新的细胞内溶素OBPgpLYS的制作方法

专利名称：新的细胞内溶素OBPgpLYS的制作方法
新的细胞内溶素OBPgpLYS本发明涉及具有根据SEQ ID NO 1的氨基酸序列的多肽和其片段或衍生物。本发明还涉及包含所述多肽以及与所述多肽在N端或C端融合的附加肽段的融合蛋白。此外，本发明涉及编码所述多肽或融合蛋白的核酸分子、包含所述核酸分子的载体以及包含所述核酸分子或所述载体的宿主细胞。此外，本发明涉及所述多肽或融合蛋白用作药物，特别是用于治疗或预防革兰氏阴性细菌感染，用作诊断手段、作为美容物质或消毒剂。本发明还涉及所述多肽或融合蛋白用于治疗或预防食品、食品加工装置、食品加工厂、与食品相接触的表面、医疗设备、医院和手术中的表面的革兰氏阴性细菌污染。此外，本发明涉及包含所述多肽或融合蛋白的药物组合物。革兰氏阴性细菌具有外膜，其特点为特征性的不对称双分子层。外膜的双分子层由含有磷脂(主要为磷脂酰乙醇胺)的内侧单分子层和主要由单一糖脂——脂多糖(LPS)构成的外侧单分子层组成。在细菌界，LPS结构具有广阔的多样性，且LPS结构可响应主导的环境条件而受到修饰。LPS层的稳定性以及不同LPS分子之间的相互作用主要通过二价离子(Mg2+、Ca2+)与LPS分子的阴离子组分(脂质A中的磷酸基团和KDO的内核和羧基基团)的静电相互作用实现。此外，由于缺乏不饱和脂肪酸所致，脂质A疏水部分的密集而有序的包装形成具有高粘性的刚性结构。这使其较不易被亲脂性分子渗透，并赋予外膜(OM)额外的稳定性。多种类型的具有杀菌或抑菌活性的试剂是已知的，例如抗生素、细胞内溶素、抗微生物肽和防卫素。然而，微生物对抗生素抗性的增加对治疗愈来愈多的细菌导致的感染造成了困难。特别的困难出现于由革兰氏阴性细菌如铜绿假单胞菌O^eudomonasaeruginosa)禾口(Enterobacteriaceae)帛Ifc白勺胃I。细胞内溶素为噬菌体(或细菌的病毒)编码的肽聚糖水解酶。其在噬菌体复制(multiplication)的裂解周期中的晚期基因表达期间合成，并通过降解细菌肽聚糖来介导后代病毒体从受感染的细胞的释放。其为β (1，4)_糖基化酶(溶菌酶)、转糖基酶、酰胺酶或内肽酶。细胞内溶素的抗微生物应用已经在1991年由Gasson(GB2243611)提出。尽管细胞内溶素的杀灭能力久为人知，但由于抗生素的成功和主宰地位，忽略了这些酶作为抗细菌剂的用途。仅在多重抗生素抗性细菌出现后，用细胞内溶素对抗人类病原体这一简单理念方才受到注意。出现了令人瞩目的开发全新类型的抗细菌剂的需求，而用作酶抗生素(enzybiotics)( “酶”和“抗生素”的组合术语)的细胞内溶素完美地符合该需求。2001年，Fischetti及其同事首次证实了噬菌体Cl细胞内溶素对A组链球菌的治疗潜力(Nelson等，2001)。此后，许多公开物确立了细胞内溶素作为控制细菌感染，特别是革兰氏阳性细菌的有吸引力和补充的替代手段。接着，证明了针对其他革兰氏阳性病原体如月市炎链球菌(Streptococcus pneumoniae) (Loeffler 等，2001)、炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis) (Schuch 等，2002)、无乳链球菌(S. agalactiae) (Cheng 等，2005)和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus) (Rashel等，2007)的不同细胞内溶素作为酶抗生素的效力。现在，细胞内溶素疗法最重要的挑战在于革兰氏阴性细菌由于外膜屏蔽细胞内溶素接近肽聚糖而对细胞内溶素的外源作用不敏感。这一点现在阻止了细胞内溶素的有效范围扩张至重要的革兰氏阴性病原体。抗微生物肽(AMP)代表了一大类短的、阳离子或两亲性、基因编码的肽抗生素，其可在几乎每一种生物中发现。