用pa-card预防和/或治疗癌症的组合物和方法

专利名称：用pa-card预防和/或治疗癌症的组合物和方法
用PA-CARD预防和/或治疗癌症的组合物和方法相关申请本申请要求在美国法典第35篇第119款(35U. S. C. § § 119)和美国法典第35篇第120款(35U. S.C. § § 120)下的对2009年2月20日提交的美国临时申请第61/1M，236 号和2009年5月19日提交的美国临时申请第61/179，435号的优先权；并且是2008年12 月15日提交的美国专利申请第12/314,703号的部分连续案；并且是2006年8月23日提交的美国专利申请第11/508，173号的部分连续案；并且是2005年10月6日提交的美国专利申请第11Λ44，105号的部分连续案；并且是2006年7月19日提交的美国专利申请第 11/488，695号的部分连续案。这些申请的全部内容通过引用完全并入本文。背景白血病是骨髓和血液的恶性癌症。白血病的特征为异常血细胞不受控制的积聚， 导致正常血细胞功能的抑制，并且在许多情况下导致死亡。据估计在2008年白血病侵袭美国大约44，270新人口。白血病是男性第五大最常见的癌症死因和女性第六大最常见的癌症死因。白血病在20岁以下儿童中引起的死亡比任何其他癌症都多(“Cancer facts and figures 2008 (癌症的事实和数字 2008)/'Atlanta :American Cancer Society (2008) ；Xie Y等人，Cancer 97 :2229-35(2003)).某些白血病类型极其难治-例如，急性前髓细胞白血病(APL)是一种罕见但通常致命的疾病，在这种疾病中只有30%的患者响应于标准化学疗法。许多当前的治疗方式在某种程度上是有效的，但由于缺乏针对癌细胞的特异性而具有显著有害的副作用。开发靶特异性疗法的努力被伊马替尼的成功极大地激励，伊马替尼是称为Gleevec 的高效药物。Gleevec 特异性抑制Bcr-Abl酪氨酸激酶。慢性髓细胞样白血病(CML)中的染色体易位导致Bcr-Abl酪氨酸激酶的组成性活化，进而导致促进癌症生长的细胞信号传导的活化。视黄酸是参与细胞分化的激素，它与三氧化二砷(As203) 结合是APL的治疗选择。然而，耐受性的形成是靶向单攻击点(如激酶)的药物伴随的主要问题，在所述单攻击点，药物的构象特异性结合可被改变。白血病患者耐受性的情况增多将临床医师引至诉诸常规的药物组合疗法实践，从而组合肿瘤特异性药物以产生药物活性的协同作用，以允许使用较小剂量的非特异性药物，并寻找其他的有效治疗。发明概述本发明涉及使用细胞毒性肽来杀伤癌症且尤其是白血病和/或卵巢癌的组合物和方法。本发明的一个方面是能够杀伤癌细胞的分离肽，该分离肽包含胱天蛋白酶募集(CARD)样结构域。该分离肽可来源于细菌，且特别是铜绿假单胞菌(I^eudomonas aeruginosa)。在一些实施方案中，分离肽是Pa-CARD。在其他实施方案中，分离肽包括SEQ ID N0:27或由SEQ ID NO :27组成。在一些实施方案中，分离肽能够杀伤白血病、纤维肉瘤、 卵巢癌和/或乳腺癌的细胞。在其他实施方案中，分离肽被化学修饰以延长或优化其在血流中的半衰期。本发明还涉及通过使癌细胞与一种或多种蛋白接触来杀伤癌细胞的方法，所述一种或多种蛋白选自由以下组成的组能够杀伤癌细胞的包含胱天蛋白酶募集(CARD)样结构域的分离肽、Laz, HS-Azu和hu-H8。在一些实施方案中，癌细胞选自由以下组成的组白血病细胞、纤维肉瘤细胞、卵巢癌细胞和乳腺癌细胞。这种方法还可包括使所述细胞与能够杀伤癌细胞的一种或多种细胞毒剂接触。这些细胞毒剂可以为，但不限于顺钼、 Gleevec 、视黄酸、5'-氮杂-2'-脱氧胞苷和三氧化二砷。在具体的实施方案中，所述方法包括使癌细胞与顺钼接触。在另一实施方案中，癌细胞在与所述一种或多种蛋白大约相同的时间同所述一种或多种细胞毒剂接触。本发明还涉及包括向患有癌症的哺乳动物患者施用一种或多种蛋白的方法，所述一种或多种蛋白选自由以下组成的组能够杀伤癌细胞的包含胱天蛋白酶募集(CARD)样结构域的分离肽、Laz, HS-Azu和Azu-H8。在一些实施方案中，癌症选自由以下组成的组 白血病、纤维肉瘤、卵巢癌和乳腺癌。在又一实施方案中，还可以向患者施用能够杀伤癌细胞的一种或多种细胞毒剂。这些细胞毒剂可以包括，但不限于顺钼、Gleevec 、视黄酸、 5'-氮杂-2'-脱氧胞苷和三氧化二砷。在又一个实施方案中，向患者施用的另外的细胞毒剂是顺钼。在另一个实施方案中，所述一种或多种细胞毒剂在与所述一种或多种蛋白大约相同的时间施用。本发明还涉及如下一种方法所述方法包括通过使白血病细胞与天青蛋白 (azurin)和包含Laz的H. 8区的肽接触来杀伤白血病细胞。在又一个实施方案中，白血病细胞与天青蛋白和包含Laz的H. 8区的肽同时或大致同时接触。本发明还涉及包括向患有白血病的哺乳动物患者施用天青蛋白和包含Laz的H. 8 区的肽的方法。在又一实施方案中，所述天青蛋白和所述包含Laz的H. 8区的肽同时或大致同时向所述患者施用。本发明还涉及包括通过使白血病细胞与一种或多种蛋白接触来诱导白血病细胞中的细胞分化的方法，所述一种或多种蛋白选自由以下组成的组Laz、天青蛋白、H. 8-Azu、 hu-H. 8和能够杀伤癌细胞的包含胱天蛋白酶募集(CARD)样结构域的分离肽。本发明还涉及包括通过使癌细胞与一种或多种蛋白接触来选择性进入癌细胞的方法，所述一种或多种蛋白选自由以下组成的组Laz、天青蛋白、H. 8-Azu、Azu-H. 8和能够杀伤癌细胞的包含胱天蛋白酶募集(CARD)样结构域的分离肽；其中所述癌细胞选自由白血病细胞和卵巢癌细胞组成的组。本发明还涉及包括通过使癌细胞与一种或多种蛋白接触来诱导癌细胞中的细胞周期停滞的方法，所述一种或多种蛋白选自由以下组成的组Laz、天青蛋白、H. 8-Azu、 hu-H. 8和能够杀伤癌细胞的包含胱天蛋白酶募集(CARD)样结构域的分离肽。所述癌细胞可以选自由以下组成的组白血病细胞、纤维肉瘤细胞、乳腺癌和卵巢癌细胞。在又一实施方案中，所述蛋白增加细胞中的Weel蛋白水平。在另一个实施方案中，所述蛋白引起磷酸化的AKT-kr-473的消耗(d印letion)。又在另一个实施方案中，所述蛋白既提高所述细胞中的Wfeel蛋白水平又引起磷酸化的AKT-kr-473的消耗。本发明还涉及如下一种方法所述方法包括通过使癌细胞与能够杀伤癌细胞的包含胱天蛋白酶募集(CARD)样结构域的分离肽接触而通过胱天蛋白酶3的活化诱导癌细胞中的凋亡。在又一实施方案中，癌细胞是卵巢癌细胞。本发明还涉及如下一种方法所述方法包括通过使癌细胞与能够杀伤癌细胞的包含胱天蛋白酶募集(CARD)样结构域的分离肽接触而调节癌细胞中NF-kB信号传导途径基因的表达。在又一实施方案中，其中癌细胞是卵巢癌细胞。本发明还涉及编码能够杀伤癌细胞的包含胱天蛋白酶募集(CARD)样结构域的分离肽的表达载体。在具体实施方案中，表达载体编码Pa-CARD。本发明还涉及包含如下分离肽的药物组合物所述分离肽能够杀伤癌细胞，包含胱天蛋白酶募集(CARD)样结构域。在又一实施方案中，药物组合物还包含药学上可接受的载体。在另一个实施方案中，药物组合物还包括选自由以下组成的组的蛋白天青蛋白 (Azurin)、Laz、H. 8-Azu和Azu-H. 8。在另一个实施方案中，药物组合物还包含能够杀伤癌细胞的一种或多种细胞毒剂。在具体的实施方案中，药物组合物包含适于静脉内注射的药学上可接受的载体。本发明还涉及包括向患有白血病的患者施用治疗有效量的本发明公开的一种或多种药物组合物的方法。在又一实施方案中，所述药物组合物以选自由以下组成的组的方式向患者施用静脉内、局部(topically)、皮下、肌内、口服和进入肿瘤内。本发明的另一个方面是编码本文所公开的一种或多种分离肽的核酸分子。本发明的另一方面是包含本文所述的一种或多种药物组合物的药盒。序列简述SEQ ID NO :1是编码淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae) Iaz基因的基因组 DNA 编码序歹丨J, Genbank 登录号 Y00530 (ctggcaggct tgacgcttcgatacgctctg tttcggtcag
gctggtcccgaaaccggaaaaaccgccgaaaac caataccctgcatttgagtaaggctgcgctggagagtttcggttcggcggcggcaaagttggaaaaacggcatcccgaattggcggaggcattggcaaacttggttagaaggcatggcgcataaaatgtatacgggaatttgtgtaaacatccgttaatattaagaagtaaaggataatgggtctaatactaaagaaataggttcggggtaaaattgccccttttaaagtaaacgattgtaaacttgcagacaggctttgatttcaaatgaaatttgtagcaaaatgccgccccgaaacatctgtttgtgcaacgcggcggaatctttttcaaggttttgttaatggcggttgcactttgatttctgtaaaaccgaatattattttatcgattggagatttaccatgaaagcttatctggctctgatttctgccgccgttatcggtttggctgcctgctctcaagaaCCtgCCgCgCctgctgccgaggcaactcctgctgctgaagcacccgcttccgaagcgcctgccgccgaagctgctcctgcagatgctgccgaagcccctgctgccggcaattgtgcggcaactgtcgaatccaacgacaatatgcagttcaacaccaaagacatccaagtcagcaaagcatgtaaagagtttaccatcactctgaaacataccggtacgcaacccaaagccagcatgggtcacaaccttgtgattgccaaagctgaagacatggacggcgtatttaaagacggcgtaggtgctgccgataccgactatgtcaaacctgacgatgcgcgcgttgttgcccacaccaaactgatcggcggcggcgaagagtcttccctgactctggatcctgccaaattggctgacggcgactacaaatttgcctgcactttcccgggtcacggtgctttgatgaacggcaaagtgactttggtcgattaatccgcttaaagtctcaaaagacggacagcctgctttgtgcaggctgttttattataaaatg
