从固相脱离在溶液中的肽3纯化作为TFA盐的纯化的肽4纯化/盐交换/氧化环化作为乙酸盐的纯化的肽5分析实验纯化的肽
环化通过用谷氨酸(位置19)的Y-羧基基团与赖氨酸(位置1)的氨基基团的连
9接形成酰胺键来发生。例如，这通过将谷氨酰胺基团的Y-羧基基团借助二环己基碳二亚胺(DHC)转变为活性的酯，所述活性酯随后与赖氨酸的ε -氨基基团自发地反应，形成肽中的环闭合来实现。随后，使用反相HPLC来检查所述肽，其中获得在附图IB中显示的结果。肽SEQ ID NO. 2的纯度高于95%。附图IC 具有氨基酸序列SEQ ID NO. 3的肽的合成 SEQ ID No. 3
(NH2) Cys-Gly-Gln-Arg-Glu-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ala-Ala-Lys-Pro-Trp-Tyr-Cys (COOH)
(NH2) Cys-Gly-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala-Lys-Pro-Trp-Tyr-Cys (COOH)
具有氨基酸序列SEQ ID NO. 3的肽使用Fmoc固相合成以以下步骤完全自动化地合
成
步骤过程产物1氨基酸的偶联结合到固相的肽2从固相脱离在溶液中的肽3纯化作为TFA盐的纯化的肽4纯化/盐交换作为乙酸盐的纯化的肽5分析实验纯化的肽
随后，肽SEQ ID NO. 3通过氨基酸半胱氨酸(位置1)和半胱氨酸(位置17)的侧链之间二硫键的氧化形成来环化。随后，使用反相HPLC来检查所述肽，其中获得在附图IC中显示的结果。肽SEQ ID NO. 3的纯度高于95%。肽SEQ ID N0. 3和肽SEQ ID NO. 1之间的差异在于，肽SEQ ID NO. 1的氨基酸 Thr (6)、Glu (8)禾口 Glu (11)在肽 SEQ ID N0. 3 中被 Ala (6)、Ala (8)禾口 Ala (11)替代。实施例2 肽SEQ ID NO. 1对反应性氧分子的影响内皮细胞的细胞培养
内皮细胞的细胞培养借助添加和不添加50 μ g/ml的肽SEQ ID N0. 1，或添加和不添加50 μ g/ml的肽SEQ ID NO. 3来进行。对于反应性氧分子的产生，动脉的内皮细胞在0. 1%氧气、5% 二氧化碳和94. 9%氮气的缺氧的气体混合物(含氧量低的气体混合物)中培养。在对照实验中，气体浓度是21% 氧气、5% 二氧化碳和74%氮气(含氧量正常的气体混合物)。在缺氧条件下90分钟之后，内皮细胞用21%氧气进一步培养30分钟。此后，将由 20 口]\11-羟基-3-甲氧羰基-2，2，5，5-四甲基吡咯烧!1(1((腿)、20 μ M DPBS.25 μ M 去铁草酰胺和5 μ M 二乙基二硫代氨基甲酸酯组成的20 μ 1的溶液以及2 μ 1的DMSO添加至细胞。细胞的胰蛋白酶消化
在细胞培养之后，通过添加胰蛋白酶溶液以实验室中常规的方式分离细胞。内皮细胞经洗涤并悬浮在35 μ 1的溶液中，所述溶液由DPBS和25 μ M去铁草酰胺和5 μ M 二乙基二硫代氨基甲酸酯组成。
电子顺磁共振(EPR)的测量