不同的AMP展现出不同的特性，并且这一种类中的许多肽已被深入地研究，不仅作为抗生素，而且还作为细胞渗透肽的模板。尽管共有少量的共同特征(例如，阳离子性、两亲性和短尺寸)，但AMP序列有极大的不同，并且已提出至少四种结构组(α螺旋、β螺旋、延伸和环)提供了观察到的AMP构象的多样性。并且，已提议了多种作为抗生素作用的模式，并且已显示，例如，许多这些肽的主要靶标是细胞膜，而其他肽的主要靶标是细胞质入侵以及核心代谢功能的破坏。尽管缺乏特定的靶结合，但AMP可变得足够集中从而显示出协作活性；例如，通过在膜中形成孔，如在多数AMP的情况下即如此。然而，这一现象仅在模式磷脂双层中观察到，并且在一些情况下，这些事件的发生需要膜中高达每六个磷脂分子一个肽分子的AMP浓度。这些浓度接近(如果没有达到的话)整个膜的饱和。由于AMP的最小抑制浓度(MIC)通常在低微摩尔范围之内，因此就这些阈值和它们在体内重要性的关联合理地产生了怀疑(Melo等，Nature reviews,Microbiology, 2009,245)。防卫素是一大家族的小的、阳离子的、富含半胱氨酸和精氨酸的抗微生物肽，其在脊椎动物和无脊椎动物中均有发现。根据半胱氨酸间隔样式，可将防卫素分为五组植物、无脊椎、α-、β-和θ-防卫素。后三种大多数发现于哺乳动物中。α-防卫素是在嗜中性粒细胞和肠上皮中发现的蛋白质。防卫素是分布最广的，并由许多种类的白细胞和上皮细胞分泌。θ -防卫素目前很少发现，例如在恒河猴的白细胞中。防卫素具有抗细菌、真菌和许多有包膜和无包膜病毒的活性。然而，有效杀灭细菌所需的浓度大多数都很高，即，在微摩尔范围内。许多肽的活性可能限于存在生理盐条件、二价阳离子和血清时。取决于疏水氨基酸残基的含量，防卫素也可显示出溶血活性。因此，有对针对革兰氏阴性细菌的新型抗微生物剂的需要。该目标通过权利要求中限定的主题所解决。下述附图用于阐释本发明。

图1显示了根据本发明的细胞内溶素OBPgpLYS。(A)描述了根据本发明的细胞内溶素OBPgpLYS的氨基酸序列(SEQ ID NO :1)。(B)给出了包含附加His6-标签的OBPgpLYS的一级结构，其显示了应用BLASTp和Pfam的功能性分析的结果。预测的N端肽聚糖结合结构域(PBD，氨基酸残基7-96)由下划线显示，并且溶菌酶样超家族的C端催化结构域(氨基酸残基126492)由斜体书写。(B)中显示的在C端包含附加HiS6-标签的OBPgpLYS的完整氨基酸序列描述于SEQ ID NO :47。图2显示了噬菌体OBP的细胞内溶素的核苷酸序列(SEQ ID NO :101)。图3显示了根据本发明的细胞内溶素OBPgpLYS (SEQ ID NO 1)的核苷酸序列(SEQID NO 3)。图4显示经考马斯染色的SDS-PAGE的图片，显示未经修饰的细胞内溶素OBPgpLYS (SEQ ID NO 47)及其修饰的细胞内溶素变体I3KOBPgpLYS (SEQ ID NO 49)的表达和纯化结果。LMW泳道为大小标记(LMW梯型分子量标记)。之后的三个泳道为Ni2+亲和层析之后纯化蛋白在洗脱缓冲液OOmM NaH2PO4-NaOH pH7. 4 ；0. 5M NaCl ；500mM咪唑)中的蛋白质级分。泳道FT为流过物，而泳道W为废级分。在纯化的蛋白质级分中仅可见很少的次级条带，表明重组蛋白的高纯度(> 90% )。图5中A至F显示未经修饰的OBPgpLYS (SEQ ID NO 47)和经修饰的PKOBPgpLYS(SEQ ID NO :49)的不同组合物在室温不振荡的条件下温育之后针对几种指数生长的革兰氏阴性细菌的抗菌活性的图示。每个菌种的革兰氏阴性细菌用包含0.5mMEDTA但不含细胞内溶素的组合物、包含1. 315 μ M未经修饰的OBPgpLYS但不含EDTA的组合物、包含1. 