actgcttgaa aagtgccccg ttgagaacga aaacatgaat ccgtttgaaa)。 SEQ ID NO :2是编码铜绿假单胞菌天青蛋白基因的基因组DNA编码序列 (ctttttcatg cagcggatcg ctcgcgcatc acttcagggtcagggtgccc ttcatcagcgcggagtggcc cgggaaggtg cagaagaaca tgtactgctc gccttccttc agcttggaga cgtcgaaggtcaccgagtcc ttctcgcccg agccgatcag cttggtgtgg gcgatgacac ggctgtcgtc gggcttcaggtaatccttgt ccaggccgga agccatgccg tcggtgacca cgccctgcat gtcggcggcg gtgctcagtacccagttgtggcccatgacg ttcttcggca ggttgccggg gtgggacagg ttgacggtga actgcttgcagctcttgtcg acggtgatgg cattggtgtt gaactgcatc tggtcgttac cctggatgtc caccgagcactcggcagcca gcagtggcgc actgagcagg gacagcaggg ataccgcagc gagtttacgtagcatggagc agcctcctag gcaggttggg cgatgaatcc tgaaagagca gactgcccgatcgggcaccg)。SEQ ID NO 3是编码淋病奈瑟氏球菌Iaz基因的H. 8区域的基因组DNA编码序列 (tgctctcaag aacctgccgc gcctgctgcc gaggcaactc ctgccggtgaagcacccgct tccgaagcgc ctgccgccga agctgctcct gcagatgctg ccgaagcccc tgctgcc)。SEQ ID NO :4是PCR扩增淋病奈瑟氏球菌的Laz编码基因(Iaz)的正向引物 (ccggaattcc ggcagggatg ttgtaaatat ccg)。SEQ ID NO :5是PCR扩增淋病奈瑟氏球菌的Laz编码基因(Iaz)的反向引物 (ggggtaccgc cgtggcBggc atacagcatt tcaatcgg)。SEQ ID NO 6 是 PCR 扩增 pUC18_laz 的 3. Ikb 片段的正向引物(ggcagcaggg gcttcggcag catctgc)。SEQ ID NO :7 是 PCR 扩增 pUC18_laz 的 3. Ikb 片段的反向引物(ctgcaggtcg actctagagg atcccg)。SEQ ID NO 8 是 PCR 扩增 pUC19_paz 的 0. 4kb 片段的正向引物(gccgagtgct cggtggacat ccagg)。SEQ ID NO 9 是 PCR 扩增 pUC19_paz 的 0. 4kb 片段的反向引物(tactcgagtc acttcagggt cagggtg)。SEQ ID NO 10 是 PCR 扩增 pUC19_paz 的 3. 3kb 片段的正向引物(cttcagggtc agggtgccct tcatc)。SEQ ID NO 11 是 PCR 扩增 pUC19_paz 的 3. 3kb 片段的反向引物(ctgcaggtcg actctagagg atcccg)。SEQ ID NO 12 是 PCR 扩增 pUC18_laz 的 0. 13kb 片段的正向引物(tgctctcaag aacctgccgc gcctgc)。SEQ ID NO 13 是 PCR 扩增 pUC18_laz 的 0. 13kb 片段的反向引物(taggatcctt aggcagcagg ggcttcggca gcatctgc)。SEQ ID NO 14是PCR扩增来自pGEX-5X_3的GST编码基因的正向引物 (cgagctcatg tcccctatac taggttattg g)。SEQ ID NO 15是PCR扩增来自pGEX_5X_3的GST编码基因的反向引物 (cccaagcttt caggggatcc cacgaccttc gatcagatcc)。SEQ ID NO 16是PCR扩增来自pUC18_laz的Iaz的信号肽和H. 8编码区的正向弓丨物(ggaattcata tgaaagctta tctggc)。SEQ ID NO 17是PCR扩增来自pUC18_laz的Iaz的信号肽和H. 8编码区的反向弓丨物(ccggaattcg gcagcagggg cttcggc)。SEQ ID NO :18是PCR扩增来自pUC18_laz的H. 8编码区的正向引物(cgggatcccc tgctctcaag aacctgccgc gee)。SEQ ID NO 19是PCR扩增来自pUC18_laz的H. 8编码区的反向引物(cggaattctt aggcagcagg ggcttcggca gcatctgcag g) 0
SEQ ID NO 20是PCR扩增来自pGEX-5X-3_H. 8的GST-H. 8融合区的正向引物 (cgagctcatg tcccctatac taggttattg g)。SEQ ID NO 21是PCR扩增来自pGEX-5X-3_H. 8的GST-H. 8融合区的反向引物 (ccgctcgagt caggcagcag gggcttcggc ag)。SEQ ID NO 22是淋病奈瑟氏球菌菌株F62 Laz蛋白的氨基酸序列，Genbank登录号Y00530(Cys Ser Gln Glu Pro Ala Ala Pro Ala Ala Glu AlaThr Pro Ala Gly Glu Ala Pro Ala Ser Glu Ala Pro Ala Ala Glu Ala Ala Pro AlaAsp Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ala Gly Asn Cys Ala Ala Thr Val Glu Ser AsnAsp Asn Met Gln Phe Asn Thr Lys Asp lie GIn Val Ser Lys Ala Cys Lys GluPhe Thr lie Thr Leu Lys His Thr Gly Thr GIn Pro Lys Ala Ser Met Gly HisAsn Leu Val lie Ala Lys Ala Glu Asp Met Asp Gly Val Phe Lys Asp Gly ValGly Ala Ala Asp Thr Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp Ala Arg Val Val Ala HisThr Lys Leu lie Gly Gly Gly Glu Glu Ser Ser Leu Thr Lai Asp Pro Ala LysLeu Ala Asp Gly Asp Tyr Lys Phe Ala Cys Thr Phe Pro Gly His Gly Ala LeuMet
Asn GlyLysVal Thr Leu Val Asp)。
SEQID NO 是铜绿假单胞菌天青蛋白的氨基酸序列(Ala Glu CysSerValAsplie GlnGlyAsn Asp Gln Met Gln Phe Asn Thr Asn Ala lie ThrValAspLysSerCysLys GlnPheThr Val Asn Leu Ser His Pro Gly Asn LeuPro Lys AsnValMetGlyHisAsn TrpValLeu Ser Thr Ala Ala Asp Met GlnGly Val Val Thr AspGlyMetAlaSerGly LeuAspLys Asp Tyr Leu Lys ProAsp Asp Ser Arg Val lie AlaHisThrLysLeulie GlySerGly Glu Lys AspSer Val Thr Phe Asp Val Ser Lys LeuLysGluGlyGluGln TyrMetPhe PheCys Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met LysGlyThrLeuThr
Leu Lys)。SEQ ID NO :24是来自淋病奈瑟氏球菌F62 Laz蛋白的H. 8区域的氨基酸序列(Cys Ser Gln Glu Pro Ala Ala Pro Ala Ala Glu Ala Thr Pro Ala GlyGlu Ala Pro Ala Ser Glu Ala Pro Ala Ala Glu Ala Ala Pro Ala Asp Ala AlaGlu Ala Pro Ala Ala)。SEQ ID NO :25 是五肽基序的氨基酸序列(Ala Ala Glu Ala Pro)。SEQ ID NO 是铜绿假单胞菌精氨酸脱亚胺酶(ADI)的氨基酸序列(Met Ser Thr Glu Lys Thr Lys Leu Gly Val His Ser Glu Ala Gly Lys Leu ArgLys Val Met Val Cys Ser Pro Gly Leu Ala His Gln Arg Leu Thr Pro Ser AsnCys Asp Glu Leu Leu Phe Asp Asp Val lie Trp Val Asn Gln Ala Lys Arg AspHis Phe Asp Phe Val Thr Lys Met Arg Glu Arg Gly lie Asp Val Leu Glu MetHis Asn Leu Leu Thr Glu Thr lie Gln Asn Pro Glu Ala Leu Lys Trp lie LeuAsp Arg Lys lie Thr Ala Asp Ser Val Gly Leu Gly Leu Thr Ser Glu Leu ArgSer Trp Leu Glu Ser Leu Glu Pro Arg Lys Leu Ala Glu Tyr Leu lie Gly GlyVal Ala Ala Asp Asp Leu Pro Ala Ser Glu Gly Ala Asn lie Leu Lys Met TyrArg Glu Tyr Leu Gly His Ser Ser Phe Leu Leu Pro Pro Leu Pro Asn Thr GlnPhe Thr Arg Asp Thr Thr Cys Trp lie Tyr Gly Gly Val Thr Leu Asn Pro MetTyr Trp Pro Ala Arg Arg Gln Glu Thr Leu Leu Thr Thr Ala lie Tyr Lys PheHis Pro Glu Phe Ala Asn Ala Glu Phe Glu lie Trp Tyr Gly Asp Pro Asp LysAsp His Gly Ser Ser Thr Leu Glu Gly Gly Asp Val Met Pro lie Gly Asn GlyVal Val Leu lie Gly Met Gly Glu ArgSer Ser Arg Gln Ala lie Gly Gln Val AlaGln Ser Leu Phe Ala Lys Gly Ala Ala Glu Arg Val lie Val Ala Gly Leu ProLys Ser Arg Ala Ala Met His Leu Asp Thr Val Phe Ser Phe Cys Asp Arg AspLeu lie Val Pro Phe Ser Leu Arg Pro Asp Pro Ser Ser Pro Tyr Gly Met Asn IleArg Arg Glu Glu Lys Thr Phe Leu Glu Val Val Ala Glu Ser Leu Gly Leu LysLys Leu Arg Val Val Glu Thr Gly Gly Asn Ser Phe Ala Ala Glu Arg Glu GlnTrp Asp Asp Gly Asn Asn Val Val Cys Leu Glu Pro Gly Val Val Val GlyTyr Asp Arg Asn Thr Tyr Thr Asn Thr Leu Leu Arg Lys Ala Gly Val Glu ValIle Thr lie Ser Ala Ser Glu Leu Gly Arg Gly Arg Gly Gly Gly His Cys Met ThrCys Pro lie Val Arg Asp Pro lie Asp Tyr)。