内皮因子抗体的制作方法

专利名称：内皮因子抗体的制作方法
内皮因子抗体交叉引用
本申请要求2009年9月30日提交的美国临时申请号61/247，290和2010年3月31日提交的美国非临时申请号12/751,907的权益，它们二者的公开内容通过引用整体并入本文。
背景技术：
内皮因子(除了别的以外，也称作⑶105或edg-1)是在增殖中的血管内皮细胞中高水平表达的I型同源二聚膜糖蛋白(Burrows等人，1995，Clin. Cancer Res.1:1623-1634)。因此，内皮因子主要是进行活跃的血管生成的内皮细胞的增殖相关标志物。但是，内皮因子的有些表达是通过正常组织的血管内皮(Burrows等人，同上；Wang等人，1993，Int. J. Cancer 54:363-370)。已知人内皮因子会特异性地结合转化生长因子-3(TGF-P)，并且内皮因子的推论氨基酸序列与￠-聚糖(TGF-0受体的一种类型)具有强同源性。在基于抗体的减少肿瘤脉管系统的方法中，已经靶向内皮因子(EDG)，因为EDG是在内皮和白血病细胞上的一种增殖相关的抗原。在肿瘤相关的血管内皮中，它的表达被增量调节，且对血管生成而言是必需的。血管生成包括导致新生血管形成的新毛细血管形成，以及现有脉管系统的维持。它是一个复杂的过程，包括一系列连续步骤，所述步骤包括血管基膜和间质基质的内皮细胞介导的降解，内皮细胞的迁移，内皮细胞的增殖，以及通过内皮细胞形成毛细血管袢。已经描述了几种抗-内皮因子抗体，尤其是抗-内皮因子单克隆抗体(“mAb”XmAbSN6是用人白血病细胞的细胞膜的糖蛋白混合物免疫小鼠所生成的抗体(Haruta和Seon，1986，Proc. Natl. Acad. Sci. 83:7898_7902XSN6是一种识别人内皮因子的鼠mAboinAb44G4是用人前-B白血病细胞的全细胞悬浮液免疫小鼠所生成的抗体(Gougos和Letarte，1988， J. Immunol. 141:1925-1933; 1990， J. Biol. Chem. 265:8361-8364)。 44G4 也是一种识别人内皮因子的鼠mAb。mAb MJ7/18是用发炎的小鼠皮肤免疫大鼠所生成的抗体(Ge和Butcher, 1994，同上)。MJ7/18也是一种识别鼠内皮因子的mAb。mAb Tec-Il是用人脐静脉内皮细胞免疫小鼠所生成的抗体(Burrows等人，1995，Clin. Cancer Res.1:1623-1634)。Tec-Il是一种具有限于人内皮因子的反应性的鼠mAb。针对内皮因子的抗体代表用于治疗多种疾病和病症(它们涉及血管生成，受血管生成的影响)的疗法的发展的一个重要领域。血管生成是从现有血管形成新血管的生理过程(Varner，等人，Cell Adh. Commun. 1995, 3:367-374; Blood,等人，Biochim. Biophys. Acta. 1990,1032:89-118; Weidner,等人，J. Natl. Cancer Inst. 1992，84:1875-1887)。已经提出，血管生成在正常过程和病理过程中都起作用。例如，血管生成过程涉入动物器官和组织的血管系统的发育。这些过程也涉入血管生成的暂时相，例如，在月经周期中，在妊娠中，和在伤口愈合中。另一方面，已知许多疾病与失调的血管生成有关。
在某些病理状态下，血管生成受到刺激，作为为受累组织内的细胞提供充足的血液和营养物供给的方式。许多这样的病理状态包括异常的细胞增殖和/或调节。因此，血管生成的抑制是治疗特征在于新血管形成的疾病的潜在有用方案。例如，血管生成涉入的病理状态包括不同形式的特征在于血管生成/新生血管形成的眼疾病和非眼疾病(例如，黄斑变性、糖尿病视网膜病变)、糖尿病肾病、慢性炎性疾病(例如，IBD)、类风湿性关节炎、骨关节炎和不同形式的癌症、实体瘤和转移灶等。

发明内容
本文提供了一种结合内皮因子的人源化抗体或其抗原结合片段。这样的抗体具有体外和体内纯化、检测、诊断和 治疗用途。本文也提供了这样的人源化抗体或其抗原结合片段其结合内皮因子的一种或多种物质或变体，并抑制血管生成。本文另外提供了用结合内皮因子的人源化抗体或其抗原结合片段治疗血管生成相关疾病的方法。本文所述的结合内皮因子的人源化抗体和抗原结合片段可以用于治疗或预防黄斑变性、脉络膜新血管生成(CNV)、糖尿病视网膜病变或增生性玻璃体视网膜病变。本文描述了通过施用本文所述的抗体和抗原结合片段来治疗或预防黄斑变性、CNV、糖尿病视网膜病变或增生性玻璃体视网膜病变的方法。本文所述的结合内皮因子的人源化抗体和抗原结合片段也可以收缩血管、抑制与眼病有关的内皮细胞增殖、清除出血的征状、治疗视力模糊、提供视力损失的停滞和/或防止血管的渗漏。本文所述的人源化抗体和抗原结合片段也可以用于药物中，所述药物用于治疗黄斑变性、CNV、糖尿病视网膜病变或增生性玻璃体视网膜病变。本文所述的人源化抗体和抗原结合片段也可以用于治疗癌症用的药物中。本文提供了一种抗体或其抗原结合片段，其具有具有如SEQ ID NO: 41所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的轻链可变区。本文提供了一种结合内皮因子的抗体或其抗原结合片段，其包含具有如SEQ IDNO: 3所示的氨基酸序列的轻链可变区和具有如SEQ ID NO: 41所示的氨基酸序列的重链可变区，其中，所述重链可变区另外包含一个或多个选自下述的修饰用丙氨酸(A)置换在位置49处的甘氨酸(G);用丝氨酸(S)置换在位置76处的天冬酰胺(N);用精氨酸(R)置换在位置77处的苏氨酸(T);用缬氨酸(V)置换在位置78处的亮氨酸(L);用异亮氨酸(I)置换在位置82a处的天冬酰胺(N);用异亮氨酸(I)或亮氨酸(L)置换在位置89处的缬氨酸(V);用精氨酸(R)或甘氨酸(G)置换在位置94处的苏氨酸(T);用苏氨酸(T)置换在位置108处的亮氨酸(L);用亮氨酸(L)置换在位置109处的缬氨酸(V);和用丙氨酸(A)置换在位置113处的丝氨酸(S)，其中使用Kabat编号系统；且所述轻链可变区另外包含一个或多个选自下述的修饰用谷氨酰胺(Q)置换在位置I处的天冬氨酸(D);用缬氨酸(V)置换在位置3处的谷氨酰胺(Q);用亮氨酸(L)置换在位置4处的甲硫氨酸(M);用丝氨酸(S)置换在位置5处的苏氨酸(T);用苯丙氨酸(F)置换在位置36处的酪氨酸(Y);用脯氨酸(P)置换在位置46处的亮氨酸(L);用色氨酸(W)置换在位置47处的亮氨酸(L);用缬氨酸(V)或丙氨酸(A)置换在位置60处的丝氨酸(S);用丝氨酸(S)置换在位置70处的天冬氨酸(D);用酪氨酸(Y)置换在位置71处的苯丙氨酸(F);用丙氨酸(A)置换在位置100处的谷氨酰胺(G);和用亮氨酸(L)置换在位置106处的异亮氨酸(I),其中使用Kabat编号系统。本文提供了一种结合内皮因子的抗体或其抗原结合片段，其具有重链可变区和轻链可变区，
其中所述重链可变区包含
(i)SEQ ID NO: 66 的 CDRl、SEQ ID NO: 67 的 CDR2 和 SEQ ID NO: 68 的 CDR3 ；
(ii)重链FRl，其具有SEQID NO: 44的氨基酸序列或包含一个或多个保守置换的SEQID NO: 44的氨基酸序列；
(iii)重链FR2，其具有SEQID NO: 45的氨基酸序列或包含丙氨酸(A)对位置49处的甘氨酸(G)的置换的SEQ ID NO: 45的氨基酸序列，其中使用Kabat编号系统；和
(iv)重链FR3，其具有SEQID NO: 47的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 47的氨基酸序列
Ca)用丝氨酸(S)置换在位置76处的天冬酰胺(N)；
(b)用精氨酸(R)置换在位置77处的苏氨酸(T)；
(c)用缬氨酸(V)置换在位置78处的亮氨酸(L)；
Cd)用异亮氨酸(I)置换在位置82a处的天冬酰胺(N)；
Ce)用异亮氨酸(I)或亮氨酸(L)置换在位置89处的缬氨酸(V);和(f)用精氨酸(R)或甘氨酸(G)置换在位置94处的苏氨酸(T)，其中使用Kabat编号系统；和
(V)重链FR4，其具有SEQ ID NO: 56的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 56的氨基酸序列
Ca)用苏氨酸(T)置换在位置108处的亮氨酸(L)；
(b)用亮氨酸(L)置换在位置109处的缬氨酸(V);和
(C)用丙氨酸(A)置换在位置113处的丝氨酸(S)，其中使用Kabat编号系
统；
且所述轻链可变区包含
(i)SEQ ID NO: 63 的 CDRl、SEQ ID NO: 64 的 CDR2 和 SEQ ID NO: 65 的 CDR3 ；
(ii)轻链FRl，其具有SEQID NO: 6的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 6的氨基酸序列
Ca)用谷氨酰胺(Q)置换在位置I处的天冬氨酸(D)；
(b)用缬氨酸(V)置换在位置3处的谷氨酰胺(Q)；
(c)用亮氨酸(L)置换在位置4处的甲硫氨酸(M);和
(d)用丝氨酸(S)置换在位置5处的苏氨酸(T);其中使用Kabat编号系统；
和
(iii)轻链FR2，其具有SEQID NO: 20的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 20的氨基酸序列
Ca)用苯丙氨酸(F)置换在位置36处的酪氨酸(Y)；
(b)用脯氨酸(P)置换在位置46处的亮氨酸(L);和(C)用色氨酸(W)置换在位置47处的亮氨酸(L),其中使用Kabat编号系
统；和
(iv)轻链FR3，其具有SEQID NO: 28的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 28的氨基酸序列(a)用缬氨酸(V)或丙氨酸(A)置换在位置60处的丝氨酸(S)；
(b)用丝氨酸(S)置换在位置70处的天冬氨酸(D);和
(b)用酪氨酸(Y)置换在位置71处的苯丙氨酸(F)，其中使用Kabat编号系
统；和
(V)轻链FR4，其具有SEQ ID NO: 35的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 35的氨基酸序列
Ca)用丙氨酸(A)置换在位置100处的甘氨酸(G);和
(b)用亮氨酸(L)置换在位置106处的异亮氨酸(I)，其中使用Kabat编号系统。本文提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包含具有如SEQ ID NO: 42所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列的轻链可变区。本文提供了一种结合内皮因子的抗体或其抗原结合片段，其包含具有如SEQ IDNO: 4所示的氨基酸序列的轻链可变区和具有如SEQ ID NO: 42所示的氨基酸序列的重链可变区，其中，所述重链可变区另外包含一个或多个选自下述的修饰用丙氨酸(A)置换在位置49处的甘氨酸(G);用丝氨酸(S)置换在位置76处的天冬酰胺(N);用精氨酸(R)置换在位置77处的苏氨酸(T);用缬氨酸(V)置换在位置78处的亮氨酸(L);用异亮氨酸(I)置换在位置82a处的天冬酰胺(N);用异亮氨酸(I)或亮氨酸(L)置换在位置89处的缬氨酸(V);用苏氨酸(T)或甘氨酸(G)置换在位置94处的精氨酸(R);用苏氨酸(T)置换在位置108处的亮氨酸(L);用亮氨酸(L)置换在位置109处的缬氨酸(V);和用丙氨酸(A)置换在 位置113处的丝氨酸(S)，其中使用Kabat编号系统；且所述轻链可变区另外包含一个或多个选自下述的修饰用谷氨酰胺(Q)置换在位置I处的天冬氨酸(D);用缬氨酸(V)置换在位置3处的谷氨酰胺(Q);用亮氨酸(L)置换在位置4处的甲硫氨酸(M);用丝氨酸(S)置换在位置5处的苏氨酸(T);用苯丙氨酸(F)置换在位置36处的酪氨酸(Y);用亮氨酸(L)置换在位置46处的脯氨酸(P);用亮氨酸(L)置换在位置47处的色氨酸(W);用缬氨酸(V)或丙氨酸(A)置换在位置60处的丝氨酸(S);用丝氨酸(S)置换在位置70处的天冬氨酸(D);用苯丙氨酸(F)置换在位置71处的酪氨酸(Y);用丙氨酸(A)置换在位置100处的谷氨酰胺(G);和用亮氨酸(L)置换在位置106处的异亮氨酸(I),其中使用Kabat编号系统。本文提供了一种结合内皮因子的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，