315 μ M修饰的I3KOBPgpLYS但不含EDTA的组合物、包含1. 315 μ M未经修饰的OBPgpLYS 和 0. 5mM EDTA 的组合物以及包含 1. 315 μ M 修饰的 PKOBPgpLYS 和 0. 5mM EDTA的组合物温育30分钟。在图5A中，显示了针对大肠杆菌(Escherichia coli)WK 6细胞的抗细菌活性，在图5B中显示了针对鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium) LT2 (SGSCN0 2317)细胞的抗细菌活性，在图5C中显示了针对铜绿假单胞菌PAOlp细胞的抗细菌活性，在图5D中显示了针对铜绿假单胞菌Br667细胞的抗细菌活性，在图5E中显示了针对恶臭假单胞菌O^seudomonas putida)Gl细胞的抗细菌活性，而在图5F中显示了针对类鼻疽伯克霍尔德氏菌(BurWiolderia pseudomallei)细胞的活性。“ Δ ”给出了对应的OBPgpLYS和I5KOBPgpLYS样品之间的抗细菌活性差异。误差棒表示平均值的标准偏差。图 6 显示了未修饰的 OBPgpLYS (SEQ ID NO 47)和经修饰的 PKOBPgpLYS (SEQID NO :49)的宿主特异性的图示。每一种革兰氏阴性细菌与包含每一 1.315μΜ未修饰的OBPgpLYS或经修饰的I3KOBPgpLYS的组合物温育30分钟。该柱形图给出了未修饰的OBPgpLYS和经修饰的I3KOBPgpLYS对铜绿假单胞菌PAOlp细胞(ΡΑ01)、大肠杆菌WK 6细胞(wk6)、类鼻疽伯克霍尔德氏菌细胞(Burk pseudo)、铜绿假单胞菌Br667细胞(Br667)、鼠伤寒沙门氏菌LT2细胞(LD)和恶臭假单胞菌Gl细胞(Ppu Gl)的抗细菌活性。误差棒表示平均值的标准偏差。如本文中使用的术语“蛋白质/蛋白”与术语“多肽”所指相同。本文中使用的术语“蛋白质/蛋白”指氨基酸残基通过肽键以特定顺序连接的直链聚合物。蛋白的氨基酸残基可通过例如共价附接多种基团如糖和磷酸而得以修饰。其他的物质如血红素或脂质可更松散的与多肽链相联系，得到缀合的蛋白，其也包含于本文中使用的术语“蛋白质/蛋白”中。有多种方式阐明多肽链的折叠，特别是针对存在α螺旋和β折叠片层。如本文中使用的术语“蛋白质/蛋白”指所有四种类型的蛋白，即全α、全β、α/β和α力卩β (aplus^)0如本文中使用的术语“融合蛋白”指由两个核酸序列融合所得的表达产物。此类蛋白可例如在重组DNA表达系统中产生。而且，如本文中使用的术语“融合蛋白”指第一氨基酸序列例如细胞内溶素与第二或更进一步的氨基酸序列的融合物。所述第二或更进一步的氨基酸序列优选为肽段，特别是阳离子肽、聚阳离子肽、两亲性肽、sushi肽、防卫素、疏水肽或抗微生物肽。优选地，所述第二和/或更进一步的氨基酸序列对于所述第一氨基酸序列为外源的，并且不与第一氨基酸序列的任何结构域实质上同源。如本文中使用的术语“肽段”指任何类型的连接于蛋白如细胞内溶素的肽。具体而言如本文中使用的术语“肽段”指阳离子肽、聚阳离子肽、两亲性肽、sushi肽、防卫素、疏水肽和/或抗微生物肽。然而，在本发明的含义中，肽段并不指Hk6标签、Str印标签、Avi标签、Myc标签、Gst标签、JS标签、半胱氨酸标签、FLAG标签或本领域已知的其他标签，硫氧还蛋白或者麦芽糖结合蛋白(MBP)。与如本文中使用的术语“肽段”相对，术语“标签”指可用于帮助多肽的表达和/或亲和纯化，将多肽固定于表面或者充当标志物或标记部分以供检测多肽(例如通过在不同的ELISA测定形式中的抗体结合)的肽，只要使该标签可用于上述所列举之一的功能并非由所述肽所荷的正电荷所致即可。然而，Hk6标签可能取决于相应的PH，亦可荷正电，但却是因为其结合于固定化的二价阳离子而用作亲合纯化工具而并非用作根据本发明的肽段。