SEQ ID NO :27是铜绿假单胞菌ADI的CARD区，残基75-225的氨基酸序列(Leu Leu Thr Glu Thr lie Gln Asn Pro Glu Ala Leu Lys Trp lie LeuAsp Arg Lys lie Thr Ala Asp Ser Val Gly Leu Gly Leu Thr Ser Glu Leu ArgSer Trp Leu Glu Ser Leu Glu Pro Arg Lys Leu Ala Glu Tyr Leu lie Gly GlyVal Ala Ala Asp Asp Leu Pro Ala Ser Glu Gly Ala Asn lie Leu Lys Met TyrArg Glu Tyr Leu Gly His Ser Ser Phe Leu Leu Pro Pro Leu Pro Asn Thr GlnPhe Thr Arg Asp Thr Thr Cys Trp lie Tyr Gly Gly Val Thr Leu Asn Pro MetTyr Trp Pro Ala Arg Arg Gln Glu Thr Leu Leu Thr Thr Ala lie Tyr Lys PheHis Pro Glu Phe Ala Asn Ala Glu Phe Glu lie Trp Tyr Gly Asp Pro Asp LysAsp His Gly Ser Ser Thr Leu Glu Gly)。SEQ ID NO 是PCR扩增铜绿假单胞菌ADI基因的CARD基序的正向引物的核苷酸序列(ATGCAC AATC TGCTGACCGAGACCATCCAG)。SEQ ID NO : 是PCR扩增铜绿假单胞菌ADI基因的CARD基序的反向引物的核苷酸序列(CAGGTCGAGG AGCCGTGGTC CTTGTC)。附图简述

图1.图1描绘了来自淋病奈瑟氏球菌的Iaz㈧和来自铜绿假单胞菌的paz (B) 的示意图。用于在大肠杆菌中克隆和过高表达的铜绿假单胞菌天青蛋白基因由天青蛋白基因本身(Paz)和决定其周质位置的信号肽(psp)序列组成(B)。将Iaz的H. 8区域符合读框地克隆在包括奈瑟氏球菌信号序列nsp的paz基因的5'端(C) (pUC18_H. 8-paz)或paz 基因的3'端(D) (pUC19-paz-H. 8)。用于制备这些构建体的详细程序在实施例1中给出。 naz，在Iaz基因中存在的淋病奈瑟氏球菌的天青蛋白样序列；nsp，奈瑟氏球菌信号肽序列。在两种情况下的信号肽序列被切掉以产生成熟的I^az (周质)和Laz (表面暴露的)蛋白。(E)，Laz、Paz和融合蛋白的SDS-PAGE。H. 8融合蛋白诸如Laz、H. 8_Paz或Paz-H. 8 (均大约17kDa)的异常迁移之前已对脂化的(lapidated)包含H. 8的蛋白指出(Cannon，Clin. Microbiol. Rev. 2 :S1_S4 (1989) ；Fisette,等人，J. Biol. Chem. 278 :46252-46260 (2003))。图2.图2描绘了显示H. 8-Paz融合蛋白对各种癌细胞的细胞毒性程度的图。㈧ 合成的H. 8肽、Paz, Laz以及在Paz (Paz-H. 8)的羧基末端和Paz (H. 8-Paz)的氨基末端的 H. 8融合物对成胶质细胞瘤LN-2^细胞的细胞毒性。用三种不同浓度(10μΜ、20μΜ和 40 μ Μ)的蛋白处理细胞6、12和对小时。进行MTT测定来测量活细胞的程度以说明细胞毒性(细胞死亡百分比)。为了计算细胞毒性百分比，将未处理的有活力的细胞的值视为 100%，并且在I^Z、Laz和H. 8融合蛋白处理的样品中确定有活力的细胞的数目。然后从死细胞的数目确定细胞毒性的程度(％ )。(B)H. 8肽、Paz, Paz-H. 8、H. 8-Paz和Laz对人乳腺癌MCF-7细胞的细胞毒性。所有的处理条件与以上(A)相似。图3.图3描绘了各种荧光标记的天青蛋白相关蛋白进入成胶质细胞瘤LN-2^细胞和乳腺癌 MCF-7 细胞中。(A)轭合于Alexa fluor 568的 H. 8 肽、Paz、Paz-H. 8、H. 8-Paz 和Laz (各20 μ Μ)与LN-2^细胞在盖玻片上在37°C孵育30min，之后拍摄图像。(B)如通过共聚焦显微镜所观察到的且根据对于(A)所述的，各种轭合于Alexa fluo:r 568的蛋白内化到MCF-7细胞中。(C)通过共聚焦显微镜观察到Laz的内化。将各种浓度ΟμΜ、4μΜ、 8μΜ和16μΜ)的荧光标记的Laz与LN-2^细胞在37°C孵育30min。细胞核用DAPI (4， 6- 二脒基-2-苯基吲哚)标记为蓝色。(D)将轭合于Alexa fluor 568的Laz (10 μ M)在 37°C与LN-2^细胞孵育多个时段(5min、10min、20min和30min)。通过共聚焦显微镜观察内化。(E)将轭合于Alexa fluor 568的Paz (10 μ M)与LN-2^细胞在盖玻片上在37°C孵育不同的时间，之后拍摄图像。在(E)中检测到非常少的可测量的荧光。图4.图4描绘了指示在图3A-D的共聚焦显微镜图像中发现的荧光定量的柱状图。(A)在图3A的图像中的荧光定量。通过使用人如^^!^·^^^ 进行天青蛋白的荧光定量。误差棒代表单一样品的三种不同细胞中的荧光的标准差。(B)在图:3B的图像中的荧光定量。如在图4A中那样进行定量。(C)在图3C的图像中的荧光定量。如在图4A中那样进行定量。(D)在图3D的图像中的荧光定量。如在图4A中那样进行定量。图5.图5分别描绘了细胞中标记的融合蛋白的摄取和细胞毒性的图像和照片。用 H. 8-GST融合蛋白联合处理促进Alexa fluor 568标记的Paz在成胶质细胞瘤LN-2^细胞中的摄取。将未标记的 20 μ M(A)H. 8、⑶GST、(C)GST-H. 8、(D)H. 8-GST, (E)PBS 缓冲液和 20 μ M轭合于Alexa flUOT 568的Paz与LN-2^细胞在37°C孵育30min。通过共聚焦显微镜观察内化。(F)合成的H. 8肽、GST和GST-H. 8/H. 8-GST融合衍生物在有或没有Paz的情况下的细胞毒性。将大约5X 103LN-2^细胞接种到96孔培养板中并在有20 μ M Paz (+Paz) 或没有20 μ M Paz (-Paz)的情况下用各20 μ M的H. 8肽、GST和GST-H. 8、H. 8-GST或相同体积的PBS缓冲液处理M小时。图6.图 6 描绘了以轭合于IRdye 800CW (LI-COR Biotechnology, Lincoln, Nebraska)的I^az、H. 8-Paz和Laz注射的小鼠的脑的图像。(A)来自活小鼠的脑图像。在活的裸鼠中向腹膜内注射轭合于IRdyelOOCW的500 μ g Paz,H. 8-Paz和Laz。在M小
时后，处死小鼠，取出脑，并用LI-C0ROdyssey 红外成像系统检测和测量荧光。(B)按(A) 中那样处理的裸鼠脑的中脑喙(rostral mesencephalon)区图像。平行地切割小鼠脑并拍摄图像。图7.图8描绘了 H.8_Gst融合蛋白在大肠杆菌中的定位的SDS-PAGE、蛋白质印迹和共聚焦图像。(A)用0. ImM IPTG在37°C培养具有克隆的gst、H. S-gst或gst-H.8基因的大肠杆菌BL21(DE!3)细胞。细胞沉淀(cell pellet)用PBS洗涤两次，并且对全细胞裂解物进行SDS-PAGE。考马斯亮蓝染色用于检测蛋白。(B).重复以上步骤，但这次全细胞裂解物和周质空间内容物被分别分离，进行SDS-PAGE(20yg蛋白)，并且通过用抗GST抗体的蛋白质印迹检测GST或GST-H. 8融合蛋白来确定这些蛋白的总浓度和周质浓度。(C).用0.4mM IPTG在37°C培养具有克隆的gst、H. S-gst或gst_H. 8基因的大肠杆菌菌株BL21 (DE)细胞(表幻。将各Iml的这些细菌培养物离心并收集得到的细菌沉淀。在用PBS洗涤两次后，施加Iml包含抗GST抗体的FBS-PBS (1 2000)。将细胞悬浮液孵育1小时，然后用PBS洗涤两次。将细菌细胞与FBS-PBS中的FITC轭合的抗兔IgG孵育30min。为了除去未结合的抗体，再次洗涤细胞，然后用乙醇在冰上固定。在共聚焦显微镜(X100物镜)下观察用DAPI (赋予蓝色染色)处理的大肠杆菌样品，并且还对单个细胞拍照。(D)将带有pUC19-paz (铜绿假单胞菌天青蛋白)、pUC19-laz (奈瑟氏球菌)、pUC18_H. 8-paz或 pUC18-paz-H. 8的大肠杆菌细胞在存在0. ImM IPTG的情况下于37°C培养过夜。将0. 5ml 这种培养物离心，并且将得到的细菌沉淀用预冷的PBS洗涤两次。施加Iml的FBS-PBS 中的抗天青蛋白抗体(1 500)，并且在冰上孵育1小时。在用PBS洗涤两次后，施加FITC 轭合的抗兔抗体，在冰上孵育30min，用PBS洗涤两次，并且用冷乙醇固定。通过共聚焦显微镜(X 100物镜)观察细菌样品。图8.图8描绘了显示如MTT测定所确定的细胞的细胞毒性的图。(A和B)通过对用10 μ M的Laz、天青蛋白(Azu)、H8_Azu和Azu_H8或作为阳性对照的5 μ M DAC处理的 HL60 (A)和Κ562(Β)细胞在24小时、48小时和72小时后进行MTT测定，来确定细胞的细胞毒性。(C)用低浓度3· 75ηΜ、37· 5ηΜ、75ηΜ、2· 5 μ Μ、5 μ M 及 10 μ M 的 Laz、Azu、H8_Azu、 iVzu-H8或作为阳性对照的5μΜ DAC处理的Κ562细胞。(D)通过对用不同浓度1 μ Μ、 2· 5 μ Μ、5 μ M 和 10 μ M 的 Laz、Azu、H8-Azu、Azu-H8 或 5 μ M DAC 处理的 HL60 细胞进行 MTT 测定确定的细胞的细胞毒性。数据代表一式三份进行的三个独立实验的平均值(士标准误)。所有值与对照具有显著差异(P < 0. 05)。图9.图9描绘了在HL60细胞和Κ562细胞中由Laz和天青蛋白诱导的细胞形态学改变的荧光显微图像。如通过荧光显微术所显示的，Laz诱导了 HL60细胞和Κ562细胞的形态学改变。(A)和(B)代表未处理的HL60细胞和Κ562细胞。用10 μ M Laz处理48小时的HL60细胞(C)或Κ562细胞(D)经历分化，分化是与后面的细胞凋亡相关联的过程。箭头指出分化的肉芽肿细胞。即使细胞毒性很高，在用10 μ M天青蛋白处理48小时的HL60 细胞(E)或Κ562细胞(F)中看见较少的形态学改变。图10.图10描绘了显示Laz和天青蛋白选择性进入HL60细胞和Κ562细胞的来自共聚焦显微镜的图像。组图1 天青蛋白和Laz在以10 μ M浓度孵育1小时后都没有进入外周血单核细胞(Α和B)。天青蛋白在1小时孵育后进入Κ562细胞(D)，Laz也如此(C)。 天青蛋白在1小时孵育后进入HL60细胞(F)，Laz也如此(E)。组图2 与对照K562细胞比较，Azu-H8, H8-Azu像Laz —样进入这些K562细胞。图11.图11描绘了在不存在和存在天青蛋白、Laz和DAC的情况下细胞周期进程的图示。K562细胞用10 μ M Laz、天青蛋白和5μ M DAC处理48小时，固定，染色并按之前所述分析DNA含量。图12.图12描绘了免疫印迹的图像。该图提供了经由在Laz和Pa-CARD处理的 Κ562细胞和HL-60细胞中在胞质和细胞核提取物中的蛋白的免疫印迹对AKT的磷酸化状态 (AKT-P-Ser473)和Weel蛋白水平的分析。显示了比较用10 μ M的Laz或10 μ M的Pa-CARD 处理48小时后的HL60细胞和Κ562细胞(相比于未处理的细胞对照)的W^eel和磷-AKT 丝氨酸473的水平的胞质蛋白和细胞核蛋白的蛋白质印迹分析。图13.图13描绘了来自具有针对白血病细胞的细胞毒活性的铜绿假单胞菌ADI