电子顺磁共振(Era)，也称为电子自旋共振的测量提供了顺磁物质的探查，例如，用于反应性氧分子中不成对电子(氧的自由基)的检测。为此，将早先处理的细胞置入50 μ 1毛细管，在Magnettech公司(Berlin，德国) 的MinKcope MS200 ESR中以40 mW微波、3000 mG调幅、100 kHz调频下检查。如附图2A和2B所示，21%的标准氧浓度(含氧量正常的气体混合物)下，仅少量形成反应性氧分子。在缺氧(0. 1%氧气，含氧量低的气体混合物)下，存在着反应性氧分子的 3倍高的形成。然而，如果肽SEQ ID NO. 1被添加给在缺氧(氧含量0. 1%，含氧量低的气体混合物)下培养的内皮细胞，则没有由内皮细胞形成的反应性氧分子。与肽SEQ ID NO. 1相反，向在缺氧(氧含量0. 1%，含氧量低的气体混合物)下培养的内皮细胞添加肽SEQ ID NO. 3不引起内皮细胞的反应性氧分子形成的抑制作用。肽SEQ ID NO. 3和肽SEQ ID NO. 1之间的差异在于，肽SEQ ID NO. 1的氨基酸 Thr (6)、Glu (8)和 Glu (11)在肽 SEQ ID N0. 3 中被替换为 Ala (6)、Ala (8)禾口 Ala (11)。实施例3 通过肽SEQ ID NO. 1的内皮细胞和上皮细胞中高渗透性的抑制作用材料
H441型的人类肺部上皮细胞获自ATTC公司。分离自肺的毛细管的人类肺部内皮细胞获自Lonza公司。微生物毒素利斯特菌素(LLO)和肺炎球菌溶血素(PLY)获自Giessen大学。细胞培养
分离自肺的毛细管的人类肺部内皮细胞以实验室常规方式培养。H441型肺上皮细胞在带有添加剂2 mM L 一谷氨酰胺、1. 5 g/Ι碳酸氢钠、4. 5 g/1 葡萄糖、10 mM HEPES缓冲液pH 7. 4、10%牛血清的商业的RPMI 1640培养基中以实验室常规方式培养。ECIS实验在无血清培养基中进行。高渗透性
为了引起高渗透性，即，内皮细胞和上皮细胞的损伤，人肺上皮细胞以及人肺内皮细胞以实验室常规方式培养，直到形成连续的细胞层，随后，分别添加毒素利斯特菌素或肺炎球菌溶血素。穿内皮电阻的测定
在向人类内皮细胞添加微生物毒素肺炎球菌溶血素和利斯特菌素之前、期间和之后， 通过电学的细胞-底物阻抗分析的方式检测细胞层的电阻(穿内膜电阻)。如附图3A显示的，随着向培养的人类内皮细胞添加125 ng/ml的利斯特菌素，电阻降低。这导致高渗透性形成。这种作用在使用更高数量的500 ng/ml的利斯特菌素时更加显著。如附图;3B显示的，随着向培养的人类内皮细胞添加62. 5 ng/ml的肺炎球菌溶血素，电阻降低。这导致高渗透性形成。这种作用在使用更高数量的250 ng/ml的肺炎球菌溶血素时更加显著。如附图3C显示的，随着向培养的人类内皮细胞添加125 ng/ml的肺炎球菌溶血素，电阻降低。这导致高渗透性形成。然而，由毒素肺炎球菌溶血素的添加引起的高渗透性通过添加50 μ g/ml的肽SEQ ID NO. 1被抑制。如附图3D显示的，随着向培养的人类内皮细胞添加500 ng/ml的利斯特菌素，电阻降低。这导致高渗透性形成。然而，由毒素利斯特菌素的添加引起的高渗透性通过添加 50 μ g/ml 的肽 SEQ ID NO. 1 被抑制。如附图3E显示的，随着向培养的人类上皮细胞添加1 μ g/ml的利斯特菌素，电阻降低。这导致高渗透性形成。然而，由毒素利斯特菌素的添加引起的高渗透性通过添加50 μ g/ml的肽SEQ ID NO. 1被抑制。实施例4 通过肽SEQ ID NO. 1的肌球蛋白轻链磷酸化的抑制作用材料
分离自肺的毛细管的人类肺部内皮细胞获自Lonza公司。微生物毒素利斯特菌素(LLO)和肺炎球菌溶血素(PLY)获自Giessen大学。细胞培养
分离自肺的毛细管的人类肺部内皮细胞以实验室常规方式培养。肌球蛋白轻链磷酸化的测定