如本文中使用的术语“肽”指由约2至约100个氨基酸残基，更优选约4至约50个氨基酸残基，更优选约5至30个氨基酸残基组成的短多肽，其中一个氨基酸残基的氨基基团通过肽键连接于另一个氨基酸残基的羧基基团。肽可具有特定功能。肽可为天然存在的肽或合成设计和产生的肽。所述肽可例如通过酶法或化学剪切来源于天然蛋白或从天然蛋白移出，或者可使用常规的肽合成技术(例如，固相合成)或分子生物学技术(参见Sambrook,J.等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N. Y. (1989))来制备。优选的天然存在的肽为例如抗微生物肽、防卫素和sushi肽。优选的合成产生的肽为例如聚阳离子肽、两亲性肽或疏水肽。在本发明意义内的肽不是指用于纯化或定位蛋白的His标签、Strep标签、硫氧还蛋白或麦芽糖结合蛋白(MBP)等。本文中使用的术语“细胞内溶素”指适于水解细菌细胞壁的酶。“细胞内溶素”包含至少一个具有至少下述活性之一的“酶活性域(EAD) ”内肽酶、N-乙酰基-胞壁酰-L-丙氨酸-酰胺酶(酰胺酶)、N_乙酰基胞壁酰胺酶(N-acetyl-muramidase)、N_乙酰基-氨基葡萄糖苷酶(溶菌酶)或转糖基酶。此外，所述细胞内溶素还可含有不具酶活性并结合于宿主细菌细胞壁的区，即所谓CBD (细胞壁结合结构域)。所述细胞内溶素可含有两个或更多个CBD。然而，如本文中使用的术语“细胞内溶素”还指具有至少一个EAD但没有CBD的酶。一般而言，细胞壁结合结构域能够结合细菌表面上不同的组分。优选地，所述细胞壁结合结构域为肽聚糖结合结构域并结合于细菌的肽聚糖结构。细胞内溶素的不同结构域可通过结构域接头连接。如本发明所使用的术语“结构域接头”是指起着将单个蛋白结构域彼此相连的作用的氨基酸序列。作为规则，结构域接头不形成或仅形成很少的规则二级结构，如α螺旋或片层，并且能够占据就结构背景而言的不同构象。检测结构域接头的方法以及接头序列的特征是本领域公知的，例如描述于Bae等，2005，Bioinformatics, 21,2264-2270或George & Heringa, 2003, Protein Engineering,15,871-879 中。如本文所使用的术语“野生型”或“wt”是指如SEQ ID NO :86所示的细胞内溶素OBPgpLYS的氨基酸序列。编码该野生型细胞内溶素OBPgpLYS的核酸序列描述于SEQ IDNO :101。如本文中使用的术语“缺失”指从对应的起始序列去除1、2、3、4、5或更多个氨基
酸残基。如本文中使用的术语“插入”或“添加”指向对应的起始序列插入或添加1、2、3、4、
5或更多个氨基酸残基。如本文中使用的术语“取代”指用不同的氨基酸残基替换位于某个位置的氨基酸残基。如本文中使用的术语“细胞壁”指所有构成革兰氏阴性细菌外细胞围绕物(enclosure)并由此确保其完整性的组分。具体而言，如本文中使用的术语“细胞壁”指肽聚糖、革兰氏阴性细菌具有脂多糖的外膜、细菌细胞膜，但也指沉积于肽聚糖上的其他层例如荚膜(capsule)、外蛋白层或粘液(slime)。如本文中使用的术语“EAD”指细胞内溶素的酶活性结构域。EAD负责水解细菌肽聚糖。其呈现细胞内溶素的至少一种酶活性。EAD还可由超过一种酶活性模块构成。本文中使用的术语“EAD”与术语“催化结构域”同义。如本文中使用的术语“阳离子肽”指具有荷正电的氨基酸残基的肽。优选地，阳离子肽具有9.0或更高的pKa值。通常，所述阳离子肽的至少四个氨基酸残基可荷正电，例如为赖氨酸或精氨酸。“荷正电”指所述氨基酸残基的侧链在接近生理条件下具有净正电荷。如本文中使用的术语“阳离子肽”还指聚阳离子肽。如本文中使用的术语“聚阳离子肽”指主要由荷正电的氨基酸残基特别是赖氨酸和/或精氨酸残基构成的合成产生的肽。