12的CARD结构域的示意图。(A)CARD结构域存在于I^a-ADI和Ma-ADI中，但在胍基修饰的超家族酶的其他成员如DDAH和AGAT中不存在，如从基于结构的序列比对中所示。CARD结构域代表哺乳动物胱天蛋白酶-9的CARD结构域。DDAH，二甲基精氨酸二甲氨基水解酶；AGAT， 精氨酸甘氨酸脒基转移酶。链和α-螺旋分别显示为箭头和窄条。罗马数字I到V是五个β β α β亚基。钳部分(α-螺旋模块)见于I^a-ADI和精氨酸支原体(M. argnini) ADI (Ma-ADI)中，它与形成胱天蛋白酶_9蛋白分子的CARD结构域的六个α -螺旋模块具有结构同源性。N，N端；C，C端。(B)来自铜绿假单胞菌的纯化的46kDa ADI和17kDa CARD 蛋白的SDS-PAGE凝胶迁移。(C)I^a-ADI和Pa-CARD对纤维肉瘤细胞(HT-1080)、乳腺癌细胞(MCF-7)和白血病(HL60)细胞的细胞毒活性。将细胞与10 μ M I^a-ADI或I^a-CARD孵育 48小时，之后通过MTT测定确定细胞活力。图14.图14描绘了显示来自精氨酸支原体(Mycoplasma arginini)和铜绿假单胞菌的精氨酸脱亚胺酶(ADI)的结构特征的图像。(A)突出两个结构域的铜绿假单胞菌 ADI (1RXX_A)的带图(MolMol程序)。(B)在本文图13A中显示的图像拷贝。(C)显示如所述的铜绿假单胞菌ADI (Pa-ADI)的总体折叠和拓扑结构的示意图。图15.图15描绘了显示I^a-ADI和Pa-CARD的纯化和精氨酸脱亚胺酶的酶促活性的凝胶图像和图。(A)来自铜绿假单胞菌的纯化的ADI和CARD蛋白的SDS-PAGE凝胶迁移。
(B)纯化的Pa-ADI和Pa-CARD在37°C和pH7. 2的ADI活性动力学。在490nm测量了酶反应产物瓜氨酸。没有检测到I^a-CARD的精氨酸脱亚胺酶的酶促活性。图16.图16描绘了显示I^a-CARD具有比I3a-ADI更高的抗一系列癌细胞的细胞毒性的图。(A)将纤维肉瘤细胞(HT-1080)、乳腺癌细胞(MCF-7)和卵巢癌细胞(SK0V-3)与 20 μ M Pa-ADI或Pa-CARD孵育48小时，之后通过MTT测定来确定细胞活力。从一式三份培养物的3个实验确定每孔活力细胞的数目平均值(士标准误)。所有值与对照具有显著差异(P < 0. 05)。(B)作为时间(24,48和72小时)的函数的由Pa-CARD显示的针对卵巢癌 SK0V-3细胞的剂量依赖性细胞毒性。(C)对I^a-ADI进行相同的实验。按A中所述从一式三份培养物的3个实验确定每孔活力细胞的数目平均值(士标准误)。图17.图17描绘了显示I^-CARD、天青蛋白和顺自在卵巢癌SK0V-3细胞中的比较细胞毒性效应的图。(A)将均为20 μ M的I3a-ADI、Pa-CARD、天青蛋白和顺钼与SK0V-3细胞或正常卵巢H0SE6-3细胞孵育48小时，之后通过MTT测定来确定细胞活力。(B)与针对 SK0V-3细胞的个体处理相比，Pa-CARD显示与顺钼的某种加性效应。图18.图18描绘了显示Pa-CARD通过胱天蛋白酶活化在SK0V-3细胞中但未在 H0SE6-3细胞中诱导凋亡的照片。TUNEL测定用于检测凋亡诱导的DNA链破裂，这种检测是通过使用原位细胞死亡检测荧光素试剂盒(in situ Cell Death Detection Fluorescein kit, Roche)测量荧光素标记的dUTP的加入而实现的。使SK0V-3细胞和H0SE6-3细胞生长在 8 孔 LabiTek 腔式载玻片(Lab Tek chamber slide)中并且与 10 μ M 的 Pa-CARD、Pa-ADI 和天青蛋白孵育48小时。将没有处理或用BSA处理的阴性对照也进行平行培养(底部箭头)。用DAPI将细胞的细胞核染成蓝色。显示了在绿色(A)和蓝色(B)通道以及叠加图像
(C)(青色)下观察到的细胞。图19.图19描绘了显示胱天蛋白酶被Pa-CARD活化的图。通过购自Promega的 Caspase-GloTM 3/7测定试剂盒来测量胱天蛋白酶活性。I3a-ADI和I3a-CARD以两种不同的浓度使用以评估剂量响应效应。将胱天蛋白酶活性的提高表示为相比于没有药物处理的对照的倍增。实施方案的详细描述定义除非具体描述为“单个细胞”，否则如本文所用的术语“细胞”包括该术语的单数或复数。如本文所用的术语“细胞毒性肽”表示对癌细胞且特别是对白血病细胞但不对正常细胞具有选择性细胞毒性的本发明的肽。如本文所用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白”可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。 这些术语适用于如下氨基酸聚合物其中一种或多种氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人造化学类似物。这些术语还适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”和 “蛋白”也包括修饰，所述修饰包括但不限于糖基化、脂质附着(lipid attachment)、硫酸化、谷氨酸残基的Y羧化、羟基化和ADP-核糖基化。应理解多肽不总是完全线性的。例如， 多肽可以因为泛素化而分支，并且它们可以是环状的(有或没有分支)，一般是因为翻译后事件，包括天然加工事件和通过人的操作带来的并非天然发生的事件。环状的、分支的以及分支环状的多肽可通过非翻译天然过程且也可通过完全合成方法来合成。合成肽是没有细胞组分的帮助而制备的肽。制备肽的合成方法是本领域公知的并且是商业上可获得的。此外，本发明涵盖了本发明的蛋白的含有甲硫氨酸和甲硫氨酸较少(methionine-less)的氨基端变体的使用。如本文所用的术语“病症”包括在解剖学和生理学上偏离正常，这种偏离构成活的动物或其部分之一的正常状态的损害，这种损害破坏或改变身体功能的表现。如本文所用的术语“抑制细胞生长”表示细胞分裂和/或细胞扩增的减慢或停止。 该术语还包括细胞发育的抑制或细胞死亡的增加。如本文所用的术语“患有”包括目前显示病症的症状、具有甚至没有观察到的症状的病症、在从病症的恢复中以及从病症恢复。如本文所用的术语“治疗”包括防止、降低、停止或逆转病症或与正在治疗的病症相关的症状的进展或严重度。这样，术语“治疗”适当时包括医疗性、治疗性和/或预防性给药。治疗还可以包括防止或减轻病症如恶化前病变或癌症的形成。“治疗有效量”是有效防止、降低、停止或逆转受治疗者正在治疗的特定病症的现有症状的发展或者部分或完全地缓解受治疗者正在治疗的特定病症的现有症状的量。治疗有效量的确定完全是在本领域技术人员的能力之内。如本文所用的术语“基本纯的”当用于修饰本发明的蛋白或其他细胞产物时是指， 例如，从生长培养基或细胞内容物中分离的、处于基本上不含或不掺杂其他蛋白和/或活性抑制化合物的形式的蛋白。术语“基本纯的”是指按干重计至少约75%的分离部分或至少“75%基本纯的”的量的系数。更具体地说，术语“基本纯的”是指具有按干重计至少约 85%活性化合物的化合物，或指至少“85%基本纯的”化合物。最具体地说，术语“基本纯的”是指具有按干重计至少约95%的活性化合物的化合物，或指至少“95%基本纯的”化合物。术语“基本纯的”还可以用于修饰本发明的合成制备的蛋白或化合物，其中，例如，合成蛋白与合成反应的试剂和副产物分离。
如本文所用的术语“药物级”当指本发明的肽或化合物时是基本上或实质上与通常伴随以天然态发现的材料的组分分离的肽或化合物，所述组分包括合成试剂和副产物， 以及是基本上或实质上与损害其用作药物的组分分离的肽或化合物。例如，“药物级”肽可与任何致癌物分离。在一些情况下，“药物级”可由预定的施用方法修饰，如“静脉内药物级”，以限定基本上或实质上与将使得组合物不适于静脉内施用至患者的任何物质分离的肽或化合物。例如，“静脉内药物级”肽可与去污剂如SDS和抗细菌剂如叠氮化物分离。短语“分离的”、“纯化的”或“生物纯”是指基本上或实质上不含通常伴随以天然态发现的材料的组分的材料。因此，依据本发明的分离肽优选地不包含通常与原位环境中的肽相关的材料。“分离的”区域是指如下区域不包括该区域所来源的多肽的整个序列的区域。“分离的”核酸、蛋白或其相应片段已基本上从其体内环境中移出以便它可被技术人员操作，诸如但不限于核苷酸测序、限制酶切消化、定点诱变，和亚克隆到核酸片段的表达载体中，以及获得基本纯的数量的蛋白或蛋白片段。如本文所用的关于肽的术语“变体”是指与野生型多肽相比有氨基酸被取代、缺失或插入的氨基酸序列变体。变体可以是野生型肽的截短物。“缺失”是一个或多个氨基酸从野生型蛋白中去除，而“截短”是一个或多个氨基酸从一个或多个野生型蛋白末端去除。因此，变体肽可通过操作编码多肽的基因来制备。变体可通过改变多肽的基本组成或特征但不改变其至少某些根本活性来制备。例如，奈瑟氏球菌肽或I^a-CARD肽的“变体”可以是保留杀伤白血病细胞的能力的突变的奈瑟氏球菌肽或I^a-CARD肽。在一些情况下，用非天然氨基酸如ε _(3，5-二硝基苯甲酰基)-Lys残基合成变体肽(Ghadiri & Fernholz, J.Am. Chem. Soc, 112 :9633-9635 (1990))。在一些买施方案中，变体与野生型肽相比有不超过20、 19、18、17或16个氨基酸被取代、缺失或插入。在一些实施方案中，变体与野生型肽相比有不超过15、14、13、12或11个氨基酸被取代、缺失或插入。在一些实施方案中，变体与野生型肽相比有不超过10、9、8或7个氨基酸被取代、缺失或插入。在一些实施方案中，变体与野生型肽相比有不超过6个氨基酸被取代、缺失或插入。在一些实施方案中，变体与野生型肽相比有不超过5个或4个氨基酸被取代、缺失或插入。在一些实施方案中，变体与野生型肽相比有不超过3个、2个或1个氨基酸被取代、缺失或插入。在一些实施方案中，使用在美国专利申请系列第12/389，120号中描述的技术和方法创建变体，该文献的公开内容通过引用整体并入本文。如本文所用的术语“氨基酸”表示包括任何天然存在的或非天然存在的或合成的氨基酸残基的氨基酸部分，即，包括由一个、两个、三个或更多个碳原子(通常为一个(α) 碳原子)直接连接的至少一个羧基和至少一个氨基残基的任何部分。术语“残基”与“氨基酸”同义。如本文所用的关于肽的术语“衍生物”是指衍生自主题肽的肽。衍生包括肽的化学修饰以使得该肽仍保留其根本活性中的一些活性。例如，奈瑟氏球菌肽或I3a-CARD肽的 “衍生物”可以是保留其杀伤白血病和/或卵巢癌细胞的能力的化学修饰的奈瑟氏球菌肽或 Pa-CARD肽。感兴趣的化学修饰包括但不限于肽的酰胺化、乙酰化、硫酸化、聚乙二醇(PEG) 修饰、磷酸化或糖基化。此外，衍生肽可以是多肽或其片段与化合物的融合物，所述化合物诸如但不限于另一种肽、药物分子或其他治疗剂或药剂或可检测探针。在一些实施方案中， 使用在美国专利申请系列第12/389，120号中描述的技术和方法创建衍生物，该文献的公开内容通过引用整体并入本文。术语“氨基酸序列同一性百分比(％ ) ”被定义为当多肽与候选序列比对时多肽中的氨基酸残基与候选序列中的氨基酸残基相同的百分比。为了确定氨基酸同一性百分比，比对序列，并且如果必要，引入空位来实现最大序列同一性百分比；保守性取代不被认为是序列同一性的一部分。确定同一性百分比的氨基酸序列比对步骤是本领域技术人员公知的。通常可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST2、ALIGN2或Megalign(DNASTAR) 软件用于比对肽序列。在具体的实施方案中，使用Blastp(可从美国国立生物技术信息中