其中所述重链可变区包含
(i)SEQ ID NO: 66 的 CDRl、SEQ ID NO: 67 的 CDR2 和 SEQ ID NO: 68 的 CDR3 ；
(ii)重链FRl，其具有SEQID NO: 44的氨基酸序列或包含一个或多个保守置换的SEQID NO: 44的氨基酸序列；
(iii)重链FR2，其具有SEQID NO: 45的氨基酸序列或包含丙氨酸(A)对位置49处的甘氨酸(G)的置换的SEQ ID NO: 45的氨基酸序列，其中使用Kabat编号系统；和
(iv)重链FR3，其具有SEQID NO: 47的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 47的氨基酸序列
Ca)用丝氨酸(S)置换在位置76处的天冬酰胺(N)；
(b)用精氨酸(R)置换在位置77处的苏氨酸(T)；(C)用缬氨酸(V)置换在位置78处的亮氨酸(L)；
Cd)用异亮氨酸置换在位置82a处的天冬酰胺(N)；
Ce)用异亮氨酸(I)或亮氨酸(L)置换在位置89处的缬氨酸(V);和(f)用苏氨酸(T)或甘氨酸(G)置换在位置94处的精氨酸(R)，其中使用Kabat编号系统；和
(V)重链FR4，其具有SEQ ID NO: 56的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 56的氨基酸序列
Ca)用苏氨酸(T)置换在位置108处的亮氨酸(L)；
(b)用亮氨酸(L)置换在位置109处的缬氨酸(V);和
(C)用丙氨酸(A)置换在位置113处的丝氨酸(S)，其中使用Kabat编号系
统；
且所述轻链可变区包含
(i)SEQ ID NO: 63 的 CDRl、SEQ ID NO: 64 的 CDR2 和 SEQ ID NO: 65 的 CDR3 ；
(ii)轻链FRl，其具有SEQID NO: 6的·氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 6的氨基酸序列
Ca)用谷氨酰胺(Q)置换在位置I处的天冬氨酸(D)；
(b)用缬氨酸(V)置换在位置3处的谷氨酰胺(Q)；
(c)用亮氨酸(L)置换在位置4处的甲硫氨酸(M);和
(d)用丝氨酸(S)置换在位置5处的苏氨酸(T);其中使用Kabat编号系统；
和
(iii)轻链FR2，其具有SEQID NO: 21的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 20的氨基酸序列
Ca)用苯丙氨酸(F)置换在位置36处的酪氨酸(Y)；
(b)用亮氨酸(L)置换在位置46处的脯氨酸(P);和(C)用亮氨酸(L)置换在位置47处的色氨酸(W),其中使用Kabat编号系
统；和
(iv)轻链FR3，其具有SEQID NO: 29的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 28的氨基酸序列
Ca)用缬氨酸(V)或丙氨酸(A)置换在位置60处的丝氨酸(S)；
(b)用丝氨酸(S)置换在位置70处的天冬氨酸(D);和
(b)用苯丙氨酸(F)置换在位置71处的酪氨酸(Y)，其中使用Kabat编号系
统；和
(V)轻链FR4，其具有SEQ ID NO: 35的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 35的氨基酸序列
Ca)用丙氨酸(A)置换在位置100处的甘氨酸(G);和
(b)用亮氨酸(L)置换在位置106处的异亮氨酸(I)，其中使用Kabat编号系统。本文提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包含具有如SEQ ID NO: 93所示的氨基酸序列的轻链可变区(VKlAA)和具有如SEQ ID NO: 89所示的氨基酸序列的重链可变区(VH1A2)。本文提供了一种结合内皮因子的抗体或其抗原结合片段，其包含具有如SEQ IDNO: 89所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 93所示的氨基酸序列的轻链可变区，其中
(i )所述重链可变区另外包含一个或多个选自下述的修饰用丙氨酸(A)或丝氨酸(S)置换在位置49处的甘氨酸(G);用异亮氨酸(I)置换在位置51处的丙氨酸(A);用精氨酸(R)或天冬酰胺(Q)置换在位置52b处的赖氨酸(K);用缬氨酸(V)置换在位置78处的亮氨酸(L),其中使用Kabat编号系统；和
(ii)所述轻链可变区另外包含一个或多个选自下述的修饰用亮氨酸(L)置换在位置 4处的甲硫氨酸(M);用缬氨酸(V)置换在位置19处的丙氨酸(A);用丝氨酸(S)置换在位置22处的苏氨酸(T);用异亮氨酸(I)置换在位置48处的丙氨酸(A);和用丝氨酸(S)置换在位置51处的苏氨酸(T)，其中使用Kabat编号系统。本文提供了根据权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其包含具有如SEQID NO: 88、89、90、91或92所示的氨基酸序列的重链可变区；和具有如SEQ ID NO: 93、94、
95、96、97、100、102或103所示的氨基酸序列的轻链可变区。在一个方面，本文所述的抗体和抗原结合片段是人源化的，且可以是任意同种型。在本文中也包括AVIMER、双体和重链二聚体(包括骆驼类和鲨鱼重链构建体)。术语“抗体的抗原结合部分”、“抗原结合片段”、“抗原-结合域”、“抗体片段”或“抗体的功能片段”在本文中互换地用于表示，抗体的保留特异性地结合抗原的能力的一个或多个片段。被包括在这样的术语内的抗体片段的非限制性实例包括、但不限于(i) Fab片段，即由\、VH、(^和Cm结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，即含有通过在铰链区处的二硫键相连的2个Fab片段的二价片段；(iii)由Vh和Chi结构域组成的Fd片段；(iv)Fv片段,其含有抗体的单条臂的Vlj和Vh结构域；(v)dAb片段(Ward等人，(1989) Nature341:544 546)，其含有Vh结构域；和(vi)分离的⑶R。在该定义中另外包括“一半”抗体，其包括单个重链和单个轻链。在本文中也包括其它形式的单链抗体，诸如双体。抗原结合片段可以是本文所述的那些中的任一种，包括、但不限于，Fab片段、Fab’、F(ab’ )2片段、Fv片段(包括非共价地和共价地连接的Fv片段)、scFv片段、单链结合多肽、Fd片段、Fv片段或dAb片段。在一个非限制性实施方案中，所述抗原结合片段是scFv,其可以任选地进一步与抗体的人Fe部分融合。在一个非限制性实施方案中，所述结合内皮因子的抗体或其抗原结合片段包含具有如SEQ ID NO: 41、42或43所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 3、4或5所示的氨基酸序列的轻链可变区。在另一个非限制性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含具有如SEQ IDNO: 41所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的轻链可变区。在另一个非限制性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含具有如SEQ IDNO: 41所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列的轻链可变区。在另一个非限制性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含具有如SEQ IDNO: 41所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列的轻链可变区。在另一个非限制性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含具有如SEQ IDNO: 42所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的轻链可变区。在另一个非限制性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含具有如SEQ IDNO: 42所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列的轻链可变区。在另一个非限制性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含具有如SEQ IDNO: 42所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一个非限制性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含具有如SEQ IDNO: 43所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的轻链可变区。在另一个非限制性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含具有如SEQ IDNO: 43所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列的轻链可变区。在另一个非限制性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含具有如SEQ IDNO: 43所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列的轻链可变区。在另一个非限制性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区另外包含一个或多个选自下述的修饰用丝氨酸(S)置换在位置76处的天冬酰胺(N);用精氨酸(R)置换在位置77处的苏氨酸(T);用异亮氨酸(I)置换在位置82a处的天冬酰胺(N);用异亮氨酸(I)或亮氨酸(L)置换在位置89处的缬氨酸(V);用甘氨酸(G)置换在位置94处的苏氨酸(T);用苏氨酸(T)置换在位置108处的亮氨酸(L);用亮氨酸(L)置换在位置109处的缬氨酸(V);和用丙氨酸(A)置换在位置113处的丝氨酸(S);且所述轻链可变区另外包含一个或多个选自下述的修饰用谷氨酰胺(Q)置换在位置I处的天冬氨酸(D);用缬氨酸(V)置换在位置3处的谷氨酰胺(Q);用丝氨酸(S)置换在位置5处的苏氨酸(T);用苯丙氨酸(F)置换在位置36处的酪氨酸(Y);用缬氨酸(V)或丙氨酸(A)置换在位置60处的丝氨酸(S);用丝氨酸(S)置换在位置70处的天冬氨酸(D);用丙氨酸(A)置换在位置100处的甘氨酸(G);和用亮氨酸(L)置换在位置106处的异亮氨酸(I)，其中使用Kabat编号系统。在一个方面，可以修饰本文所述的抗体和抗原结合片段。例如，在一个实施方案中，可以修饰所述化合物，以改变所述化合物的药代动力学性质，例如，体内稳定性、溶解度、生物利用度或半衰期。这样的修饰包括、但不限于聚乙二醇化和/或糖基化。使用常规方法，可以配制本文所述的抗体和抗原结合片段，用于快速的或长期的递送。在一个非限制性实施方案中，快速递送是，例如，通过静脉内注射。在另一个非限制性实施方案中，长期递送是，例如，通过皮下蓄积。在另一个非限制性实施方案中，通过施用气雾剂来实现递送。本文提供了本文所述的抗体和抗原结合片段和可接受的载体或赋形剂的组合物。