如果氨基酸残基的至少约20、30、40、50、60、70、75、80、85、90、95或约100%是荷正电的氨基酸残基，特别是赖氨酸和/或精氨酸残基，则肽主要由荷正电的氨基酸残基构成。作为不荷正电的氨基酸残基的氨基酸残基可为电中性的氨基酸残基和/或荷负电的氨基酸残基和/或疏水氨基酸残基。优选地，作为不荷正电的氨基酸残基的氨基酸残基为电中性的氨基酸残基，特别是丝氨酸和/或甘氨酸。如本文所使用的术语“抗微生物肽”(AMP)是指任何具有抗微生物和/或抑微生物活性的肽。因此，如本文所使用的术语“抗微生物肽”特别是指任何具有抗细菌、抗真菌、抗霉菌、抗寄生物、抗原生动物、抗病毒、抗感染(anti-infectious)、抗传染(anti-infective)和/或杀菌、杀藻、杀变形虫、杀微生物、杀细菌、杀真菌、杀寄生物、杀原生动物、杀原虫(protozoicidal)特性的肽。如本文所使用的术语“防卫素”是指存在于动物、优选哺乳动物、更优选人中的肽，其中防卫素在固有宿主防御系统中起着破坏外来物质诸如感染性细菌和/或感染性病毒和/或真菌的作用。防卫素是非抗体杀微生物和/或杀肿瘤蛋白、肽或多肽。“防卫素”的实例是“哺乳动物防卫素”、α防卫素、β防卫素、indolicidin和magainin。如本文所使用的术语“防卫素”是指自动物细胞分离的形式或合成产生的形式二者，还指基本上保留了它们母体蛋白的细胞毒活性、但其序列已通过插入或缺失一个或多个氨基酸残基而得以改变的变体。如本文所使用的术语“sushi肽”是指具有短共有重复的补体调控蛋白(CCP)。sushi肽的sushi模块在许多不同的蛋白质中起着蛋白-蛋白相互作用结构域的功能。已显示含有sushi结构域的肽具有抗微生物活性。如本文所使用的术语“两亲性肽”是指具有亲水和疏水两种官能团的肽。优选地，如本文所使用的术语“两亲性肽”是指具有确定的亲水和疏水基团排列的肽，例如，两亲性肽可以例如是α螺旋，其中沿着该螺旋一侧主要具有非极性侧链并且沿着其表面的剩余部分具有极性残基。如本文所使用的术语“疏水基团”是指诸如氨基酸侧链的化学基团，其基本上不溶于水，但可溶于油相，其中在油相中的溶解度比在水中或水相中的溶解度更高。在水中，具有疏水侧链的氨基酸残基彼此相互作用从而产生非水性环境。具有疏水侧链的氨基酸残基的实例是缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和甘氨酸残基。
本发明涉及新颖的抗革兰氏阴性细菌的抗细菌剂。具体地，本发明涉及包含根据SEQ ID NO 1的氨基酸序列的多肽或其片段或衍生物。该包含根据SEQ ID NO 1的氨基酸序列的多肽优选由根据SEQ ID NO :3的核苷酸序列编码。具有根据SEQ ID NO=I的氨基酸序列的细胞内溶素OBPgpLYS具有3 个氨基酸的长度。其包含N端细胞壁结合结构域(CBD)和C端酶活性结构域(EAD)。N端CBD是具有根据SEQ ID NO 4的氨基酸序列的肽聚糖结合结构域(PGB，aa 7-96)。C端EAD是符合溶菌酶样超家族催化结构域的催化结构域(aa U6-292)，并且具有根据SEQ ID NO :5的氨基酸序列。细胞内溶素OBPgpLYS的PGB和催化结构域通过结构域接头连接。因此，根据本发明优选的多肽片段是包含根据SEQ ID NO :4和/或根据SEQ IDNO :5的氨基酸序列的多肽。根据本发明的多肽的另一优选片段包含根据SEQ ID N0:69的氨基酸序列。具有根据SEQ ID NO 69的氨基酸序列的片段与具有根据SEQ ID NO=I的氨基酸序列的多肽的不同在于缺失了起始甲硫氨酸残基。根据本发明的衍生物是包含根据SEQ ID NO :1、4、5和/或69的氨基酸序列但具有额外修饰和/或改变的多肽。