(National Center for Biotechnology Information), Bethesda MD )，i^M 白勺@ 省参数为长复杂度滤波器(long complexity filter)、期望值(expect) 10、字长(word size) 3、存在(existence) 11 禾口延伸(extension) 1。当比对氨基酸序列时，给定氨基酸序列A对给定氨基酸序列B、与给定氨基酸序列 B、或针对给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性百分比(能够可替代地被表达为具有或包含对给定氨基酸序列B、与给定氨基酸序列B、或针对给定氨基酸序列B的某一氨基酸序列同一性百分比的给定氨基酸序列A)可计算为氨基酸序列同一性％= X/Y * 100其中X是根据A与B的序列比对程序或算法比对而评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，和Y是B中的氨基酸残基总数。如果氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度，那么A对B的氨基酸序列同一性百分比不等于B对A的氨基酸序列同一性百分比。当将较长序列与较短序列比较时，较短的序列是“B”序列。例如，当将截短的肽与相应的野生型肽进行比较时，截短的肽是“B”序列。概况本发明提供了包含对癌细胞而不是正常细胞具有细胞毒效应的细菌肽以及这些肽的变体、衍生物和结构等同物的组合物，以及防止哺乳动物形成癌症、治疗哺乳动物癌症和杀伤哺乳动物癌细胞的方法。具体地说，本文公开的组合物和方法可用于防止、治疗和/ 或杀伤白血病和/或卵巢癌。已显示，许多铜氧还蛋白(cupredoxin)、特别是铜绿假单胞菌天青蛋白及其截短物具有在体内和体外优先进入并杀伤许多类型的哺乳动物实体癌细胞的能力(Yamada等人，Cell. Biol. 7 :1418-1431 (2005) ；Hiraoka 等人，PNAS 101 :6427-6432(2004) ；Hiraoka 等人，Biochem. Biophys. Res. Comm. 338 1284-1290 (2005)) 还参见美国专利第 7，491，394 号、7，381，701号和7，084，105号，以及美国专利申请系列第11/488,693号、11/950，165 号、11/854，654号和12/338,480号，它们的公开内容通过引用整体并入本文。天青蛋白样基因存在于许多淋球菌和脑膜炎双球菌如淋病奈瑟氏球菌和脑膜炎奈瑟氏球菌 (N. meningitidis)中(Gotschlich & Seiff, FEMS Microbiol. Lett. 43 :253-255(1987)； Kawula，等人，Mol. Microbiol. 1 :179-185 (1987))。天青蛋白由许多病原菌产生，并且在这些基因中存在显著的序列同源性(Yamada，等人，Cell. Microbiol. 7 1418-1431 (2005))。一种称为“H. 8”的蛋白表位在病原奈瑟氏球菌属物种中是保守的，并且通过结合指定的H. 8的单克隆抗体来检测。这种不同的淋球菌基因Iaz编码与H. 8单克隆抗体交叉反应的蛋白(Hayashi & Wu，J. Bioenerg. Biomembr. 22 :451-471 (1990))。Laz是包含由细菌酶信号肽酶II识别的信号肽脂蛋白共有序列的淋球菌外表面蛋白，该信号肽酶II加工该信号肽脂蛋白共有序列导致脂肪酸和甘油的半胱氨酸残基的N 端酰化。(Hayashi & Wu，同前；Yamada，等人，Cell. Microbiol. 7 :1418-1431 (2005))。Laz 脂蛋白，大约17kDa，包括H. 8区，该H. 8区是N端包含基序Ala_Ala_Glu_Ala-Pro (AAEAP (SEQ ID N0:25))的不完美的五肽重复序列的39氨基酸区域(Gotschlich & kiff，同前； Kawula,等人，同前；Woods 等人，Mol. Microbiiol. 3 :43-48 (1989))。除此之外在 Laz 中的这种39氨基酸N端区域是与铜绿假单胞菌天青蛋白高度同源的127个氨基酸区域。(Cannon， Clin. Microbiol. Rev. 2 :S1_S4 (1989)) Laz参与针对氧化应激和铜毒性的防御并提高在活体夕卜的原代人夕卜宫颈上皮测定(ex vivo primary human ectocervical epithelial assay)中的存活率(Wu，等人，Infect. Immun. 73 :8444-8448 (2005)) 现在已知来自淋病奈瑟氏球菌和其他奈瑟氏球菌属物种的天青蛋白样蛋白Laz 蛋白能够特异性进入并杀伤脑癌细胞如成胶质细胞瘤细胞以及其他肿瘤。见实施例2和实施例7。此外，现在已知Laz蛋白的H. 8区当融合至铜绿假单胞菌天青蛋白的N端或C端时能够赋予铜绿假单胞菌天青蛋白进入并杀伤成胶质细胞瘤细胞的能力。见实施例2和实施例3。现在还已知H. 8区不必与共施用的蛋白如天青蛋白物理地连接来赋予该蛋白进入成胶质细胞瘤细胞的能力。见实施例5。相比于单独的天青蛋白，H. 8和融合至GST的N 端的H. 8均增加物理上未连接的天青蛋白进入成胶质细胞瘤细胞，然而融合至GST的C端的H. 8无效。此外，H. 8和融合至GST的N端的H. 8当与天青蛋白共施用时均增强天青蛋白对成胶质细胞瘤细胞的细胞毒性。见实施例5。还考虑可用这种AAEAP(SEQ ID NO 25) 重复单元设计杀伤白血病细胞的肽。天青蛋白和Iaz已知在癌症进展途径中靶向多个步骤，如通过复合物形成和p53 的稳定诱导凋亡、抑制凋亡以及抑制由受体酪氨酸激酶如EphB2/肝配蛋白B2所介导的细胞信号传导，从而使形成抗性的机会降到最小。参见，例如美国专利第7，381，701号，通过引用将其公开内容整体并入本文。天青蛋白和Laz已知在黑色素瘤或乳腺癌细胞中相比于正常细胞具有进入特异性。出人意料地，除了对实体型癌细胞具有细胞毒性外，天青蛋白和Laz蛋白也对液体传播癌症(liquid-borne cancer)如白血病有效，如通过本文给出的实施例所显示的。这些实施例显示天青蛋白和Laz能够各自进入白血病细胞系并且在其中具有细胞毒效应。此外，如在实施例9和实施例11中所讨论且在图8-11中所显示的，Laz对白血病细胞系发挥细胞毒效应，而对正常的外周血单核细胞(PBMC)几乎没有效应，在正常的外周血单核细胞它们具有有限的进入。这些细菌蛋白在白血病细胞中具有进入特异性，但在正常的PBMC中没有(图10，组图1)。除了天青蛋白和Laz以外，门冬酰胺酶和精氨酸脱亚胺酶(ADI)已显示具有针对实体瘤的活性，所述实体瘤包括乳腺癌、黑色素瘤、肾细胞癌、肝细胞癌等等，并且也已报道来自精氨酸支原体的ADI (Ma-ADI)抑制人白血病细胞的增殖(Yamada T等人，Proc Natl Acad Sci USA2002 ；99 :14098-103 ；Punj V 等人，Oncogene 23 :2367-78(2004) ；Ni Y 等人,Cancer Lett. 261 :1-11(2008) ；Fialho AM,Chakrabarty AM,Anticancer Drug Discov 2 :224-34(2007) ；Ensor CM 等人，Cancer Res 62 :5443-50(2002) ；Yoon CY 等人，Int. J Cancer 120 :897-905(2007) ；Gong H 等人，Leukemial4 :拟6_9 Q000))。在 Ma-ADI 中的催化三联体是Cys 398-His 269_Glu213。然而，除了 Ma-ADI对白血病细胞的效应的一次报道外，之前几乎不知道细菌蛋白如ADI在可能的针对白血病的治疗应用中的作用。铜绿假单胞菌也产生ADI (Pa-ADI)，该ADI在Cys406-His278_Aspl66具有催化三联体，并且具有与Ma-ADI的一级序列同源性。二级结构匹配(SSM)程序的使用揭示了在 Pa-ADI的N端区域中的胱天蛋白酶募集结构域(“CARD”)样结构域(蛋白质数据库，PDB ID代码1RXX)，它对带有CARD结构域的胱天蛋白酶_9的原结构域(pro-domain) (PDB ID 代码3YGS)具有可辨别的结构同源性。如图14D所示，在胍基超家族的成员中，ADI是唯一带有CARD结构域的。除了以上讨论的在精氨酸支原体ADI中的CARD样结构域(PDB ID代码1LXY)之外，在细菌蛋白中没有已知的CARD样结构域。出人意料地，如本文所公开的，在 Pa-ADI (Pa-CARD)中的CARD结构域具有很强的抗癌活性。简言之，CARD结构域多肽显示显著的抗癌活性同时对正常细胞几乎未展示细胞毒性。哺乳动物的包含CARD的蛋白通常由大约95个氨基酸残基构成并且具有对死亡域 (DD)和死亡效应域(DED)的序列相似性。CARD的结晶结构表明它由环绕疏水袋的大约6 个紧密堆积的α -螺旋组成。类似地，Pa-CARD由形成5个堆积的α -螺旋的85个氨基酸残基组成，这些α-螺旋采取“夹式风扇(clip-on-fan)”部分的形式(图14B和图14C)。 因为一些哺乳动物CARD结构域促进癌症生长，所以感兴趣的可能性是细菌CARD有助于干扰哺乳动物CARD活性，从而有助于含推定的CARD样结构域的I3a-ADI的抗癌活性。预期 Pa-CARD结构域可由携带哺乳动物CARD的蛋白补充，并且Pa-CARD可在癌细胞中发挥其细胞毒效应，至少在部分上通过与已知在癌细胞中被过高表达的哺乳动物CARD蛋白的蛋白-蛋白相互作用。还预期这种相互作用可能是ADI在癌症生长的调节中的作用的原因。Pa-CARD(SEQ ID NO :27)显示了针对白血病细胞和卵巢癌细胞的出人意料的细胞毒活性。特别地，Pa-CARD多肽具有抑制白血病细胞增殖的能力。在白血病细胞系HL60和 K562中，Laz和Pa-CARD的抗癌活性是通过在G2/M期的细胞周期停滞介导的，G2/M期涉及 Weel蛋白稳定和磷酸化的AKT-kr-473的消耗，磷酸化的AKT-kr-473是通常在许多癌症类型中失调的丝氨酸/苏氨酸激酶的活性形式。见实施例11和实施例12以及图12。具体地说，Pa-CARD和Laz通过Weel蛋白在K562细胞中的上调和活性AKT P_Ser473在HL60 细胞中的下调来抑制白血病细胞的细胞周期(图12)。已知Wfee 1和磷酸化的AKT4er473 (AKT_P_Ser473)参与G2/M期的细胞周期停滞，已知G2/M期的细胞周期停滞进而导致细胞死亡。例如，促有丝分裂激酶CDC2(也称为 CDK1)的活化是真核细胞从G2期转变为M期所需要的，在真核细胞中在Thr-14和Tyr-15 残基上的CDC2的磷酸化是重要的。抑制性Tyr-15磷酸化是由Weel蛋白激酶所介导的，并因此其增强的水平介导这种对转变为M期的抑制。已知病毒蛋白模拟Laz/Pa-CARD介导的 Wee蛋白激酶水平的升高。人乳头瘤病毒1型(HPV-1)E4蛋白通过形成无活性的细胞周期蛋白Bl-CDKl复合物来抑制细胞周期的G2到M的转变，所述Bl-CDKl复合物的形成是通过由水平升高的Weel催化的抑制性Tyr-15磷酸化实现的。因此，Weel的过表达增强G2细胞周期停滞，而通过小干扰RNA(SiRNA)消耗Weel缓解E4诱导的G2阻断。