为了测定肌球蛋白轻链的磷酸化以及肽SEQ ID NO. 1对磷酸化的影响，早先培养的人类肺部内皮细胞用含有ImM原钒酸盐的磷酸盐缓冲液pH 7. 4洗涤。细胞内含物通过用20 mM Tris缓冲液(pH 7. 4),150 mM mol/1 NaClU mM EDTAU mM EGTAU % Triton X-100、 2.5 mM焦磷酸钠、1 mM β-甘油磷酸酯、1 mM钒酸钠、1 μ g/ml的亮肽素、1 mM苯甲磺酰氟的溶液孵育来裂解。此外，细胞用超声消化。细胞溶胞产物进行离心以获得可溶组分。可溶的细胞溶胞产物随后以实验室常规的方式施加到变性的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳上，根据蛋白质的质量分离蛋白质。此后，蛋白质转移到硝化纤维膜上。蛋白质印迹用0. 1% Tween 20和5%干奶粉的溶液以实验室中常规的方式处理1小时。随后，蛋白质印迹与对准(richten gegen)肌球蛋白轻链或磷酸化的肌球蛋白轻链的抗体孵育。为了使得肌球蛋白轻链或磷酸化的肌球蛋白轻链可见，以实验室中常规的方式利用化学发光在诊断薄膜上使得抗体可见。使用光密度测定法测量信号强度，测定肌球蛋白轻链与磷酸化的肌球蛋白轻链的比例。如附图4A所示，向人类内皮肺细胞添加125 ng/ml的毒素利斯特菌素引起磷酸化的肌球蛋白轻链的相对含量的提高。这个效应通过250ng/ml的利斯特菌素毒素浓度进一步增强。如附图4B所示，向人类内皮肺细胞添加62. 5 ng/ml的毒素肺炎球菌溶血素引起磷酸化的肌球蛋白轻链的相对含量的提高。这个效应通过125ng/ml的肺炎球菌溶血素毒
素浓度进一步增强。如附图4C所示，向人类内皮肺细胞添加125 ng/ml的毒素利斯特菌素引起磷酸化的肌球蛋白轻链的相对含量的提高。添加50 μ g/ml肽SEQ ID NO. 1对磷酸化的肌球蛋白轻链的含量没有影响。通过添加50 μ g/ml的肽SEQ ID NO. 1,250 ng/ml的毒素利斯特菌素对磷酸化肌球蛋白轻链含量的提高被抑制。肽SEQ ID N0. 3对毒素利斯特菌素介导的磷酸化肌球蛋白轻链的含量提高没有影响。如附图4D所示，向人类内皮肺细胞添加125 ng/ml的毒素肺炎球菌溶血素引起磷酸化的肌球蛋白轻链的相对含量的提高。添加50 μ g/ml肽SEQ ID NO. 1对磷酸化的肌球蛋白轻链的含量没有影响。通过添加50 μ g/ml的肽SEQ ID NO. 1，125ng/ml的毒素肺炎球菌溶血素对磷酸化肌球蛋白轻链含量的提高被抑制。肽SEQ ID NO. 3对毒素肺炎球菌溶血素介导的磷酸化肌球蛋白轻链的含量提高没有影响。肽SEQ ID NO. 3和肽SEQ ID NO. 1之间的差异在于，肽SEQ ID NO. 1的氨基酸 Thr (6)、Glu (8)和 Glu (11)在肽 SEQ ID N0. 3 中被替换为 Ala (6)、Ala (8)禾口 Ala (11)。实施例5 肽SEQ ID NO. 1对动物模型中高渗透性和急性肺破坏的影响小鼠中高渗透性的诱导
在准备肺之前，实验室小鼠用异氟烷/氧气的混合物，以及用100 μ 1每小鼠的氯胺酮 /甲苯噻嗪的混合物(1.33:1)气管内地处理。在麻醉之后，静脉导管植入到小鼠中。为了诱导肺的高渗透性，25 μ 1的液体随后用精细注射器喷雾到肺中。所述液体含有0.9%食盐水溶液或250 ng的毒素肺炎球菌溶血素或250 ng/ml的肺炎球菌溶血素/50 μ g/ml肽 SEQ ID NO. 1。通过伊文思蓝的高渗透性的可视化