所述修饰和/或改变可以是突变，特别是缺失、插入、添加、取代或其任意组合和/或氨基酸残基的化学变化，例如生物素化、乙酰化、PEG化、氨基、SH或羧基基团的化学变化。根据本发明的所述衍生物呈现OBPgpLYS (SEQ ID NO=D的溶解活性和/或根据本发明的所述片段活性。所述活性可为OBPgpLYS活性和/或根据本发明的片段活性的约 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或约200%。所述活性可由本领域技术人员通过本领域公知的测定法来测量，例如平板裂解(plate lysis)测定法或液体裂解(liquid lysis)测定法，其例如描述于(Briers等，J. Biochem. Biophys Methods 70:531—533，0007))。根据本发明优选的衍生物是包含根据SEQ ID NO 86和87的氨基酸序列的多肽。所述衍生物与具有根据SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :69的氨基酸序列的多肽的不同分别在于分别在325位和3M位上的亮氨酸残基被组氨酸残基所取代。包含根据SEQ ID NO 86的氨基酸序列的多肽优选由根据SEQ ID NO=IOl的核苷酸序列编码。在本发明优选的实施方案中，根据本发明的多肽、片段和/或衍生物还在N端或C端包含标签，诸如Hk6标签、Strep标签、Avi标签、Myc标签、Gst标签、JS标签、半胱氨酸标签、FLAG标签，或其他本领域公知的标签。在本发明优选的实施方案中，所述标签与根据本发明的多肽、片段和/或衍生物在C端连接。所述标签可通过额外的氨基酸残基与所述多肽、片段和/或衍生物连接。所述额外的氨基酸残基可由至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个额外氨基酸残基组成。在本发明优选实施方案中，所述标签通过额外的氨基酸残基Leu-Glu或Lys-Gly连接于根据本发明的多肽、片段和/或衍生物。在优选的实施方案中，本发明涉及包含根据SEQ ID NO 47或SEQ ID NO 88的氨基酸序列的多肽。分别与具有根据SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :86的氨基酸序列的多肽相比，具有根据SEQ ID NO 47和SEQ ID NO 88的氨基酸序列的多肽分别包含与分别具有根据SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 86的氨基酸序列的多肽的C端连接的额外的C端His6-标签，所述连接通过额外的氨基酸残基赖氨酸和甘氨酸(Lys-Gly)。包含根据SEQ ID NO 47的氨基酸残基的多肽优选由根据SEQ ID NO :48的核苷酸序列编码。包含根据SEQ ID NO88的氨基酸残基的多肽优选由根据SEQ ID NO 89的核苷酸序列编码。
本发明的其他方面是由根据本发明的多肽、片段和/或衍生物和肽段组成的融合蛋白，其中所述肽段在N端或C端与根据本发明的多肽、片段和/或衍生物融合。根据本发明的融合蛋白的肽段优选与根据本发明的多肽、片段和/或衍生物共价连接。优选地，所述肽段由至少5个、更优选至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或至少100个氨基酸残基组成。特别优选的肽段包含约5至约100个氨基酸残基、约5至约50个或约5至30个氨基酸残基。更优选的肽段包含约6至约42个氨基酸残基、约6至约39个氨基酸残基、约6至约38个氨基酸残基、约6至约31个氨基酸残基、约6至约25个氨基酸残基、约6至约M个氨基酸残基、约6至约22个氨基酸残基、约6至约21个氨基酸残基、约6至约20个氨基酸残基、约6至约19个氨基酸残基、约6至约16个氨基酸残基、约6至约14个氨基酸残基、约6至约12个氨基酸残基、约6至约10个氨基酸残基或约6至约9个氨基酸残基。