本文提供了多核苷酸(核酸)，其包含编码本文所述的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。本文所述的抗体和其抗原结合片段可以用于治疗与血管生成有关的多种疾病和病症，例如，不同形式的特征在于血管生成/新生血管形成的眼疾病(例如，黄斑变性、糖尿病视网膜病变)、糖尿病肾病、慢性炎性疾病(例如，IBD)、类风湿性关节炎、骨关节炎和不同形式的癌症、实体瘤和转移灶。另外，本文所述的这些抗体和其抗原结合片段可以用于药物制剂中，所述药物制剂用于预防、治疗或诊断与血管生成有关的疾病和病症，例如，不同形式的特征在于血管生成/新生血管形成的眼疾病和非眼疾病(例如，黄斑变性、糖尿病视网膜病变)、糖尿病肾病、慢性炎性疾病(例如，IBD)、类风湿性关节炎、骨关节炎和不同形式的癌症、实体瘤和转移灶。 本文提供了一种通过给患者施用组合物来在所述患者中诱导针对内皮因子的宿主免疫应答的方法，其中所述组合物包含人源化的抗-内皮因子抗体或其抗原结合片段，其诱导针对所述抗体或其片段特异性地识别的表位的有效宿主免疫应答。所述宿主免疫应答可以是体液免疫应答或细胞介导的免疫应答。如果所述免疫应答是体液免疫应答，它可以是抑制血管生成、血管生成依赖性的疾病或血管生成依赖性的障碍的保护性抗体应答。免疫应答也包括细胞信号传递途径(例如Smad信号传递)的诱导或阻断。所述血管生成依赖性的疾病或障碍可以是，例如，不同形式的特征在于血管生成/新生血管形成的眼疾病和非眼疾病(例如，黄斑变性、糖尿病视网膜病变)、糖尿病肾病、慢性炎性疾病(例如，IBD)、类风湿性关节炎、骨关节炎、不同形式的癌症(原发性肿瘤和转移灶)等。在一个实施方案中，所述保护性的抗体应答会抑制血管生成。本文提供了一种影响与内皮因子和血管生成有关的细胞信号传递途径的方法。可以使血管生成细胞与足以改变细胞信号传递途径的量的本文所述的抗体或其抗原结合片段接触(体外、体内或离体)。在一个非限制性实施例中，响应于抗体结合，血管生成细胞中的Smad 1、5和/或8信号传递被抑制了约I. 5倍或更多。在另一个非限制性实施例中，Smad 3水平增加了约I. 5倍或更多，提示细胞正在恢复至静止状态。本文提供了一种抑制受试者的血管生成或血管生成依赖性的疾病或障碍的方法，其中将本文提供的组合物施用给患者。所述血管生成依赖性的疾病或障碍可以是下述的任一种不同形式的特征在于血管生成/新生血管形成的眼疾病和非眼疾病(例如，黄斑变性、糖尿病视网膜病变)、糖尿病肾病、慢性炎性疾病(例如，IBD)、类风湿性关节炎、骨关节炎和不同形式的癌症、实体瘤和转移灶。在一个实施方案中，抑制血管生成或血管生成依赖性的疾病或障碍会减轻与所述疾病或障碍有关的征状。在另一个实施方案中，抑制血管生成或血管生成依赖性的疾病或障碍会导致肿瘤大小的减小、肿瘤进展的预防、细胞增殖的减少、细胞凋亡的增加或患者存活期的增加。抑制血管生成可以导致肿瘤大小的减小，或预防肿瘤进展。所述方法可以另外包括外科手术切除癌症和/或给遭受癌症的患者施用一种或多种额外的抗癌剂或治疗。本文提供了一种预防或治疗受试者的癌症或转移的方法，其中施用本文提供的组合物。在一个实施方案中，所述药物组合物的施用会延长被治疗的受试者的寿命。要治疗的癌症/肿瘤包括实体瘤；肿瘤可以是原发性肿瘤或转移性肿瘤。示例性的实体瘤属于选自下述的组织或器官皮肤、黑素瘤、肺、胰腺、乳房、卵巢、结肠、直肠、胃、甲状腺、喉部、卵巢、前列腺、结肠直肠、头部、颈部、眼、嘴、喉、食管、胸部、骨、睾丸、淋巴、骨髓、骨、肉瘤、肾、汗腺、肝、肾、脑(例如多形性胶质母细胞瘤)和类似的组织。在一个非限制性实施例中，实体瘤是结肠肿瘤、乳腺肿瘤、肾肿瘤、肺肿瘤、前列腺癌、卵巢肿瘤或这些肿瘤中任一种的转移灶。所述方法可以另外包括外科手术切除癌症，和/或施用一种或多种抗癌剂。可以在施用所述药物组合物之前、同时或之后，施用抗癌剂。可以在所述药物组合物之前一周内、在所述药物组合物之后一周内，施用抗癌剂，或者可以在所述药物组合物同一天施用抗癌剂。如果在所述药物组合物同一天施用抗癌剂，施用可以是并行的。本文提供了一种预防或治疗癌症或转移的方法，其中外科手术切除癌症/肿瘤，并将抗癌剂或治疗和本文提供的组合物同时施用给受试者。
本文提供了一种抑制血管生成的方法，其中使细胞或组织接触足以抑制血管生成的治疗有效量的本文所述的抗体或其抗原结合片段。本文提供了一种抑制癌细胞生长的方法，其中接触足以抑制癌细胞生长或造成癌细胞的细胞凋亡的治疗有效量的本文所述的抗体或其抗原结合片段。本文提供了一种方法，所述方法包括使组织接触本文所述的抗体或其抗原结合片段，其中接触会抑制血管生成。所述组织可以是培养的组织活组织检查样品，或可以存在于受试者中。本文提供了一种预防或治疗细胞增殖(例如，血管生成)障碍的方法，其中给具有细胞增殖障碍的受试者或处于该风险中的受试者施用有效量的本文提供的组合物，以有效地治疗细胞增殖障碍。所述细胞增殖障碍可以是，例如良性或恶性实体瘤或非实体瘤，所述肿瘤可以是转移性的或非转移性的。所述治疗可以导致改善受试者的病症，且可以通过确定是否已经发生下述因素中的一个或多个来评估细胞增殖的减少、细胞数目的减少、细胞凋亡的增加或至少一部分构成细胞增殖障碍的细胞的存活期减小。在某些情况下，这些事件中的一个或多个可能导致癌症的部分或完全消除和患者存活期的延长。任选地，所述方法可以另外包括给所述受试者施用抗癌剂或治疗。本文提供了一种治疗患者的糖尿病视网膜病变、黄斑变性、脉络膜新血管生成或新生血管性青光眼的方法，其中给患者施用治疗有效量的本文提供的组合物。所述治疗可以导致改善受试者的病症，且可以通过确定是否已经发生下述因素中的一个或多个来评估黄斑水肿的减少、CNV面积的减小或视敏度的增加。在本文提供的方法中，所述受试者可以是人或非人受试者。本文提供的组合物和抗癌剂或治疗可以施用一次或多次，取决于患者的健康、疾病或病症的进展、和治疗的效能。在治疗过程中，可以调节疗法和治疗。可以局部地(locally)、区域性地(regionalIy)或全身地施用组合物,例如,通过皮下的、玻璃体内的、真皮内的、静脉内的、动脉内的、腹膜内的或肌肉内的注射来施用。另外，本文所述的人源化抗体和抗原结合片段也可以与已知的用于治疗黄斑变性、CNV、糖尿病视网膜病变或增生性玻璃体视网膜病变的疗法和/或化合物联合使用。这样的化合物的实例包括、但不限于贝伐单抗(阿伐他汀 )、ranibizumab (LUCENTIS )>aflibercept(VEGF-Trap)或Macugen。除了本文所述的施用模式以外,所述人源化的抗-内皮因子抗体和抗原结合片段可以经由玻璃体内途径来施用。玻璃体内施用模式的非限制性实例包括玻璃体内注射和使用玻璃体内植入物。另一个方面是，通过施用本文所述的抗体或其抗原结合片段的组合物来治疗受试者的慢性炎性疾病。慢性炎性疾病的非限制性实例包括IBD、克罗恩病和溃疡性结肠炎。另一个方面是，通过施用本文所述的抗体或其抗原结合片段的组合物来治疗受试者的类风湿性关节炎。另一个方面是，通过施用本文所述的抗体或其抗原结合片段的组合物来治疗受试者的骨关节炎。通过不同的方法，可以评估具有类风湿性关节炎和/或骨关节炎的受试者的治疗，所述方法包括根据公开的指南测量的ACR评分的适当分类的改善。本文提供了一种监测本文提供的方法中的任意一种或多种的效能的方法。增加的 可溶性内皮因子的水平，已经与癌症患者的降低的存活期相关联。因而，在一个方面，可以在治疗之前和过程中，监测可溶性内皮因子的水平。因此，可溶性内皮因子的水平的降低可以指示，治疗方案有效地治疗患者。本发明的一个实施方案预见到，本发明的任一种组合物用于配制药物的用途，所述药物用于本发明的障碍。可以基于需要治疗的患者/受试者的身体特征来配制药物，且可以基于例如癌性组织的阶段，配制成单个制剂或多个制剂。可以将本发明的药物包装在具有适当标签的合适药物包中以分配给医院和诊所，其中所述标签是用于指示治疗受试者的本文所述的障碍。药物可以包装成单个或多个单元。在药物包中可以包括关于本发明的组合物的剂量和施用的说明书。本文提供了一种诊断方法，其中提供来自待测患者的实体瘤的癌细胞或血浆样品，检测至少一种基因或基因广物在样品中的表达，所述基因或基因广物选自其表达已经与对血管生成抑制剂的敏感性或抗性相关联的基因或基因产物集合，其中所述至少一种基因或基因产物选自下述的一种或多种基因或基因产物VEGF、VEGF受体、HIF-I a、胎盘生长因子受体和CD105，并对比在患者样品中检测到的至少一种基因或基因产物的表达水平和已经与对血管生成抑制剂的敏感性或抗性相关联的至少一种基因或基因产物的表达水平。在一个实施方案中，所述血管生成抑制剂选自=VEGF受体抑制剂、VEGF抑制剂和内皮因子抑制剂。本文提供了一种试剂盒，其用于检测已经与对血管生成抑制剂的敏感性或抗性相关联的基因在癌细胞或人血浆样品中的表达水平。在一个实施方案中，一种或多种基因是选自VEGF、VEGF受体、HIF-I a、胎盘生长因子受体和内皮因子。通过引用并入
在本说明书中提及的所有出版物和专利申请都通过引用并入本文中，其程度如同具体地且单个地指出每篇单独的出版物或专利申请通过引用整体并入，除非另外特别指出。本申请含有对氨基酸序列的提及，所述氨基酸序列已经作为序列表文本文件“35882-706-202-SeqList. txt”(文件大小 67，843 千字节(KB)，于 2010 年 3 月 30 日建立)与本文同时呈交。根据37C.F.R. § 1.52(e) (5)，前述序列表通过引用整体并入本文。