类似地，病毒癌基因v-akt的人同源物AKT (蛋白激酶B)在磷脂酰基肌醇3-激酶(PI3K)途径中起作用。在AKT-I中Ser-473残基被PDK2磷酸化对于细胞周期进程是重要的，而磷酸化的Akt Ser-473 (Akt-P-S473)水平的降低增强G2/M停滞，如通过HL60细胞中的Laz和Pa-CARD所证明的。Pa-CARD经由编码GM-CSF的基因的转录刺激而具有对SK0V-3 (卵巢癌)的效应。 基因被刺激大约3倍的GM-CSF和IL-12已知是许多肿瘤模型中的抗肿瘤免疫性的有效诱导剂，在肿瘤位点引发粒细胞、巨噬细胞和树突细胞的浸润，从而大大地增强肿瘤抗原递呈。因此似乎I3a-CARD诱导的凋亡(图18)可显著加到在存在I^a-CARD的情况下过高生成的任何GM-CSF的抗肿瘤响应。尽管基因谱表达显示许多细胞因子基因的刺激，但细胞因子 CCL2(C-C基序配体2)的基因，也称为单核细胞趋化蛋白-I(MCP-I)，显示显著的(17倍) 阻抑(表幻。CCL2通常显示通过在肿瘤中增加单核细胞募集和有害的肿瘤相关巨噬细胞 (TAM)而促进在乳腺癌中的恶性转化。CCL2也已知可能经由MCPIP促进血管发生和转移， MCPIP是一种新颖的转录因子，它活化钙粘蛋白基因cdhl2和cdhl9的转录。因此，Pa-CARD 降低CCL2水平可通过干扰血管发生和肿瘤生长进程而允许肿瘤衰退。总之，本文的实施例和公开内容显示细菌蛋白如天青蛋白、Laz和Pa-CARD能够进入白血病细胞并诱导G2/M期的细胞周期停滞，G2/M期的细胞周期停滞似乎是由CDC2-细胞周期蛋白B阻抑途径和细胞Pi:3K/AKT途径介导的细胞信号传导的调节所引发的。此外， ADI能够具有几种方式的抗癌活性，包括经由酶促消耗精氨酸和通过没有ADI活性的N端推定的CARD样结构域(图14-16)。Pa-cARD蛋白显示主要对癌细胞的抑制作用，但对正常细胞没有(图18)。此外，抗癌活性可通过胱天蛋白酶活性介导(图19)，并且能够诱导在卵巢癌细胞中的凋亡。本发明的组合物本发明提供了单独或与一种或多种其他细胞毒剂组合的细胞毒性肽和/或这些肽的变体、衍生物、截短物或结构等同物。在一些实施方案中，细胞毒性肽是铜氧还蛋白或其截短物。在一些这样的实施方案中，细胞毒性肽是天青蛋白或其截短物。在其他这样的实施方案中，细胞毒性肽是Laz或其截短物。在其他实施方案中，细胞毒性肽是Laz的H.8区。在一些实施方案中，细胞毒性肽包括选自由SEQ ID NO 22-24组成的组的一种或多种氨基酸序列。在其他实施方案中，细胞毒性肽包括CARD结构域。在一些实施方案中，细胞毒性肽是携带CARD的蛋白。在一些实施方案中，携带CARD的蛋白来源于细菌。在另一个实施方案中，细菌为铜绿假单胞菌。在一个实施方案中，细胞毒性肽是I^a-CARD。在另一个这样的实施方案中，细胞毒性肽包括SEQ ID N0:27。在一些实施方案中，使用本领域公知的技术将细胞毒性肽与赋予其更大细胞毒效应的另一种肽融合。在一个这样的实施方案中，另一种肽是Laz的H. 8区。在另一种肽中，另一种肽具有包括SEQ ID N0:24的序列。在一个实施方案中，细胞毒性肽是融合蛋白 hu-H.8。在另一个实施方案中，细胞毒性肽是融合蛋白H. 8-Azu。图1。可以与本文所述的细胞毒性肽组合施用的一种或多种其他细胞毒剂可以是癌症治疗药物，包括但不限于顺钼、Gleevec 、视黄酸、5'-氮杂-2'-脱氧胞苷(“DAC”)和 /或与三氧化二砷结合的视黄酸。除了Gleevec 、视黄酸、DAC和/或与三氧化二砷结合的视黄酸以外的癌症治疗药物包括细胞周期控制蛋白，如P53 ；细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，如pl6、p21或p27 ；自杀蛋白，如胸腺嘧啶核苷激酶或硝基还原酶；细胞因子或其他免疫调节蛋白，如白细胞介素1、白细胞介素2或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)； 毒素，如铜绿假单胞菌外毒素A ;5_氟尿嘧啶；干扰素α ；甲氨蝶呤；他莫西芬；雷洛昔芬； 长春新碱；烷化剂，如氮芥、烷基磺酸盐、亚硝基脲、氮丙啶、和三氮烯；抗代谢药，如叶酸拮抗剂、嘌呤类似物、以及嘧啶类似物；抗生素，如蒽环类抗生素、博来霉素、丝裂霉素、更生霉素和普卡霉素；酶，如L-门冬酰胺酶；法尼基-蛋白转移酶抑制剂；5 α -还原酶抑制剂； 17 β -羟基类固醇脱氢酶3型抑制剂；激素药，如糖皮质激素、雌激素/抗雌激素、雄激素 /抗雄激素、黄体酮、和促黄体生成素释放激素拮抗剂、醋酸奥曲肽；微管破坏剂，如海鞘素 (ecteinascidin)或其类似物和衍生物；微管稳定剂，如紫杉烷，例如，紫杉醇(Taxo 1 )、 多西他赛(Taxotere )、及其类似物，和埃坡霉素，如埃坡霉素A-F及其类似物；植物源产物，如长春花生物碱、表鬼白毒素、紫杉烷；和拓扑异构酶抑制剂；异戊二烯基-蛋白转移酶抑制剂；和各种各样的剂，如羟基脲、丙卡巴胼、米托坦、六甲蜜胺、钼配位络合物，如顺钼和卡钼；和用作抗癌剂和细胞毒性剂的其他剂，如生物反应调节物、生长因子；免疫调节剂和单克隆抗体；盐酸氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、美法仑、异环磷酰胺、白消安、卡莫司汀、 洛莫司汀、司莫司汀、链佐星、噻替派、达卡巴嗪、甲氨蝶呤、硫鸟嘌呤、巯嘌呤、氟达拉滨、喷司他丁(pentastatin)、克拉屈滨、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、盐酸阿霉素、柔红霉素、伊达比星、 硫酸博来霉素、丝裂霉素C、放线菌素D、番红霉素(safracin)、沙弗拉霉素(saframycin)、 quinocarcin, discodermolide、长春新碱、长春碱、酒石酸长春瑞滨、依托泊苷、磷酸依托泊苷、替尼泊苷、紫杉醇、雌莫司汀、雌莫司汀磷酸钠、氟他胺、布舍瑞林、亮丙立德、蝶啶、双炔 (diynes)、左旋咪唑、aflacon、干扰素、白细胞介素、阿地白介素、非格司亭、沙格司亭、利妥昔单抗、BCG、维甲酸、盐酸伊立替康、倍他米松(betamethosone)、盐酸吉西他滨、六甲蜜胺、 和托泊替康以及它们的任何类似物或衍生物。其他细胞毒剂的实例还包括以下如在德国专利第4138042. 8号；W097/19086、 WO 98/22461、WO 98/25929、WO 98/38192、WO 99/01124、WO 99/02224、WO 99/02514、 WO 99/03848、WO 99/07692、WO 99/27890、WO 99/28324、WO 99/43653、WO 99/54330、WO 99/54318、WO 99/54319、WO 99/65913、WO 99/67252、WO 99/67253 和 WO 00/00485 中发现的埃坡霉素衍生物；如在WO 99/对416(还参见美国专利第6，040，321号)中发现的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂；以及如在WO 97/30992和W098/54966中发现的异戊二烯基-蛋白转移酶抑制剂；以及诸如那些一般且特定地在美国专利第6，011,0 号中描述的剂，其化合物能够与任何NHR调节剂如AR调节剂、ER调节剂一起，与LHRH调节剂一起利用，尤其是在癌症的治疗中。本发明还提供了为铜氧还蛋白和/或携带CARD的蛋白的变体、衍生物、截短物或结构等同物的细胞毒性肽。在一些实施方案中，分离细胞毒性肽。在一些实施方案中，细胞毒性肽是基本纯的或药物级的。在其他实施方案中，细胞毒性肽在包含该细胞毒性肽或基本上由该细胞毒性肽组成的组合物中。在其他实施方案中，细胞毒性肽在包含该细胞毒性肽和至少一种其他细胞毒剂的组合物中。在另一个具体实施方案中，细胞毒性肽是无抗原性的并且不在哺乳动物(且更具体为人)中产生免疫应答。在一些实施方案中，细胞毒性肽比全长铜氧还蛋白或携带CARD的蛋白小，并且保留了全长蛋白的某些药理活性。具体地说，在一些实施方案中，细胞毒性肽可保留杀伤癌细胞特别是白血病细胞的能力。因为在铜氧还蛋白之间的高结构同源性，预期其他铜氧还蛋白将具有与天青蛋白和Laz相同的细胞毒特性，特别是关于白血病的。在一些实施方案中，铜氧还蛋白为， 但不限于天青蛋白、假天青蛋白、质体蓝素、铁硫菌蓝蛋白(rusticyanin)、绿丝菌蓝色铜蛋白(auracyanin)、漆树蓝蛋白、黄瓜碱性蛋白或Laz。在特别具体的实施方案中，天青蛋白或Laz来源于铜绿假单胞菌、粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)、木糖氧化物色杆菌反硝化亚种 I (Achromobacter xylosoxidans ssp. denitrificans I)、支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)、甲基单胞菌(Methylomonas sp·)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhea)、焚光假单胞菌 (Pseudomonas fluorescens)、參录针{段单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)、昔养木！flif (Xylella fastidiosa) > Ulva pertussis 或苜Ij溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)。在具体的实施方案中，天青蛋白来自铜绿假单胞菌。本发明提供了如下细胞毒性肽所述细胞毒性肽为与野生型铜氧还蛋白或携带 CARD的蛋白相比氨基酸被取代、缺失或插入的铜氧还蛋白或携带CARD的蛋白的氨基酸序列变体。本发明的变体可以是野生型蛋白的截短物。在一些实施方案中，本发明的细胞毒性肽包含比全长野生型多肽小的铜氧还蛋白或携带CARD的蛋白的区域。本发明的细胞毒性肽还可以包括用非天然存在的合成氨基酸制备的肽。例如，非天然存在的氨基酸可被整合到化学预防剂中来延长或优化该组合物在血流中的半衰期。这些化学预防剂包括但不限于D，L-肽(非对映体)(例如Futaki等人， J. Biol. Chem. 276(8) :5836-40(2001) ；Papo 等人，Cancer Res. 64(16) :5779-86(2004)； Miller 等人，Biochem. Pharmacol. 36(1) 169-76，(1987)；包含罕见氨基酸的肽(例如Lee等人，J. Pept. Res. 63 (2) :69-84 (2004))，包含非天然氨基酸的烯烃接着碳化 S 钉针(hydrocarbon stapling)(例如 Schafmeister 等人，J. Am. Chem. Soc. 122 5891-5892(2000) ；Walenski 等人，Science 305 1466-147(^2004))，和包含 ε-(3，5_ 二硝基苯甲酰基)-Lys残基的肽。在其他实施方案中，本发明的细胞毒性肽是铜氧还蛋白或携带CARD的蛋白的衍生物。铜氧还蛋白或携带CARD的蛋白的衍生物是化学修饰的肽，使得该肽仍保留其一些根本活性。例如，天青蛋白、Laz或I5a-CARD的“衍生物”可以是保留其杀伤癌细胞特别是白血病细胞和/或卵巢癌细胞的能力的化学修饰的蛋白。另一种衍生物可以是具有增加的或优化的在血流中的半衰期的衍生物。