优选地，所述肽段不是诸如Hk6标签、Str印标签、Avi标签、Myc标签、Gst标签、JS标签、半胱氨酸标签、FLAG标签、或其他本领域公知标签的标签，也不是硫氧还蛋白或麦芽糖结合蛋白(MBP)。然而，该肽段可额外的包含此类标签或多个标签等，其用于纯化或定位蛋白。优选地，该肽段具有引导根据本发明的融合蛋白穿过革兰氏阴性细菌外膜的功能，但当不与根据本发明的多肽、片段和/或衍生物融合而施与时没有活性或仅仅有很低的活性。引导融合蛋白穿过革兰氏阴性细菌外膜的功能是由所述肽段破坏膜或LPS的潜力造成的。为测定肽段是否具有破坏膜或LPS的活性，可将所述肽段与根据本发明的多肽融合，例如如本发明实施例所描述的那样。随后，可测试由根据本发明的多肽和所述肽段组成的融合蛋白的抗细菌活性，并与根据本发明的不具有该肽段的多肽相比较，也如在本发明实施例中所描述，并且例如在图5A至F和6所示。优选地，所述测试可在大肠杆菌WK6和/或铜绿假单胞菌PAOlp细胞上进行，如在本发明实施例中所使用的那样。如果对于至少一种测试革兰氏阴性细菌物种，所述融合蛋白与没有所述肽段的根据本发明的多肽相比较具有升高的抗细菌活性，则所述肽段具有破坏膜或LPS的活性。优选地，通过具有破坏膜或LPS的活性的肽段，根据本发明的多肽的抗细菌活性(以对数单位(=Iog10N0ZNi)计)升高至少约5 %、更优选至少约10%。在本发明的一个方面，融合的肽段是两亲性肽，其包含一个或多个荷正电的氨基酸残基赖氨酸、精氨酸和/或组氨酸，其与一个或多个疏水氨基酸残基缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和/或甘氨酸组合。氨基酸残基侧链优选适当定向，使得阳离子和疏水表面在肽的相反侧簇集((311^切10。优选地，所述肽中超过约30、40、50、60或70%的氨基酸是荷正电氨基酸。优选地，所述肽中超过约30、40、50、60或70%的氨基酸残基是疏水氨基酸残基。有利地，该两亲性肽融合在具有细胞壁降解活性的根据本发明的多肽、片段和/或衍生物的N端和/或C端末端，如此提高了后一蛋白的两亲性。在优选的实施方案中，两亲性肽中至少约30、40、50、60或70%的所述氨基酸残基是精氨酸或赖氨酸残基和/或该两亲性肽中至少约30、40、50、60或70 %的所述氨基酸残基是疏水氨基酸残基缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和/或甘氨酸。优选的两亲性肽是根据SEQ ID NO :6的Pleurocidin、根据SEQ ID NO :7的天蚕素P1、根据 SEQ ID NO 8 的 Buforin II、根据 SEQ ID NO 9 的 Buforin I 和根据 SEQ ID NO 10的Magainin。其他优选的两亲性肽是Cathelidicine，例如根据SEQ ID NO 11的LL-37。在本发明其他方面，融合的肽段是抗微生物肽，其包含净正电荷，以及约50%的疏水氨基酸残基。该抗微生物肽是两亲性的，具有约12至约50个氨基酸残基的长度。优选的抗微生物肽如下表所列。
权利要求
1.包含根据SEQID NO :1的氨基酸序列的多肽或其片段或衍生物。
2.根据权利要求1的多肽，其中所述片段包含根据SEQID NO :4、5或69或4和5的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2的多肽，其中所述衍生物在根据SEQID而1、4、5和/或69的氨基酸序列中具有缺失、添加、插入和/或取代。
4.根据权利要求3的多肽，其中所述衍生物包含根据SEQID NO :86或87的氨基酸序列。
5.根据前述任一项权利要求的多肽，其还包含标签，优选His6-标签。