在施用毒素肺炎球菌溶血素之后5. 5小时，溶解在0. 9%食盐水溶液中的伊文思蓝染料以100 mg/kg小鼠体重静脉内地施用给小鼠。在30分钟后，通过心穿刺的方式从动物抽取血液。随后，取出肺，用1 ml的EDTA磷酸盐缓冲液(pH 7. 4)洗涤，在液氮中急冻。对于肺组织中伊文思蓝染料含量的测定，肺在冷的磷酸盐缓冲液中勻化(每100 mg肺1 ml缓冲液)，与甲醛溶液孵育18小时，随后离心(5，000 X g，30分钟)。在液体上清液中，然后620 nm 和740nm光度计地测定吸收。在溶于甲醛溶液中的伊文思蓝染料的参考曲线的基础上，扣除血红蛋白色素的含量，测定肺组织中伊文思蓝染料含量。由于毒素肺炎球菌溶血素诱导的高渗透性，伊文思蓝染料从毛细管进入肺组织的释出与血清中染料的数量建立联系。如附图5A所示，250 ng和500 ng每小鼠的毒素肺炎球菌溶血素的气管内施用引起高渗透性，这可以通过带有伊文思蓝染料的血液从肺毛细管进入肺组织来确定，和在肺组织中来验证。如附图5B所示，250 ng每小鼠剂量的毒素肺炎球菌溶血素的气管内施用引起高渗透性，通过带有伊文思蓝染料的血液从肺毛细管通过进入肺组织所确定，可以在肺组织中验证。通过50 μ g的肽SEQ ID NO. 1的气管内施用，导致毒素介导的高渗透性形成的抑制作用。如附图5C显示，250 ng每小鼠的毒素肺炎球菌溶血素的气管内施用由于高渗透性的形成引起小鼠肺中支气管肺泡液中白细胞数量提高。通过50 μ g肽SEQ ID NO. 1的气管内施用，导致毒素介导的高渗透性形成的抑制作用，以及小鼠肺中支气管肺泡液中白细胞数目的明显降低。实施例6 通过肽SEQ ID NO. 1的蛋白激酶C的活化的抑制作用材料
分离自肺的毛细管的人类肺部内皮细胞获自Lonza公司。微生物毒素肺炎球菌溶血素(PLY)获自Giessen大学。细胞培养
分离自肺的毛细管的人类肺部内皮细胞以实验室常规方式培养。在细胞培养期间，以250 ng/ml的浓度添加毒素肺炎球菌溶血素，或250 ng/ml浓度的毒素肺炎球菌溶血素和 50 yg/ml 浓度的肽 SEQ ID NO. 1。活化的蛋白激酶C α含量的测定
活化的蛋白激酶C α的含量通过使用对准活化的蛋白激酶C α (磷酸-苏氨酸638 蛋白激酶C α )的抗体通过ELISA测量来测定。同时地，蛋白激酶C α的总体含量通过商业常规的ELISA分析来测定。如附图6所示，由于毒素肺炎球菌溶血素的作用，导致与蛋白激酶C α的总体浓度相比活化的蛋白激酶C α含量的强烈提高。通过添加肽SEQ ID NO. 1，导致蛋白激酶C α的活化的抑制作用。实施例7 通过肽SEQ ID NO. 1在上皮细胞中上皮钠通道(ENaC)的表达的提高材料
H441型的人类肺部上皮细胞获自ATTC公司。细胞培养
H441型肺上皮细胞在带有添加剂2 mM L 一谷氨酰胺、1.5 8/1碳酸氢钠、4.5 g/Ι葡萄糖、10 mM HEPES缓冲液pH 7. 4、10%牛血清的商业的RPMI 1640培养基中以实验室常规方
式培养。上皮钠通道的表达的验证
在培养的上皮细胞中，钠通道(ENaC)的表达通过“实时PCR”的方式测定。这些实验在没有或有添加50 yg/ml的肽SEQ ID NO. 1、以及在添加50 yg/ml的肽SEQ ID NO. 3的细胞中进行。如实验7显示的，向肺的上皮细胞添加50 μ g/ml的肽SEQ ID N0. 1，导致钠通道 ENaC的三倍表达。添加50 μ g/ml的肽SEQ ID NO. 3，在钠通道ENaC的表达方面没有大幅度提高。肽SEQ ID N0. 3和肽SEQ ID NO. 1之间的差异在于，肽SEQ ID NO. 1的氨基酸 Thr (6)、Glu (8)禾口 Glu (11)在肽 SEQ ID N0. 3 中被 Ala (6)、Ala (8)禾口 Ala (11)替代。实施例8 肽SEQ ID NO. 1对患有病毒肺部感染的小鼠中疾病的进程的作用对于肽SEQ ID NO. 1对病毒肺部感染的作用，检查以下动物研究组