化学修饰可包括但不限于，在美国专利申请系列第 12/389，120号中公开的化学修饰，该申请的公开内容通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，可使用包括但不限于以下的方法修饰细胞毒性肽减少肽的水解、减少肽的脱酰胺作用、减少氧化、减少免疫原性和/或增加肽的结构稳定性。预期本文所述的或通过引用并入的两种或更多种修饰可合并在一种修饰的铜氧还蛋白衍生肽中， 且本文所述的一种或多种修饰与改进药物代谢动力学特性的其他修饰的组合是本领域技术人员公知的。设计这些变体和衍生物的许多方法是本领域公知的。使用方法本发明提供了杀伤哺乳动物特别是人的癌细胞、特别是白血病细胞和/或卵巢癌细胞的方法。所述方法包括使癌细胞与对癌细胞具有细胞毒效应的分离肽或其变体、衍生物、截短物或结构等同物接触。分离肽可以是本文所述的铜氧还蛋白或携带CARD的蛋白。 在一个实施方案中，分离肽是天青蛋白。在另一个实施方案中，分离肽是Laz。又在另一个实施方案中，分离肽是I^a-CARD。在另外的实施方案中，分离肽是包含Laz的H.8区的融合蛋白。在一个这样的实施方案中，融合蛋白是H. 8-Azu。在另一个这样的实施方案中，融合蛋白是hu-H. 8。细胞毒性肽可以单独施用给癌细胞或与本文所述的另一种细胞毒剂组合或与Laz的H. 8区组合施用给癌细胞。在一些实施方案中，细胞毒性肽与Laz的H. 8区同时或大致同时施用。在其他实施方案中，细胞毒性肽与包含SEQ ID NO : 的序列同时或大致同时施用。本发明还提供了通过向患者施用对癌细胞具有细胞毒效应的分离肽或其变体、衍生物、截短物或结构等同物来治疗患有癌症的哺乳动物患者或另外杀伤哺乳动物患者中的癌细胞的方法。分离肽可以是本文所述的铜氧还蛋白或携带CARD的蛋白。在一个实施方案中，分离肽是天青蛋白。在另一个实施方案中，分离肽是Laz。又在另一个实施方案中，分离肽是I^a-CARD。在另外的实施方案中，分离肽是包含Laz的H.8区的融合蛋白。在一个这样的实施方案中，融合蛋白是H. 8-Azu。在另一个这样的实施方案中，融合蛋白是hu-H. 8。 细胞毒性肽可以单独施用或与本文所述的另一种细胞毒剂组合或与Laz的H. 8区组合施用。在一些实施方案中，细胞毒性肽与Laz的H. 8区同时或大致同时施用。在其他实施方案中，细胞毒性肽与包含SEQ ID NO :24的序列同时或大致同时施用。本发明还提供了通过向白血病细胞和/或卵巢癌细胞施用一种或多种细胞毒性肽来诱导白血病细胞和/或卵巢癌细胞通过细胞分化而死亡的方法。细胞毒性肽可以是本文所述的铜氧还蛋白或携带CARD的蛋白。在一个实施方案中，细胞毒性肽是天青蛋白。 在另一个实施方案中，细胞毒性肽是Laz。在另一个实施方案中，细胞毒性肽是融合蛋白 H. 8-Azu。又在另一个实施方案中，细胞毒性肽是融合蛋白Azu-H. 8。本发明还提供了通过向白血病细胞和/或卵巢癌细胞施用一种或多种细胞毒性肽来选择性进入白血病细胞和/或卵巢癌细胞并且在其中具有细胞毒效应的方法。细胞毒性肽可以是本文所述的铜氧还蛋白或携带CARD的蛋白。在一个实施方案中，细胞毒性肽是天青蛋白。在另一个实施方案中，细胞毒性肽是Laz。又在另一个实施方案中，细胞毒性肽是I^a-CARD。在另外的实施方案中，细胞毒性肽是包含Laz的H.8区的融合蛋白。在一个这样的实施方案中，融合蛋白是H. 8-Azu。在另一个这样的实施方案中，融合蛋白是hu-H. 8。本发明还包括通过引起G2/M期的细胞周期停滞来杀伤白血病细胞和/或卵巢癌细胞的方法，所述方法包括施用一种或多种细胞毒性肽。在另外的实施方案中，细胞毒性肽稳定Weel蛋白和/或提高细胞中的Weel蛋白水平，包括但不限于细胞的细胞质和/或细胞核中的Weel蛋白水平。又在另一个实施方案中，细胞毒性肽消耗磷酸化的 AKT-Ser-473.又在另一个实施方案中，细胞毒性肽既稳定/提高Weel蛋白水平又消耗磷酸化的AKT-kr-473。在另一个实施方案中，细胞毒性肽是天青蛋白。在另一个实施方案中，细胞毒性肽是Laz。又在另一个实施方案中，细胞毒性肽是I^-CARD。又在另一个实施方案中，细胞毒性肽是融合蛋白H. 8-Azu和hu-H. 8中的一种或多种。编码细胞毒性肽的核酸和表达载体在另一方面，本发明提供了编码本文所述的细胞毒性肽及其变体、衍生物和/或结构等同物的核酸分子。根据本发明的核酸分子可通过组合本领域已知的技术来制备。在这些核酸中使用的编码序列可以是那些在编码特定肽的天然基因组DNA中发现的编码序列，或者可以由已知密码子设计。这些编码序列也可以被设计成考虑到要表达多肽的生物的替代密码子使用和偏好密码子使用。细胞毒性肽的核酸序列可通过化学合成或克隆个别地制备。然后可用连接酶将核酸序列连接在一起，以便给出感兴趣的核酸分子。用于使遗传材料在生物之间穿梭的载体可分为两大类克隆载体是具有在适当的宿主细胞中繁殖所必需的且外源DNA可插入其中的区域的复制质粒或噬菌体；外源DNA如同它是载体的组分一样被复制和繁殖。表达载体(如质粒、酵母或动物病毒基因组)用来将外源遗传材料引入宿主细胞或组织中以便转录和翻译外源DNA，如细胞毒性肽像Laz、天青蛋白、Pa-CARD、H. 8_Azu或iVzu-H. 8的DNA。在表达载体中，引入的DNA与传递信号给宿主细胞以高效转录插入的DNA的元件如启动子可操作地连接。一些启动子是格外有用的， 如响应于特定因子而控制基因转录的诱导型启动子。将细胞毒性肽及其变体和衍生物与诱导型启动子可操作地连接能够响应于特定因子而控制该细胞毒性肽及其变体和衍生物的表达。经典诱导型启动子的实例包括那些对α-干扰素、热休克、重金属离子和类固醇如糖皮质激素(Kaufman, Methods Enzymo 1. 185 :487-511(1990))以及四环素有响应的启动子。其他令人期望的诱导型启动子包括那些对于引入构建体的细胞来说不是内源的但是当外源供应诱导剂时在这些细胞中有响应的启动子。一般来说，有用的表达载体通常是质粒。 然而，考虑其他形式的表达载体，如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒以及腺伴随病毒)。载体选择由正使用的生物或细胞以及期望的载体去向来决定。一般来说，载体包括信号序列、复制起点、标记基因、多聚接头位点、增强元件、启动子和转录终止序列。包含细胞毒性肽的药物组合物本发明还提供了包含至少一种细胞毒性肽的组合物，所述细胞毒性肽是铜氧还蛋白或携带CARD的蛋白，或是铜氧还蛋白或携带CARD的蛋白的变体、衍生物、截短物或结构等同物，特别是在药物组合物中单独的或与至少另一种细胞毒剂组合的细胞毒性肽。在具体实施方案中，将药物组合物设计为特定的施用方式，例如，但不限于，口服、腹膜内或静脉内。这些组合物可以是在水中水合的，或可以是干燥的(如通过冷冻干燥)以用于后来的水合。这些组合物可以在除水外的溶剂中，诸如但不限于醇。包含细胞毒性肽的本发明的药物组合物能够以任何常规方式制造，例如，通过常规的混合、溶解、成粒、制糖衣(dragee-making)、乳化、装胶囊、截留或冷冻干燥工艺。细胞毒性肽可容易地与本领域公知的药学上可接受的载体合并。这些载体使得制剂能够被配制成片剂、丸剂、糖衣片、胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂、悬浮剂等等。适合的赋形剂还可以包括，例如，填充剂和纤维素制剂。其他的赋形剂可包括，例如，调味剂、着色剂、防粘剂、增稠剂和其他可接受的添加剂、佐剂或粘合剂。在多个实施方案中，组合物包括载体和赋形剂(包括但不限于缓冲液、碳水化合物、甘露醇、蛋白、多肽或氨基酸如甘氨酸、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂、悬浮剂、增稠剂和/ 或防腐剂)，水，油，盐水溶液，含水葡萄糖和甘油溶液，适当的生理条件所需的其他药学上可接受的辅助物质，如缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等等。将认识到，尽管可利用本领域技术人员已知的任何适宜的载体施用本发明的组合物，但载体类型将随施用方式而改变。还可使用公知技术将化合物封装在脂质体中。也可以利用生物可降解的微球作为本发明的组合物的载体。适合的生物可降解的微球显示在，例如美国专利第4，897，268号、5，075，109号、 5，928，647 号、5，811，128 号、5，820，883 号、5，853，763 号、5，814，344 和 5，942，252 号中。 如本文所述的“化合物”包括本发明的肽、氨基酸序列、载荷化合物(cargo compound)和络合物和核酸。用于制备施用本文公开的细胞毒性肽和核酸的药物组合物的静脉注射液 (intravenous fluid)可由类晶体或胶体构成。如本文所用的类晶体是矿物盐或其他水溶性分子的水溶液。如本文所用的胶体包含较大的不可溶分子，如明胶。静脉注射液可以是无菌的。可用于静脉内施用的类晶体流体包括但不限于生理盐水(0. 9%浓度的氯化钠溶液)、林格氏乳酸盐或林格氏溶液、以及有时称为D5W的5%葡萄糖的水溶液，如表1所述。表1 常见的类晶体溶液的组成
溶液其他名称[Na+][Cl][葡萄糖]D5W5%葡萄糖002522/3 & 1/33.3%葡萄糖 /0.3%盐水5151168二分之一生理盐水0.45% NaCl77770生理盐水0.9% NaCl1541540林格氏乳酸盐*林格氏溶液1301090*林格氏乳酸盐还具有乳酸盐、4mmol/L K+和3mmol/L Ca2+。本发明的组合物在血流中的半衰期可通过本领域技术人员公知的几种方法延长或优化，包括但不限于环化肽(Monk等人，BioDrugsl9(4) =261-78, (2005) ；DeFreest等人，J. Pept. Res. 63 (5) :409-19 (2004))、D，L-肽(非对映体)(Futaki 等人，J. Biol. Chem. Feb 23 ；276 (8) :5836-40(2001) ；Papo 等人，Cancer Res. 64(16) :5779-86(2004) ；Miller 等人，Biochem. Pharmacol. 36(1) 169-76，(1987))；包含罕见氨基酸(Lee 等人，J. Pept. Res. 63(2) :69-84 Q004))，以及 N 端和 C 端修饰(Labrie 等人，Clin. Invest. Med. 13(5) 275-8，(1990))的肽。特别感兴趣的是经由D-取代或L-氨基酸取代的肽稳定性的d_异构化(取代)和修饰。当施用是通过注射时，组合物可以被配制在水溶液中，优选在生理相容的缓冲液中，如汉克斯溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液。溶液可包含配制剂如悬浮剂、稳定剂和/ 或分散剂。可选地，组合物可以是在使用前以适合的媒介物例如无菌无热原水构建的粉末形式。当通过吸入法施用时，组合物可以以喷雾剂形式递送，所述喷雾剂来自利用适合的推进剂的加压包或喷雾器，所述推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氧化碳或其他适合的气体。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可通过提供递送计量用量的阀来确定。例如在吸入器或吹入器中使用的明胶的胶囊和药筒可被配制成包含蛋白与适合的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。当施用是通过局部施用时，如本领域所公知的，组合物可被配制成溶液、凝胶、软膏、乳膏、悬浮液等等。在一些实施方案中，施用是借助透皮贴剂。当施用是通过栓剂(例如，直肠栓剂或阴道栓剂)时，组合物也可以被配制在包含常规栓剂基质的组合物中。