6.根据权利要求5的多肽，其中所述多肽包含根据根据SEQID NO :47或88的氨基酸序列。
7.融合蛋白，其包含根据前述任一项权利要求的多肽和在N端或C端与所述多肽融合的肽段，其中所述肽段是阳离子肽、聚阳离子肽、两亲性肽、sushi肽、防卫素、疏水肽和/或抗微生物肽。
8.根据权利要求7的融合蛋白，其中所述肽段包含约5至约100个氨基酸残基，特别是约5至50个氨基酸残基，特别是约5至30个氨基酸残基。
9.根据权利要求7或8的融合蛋白，其中所述阳离子和/或聚阳离子肽段包含选自由精氨酸、组氨酸和赖氨酸残基组成的组中的至少一种氨基酸残基，特别是其中所述肽段中包含的至少70 %的氨基酸残基是精氨酸、组氨酸和/或赖氨酸残基，特别是精氨酸和/或赖氨酸残基。
10.根据权利要求7的融合蛋白，其中所述两亲性肽包含选自由赖氨酸、精氨酸和组氨酸残基组成的组的至少一种荷正电氨基酸残基，其与选自由缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和甘氨酸残基组成的组的至少一种疏水氨基酸组合，特别是其中所述两亲性肽中至少约70%的所述氨基酸残基是精氨酸或赖氨酸残基，并且所述两亲性肽中至少约30%的所述氨基酸残基是缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸或甘氨酸残基。
11.根据权利要求7的融合蛋白，其中所述肽段包含根据SEQID NO :6-39,50-53,68,.70-73或117-119的氨基酸序列。
12.根据权利要求7的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含根据SEQID NO =43,49,.54-67,74-85或115-116的氨基酸序列。
13.分离的核酸分子，其编码根据权利要求1-6中任一项的多肽或根据权利要求7-12中任一项的融合蛋白。
14.载体，其包含根据权利要求13的核酸分子。
15.宿主细胞，其包含根据权利要求13的核酸分子或根据权利要求14的载体。
16.根据权利要求1-6中任一项的多肽或根据权利要求7-12中任一项的融合蛋白，其用作人用药物、兽药或诊断物质，用作食品或化妆品的抗微生物剂，用作消毒剂或用于环境领域中。
17.根据权利要求1-6中任一项的多肽或根据权利要求7-12中任一项的融合蛋白，其用作治疗或预防革兰氏阴性细菌感染的药物。
18.根据权利要求1-6中任一项的多肽或根据权利要求7-12中任一项的融合蛋白用于治疗或预防食品、食品加工装置、食品加工厂、与食品相接触的表面、医疗设备、医院和手术中的表面的革兰氏阴性细菌污染的用途。
19.药物组合物，其包含根据权利要求1-6中任一项的多肽或根据权利要求7-12中任一项的融合蛋白。
全文摘要
本发明涉及具有根据SEQ ID NO1的氨基酸序列的多肽和其片段或衍生物。本发明还涉及融合蛋白，其包含所述多肽和在N端或C端与所述多肽融合的额外肽段。此外，本发明还涉及编码所述多肽或融合蛋白的核酸，包含所述核酸分子的载体，以及包含所述核酸分子或所述载体的宿主细胞。此外，本发明还涉及用作药物、尤其是用于治疗或预防革兰氏阴性细菌感染、用作诊断手段、作为美容用物质或消毒剂的所述多肽或融合蛋白。本发明还涉及所述多肽或融合蛋白用于治疗或预防食品、食物加工装置、食品加工厂、与食品相接触的表面、医疗设备、医院和手术中的表面的革兰氏阴性细菌污染。此外，本发明涉及包含所述多肽或融合蛋白的药物组合物。
文档编号A61K38/46GK102575240SQ201080048012
公开日2012年7月11日 申请日期2010年8月24日 优先权日2009年8月24日
发明者M.瓦尔马格, R.拉维格尼, S.米勒, Y.布赖尔斯 申请人:勒芬天主教大学，K.U.勒芬R&D, 莱桑多公司