图I提供了人源化的02-V 1-39可变(Vl)轻链，其具有嫁接在人序列02-V 1-39的框架区(FR) 1-3和来自人J 4序列的框架区4 (SEQ ID NO: 4)(都为粗体)之间的单克隆鼠嵌合的TRC105 Vl⑶R (带有下划线)。在所述序列(在SEQ ID NO: 86中公开的序列)的位置1、3、4、5、36、46、47、60、70、71、100和106处，指示可以对人FR做出的变化(在人源化序列下面以斜体显示)，其中使用Kabat编号系统。图2提供了人源化的VH3-15可变(Vh)重链，其具有嫁接在人序列VH3-15的框架区(FR) 1-3和人JH4序列的框架区4 (SEQ ID NO: 42)(都为粗体)之间的单克隆鼠单克隆鼠嵌合的TRC105 Vh⑶R (带有下划线)。在所述序列(在SEQ ID NO: 87中公开的序列)的位置49、76、77、78、82a、89、94、108、109和113处，指示可以对人FR做出的一个或多个变化(在人源化序列下面以斜体显示)，其中使用Kabat编号系统。图3提供了 TGF-P /ALK5信号传递途径的简图。TGF-P /ALK5途径(A)会导致细胞增殖和迁移的抑制。TGF-P/ALKl途径(B)会诱导内皮细胞增殖和迁移，并需要⑶105 (内 皮因子)进行ALKl信号传递。虚线指示无活性的或阻断的途径。加粗的箭头指示信号传递途径的刺激。图4提供了根据本文所述的发明生产的示例性的小鼠和人源化的VK链(按照出现次序，分别是SEQ ID NO 1-5)和Vh链(按照出现次序，分别是SEQ ID NO 39-43)的氨基酸序列比对。图5提供了根据本文所述的发明生产的示例性的小鼠和超人源化的VK链(按照出现次序，分别是SEQ ID NO I和69-72)和Vh链(按照出现次序，分别是SEQ ID NO 39和73-75)的氨基酸序列比对。图6提供了根据本文所述的发明生产的示例性的小鼠和人源化的和超人源化的VK链(按照出现次序，分别是SEQ ID NO I、3和70 )和Vh链(按照出现次序，分别是SEQ IDNO 39、41和74)的氨基酸序列比对和对比。图I解释了在竞争ELISA试验中人源化的变体构建体与内皮因子的结合。图8.使用人源化的和人源化的/去免疫化的抗体的抗-CD105竞争ELISA。将不同浓度的每种抗体与固定浓度的生物素化的参照抗-CD105抗体(6. 25 ng/ml)相混合，并与CD105 (100 ng/ml)结合，所述CD105捕获在Nunc MaxiSorp平板上。通过抗生蛋白链菌素-HRP和TMB底物，检测结合。在平板读数器上测量在450nm的吸光度(OD)，并相对于实验抗体浓度绘图。图9解释了变体VK1AAVH1A +含有VK2的对照的结合试验数据。图10解释了嵌合体相对于VK1AAVH1A2和VK2AAVH1A2的结合试验数据。图11解释了嵌合体相对于VK2AAVH1Q的结合试验数据。图12解释了嵌合体相对于VK2AAVH1R的结合试验数据。图13解释了嵌合体相对于VK1AAVH1A2的结合试验数据。图14解释了嵌合体相对于VK1AAVH1Q的结合试验数据。图15解释了嵌合体相对于VK1AAVH1R的结合试验数据。图16解释了嵌合体相对于VK2AAVH1A2的结合试验数据。图17解释了先导人源化的去免疫化的重链可变区，其中CDR显示为粗体并带有下划线(在SEQ ID NO: 89中公开的序列)。在所述序列(在SEQ ID NO: 116中公开的序列)的鉴定位置处，指出了可以做出的变异(在人源化序列下面以斜体显示)，其中使用Kabat编号系统。变异可以作为单突变或作为超过一个突变而产生，且变异可以与突变任意组合地产生。图18解释了先导人源化的去免疫化的轻链可变区，其中CDR显示为粗体并带有下划线(在SEQ ID NO: 93中公开的序列)。在所述序列(在SEQ ID NO: 117中公开的序列)的鉴定位置处，指出了可以做出的变异(在人源化序列下面以斜体显示)，其中使用Kabat编号系统。变异可以作为单突变或作为超过一个突变而产生，且变异可以与突变任意组合地产生。图19解释了使用iTope 对重链(SEQ ID NO: 41)的区域的分析。以一个氨基酸增量，将跨整个序列的肽测试为9聚体肽。用“0”(如果结合评分是0.55-0. 6)和用“X”(如果结合评分>0. 6)指示预测的每个残基(作为核心9聚体肽的pi锚)与MHC II类等位基因的结合。在“iTope”列中，指出了含有潜在免疫原性肽的区域，深灰色指示混杂的高亲和力MHC II类结合肽，浅灰色指示混杂的中等亲和力MHC II类结合肽。在“总”和“高亲和力”列中，显示了预测会结合的MHC II类等位基因的数目。在“序列”列的相反类型中，显示了被鉴别为种系序列的潜在Pl锚残基。
图20解释了使用iTope 对重链变体(SEQ ID NO: 118)的变体区域的分析。以一个氨基酸增量，将跨整个序列的肽测试为9聚体肽。用“0”(如果结合评分是0.55-0. 6)和用“X”(如果结合评分>0. 6)指示预测的每个残基(作为核心9聚体肽的pi锚)与MHC II类等位基因的结合。在“iTope”列中，指出了含有潜在免疫原性肽的区域，深灰色指示混杂的高亲和力MHC II类结合肽，浅灰色指示混杂的中等亲和力MHC II类结合肽。在“总”和“高亲和力”列中，显示了预测会结合的MHC II类等位基因的数目，显示了结合的差异。在“序列”列的相反类型中，显示了被鉴别为种系序列的潜在Pl锚残基，变体中的氨基酸差异带有框。图21解释了使用iTope 对轻链(SEQ ID NO: 3)的区域的分析。以一个氨基酸增量，将跨整个序列的肽测试为9聚体肽。用“0”(如果结合评分是0.55-0. 6)和用“X”(如果结合评分>0. 6)指示预测的每个残基(作为核心9聚体肽的pi锚)与MHC II类等位基因的结合。在“iTope”列中，指出了含有潜在免疫原性肽的区域，深灰色指示混杂的高亲和力MHC II类结合肽，浅灰色指示混杂的中等亲和力MHC II类结合肽。在“总”和“高亲和力”列中，显示了预测会结合的MHC II类等位基因的数目。在“序列”列的相反类型中，显示了被鉴别为种系序列的潜在Pl锚残基。图22解释了使用iTope 对轻链(SEQ ID NO: 101)的变体区域的分析。以一个氨基酸增量，将跨整个序列的肽测试为9聚体肽。用“0”(如果结合评分是0.55-0. 6)和用“X”(如果结合评分>0. 6)指示预测的每个残基(作为核心9聚体肽的pi锚)与MHC II类等位基因的结合。在“iTope”列中，指出了含有潜在免疫原性肽的区域，深灰色指示混杂的高亲和力MHC II类结合肽，浅灰色指示混杂的中等亲和力MHC II类结合肽。在“总”和“高亲和力”列中，显示了预测会结合的MHC II类等位基因的数目，显示了结合的差异。在“序列”列的相反类型中，显示了被鉴别为种系序列的潜在Pl锚残基，变体中的氨基酸差异带有框。图23解释了 MHC II类同种异型在世界人群和研究人群中的频率。图24使用来自20个供体的PBMC，在EpiScreen 时程T细胞试验中测试了嵌合的抗-内皮因子抗体、人源化的抗-内皮因子抗体VKlVHl和人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体VK1AAVH1A2。在第5、6、7和8天，对与实验抗体一起温育的PBMC主培养物(Bulkculture)取样，并用3H-胸苷脉冲处理。收获细胞，并通过闪烁计数，测量放射性的掺入。取每个一式三份样品的结果的平均值，并通过转化成刺激指数(SI)来标准化。对于嵌合抗体TRC105 (图24A)、VK1VH1 (图24B)和VK1AAVH1A2 (图24C)，在上面显示了每种供体的每个时间点的SI。用虚线突出了用于测定SI >2的阳性应答的截止值，并指出(*)显著的应答(在 student 氏 t_ 检验中，p〈0. 05)。
具体实施例方式应当理解，本申请不限于特定制剂或工艺参数，因为这些当然可以变化。还应当理解，在本文中使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，无意进行限制。此外，应当理解，与本文所述的那些类似或等效的许多方法和材料可以用于实践本发明。根据本申请，可以采用属于本领域技能的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。在本领域中充分解释了这样的技术。参见，例如，Sambrook等人，“MolecularCloning: A Laboratory Manual” (1989) ；uCurrent Protocols in Molecular Biology”第 I-III 卷[Ausubel, R. M.,编(1994)] ;“Cell Biology: A Laboratory Handbook，，第 I-III 卷[J. E. Celis,编(1994))] ；uCurrent Protocols in Immunology” 第I-III 卷[Coligan, J. E.,编(1994)] ,Oligonucleotide Synthesis”(M. J. Gait编 1984) ;“Nucleic Acid Hybridization，，[B. D. Hames 和 S. J. Higgins 编(1985)]；“Transcription And Translation，，[B. D. Hames 和 S. J. Higgins,编(1984)] ;“AnimalCell Culture” [R. I. Freshney,编(1986)] Immobilized Cells And Enzymes” [IRLPress, (1986)]; B. Perbal, “A Practical Guide To Molecular Cloning，，(1984),它们各自特别地通过弓I用整体并入本文。已经针对内皮因子产生了鼠单克隆抗体(mAb)，其调节内皮因子活性，并从而抑制血管生成和/或抑制小血管的血管舒张。这些鼠抗体描述在美国专利5，928，641、6，200，566，6，190，660和7，097，836中，它们特此整体并入。另外，已经证实了许多这样的抗体的离体和体内有效性；这些结合内皮因子的单克隆抗体具有作为调节内皮因子的化合物的利益。但是，这些鼠抗体的治疗用途是不可行的，因为它们的施用具有许多限制，包括，例如，以人抗-小鼠抗体(HAMA)形式时的免疫原性。制备人源化抗体来解决这些反应。本文描述了结合内皮因子的人源化抗体,其表现出降低的免疫原性,并同时维持和/或提高它们的特异性。另外，为了解决与鼠抗体有关的问题，本文描述了结合内皮因子并减少和/或抑制血管生成的人源化抗体，其表现出降低的免疫原性，并同时维持和/或提高它们的特异性。这些人源化的内皮因子抗体可用于诊断和治疗不同的病症和疾病，以及 用于纯化和检测内皮因子。I.抗-内皮因子抗体
本文提供了结合内皮因子的人源化抗体和其抗原结合片段。在包含和支持现有脉管系统的细胞以及促进新脉管系统的生长并变成其一部分的细胞上，可以发现内皮因子。这些抗体和抗原结合片段可以结合内皮因子，并从而抑制血管生成、抑制现有脉管系统或现有脉管系统的维持和/或抑制小血管膨胀。在下文中，提及的术语“抗体”应当视作包括本文所述的任一种抗原结合片段，且所述术语在适用之处是可互换的。除了它们用于纯化内皮因子的用途以外，这些抗体可用于纯化、检测和诊断目的以及治疗目的。本文提供的抗体可以用于配制用于治疗多种病症和疾病的药物制剂、治疗所述病症和疾病的方法和检测方法或诊断方法。本文使用的血管生成包括新血管的生长和/或发育(也称作新生血管形成)、小血管的膨胀、过度的或延长的血管生长和现有脉管系统的维持。血管生成病症和疾病表示与血管生成有关、由血管生成造成或伴随血管生成的那些疾病和病症。这样的疾病的非限制性实施例包括，例如，不同形式的特征在于血管生成/新生血管形成的眼疾病(例如，黄斑变性、CNV、糖尿病视网膜病变)、糖尿病肾病、慢性炎性疾病(例如，IBD)、类风湿性关节炎、骨关节炎和不同形式的癌症(原发性肿瘤和转移灶)。A.抗体术语