当施用是口服时，组合物可以容易地与本领域公知的药学上可接受的载体组合在一起配制。可利用固体载体，如甘露醇、乳糖、硬脂酸镁等等；这些载体使得趋化因子能够被配制成片剂、 丸剂、糖衣片、胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂、悬浮剂等等，以用于待治疗的受治疗者的口服摄入。对于口服固体制剂例如像粉末、胶囊和片剂来说，适合的赋形剂包括填充剂如糖、纤维素制剂、成粒剂和粘合剂。其他本领域公知的常规载体也包括多价载体，如细菌荚膜多糖、葡萄糖或基因工程载体。此外，包括所述组合物的缓释制剂允许该组合物经延长的时间释放，以至于如果没有该缓释制剂，组合物将在引起或增强治疗效果之前从受治疗者的系统中清除，和/或被例如蛋白酶和单纯水解降解。包含细胞毒性肽的药盒在另一方面，本发明提供了在包装或容器中包含以下的一种或多种的药盒(1) 包括本文所述的一种或多种细胞毒性肽的试剂；( 包括药学上可接受的佐剂或赋形剂的试剂；C3)施用媒介物，如注射器；(4)施用说明。在同一容器中发现组分(1)- )的两种或更多种的实施方案也被考虑。在其他实施方案中，药盒组分也可以包括一种或多种额外的细胞毒剂。在其他的实施方案中，配制试剂用于静脉内施用，和/或施用的媒介物适合于静脉内施用。当提供药盒时，组合物的不同组分可被包装在各自的容器中并且在使用前立即混合。组分的这种分别包装可分别允许长期储存而不损失活性组分功能。在药盒中包括的试剂可提供在任何种类的容器中，以使得不同组分的寿命被保藏并且不被容器的材料吸附或改变。例如，密封的玻璃安瓿可盛装冻干的多肽或多核苷酸，或在中性非反应的气体如氮气之下包装的缓冲液。安瓿可由任何适宜的材料组成，如玻璃，有机聚合物如聚碳酸酯、聚苯乙烯等，陶瓷，金属或通常用于容纳相似试剂的任何其他材料。 适合的容器的其他实例包括可由类似的物质像安瓿一样制造的简单的瓶，以及可包含如铝或合金的箔内衬的包装袋(envelop)。其他容器包括试管、管形瓶、烧瓶、瓶、注射器或类似容器。容器可具有无菌入口(sterile access port)，如具有可被皮下注射针穿入的塞子的瓶。其他容器可具有两个被容易移去的膜分隔的室，该膜在移去后允许组分混合。可移去的膜可以是玻璃、塑料、橡胶等等。药盒还可以配有说明材料。可以将说明印在纸上或其他基质上，和/或可以作为电子可读介质提供，如软磁盘、⑶_R0M、DVD-R0M、Zip盘、录像带、录音带、闪存装置等等。详细说明可以不与药盒在物理上关联；相反，可将用户引导至由药盒的制造商或分销商指定的因特网网站，或作为电子邮件提供。通过参考以下具体实施例，可获得对本发明的更完整的理解。仅出于解释的目的描述实施例，且实施例不旨在限制本发明的范围。在情况提示有利或变得有利时，考虑形式变化和等同物的取代。尽管本文已利用特定术语，但这些术语意在描述意义而不是出于限制的目的。可在不背离本发明的精神和范围的情况下作出本文之前给出的本发明的修饰和变化，因此，仅这些限制应按照由所附实施方案所指示那样来施加。实施例
实施例1. Laz和H. 8_天青蛋白融合基因的克隆和表达基于来自淋病奈瑟氏球菌的Iaz基因的已知序列(SEQ ID NO 1)克隆该基因(图 1A)。使用称为paz (图1B)的铜绿假单胞菌天青蛋白基因(SEQ ID NO 2)和来自淋病奈瑟氏球菌的Iaz的H. 8表位序列(SEQ ID NO 3)将H. 8表位基因符合读框地克隆在paz的 5'端中产生H. 8-paz (图1C)或者符合读框地克隆在paz的3'端中产生paz-H. 8 (图1D)， 如以下所述。细胞系和试剂。人癌细胞、细菌菌株和质粒列在表2中。人乳腺癌MCF-7细胞和脑瘤LN-2^细胞来自伊利诺斯大学芝加哥校区(UIC)手术肿瘤学系的储存培养物保藏中心(stock culture collection of the Department of Surgical Oncology,University of Illinois at Chicago (UIC))。将细胞培养在包含2mM L-谷氨酰胺、0. ImM MEM必需氨基酸和补充了 10%热灭活的胎牛血清、100单位/ml青霉素和100μ g/ml链霉素的具有伊格尔盐的MEM中。所有细胞在37°C、5% (02下生长。(Yamada，等人，Proc. Natl. Acad. ki. USA 99 :14098-14103(2002) ；Punj，等人，0ncogene23 :2367-2378 (2004)) 表2.癌细胞、细菌菌株和基因构建体
权利要求
1.一种能够杀伤癌细胞的分离肽，所述分离肽包含胱天蛋白酶募集(CARD)样结构域。
2.如权利要求1所述的分离肽，所述分离肽来源于细菌。
3.如权利要求2所述的分离肽，其中所述细菌是铜绿假单胞菌(I^eudomonas aeruginosa)0
4.如权利要求1所述的分离肽，所述分离肽是I^a-CARD。
5.如权利要求1所述的分离肽，所述分离肽包括SEQID N0:27。
6.如权利要求5所述的分离肽，所述分离肽由SEQID N0:27组成。
7.如权利要求1所述的分离肽，其中所述癌选自由以下组成的组白血病、卵巢癌、纤维肉瘤和乳腺癌。
8.如权利要求1所述的分离肽，所述分离肽被化学修饰以延长或优化其在血流中的半衰期。
9.一种方法，包括通过使癌细胞与一种或多种蛋白接触来杀伤所述癌细胞，所述一种或多种蛋白选自由以下组成的组权利要求1所述的分离肽、Laz, HS-Azu和hu-H8。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述癌细胞选自由以下组成的组白血病细胞、纤维肉瘤细胞、卵巢癌细胞和乳腺癌细胞。
11.如权利要求9所述的方法，所述方法还包括使所述细胞与能够杀伤癌细胞的一种或多种细胞毒剂接触。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述一种或多种细胞毒剂选自由以下组成的组 顺钼、Gleevec 、视黄酸、5'-氮杂-2'-脱氧胞苷和三氧化二砷。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述一种或多种细胞毒剂是顺钼。
14.如权利要求11所述的方法，其中所述癌细胞在与接触所述一种或多种蛋白大约相同的时间同所述一种或多种细胞毒剂接触。
15.一种方法，包括向患有癌症的哺乳动物患者施用一种或多种蛋白，所述一种或多种蛋白选自由以下组成的组权利要求1所述的分离肽、Laz, HS-Azu和hu-H8。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组白血病、纤维肉瘤、卵巢癌和乳腺癌。
17.如权利要求15所述的方法，所述方法还包括向所述患者施用能够杀伤癌细胞的一种或多种细胞毒剂。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述一种或多种细胞毒剂选自由以下组成的组 顺钼、Gleevec 、视黄酸、5'-氮杂-2'-脱氧胞苷和三氧化二砷。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述一种或多种细胞毒剂是顺钼。
20.如权利要求17所述的方法，其中所述一种或多种细胞毒剂在与所述一种或多种蛋白大约相同的时间施用。
21.一种方法，包括通过使白血病细胞与天青蛋白和包含Laz的H. 8区的肽接触来杀伤所述白血病细胞。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述白血病细胞与所述天青蛋白和所述包含Laz 的H. 8区的肽同时或大致同时接触。
23.一种方法，包括向患白血病的哺乳动物患者施用天青蛋白和包含Laz的H. 8区的肽。
24.如权利要求23所述的方法，其中同时或大致同时向所述患者施用所述天青蛋白和所述包含Laz的H. 8区的肽。
25.一种方法，包括通过使白血病细胞接触一种或多种蛋白来诱导所述白血病细胞中的细胞分化，所述一种或多种蛋白选自由以下组成的组Laz、天青蛋白、H. 8-Azu、Azu-H. 8 和权利要求1所述的分离肽。
26.一种方法，包括通过使癌细胞与一种或多种蛋白接触来选择性进入所述癌细胞，所述一种或多种蛋白选自由以下组成的组Laz、天青蛋白、H. 8-Azu、Azu-H. 8和权利要求1所述的分离肽；其中所述癌细胞选自由白血病细胞和卵巢癌细胞组成的组。
27.一种方法，包括通过使癌细胞接触一种或多种蛋白来诱导所述癌细胞中的细胞周期停滞，所述一种或多种蛋白选自由以下组成的组Laz、天青蛋白、H. 8-Azu、Azu-H. 8和权利要求1所述的分离肽。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述癌细胞选自由以下组成的组白血病细胞、纤维肉瘤细胞、乳腺癌和卵巢癌细胞。
29.如权利要求27所述的方法，其中所述蛋白提高所述细胞中的Weel蛋白水平。
30.如权利要求27所述的方法，其中所述蛋白引起磷酸化的AKT-kr-473的消耗。
31.如权利要求27所述的方法，其中所述蛋白既提高所述细胞中的Weel蛋白水平又引起磷酸化的AKT-kr-473的消耗。
32.一种方法，包括通过使癌细胞与权利要求1所述的肽接触而通过胱天蛋白酶3的活化在所述癌细胞中诱导凋亡。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述癌细胞是卵巢癌细胞。
34.一种方法，包括通过使癌细胞与权利要求1所述的肽接触来调节所述癌细胞中 NF-kB信号传导途径基因的表达。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述癌细胞是卵巢癌细胞。
36.一种表达载体，所述表达载体编码权利要求1所述的分离肽。
37.如权利要求36所述的表达载体，所述表达载体编码权利要求4所述的分离肽。
38.一种药物组合物，所述药物组合物包括权利要求1所述的分离肽。
39.如权利要求38所述的药物组合物，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
40.如权利要求38所述的药物组合物，所述药物组合物还包括选自由以下组成的组的蛋白天青蛋白、Laz、H. 8-Azu和Azu-H. 8。
41.如权利要求38所述的药物组合物，所述药物组合物还包括能够杀伤癌细胞的一种或多种细胞毒剂。
42.如权利要求38所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体适合于静脉内注射。
43.一种方法，包括向患有白血病的患者施用治疗有效量的权利要求38所述的药物组合物。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述药物组合物以选自由以下组成的组的方式向患者施用静脉内、局部、皮下、肌内、口服和进入肿瘤内。
45.一种药盒，所述药盒包括权利要求38所述的药物组合物。
46.一种核酸分子，所述核酸分子编码权利要求1所述的分离肽。
47. 一种核酸分子，所述核酸分子编码权利要求4所述的分离肽。
全文摘要
本发明涉及用源自细菌的蛋白杀伤癌细胞的方法和材料。本发明具体涉及天青蛋白、Laz、Pa-CARD以及融合蛋白Azu-H.8和H.8-Azu，以及它们在杀伤白血病细胞和/或卵巢癌细胞中的用途。
文档编号A61K38/00GK102387809SQ201080016084
公开日2012年3月21日 申请日期2010年2月22日 优先权日2009年2月20日
发明者塔帕斯·达斯古普塔, 阿南达·查克拉博蒂, 阿塞尼奥·菲亚略 申请人:Cdg医疗公司