组1，阴性对照(通过鼻部的PBS )。组2，阳性对照(用约2000单位的A型流感病毒通过鼻部感染)。组3，测试组(用约2000单位的A型流感病毒通过鼻部感染，以及10 μ g肽SEQ ID NO. 1的气管内的施用)。 在每个组中，使用6只BALB/c小鼠。跟踪以下治疗方案 治疗的第0天
组1 通过鼻部施用PBS。组2 用A型流感病毒通过鼻部感染小鼠。组3 用A型流感病毒通过鼻部感染小鼠以及施用肽SEQ ID N0. 1。治疗的第0、2、4、6、8 天组1 :PBS的气管内的施用。组2 =PBS的气管内的施用。组3 肽SEQ ID NO. 1的气管内的施用。治疗的第0到10天
每日观察测试动物的体温、体重和存活率。检查表明，患有病毒肺部感染的测试动物(组2)在10天内失去了它们体重的约 20%。与这相比，当施用肽SEQ ID NO. 1时(组3)，测试动物的体重仅降低约10%。结果在附图8中显示。另外检查表明，在患有病毒肺部感染的测试动物(组2)中，在7天后体温从37. 5°C 降低到33 0C。随后，体温提高到35 0C。与这相比，在施用的SEQ ID NO. 1的测试动物(组3)中，在7天后体温仅降低到 35 °C。随后，体温再次提高到37 °C。结果在附图9中示出。另外检查表明，在病毒肺部感染后10天，组2的测试动物的2/3死亡。与这相比，施用肽SEQ ID NO. 1的测试动物(组3)的死亡率在10天后仅1/3。结果在附图10中示出。总起来，病毒肺部感染的测试动物的检查表明，肽SEQ ID NO. 1的施用降低了体重的减低，降低了体温的减低，导致明显提高的存活率。实施例9:肽SEQ ID NO. 1 (“AP301 ”)在灌洗诱导的大的动物ARDS模型中的应
用
材料&方法经主管的动物保护委员会的同意，在两只猪(25 kg)中在全身麻醉下通过表面活性剂耗尽(四次支气管肺泡的灌洗，30 ml/kg体重(KG)每次)诱导肺破坏。随后，1 mg/kg体重的AP301 (肽SEQ ID NO. 1)气管内地应用。动物1 (1)接受总体剂量的深部的气管注射，而对于动物2 (2)，进行在30分钟内同样剂量的喷雾。此后，是5小时的通气时间。动脉氧分压(PaO2)使用预先验证的动脉内的实时测量探针(F0XY，Ocean Optics,USA) 来记录。肺活量测定和血液动力学持续地登记，以半小时间隔时间进行PiCCO技术的测量。结果在药物的施用期间，没有展现不合意的血液动力学的效应。通气设置在无保护的范围内持续地保持(Pmax 40毫巴，潮气量彡10 ml/kg体重，PEEP彡10毫巴，频率 25-35/分钟)以避免治疗效果。两个动物显示了限于约1. 5小时的增氧的连续改善，PaO2 提高最大分别是162.8 mmHg (1)或224.6 mmHg (2)。伴随AP301的喷雾，与深部的气管应用相比这延迟发生，然而，它是更加显著的。与气体交换的改善并行地，与初始值相比，能够在表面活性剂耗尽之后记录到血管外肺水的15. 8-52. 5%的降低。这些结果给人深刻印象地表明，根据本发明用于ARDS的治疗的新的药理学有效的方法，在批准的大动物模型中用于ARDS的治疗也被证明是高效的。序列的概述SEQ ID No.1 CGQRETPSGAEAKPWYC