本文使用的术语“抗体”表示免疫球蛋白(Ig)，无论天然的还是部分地或完全地合成生产的。该术语也涵盖具有结合域的任意多肽或蛋白，所述结合域是抗原结合域或与抗原结 合域同源。该术语另外包括“抗原结合片段”和诸如下述的类似结合片段的其它可互换的术语。该术语也包括互补性决定区(CDR)移植的抗体和其它人源化抗体(包括CDR修饰和框架区修饰)。天然抗体和天然免疫球蛋白通常是约150，000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，其由2个相同的轻(L)链2个相同的重(L)链组成。每个轻链通常通过一个共价二硫键与重链相连，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链之间存在差异。每个重链和轻链也具有规则分布的链内二硫键。每个重链具有在一个末端处的可变结构域(“VH”)，其后是许多恒定结构域(“CH”)。每个轻链具有在一个末端处的可变结构域(“'”)和在它的另一个末端处的恒定结构域(“匕”)；轻链的恒定结构域与重链的第一个恒定结构域对齐，轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。认为特定氨基酸残基会形成轻链和重链可变结构域之间的接口。本文使用的术语“合成的多核苷酸”、“合成的基因”或“合成的多肽”表示，对应的多核苷酸序列或其一部分或氨基酸序列或其一部分源自已经设计的序列，或从新合成，或与等效的天然存在的序列相比被修饰。通过本领域已知的方法，可以制备合成的多核苷酸(抗体或抗原结合片段)或合成的基因，所述方法包括但不限于核酸或氨基酸序列的化学合成。合成的基因通常在氨基酸或多核苷酸水平(或在两个水平)不同于天然存在的基因，且通常位于合成的表达控制序列的背景内。例如，合成的基因序列可以包括已经改变的氨基酸或多核苷酸序列，例如，通过置换、删除或添加一个或多个氨基酸或核苷酸，从而提供不同于源序列的抗体氨基酸序列或多核苷酸编码序列。与天然的基因相比，合成的基因多核苷酸序列可能不一定编码具有不同氨基酸的蛋白；例如，它们也可以包括合成的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列掺入不同的密码子，但是它们编码相同的氨基酸(即，核苷酸变化代表在氨基酸水平的沉默突变)。关于抗体，术语“可变结构域”表示，在每个特定抗体与它的特定抗原的结合和特异性中使用的抗体可变结构域。但是，变异性不均匀地分布在抗体的可变结构域中。相反，它集中在3个称作高变区(也称作CDR)的区段中，所述区段在轻链和重链可变结构域中。可变结构域的更高度保守的部分被称作“框架区”或“FR”。未修饰的重链和轻链的可变结构域各自含有4个FR (FR1、FR2、FR3和FR4)，它们主要采取P -折叠构型，其间散布着3个⑶R，所述⑶R形成环，并在某些情况下连接P -折叠结构部分。每个链中的⑶R被FR保持紧密靠在一起，并与来自其它链的CDR —起，促进抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版.Public HealthService, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)，第 647-669 页)。在本文中使用的术语“高变区”和“CDR”表示，抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。CDR包括来自3个序列区的氨基酸残基，所述序列区以互补方式结合抗原，并被称作CDRKCDR2 和 CDR3(对于每个 Vh 和 Vl 链)。根据 Kabat 等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第 5 版.Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, Md. (1991))，在轻链可变结构域中，CDR通常大致对应着残基24-34(CDRLl)、50-56 (CDRL2)和89-97 (CDRL3)，在重链可变结构域中，CDR通常大致对应着残 基残基 31-35 (CDRHl )、50-65 (CDRH2)和 95-102 (CDRH3)。应当理解，不同抗体的 CDR 可以含有插入序列，因而氨基酸编号可能不同。Kabat编号系统用下述编号方案来补偿这样的插入序列所述方案利用与特定残基相连的字母(例如，在轻链中，⑶RLl的27A、27B、27C、27D、27E和27F)来反映在不同抗体之间的编号的任何插入。或者，根据Chothia和Lesk，J. Mol. Biol. , 196: 901-917 (1987))，在轻链可变结构域中，CDR通常大致对应着残基26-32 (CDRLl)、50-52 (CDRL2)和91-96 (CDRL3)，在重链可变结构域中，CDR通常大致对应着残基 26-32 (CDRHl)、53-55 (CDRH2)和 96-101 (CDRH3)。本文使用的“框架区”或“FR”表示，形成抗原结合槽或沟的一部分的框架氨基酸残基。在有些实施方案中，所述框架残基形成环，所述环是抗原结合槽或沟的一部分，且在所述环中的氨基酸残基可以接触或不接触抗原。框架区通常包括在CDR之间的区域。根据 Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版.PublicHealth Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)),在轻链可变结构域中，FR通常大致对应着残基0-23 (FRLl ),35-49 (FRL2)、57_88 (FRL3)和98-109，在重链可变结构域中，FR通常大致对应着残基0-30 (FRHl ),36-49 (FRH2)、66_94 (FRH3)和103-133。如上面关于轻链的Kabat编号所讨论的，重链也以类似的方式补偿插入(例如，在重链中，CDRHl 的 35A、35B)。或者，根据 Chothia 和 Lesk, J. Mol. Biol. , 196: 901-917(1987))，在轻链可变结构域中，FR通常大致对应着残基0-25 (FRLl),33-49 (FRL2) 53-90(FRL3)和97-109 (FRL4)，在重链可变结构域中，FR通常大致对应着残基0_25 (FRH1)、33-52 (FRH2)、56-95 (FRH3)和 102-113 (FRH4)。通过检查抗体重链和/或抗体轻链的三维结构，可以评估和测定FR的环氨基酸。可以分析三维结构中的溶剂可接近的氨基酸位置，因为这样的位置可能形成环和/或提供在抗体可变结构域中的抗原接触。一些溶剂可接近的位置可以耐受氨基酸序列变化，其它位置(例如，结构位置)通常更少变化。从晶体结构或蛋白建模，可以衍生出抗体可变结构域的三维结构。抗体的恒定结构域(Fe)不直接参与抗体与抗原的结合，但是相反地表现出不同的效应子功能,诸如通过与例如Fe受体(FcR)的相互作用,抗体参与抗体依赖性的细胞毒性。Fe结构域也可以增加抗体在施用给患者以后在循环中的生物利用度。根据它们的重链的恒定结构域的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白归入不同的类另IJ。存在5个主要的免疫球蛋白类别1§么、1§0、1§￡、1§6和1§11，它们中的几个可以进一步分成子类(同种型)，例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。与不同类别的免疫球蛋白相对应的重链恒定结构域(Fe)分别被称作a、S、e、Y和ii。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。基于它们的恒定结构域的氨基酸序列，可以将来自任意脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”归入2个明显不同的类型(称作kappa或(“ K ”或“K”)和lambda或(“入，，))之一。术语“抗体的抗原结合部分”、“抗原结合片段”、“抗原结合域”、“抗体片段”或“抗体的功能片段”在本文中互换地用于表示抗体的一个或多个片段，所述片段保留特异性地结合抗原的能力。在这样的术语内包括的抗体片段的非限制性实施例包括、但不限于(i)Fab片段，即由\、VH、Cl和Chi结构域组成的单价片段；(ii) F(ab’ )2片段，即含有2个通过在铰链区处的二硫键相连的Fab片段的二价片段；(iii)由Vh和Chi结构域组成的Fd片段；(iv)含有抗体的单臂的Vl和Vh结构域的Fv片段；(V) dAb片段(Ward等人，(1989) Nature 341:544 546)，其含有Vh结构域；和(vi )分离的CDR。在该定义中另外包括含有单个重链和单个轻链的“一半”抗体。在本文中也包括其它形式的单链抗体，诸如双特异抗体。通过用蛋白酶(诸如胃蛋白酶和木瓜蛋白酶)处理Ig，可以生产“F(ab’)2”和“Fab’ ”部分，且包括通过在二硫键附近消化免疫球蛋白所产生的抗体片段，所述二硫键存在于2个重链中的每一个内的铰链区之间。例如，木瓜蛋白酶会在存在于2个重链中的每一个内的铰链区之间的二硫键的上游切割IgG，以产生2个同源的抗体片段，其中由\和Q组成的轻链(轻链恒定区)和由Vh和Chy1 ( Y I)区组成的重链片段(在重链的恒定区中)在它们的C端区域通过二硫键相连。这2个同源的抗体片段中的每一个被称作Fab’。胃蛋白酶也会在存在于2个重链中的每一个内的铰链区之间的二硫键的上游切割IgG，以产生这样的抗体片段所述片段稍微大于2个上述的Fab’在其中在铰链区处相连的片段。该抗体片段被称作F(ab’)2。Fab片段也含有轻链的恒定结构域和重链的第一个恒定结构域(ChI)。Fab’片段与Fab片段的差别在于，在重链ChI结构域的羧基端处添加了几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH在本文中表示这样的Fab’ 其中恒定结构域的半胱氨酸残基携带游离的巯基。？(&13’)2抗体片段最初被生产为Fab’片段对，它们具有在它们之间的铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。“Fv”表示含有完整抗原识别和抗原结合位点的抗体片段。该区域由紧密地非共价或共价结合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体组成(本领域已经描述了二硫键连接的 Fv,Reiter 等人(1996)Nature Biotechnology 14:1239-1245)。在该构型中，每个可变结构域的3个CDR相互作用，以限定在Vh-' 二聚体的表面上的抗原结合位点。来自每个Vh和\链的一个或多个CDR的组合一起赋予抗体抗原结合特异性。例如，应当理解，例如，当转移至受体抗体的Vh和\链或其抗原结合片段上时，CDRH3和CDRL3足以赋予抗体抗原结合特异性，且可以使用本文所述的任意技术测试该CDR组合的结合、亲和力等。甚至单个可变结构域(或仅包含对抗原特异性的3个CDR的Fv的一半)具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力可能比与第二个可变结构域相组合时更低。此外，尽管Fv片段的2个结构域(\和Vh)由单独的基因编码，使用重组方法，通过合成的连接物可以连接它们，所述连接物使它们能够制成单个蛋白链，其中\和Vh区配对形成单价分子(称作单链Fv (scFv);Bird等人(1988)Science 242:423-426; Huston等人(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA85:5879-5883 ;和 Osbourn 等人(1998) Nat. Biotechnol. 16:778)。在术语抗体的“抗原结合部分”内，也意图包括这样的scFv。可以将特定scFv的任意Vj^P Vlj序列连接到Fe区cDNA或基因组序列上，以便制备编码完整Ig (例如，IgG)分子或其它同种型的表达载体。Vh和\也可以用于制备Fab、Fv或Ig的其它片段，其中使用蛋白化学或重组DNA技术。“单链Fv”或“sFv”抗体片段包含抗体的Vh和\结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。在有些实施方案中，所述Fv多肽另外包含在Vh和'结构域之间的多肽连接物，其使sFv能够形成抗原结合所希望的结构。关于sFv的综述,参见,例如，Pluckthunin The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg和 Moore 编Springer-Verlag, New York,第 269-315 页(1994)。术语“AVIMER ”表示一类人起源的治疗蛋白，它们与抗体和抗体片段无关，由几个模块的且可重复使用的结合域组成，所述结合域称作A-结构域(也称作A类模块、补体型重复序列或LDL-受体类A结构域)。它们通过体外外显子改组和噬菌体展示从人胞外受体结构域发展而成(Silverman 等人，2005，Nat. Biotechnol. 23:1493-1494;Silverman等人，2006，Nat. Biotechnol. 24:220)。得到的蛋白可以含有多个独立结合域，它们与单表位结合蛋白相比，可以表现出提高的亲和力(在某些情况下，低于纳摩尔)和特异性。参见，例如，美国专利申请公开号2005/0221384、2005/0164301、2005/0053973和2005/0089932、2005/0048512和2004/0175756，它们各自特此通过引用整体并入本文。已知的217个人A-结构域中的每一个包含约35个氨基酸(约4 kDa);这些结构域被连接物隔开，所述连接物的长度是平均5个氨基酸。天然A-结构域快速地且有效地折叠成均匀的、稳定的结构，这主要由钙结合和二硫键形成来介导。该共有结构需要仅12个 氨基酸的保守支架基序。最终结果是含有多个结构域的单个蛋白链，每个结构域代表单独的功能。所述蛋白的每个结构域独立地结合，且每个结构域的活力贡献是累加的。这些蛋白被称作来自亲合力多聚体的“AVIMERs ”。术语“双特异抗体”表示具有2个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含在相同多肽链(VH-VL)中与轻链可变结构域(VL)相连的重链可变结构域(VH)。通过使用太短而不允许在相同链上的2个结构域之间配对的连接物，迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对，并建立2个抗原结合位点。双特异抗体更完整地描述在，例如，EP 404, 097; WO93/11161 ;和 Hollinger 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444 6448 (1993)。抗原结合多肽也包括重链二聚体，例如，来自骆驼类(camelids)和鲨鱼的抗体。骆驼类和鲨鱼抗体包括V-样和C-样结构域的2条链的同源二聚体对(都不具有轻链)。因为骆驼类的重链二聚体IgG的Vh区不一定与轻链产生疏水相互作用，在骆驼类中，通常接触轻链的重链中的该区域变成亲水氨基酸残基。重链二聚体IgG的Vh结构域称作Vhh结构域。鲨鱼I g-NAR包括I个可变结构域(称作V-NAR结构域)和5个C-样恒定结构域(C-NAR结构域)的同源二聚体。在骆驼类中，抗体所有组成部分的多样性由VH* Vhh区中的CDR 1、2和3决定。骆驼Vhh区中的CDR3的特征在于它的相对长的长度，平均16个氨基酸(Muyldermans 等人，1994，Protein Engineering 7 (9): 1129)。这不同于许多其它物种的抗体的CDR3区。例如，小鼠Vh的CDR3具有平均9个氨基酸。通过例如在美国专利申请系列号20050037421中公开的方法，可以制备骆驼类-衍生的抗体可变区(它们维持骆驼类可变区的体内多样性)的文库。“人源化”形式的非人(例如，鼠)抗体包括含有源自非人Ig的最小序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体是这样的人Ig (受体抗体)其中受体的一个或多个CDR被来自非人物种(诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)抗体(供体抗体)的CDR替换，后者具有希望的特异性、亲和力和结合功能。在某些情况下，人Ig的一个或多个FR氨基酸残基被对应的非人氨基酸残基替换。此外，人源化抗体可以含有在受体抗体或供体抗体中不存在的残基。如果需要的话，可以做出这些修饰，以优化抗体性能。人源化抗体可以包含基本上所有的、或至少I个(且在有些情况下，2个)可变结构域，其中所有或基本上所有的高变区对应非人免疫球蛋白的高变区，所有或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的FR。所述人源化抗体还可以任选地包括免疫球蛋白恒定区(Fe)的至少一部分，通常人免疫球蛋白的至少一部分。关于细节，参见 Jones 等人，Nature 321: 522-525 (1986) ;Reichmann 等人，Nature 332: 323-329 (1988);和 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. , 2: 593-596(1992)。
人源化抗体也包括这样的抗体，其中重链和轻链的部分或所有CDR源自非人单克隆抗体，可变区的基本上所有的剩余部分源自人可变区(重链和轻链二者)，且恒定区源自人恒定区。在一个实施方案中，重链和轻链的⑶R1、⑶R2和⑶R3区域源自非人抗体。在另一个实施方案中，所述重链和轻链的至少一个⑶R (例如，⑶R3)源自非人抗体。⑶R1、CDR2和CDR3的不同组合可以源自非人抗体，并在本文中预见到。在一个非限制性实施例中，重链和轻链各自的CDRl、CDR2和CDR3区域中的一个或多个源自鼠嵌合的单克隆抗体克隆 TRC105。本文使用的术语“单克隆抗体”表示从基本上同质的抗体群体得到的抗体，即，除了可能以微量存在的可能天然存在的突变以外，构成该群体的单个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，不同于常规的(多克隆的)抗体制品(它们可以包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体)，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。修饰词“单克隆”指示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体得到，不应解释为需要通过任何特定方法生产抗体。例如，单克隆抗体可以通过Kohler等人，Nature 256:495(1975)首先描述的杂交瘤方法来制备，或可以通过重组DNA方法(参见，例如，美国专利号4，816，567)来制备。在某些实施方案中，使用例如在Clackson等人，Nature 352:624-628(1991)和Marks等人，J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)中所述的技术，可以从噬菌体抗体文库分离出单克隆抗体。通过饱和硫酸铵沉淀、优球蛋白(euglobulin)沉淀法、己酸方法、辛酸方法、离子交换色谱法(DEAE或DE52)或使用抗-Ig柱或蛋白A、G或L柱的亲和色谱法(诸如下面更详细地描述的那些)，可以从上述的培养物上清液或腹水分离和纯化抗体。用于本文所述的组合物和方法中的示例性抗体是完整的免疫球蛋白分子，例如，人源化抗体，或人源化Ig分子的含有抗原结合位点(即，互补位)或单个重链和单个轻链的那些部分，包括在本领域中称作Fab、Fab’、F(ab) ’、F(ab') 2、Fd、scFv、可变重结构域、可变轻结构域、可变NAR结构域、双特异性的scFv、双特异性的Fab2、三特异性的Fab3和单链结合多肽的那些部分，和也称作抗原结合片段的其它片段。当构建免疫球蛋白分子或其片段时，可变区或其部分可以与一个或多个恒定区或其部分融合、连接或以其它方式相连，以生成本文所述的任意抗体其片段。这可以以本领域已知的多种方式来实现，包括但不限于分子克隆技术，或直接合成编码所述分子的核酸。构建这些分子的示例性的非限制性方法也可以参见本文所述的实施例。在一个示例性的实施方案中，本申请预见到结合内皮因子的单链结合多肽，其具有重链可变区和/或轻链可变区，并任选地具有免疫球蛋白Fe区。在一个示例性的实施方案中，本申请预见到具有重链可变区和/或轻链可变区的单链结合多肽，其结合内皮因子，并抑制血管生成，并任选地具有免疫球蛋白Fe区。这样的分子是单链可变片段，其任选地通过免疫球蛋白Fe区的存在而具有效应子功能或增加的半衰期。制备单链结合多肽的方法是本领域已知的(例如，美 国专利申请号2005/0238646 )。术语“种系基因区段”或“种系序列”表示来自所述种系的基因(单倍体配偶子和形成它们的那些二倍体细胞)。种系DNA含有多个编码单个Ig重链或轻链的基因区段。这些基因区段被携带在生殖细胞中，但是在它们排列成功能基因之前，不能被转录和翻译成重链和轻链。在骨髓中的B-细胞分化过程中，这些基因区段被能够产生超过IO8种特异性的动态遗传系统随机地混乱化。种系数据库公开和收集了这些基因区段中的大部分。本文使用的“免疫反应性的”表示这样的结合剂、抗体或其片段它们对氨基酸残基的序列(“结合位点”或“表位”)是特异性的，且如果与其它肽/蛋白具有交叉反应性，则在它们为了施用于人用途而配制的水平是无毒的。术语“结合”表示在生理条件下由于例如共价、静电、疏水和离子和/或氢键相互作用而发生的2个分子之间的直接结合，包括相互作用诸如盐桥和水桥和任意其它常规结合方式。术语“优选地结合”是指，与它结合无关的氨基酸序列相比，结合剂以更大的亲和力结合结合位点。优选地，与结合剂对无关的氨基酸序列的亲和力相比，这样的亲和力是至少I倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍或至少1000倍。术语“免疫反应性的”和“优选地结合”在本文中可互换地使用。本文使用的术语“亲和力”表示2种试剂的可逆结合的平衡常数，并表示为Kd。结合蛋白对配体的亲和力(诸如抗体对表位的亲和力)可以是,例如,约100纳摩尔(nM)至约0. I nM、约100 nM至约I皮摩尔(pM)或约100 nM至约I飞摩尔(fM)。本文使用的术语“亲合力”表示，2种或更多种试剂的复合物在稀释以后对解离的抵抗力。通过诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的任意其它技术等方法，可以测定表观亲和力。通过诸如Scatchard分析或本领域技术人员熟悉的任意其它技术等方法,可以测定亲合力。“表位”表示，抗原或其它大分子的能够与抗体的可变区结合槽形成结合相互作用的部分。这样的结合相互作用可以显示为与一个或多个CDR的一个或多个氨基酸残基的分子间接触。抗原结合可以涉及，例如，CDR3或CDR3对，或在某些情况下，Vh和\链的多达所有6个CDR的相互作用。表位可以是线性肽序列(即，“连续的”)，或可以由不连续的氨基酸序列(即，“构象的”或“不连续的”)组成。抗体可以识别一个或多个氨基酸序列；因此，表位可以限定超过一个独特的氨基酸序列。通过肽作图和本领域技术人员众所周知的序列分析技术，可以测定由抗体识别的表位。结合相互作用显示为与CDR的一个或多个氨基酸残基的分子间接触。TRC105是一种嵌合抗体，它是与在美国专利号5，928，641,6, 200, 566、6，190, 660和7，097, 836中描述为Y4-2F1或SN6j的鼠抗体相同的可变氨基酸序列。以前已经鉴别出Y4-2F1和SN6j识别(因而TRC105也识别)的表位。术语“特异性的”表示这样的情形其中抗体不再显示出对除了含有抗体识别的表位的抗原以外的分子的任何显著结合。该术语也适用于这样的情形例如，抗原结合域对许多抗原携带的特定表位是特异性的，在该情况下，携带抗原结合域的抗体或其抗原结合片段能够结合携带所述表位的不同抗原。术语“优选地结合”或“特异性地结合”是指，与它结合无关的氨基酸序列相比，抗体或其片段以更大的亲和力结合表位，且如果与其它含有所述表位的多肽具有交叉反应性，则在它们为了施用于人用途而配制的水平是无毒的。在一个方面，与抗体或其片段对无关的氨基酸序列的亲和力相比，这样的亲和力是至少I倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍或至少1000倍。术语“免疫反应性的”、“结合”、“优选地结合”和“特异性地结 合”在本文中可互换地使用。术语“结合”表示在生理条件下由于例如共价、静电、疏水和离子和/或氢键相互作用而发生的2个分子之间的直接结合，包括相互作用诸如盐桥和水桥以及任意其它常规结合方式。短语“保守氨基酸置换”表示，在某些共同性质基础上的氨基酸分类。一种定义单个氨基酸之间的共同性质的有效方法是，分析同源生物体的对应蛋白之间的氨基酸变化的标准化频率(Schulz, G. E.和 R. H. Schirmer, Principles of Protein Structure,Springer-Verlag)。根据这样的分析,可以确定氨基酸组,其中组内氨基酸优先彼此互换，并因此在对总蛋白结构的影响方面彼此最相似(Schulz, G. E.和R. H. Schirmer,Principles of Protein Structure, Springer-Verlag)。以这种方式定义的氨基酸组的实例包括