SEO ID No.2KSPGGQEETPEGAEAKPHYE
SEQ ID No.3CGQREAPAGA&AKPWYC
SEO ID No.4TPEGAE
SEO ID No.5QRETPEGAEAKPWY
SEQ ID Mo.6PKDTPEGAELKPW￥
SEQ ID No,7CGPKDTPEGASLKPHYC
SEQ ID NO.8CGQKETPEGAEAEPWYC
SEQ ID No.9CGQRETPEGASARPW￥C
SEO ID No.10CGQRETPEGAE&KPC
SEQ ID No.11CQRETPEGAEAKPW￥C
SEO ID No.12CGQRETPEGAEAKFWYC 。
权利要求
1.肽，该肽由7-17个相邻的氨基酸组成，并且包含六聚体TX1EX2X3E,其中&、)(2和)(3能够是任何天然或非天然氨基酸，其中所述肽没有TNF受体结合活性，并且是环化的，用于预防和治疗上皮细胞和内皮细胞的高渗透性。
2.肽，该肽由7-17个相邻的氨基酸组成，并且包含六聚体TPEGAE，其中所述肽没有TNF 受体结合活性，并且是环化的，用于预防和治疗上皮细胞和内皮细胞的高渗透性。
3.环化的肽，由选自以下以及其至少7个氨基酸的片段构成的组的连续氨基酸的序列组成-QRETPEGAEAKPffY -PKDTPEGAELKPffY -CGQRETPEGAEAKPffYC,禾口 -CGPKDTPEGAELKPffYC所述片段包含六聚体TPEGAE，用于制造用于预防和治疗上皮细胞和内皮细胞的高渗透性的药物。
4.权利要求1到3的任一项中定义的肽，用于治疗肺炎、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征(ADRS)或者细菌或病毒性肺部疾病，特别是单核细胞增多性利斯特氏菌、肺炎链球菌、 SARS病毒、RSV或流感病毒的感染。
5.根据权利要求1到4的任一项的肽，特征在于它包含氨基酸序列 CGQRETPEGAEAKPffYC并且是通过C残基环化的。
6.根据权利要求5的肽，特征在于它是通过所述C残基之间的二硫键环化的。
7.根据权利要求1到6的任一项的肽，特征在于它被用于保护上皮细胞和内皮细胞对抗由反应性氧分子触发的高渗透性。
8.根据权利要求1到6的任一项的肽，特征在于它被用于保护上皮细胞和内皮细胞对抗由细菌毒素触发的高渗透性。
9.根据权利要求1到6的任一项的肽，特征在于它被用于抑制肌球蛋白轻链的磷酸化。
10.根据权利要求1到6的任一项的肽，特征在于它被用于抑制蛋白激酶C的活化。
11.根据权利要求1到6的任一项的肽，特征在于它被用于提高上皮钠通道的表达。
12.根据权利要求1到6的任一项的肽，特征在于它被用于治疗由反应性氧分子、微生物毒素、革兰氏阳性微生物或肺部病毒感染触发的高渗透性。
13.药物组合物，包含根据权利要求1到12的任一项的肽和药物载体。
全文摘要
描述了肽，其由7-17个相邻的氨基酸组成，并且包含六聚体TX1EX2X3E，其中X1、X2和X3能够是任何天然的或非天然的氨基酸，其中所述肽没有TNF受体结合活性，并且是环化的，用于上皮细胞和内皮细胞的高渗透性的预防和治疗。
文档编号A61K38/19GK102355906SQ201080010379
公开日2012年2月15日 申请日期2010年3月5日 优先权日2009年3月5日
发明者菲舍尔 B., 卢卡斯 R. 申请人:阿佩普蒂科研究和开发有限责任公司