(i)带电荷组，由Glu和Asp、Lys>Arg和His组成，
(ii)带正电荷组，由Lys、Arg和His组成，
(iii)带负电荷组，由Glu和Asp组成，
(iv)芳族组，由Phe>Tyr和Trp组成，
(V)氮环组，由His和Trp组成，
(vi)大脂肪族非极性组，由Val、Leu和Ile组成，
(vii)弱极性组，由Met和Cys组成，
(viii)小残基组，由Ser、Thr、Asp、Asn、Gly、Ala、Glu、Gln 和 Pro 组成，
(ix)脂肪族组，由Val、Leu、lie、Met和Cys组成,和 (X)小轻基组，由Ser和Thr组成。除上述组以外，每个氨基酸残基可形成它自己的组，并且由单个氨基酸形成的组可用单字母和/或三字母缩写简单地指代如上所述的本领域中常用的氨基酸。“保守残基”是在相似蛋白范围内相对不变的氨基酸。通常保守残基将只发生被相似氨基酸置换的变化，如以上关于“保守氨基酸置换”所述。在本文的氨基酸序列中使用的字母“ X ”或“ xaa”意图表示，20种标准氨基酸中的任一种可以在该位置被替换，除非另外特别指出。为了肽拟似物设计的目的，在氨基酸序列中的“x”或“xaa”可以被在所述靶序列中的氨基酸的拟似物替换，或所述氨基酸可以被不会干扰肽拟似物活性的基本上任意形式的间隔物替换。
“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性和同一性中的每一个可以通过比较每个序列中的位置来确定，所述序列为了比较目的而进行比对。当所比较的序列中的等同位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则所述分子在此位置是相同的；当等同位置被相同或相似氨基酸残基(例如在空间和/或电子性质方面相似的)占据时，则所述分子可称作在此位置是同源的(相似的)。同源性/相似性或同一性的百分比表示是指，在所比较的序列共有的位置处的相同或相似的氨基酸的数目的函数。“无关的”或“非同源的”序列与本发明的序列具有小于40%同一性，尽管优选小于25%同一性。在比较两个序列中，残基(氨基酸或核酸)的缺失或额外残基的存在，也会降低同一性和同源性/相似性。术语“同源性”描述了基于数学的序列相似性比较，所述序列相似性用来鉴定具有相似功能或基序的基因或蛋白。本发明的核酸(核苷酸、寡核苷酸)和氨基酸(蛋白)序列可以用作“查询序列”，对公共数据库进行搜索，以便例如鉴定其它家族成员、有关序列或同系物。这样的搜索可以用 Altschul,等人(1990) J. Mol. Biol. 215:403-10 的 NBLAST 和XBLAST程序(2. 0版)来进行。BLAST核苷酸搜索可以用NBLAST程序(分值=100，字长= 12)来进行，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白搜索可以用XBLAST程序(分值=50，字长=3)来进行，以获得与本发明的蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得加入空位的比对用于比较目的，可以如在Altschul等人，(1997) Nucleic Acids Res.25(17) :3389-3402 中所述，利用 Gapped BLAST。当用 BLAST 和 Gapped BLAST 程序时，可以使用各个程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数(参见，www. ncbi. nlm. nih. gov)。本文所用的“同一性”是指，当把两个或两个以上序列进行比对以使序列匹配最大化时，即考虑空位和插入时，在所述序列的相应位置上相同的核苷酸或氨基酸残基的百分比。同一性可通过已知方法容易地计算，所述方法包括、但不限于以下文献中描述的方法Computational Molecular Biology, Lesk, A. M.,编，Oxford University Press,New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. ff.,编，Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I,Griffin, A. M.,和Griffin, H. G.,编，Humana Press, New Jersey, 1994; SequenceAnalysis in Molecular Biology, von Heinje, G. , Academic Press, 1987 ;和SequenceAnalysis Primer, Gribskov, M. ^PDevereux, J.,编，M 储液 ton Press, New York,1991 ;以及 Carillo, H.,和 Lipman, D. , SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)。设计测定同一性的方法，以给出所测序列之间的最大匹配。此外，测定同一性的方法已被编入公众可得到的计算机程序中。测定两个序列之间的同一性的计算机程序方法包括、但不限于GCG 程序包(Devereux, J.,等人，Nucleic Acids Research 12(1): 387(1984) )、BLASTP、BLASTN 和 FASTA (Altschul, S. F.等人，J. Molec. Biol. 215:403-410 (1990)和 Altschul 等人 Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 (1997))。公众可从NCBI 及其它来源得到BLAST X程序(BLAST Manual, Altschul, S.,等人，NCBI NLM NIHBethesda, Md. 20894; Altschul, S.,等人，J. Mol. Biol. 215: 403-410(1990)。众所周知的Smith Waterman算法也可以用于测定同一丨丨生。当应用于多肽时，“分离的”(与“基本上纯的”可互换地使用)是指多肽或其一部分，其因为它的来源或操作而(i)存在于宿主细胞中，作为表达载体的一部分的表达产物；或(ii)与它在自然界中相连的那些以外的蛋白或其它化学部分相连；或(iii)在自然界中不存在，例如，如下化学操作的蛋白向所述蛋白附加或添加至少一个疏水部分，使得所述蛋白处于在自然界中不存在的形式。“分离的”另外表示这样的蛋白，其(i)是化学合成的；或(ii)在宿主细胞中表达，并从结合的蛋白和污染蛋白中纯化出来。该术语通常是指这样的多肽其已经与它天然地伴随的其它蛋白和核酸分离开。优选地，所述多肽也与用于纯化它的物质分离，所述物质例如抗体或凝胶基质(聚丙烯酰胺)。本文使用的术语“血管生成抑制性的”、“抑制血管生成的”或“抗血管生成的”包括血管发生的抑制，且意在表示影响新生血管形成的范围、量或速率的减小。实现内皮细胞增殖或组织迁移的范围、量或速率的减小，是抑制血管生成的具体实例。术语“血管生成抑制性的组合物”表示这样的组合物其抑制血管生成介导的过程，诸如内皮细胞迁移、增殖、管形成，并随后导致从现有血管产生新血管的抑制，并从而影响血管生成依赖性的病症。 本文使用的术语“血管生成依赖性的病症”意在表示这样的病症其中血管生成或血管发生的过程支持或增加病理状态，或有利地影响正常的生理过程。因此，其中血管生成支持病理状态的血管生成依赖性的病症的治疗可能导致疾病的迁移，而其中血管生成有利地影响正常的生理过程的血管生成依赖性的病症的治疗可能导致例如正常过程的增强。血管生成是从预先存在的毛细血管或毛细血管后微静脉形成新血管。血管发生源自新血管的形成，所述新血管从成血管细胞(它们是内皮细胞前体)产生。两个过程导致新血管形成，并被包括在术语血管生成依赖性的病症的含义中。本文使用的术语“血管生成”意图包括，血管的重新形成，诸如从血管发生产生的血管以及从现有血管、毛细血管和微静脉的分支和生长产生的血管。血管生成也可以包括，诱导ALKl信号传递和有关的Smad1/5/8磷酸化和/或信号传递。还已知⑶105涉入ALKl信号传递途径，因而也被包括在血管生成的含义内。“诱导宿主免疫应答”是指，患者经历疾病的征象或征状的减轻或减少，具体地包括但不限于生存期的延长。在根据本发明的方法的某些优选的实施方案中，在施用了拮抗剂的患者中，活化生产⑶8+ IFN-Y的T细胞，以诱导细胞毒性的T淋巴细胞(CTL)免疫应答。在根据本发明的方法的某些实施方案中，在施用了所述组合物的患者中，活化生产CD4+IFN- Y的T细胞，以诱导辅助T细胞免疫应答。这些活化的生产⑶4+ IFN- Y的T细胞(即，辅助T细胞)会提供必要的免疫学帮助(例如，通过细胞因子的释放)，以不仅诱导和维持CTL，而且诱导和维持由B细胞介导的体液免疫应答。因而，在根据本发明的方法的某些实施方案中，在施用了所述组合物的患者中，活化对抗原的体液应答。在一个方面，可以将佐剂加入所述组合物中，以增加免疫应答。佐剂是本领域众所周知的。⑶8+和/或⑶4+ T细胞的活化是指，造成具有生产细胞因子(例如，IFN- y )的能力的T细胞实际上生产一种或多种细胞因子，或增加它们对一种或多种细胞因子的生产。“CTL应答的诱导”是指，造成潜在细胞毒性的T淋巴细胞表现出抗原特异性的细胞毒性。“抗原特异性的细胞毒性”是指，针对呈递与癌症相关抗原有关的抗原的细胞的细胞毒性大于癌症不相关抗原。“细胞毒性”表示细胞毒性的T淋巴细胞的杀死靶细胞的能力。这样的抗原特异性的细胞毒性可以是对不呈递癌症不相关抗原的细胞的细胞毒性的至少约3倍、至少约10倍、至少约100倍或更高。抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性(ADCC)也包括天然杀伤细胞(“NK细胞”)的活化，所述天然杀伤细胞通过抗体结合来介导细胞杀死。本文所述的抗体和抗原结合片段可以通过NK细胞(通过内皮因子的结合)来介导ADCC。本文使用的术语“增殖障碍”和“增殖病症”是指，特征在于异常的或不希望的增殖的任何病理学的或非病理学的生理状况。术语“细胞增殖障碍”和“细胞增殖病症”是指，特征在于异常的或不希望的细胞增殖的任何病理学的或非病理学的生理状况，以及包括特征在于不希望的或不需要的细胞增殖或细胞存活(例如，由于有缺陷的细胞凋亡)的病症，特征在于有缺陷的或异常的或有缺陷的细胞凋亡的病症，以及特征在于异常的或不希望的或不需要的细胞存活的病症。术语“分化障碍”是指，特征在于异常的或有缺陷的分化的任何病理学的或非病理学的生理状况。顺从治疗的增殖或分化障碍包括特征 在于异常的或不希望的细胞数目、细胞生长或细胞存活的良性的和肿瘤性的疾病和非病理性生理状况。这样的障碍或病症因此可以构成疾病状态，且包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移组织或恶性转化的细胞、组织或器官，或可以是非病理性的，即，偏离正常，但是通常与疾病无关。根据本发明可以治疗的非病理状况的一个具体实例是，来自创伤修复的组织再生，这会导致瘢痕形成。包含增殖或分化障碍的细胞可以聚集成细胞团，或是分散的。术语“实体瘤”表示通常聚集在一起并形成块的瘤形成或转移灶。具体实例包括内脏肿瘤，诸如胃癌或结肠癌、肝细胞瘤、肾癌、肺和脑肿瘤/癌症。“非实体瘤”表示造血系统的瘤形成，诸如淋巴瘤、骨髓瘤和白血病，或在性质上是扩散的瘤形成，因为它们通常不形成实体块。白血病的具体实例包括例如，急性和慢性淋巴母细胞性白血病、成髓细胞白血病和多发性骨髓瘤。这样的障碍包括肿瘤或癌症，它们可以影响基本上任意细胞或组织类型，例如，癌、肉瘤、黑素瘤、转移性障碍或造血肿瘤性障碍。转移性肿瘤可以源自多种原发性肿瘤类型，包括但不限于乳房、肺、甲状腺、头颈部、脑、淋巴样、胃肠道(嘴、食道、胃、小肠、结肠、直肠)、泌尿生殖道(子宫、卵巢、宫颈、膀胱、睾丸、阴茎、前列腺)、肾、胰腺、肝、骨、肌肉、皮肤
坐寸o癌表示上皮或内分泌组织的恶性肿瘤，且包括呼吸系统癌、胃肠道系统癌、泌尿生殖系统癌、睾丸癌、乳癌、前列腺癌、内分泌系统癌和黑素瘤。示例性的癌包括从宫颈、肺、前列腺、乳房、头颈部、结肠、肝和卵巢形成的那些。该术语也包括癌肉瘤，例如，它们包括由癌性和肉瘤性组织组成的恶性肿瘤。腺癌包括腺组织的癌，或其中肿瘤形成腺样结构。要治疗的眼组织是，例如，具有糖尿病视网膜病变、黄斑变性或新生血管性青光眼的患者的视网膜组织，要抑制的血管生成是视网膜组织血管生成，其中存在视网膜组织的新生血管形成。要治疗的癌性组织是，例如，表达异常水平的内皮因子的内皮组织。本文使用的术语“转化的细胞”是指，已经自发地转化成无限制生长状态的细胞，即，它们已经获得通过在培养物中无限数目的分裂来生长的能力。在它们生长控制缺失方面，可以用诸如肿瘤性的、间变性的和/或增生性的等术语来表征转化的细胞。为了本发明的目的，术语“恶性哺乳动物细胞的转化表型”和“转化表型”意图包括、但不限于，与哺乳动物细胞的细胞转化有关的任何下述表型特性永生化、形态或生长转化和致肿瘤性(通过在细胞培养物中的延长生长、在半固体培养基中的生长或在无免疫能力的或同源的动物中的致肿瘤生长来检测)。术语“肿瘤细胞抗原”在本文中被定义为，与无关的肿瘤细胞、正常细胞或在正常体液中相比，抗原以更高的量存在于肿瘤细胞上或在体液中。通过本领域技术人员已知的任意数目的试验，可以测试抗原存在，所述试验包括但不限于使用抗体的阴性和/或阳性选择，诸如ELISA试验、放射免疫测定或通过蛋白印迹。术语“细胞凋亡”或“程序化细胞死亡”表示这样的生理过程在发育和其它正常生物学过程中，通过该过程来消除不希望的或无用的细胞。细胞凋亡是在正常生理条件下发生的细胞死亡模式，细胞是它自身的死亡的主参加者(“细胞自杀”)。它最常见于下述过程中正常的细胞更新和组织体内稳态、胚胎发生、免疫耐受性的诱导和维持、神经系统的发育和内分泌依赖性的组织萎缩。经历细胞凋亡的细胞表现出特有的形态学和生化特征。这些特征包括染色质聚集、细胞核和细胞质浓缩、细胞质和细胞核分隔成膜结合的囊泡(凋亡小体，它们含有核糖体)、形态学上完整的线粒体和核质。在体内，这些凋亡小体快速地被巨噬细胞、树突细胞或邻近的上皮细胞识别和吞噬。由于在体内去除凋亡细胞的这种有效机制，不会引起炎症应答。在体外，凋亡小体以及剩余的细胞碎片最终膨胀，并最后裂解。该体外细胞死亡的末期已经被称作“次要坏死”。通过本领域技术人员已知的方法，可以测量 细胞凋亡，所述方法如DNA片段化、膜联蛋白V的暴露、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的活化、细 胞色素C的释放等。已经诱导死亡的细胞在本文中称作“凋亡细胞”。“细胞凋亡诱导剂”在本文中定义为诱导细胞凋亡/程序化细胞死亡，且包括，例如，辐照、化疗剂或受体连接剂，其中细胞(例如，肿瘤细胞)被诱导经历程序化细胞死亡。在下面更详细地描述了示例性的细胞凋亡诱导剂。使用标准的膜联蛋白V细胞凋亡试验，可以测试细胞凋亡在6-孔平板(NUNC)中培养NIH:0VCAR-3细胞，辐照，或用拮抗剂(或与另一种抗癌药相组合)处理4-48小时，洗涤，并用膜联蛋白V-FITC (BD-Pharmingen)染色I小时。通过流式细胞术(Becton-Dickinson, CellQuest)分析细胞,用碘化丙唳复染色,并在流式细胞计中再次分析。B.制备和表达人源化的抗-内皮因子抗体的方法
已经开发了结合内皮因子的嵌合的单克隆抗体。该抗体被命名为TR105 (也称作c-SN6j)。在一个方面，通过人源化嵌合的单克隆TRC105抗体的'和Vh序列(分别是SEQ IDNO. I和39)，制备了本文所述的抗体和其抗原结合片段。借助于基因工程，已经构建了人源化的免疫球蛋白，包括人源化的抗体。以前已经描述的大多数人源化的免疫球蛋白已经包含与特定人免疫球蛋白链(即，接收体或受体)的框架相同的框架和3个来自非人(S卩，供体)免疫球蛋白链的CDR。本文所述的人源化也可以包括这样的标准通过所述标准，在人源化的免疫球蛋白链的框架中鉴别出有限数目的氨基酸，并选择为与在供体(而不是接收体)中的那些位置处的氨基酸相同，以便增加或维持包含人源化的免疫球蛋白链的抗体的亲和力。本发明部分地基于下述模型即在生产人源化抗体(例如，使用小鼠抗体作为CDR来源)的现有技术中造成亲和力损失的2个促成原因是(I)当小鼠CDR与人框架相化合时，框架中接近CDR的氨基酸变成人的，而不是小鼠的。无意受理论的约束，这些变化的氨基酸可能轻微的改变CDR (例如，它们可能产生不同于供体小鼠抗体的静电力或疏水力，且改变的-CDR可能不会象在供体抗体中的CDR那样与抗原发生有效接触);(2)另外，靠近CDRJM不是所述CDR的一部分(即，仍然是框架的一部分)的初始小鼠抗体中的氨基酸可与抗原发生有助于亲和力的接触。当抗体被人源化时，会丧失这些氨基酸，因为所有的框架氨基酸通常都是人的。为了避免这些问题，并且为了产生对期望的抗原具有非常强的亲和力的人源化抗体，采用下列原则中的一条或多条，可以构建人源化抗体和其抗原结合片段。一条非限制性原则是，例如，采用来自与要人源化的供体免疫球蛋白通常同源的特定人免疫球蛋白的框架作为受体，或者采用来自许多人抗体的共有框架作为受体。例如，数据库(例如，全国生物医学研究基金会蛋白鉴定资源(National Biomedical ResearchFoundation Protein Identification Resource)或国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information, NCBI)的蛋白序列数据库)中的小鼠重链(或轻链)可变区与人重链(或轻链)可变区的序列比较表明，对于不同的人区域，同源性程度变化很大，例如约40%至约60%、约70%、约80%或更高。通过选择与供体免疫球蛋白的重链可变区最同源的人重链可变区之一作为受体免疫球蛋白，在从供体免疫球蛋白变成人源化免疫球蛋白中将会改变更少的氨基酸。通过选择与供体免疫球蛋白的轻链可变区最同源的人轻链可变区之一作为受体免疫球蛋白，在从供体免疫球蛋白变成人源化免疫球蛋白中将会改 变更少的氨基酸。通常，使用这样的技术，存在更小的机会来改变一个或多个CDR附近的氨基酸并从而改变它们的构象。此外，包含人源化免疫球蛋白链的人源化抗体的精确总体形状可能更接近类似于供体抗体的形状，由此也减少了使⑶R变形的机会。也可以使用来自与受体序列相同的人抗体的轻链和重链，以提高人源化的轻链和重链彼此发生有利接触的可能性。或者，也可以使用来自与受体序列不同的人抗体种系序列的轻链和重链；当使用这样的组合时，使用常规试验(例如，ELISA)，可以容易地确定'是否结合目标表位。在一个实施例中，将会选择这样的人抗体，其中轻链和重链可变区序列(一并考虑)整体与供体轻链和重链可变区序列最同源。有时，将会更偏重于重链序列。不管怎样选择受体免疫球蛋白，在某些情况下，通过选择人源化免疫球蛋白链框架中的少量氨基酸，使其与供体(而不是受体)中那些位置处的氨基酸相同，可以实现更高的亲和力。亲和力成熟方法是本领域已知的。就用于人治疗而言，人源化抗体通常具有至少3个优于小鼠或嵌合抗体的潜在优点。因为抗体的效应部分是人的，认为它会与人免疫系统的其它部分更好地相互作用(例如，通过补体依赖性的细胞毒性(CDC)或抗体依赖性的细胞的细胞毒性(ADCC)更有效地破坏靶细胞)。另外，人免疫系统不会将人源化抗体的框架或恒定区识别为外来物，因此针对这样的注射的抗体的抗体应答会小于针对完全外来的小鼠抗体或部分外来的嵌合抗体的抗体应答。最后，已知小鼠抗体在人循环中的半衰期远远短于人抗体的半衰期。据推测，人源化抗体可以具有与天然存在的人抗体更类似的半衰期，这允许施用更小的且更低频率的剂量。通过本领域已知的和本文描述的多种方法，可以实现抗体和其抗原结合片段的人源化。类似地，通过本领域已知的和本文描述的方法，也可以实现人源化抗体的生产。修饰框架区的方法是本领域已知的，且在本文中预见到。用以变更的一个或多个有关框架氨基酸位置的选择，取决于多种标准。选择用以改变的有关框架氨基酸的一种标准可以是，在供体分子与受体分子之间在氨基酸框架残基中的相对差异。使用该方案来选择用以变更的有关框架位置，具有避免在残基确定中的任何主观偏差或在残基对CDR结合亲和力的贡献中的任何偏差的优势。用于确定用以改变的有关氨基酸位置的另一个标准可以是，例如，选择已知是重要的或有助于CDR构象的框架残基。例如，规范的框架残基对于CDR构象和/或结构而言是重要的。规范框架残基作为用以改变的有关位置的靶向，可以用于鉴别在其相关的供体CDR序列背景中更适合的氨基酸残基。氨基酸残基在特定框架位置处的频率是另一个标准，其可用于选择所要改变的有关框架氨基酸位置。例如，所选框架与其亚家族内的其它框架序列的比较，可以揭示在一个或多个特定位置处以较小频率出现的残基。接纳不太丰富的残基的位置，可类似地适用于选择作为在受体可变区框架中所要变更的位置。例如，基于与CDR的近似度，也可以选择用以改变的有关氨基酸位置。在某些背景下，FR残基可以参与CDR构象和/或抗原结合。此外，该标准可类似地用于把通过本文所 述的其它标准选出的有关位置区分优先次序。因此，区分在一个或多个CDR的近侧和远侧的残基，代表减少所要改变的有关位置的数目的一种方法。用于选择所要变更的有关氨基酸框架位置的其它标准包括，例如，已知或预测存在于抗原-CDR界面附近的三维空间中的残基，或预测会调节CDR活性的残基。类似地，可选择已知或预测在重链可变区(Vh)和轻链可变区(')界面之间形成接触的框架残基。通过调节⑶R结合槽、抗原(表位)相互作用或V1^P '相互作用，这样的框架位置可以影响⑶R的构象和/或亲和力。因此，选择这些氨基酸位置来构建用于筛选结合活性的不同群体，可以用于鉴别框架变化，所述框架变化替代对CDR构象具有不利影响的残基，或抵偿对框架中别处存在的残基的不利影响。可选择用于变更的其它框架残基包括溶剂难以接近的氨基酸位置。这样的残基通常隐匿在可变区中，且因此能够影响CDR的构象或V1^P '相互作用。例如，从由多肽的氨基酸侧链和/或由已知的三维结构数据所创造的环境的相对疏水性，可以预测溶剂的可接近性。在于供体CDR中选择有关氨基酸位置、以及在想要改变的框架区中选择任意有关氨基酸位置之后，可以将在某些或全部所选位置处的氨基酸变化掺入受体可变区框架和供体⑶R的编码核酸中。可以单个地制备并测试变更的框架或⑶R序列，或者可以顺序地或同时地化合并测试。在任意或全部变更位置的可变性范围可以是从几个至多个不同氨基酸残基，包括所有二十种天然存在的氨基酸或其功能等价物和类似物。在某些情况下，也可以考虑非天然存在的氨基酸，且是本领域已知的。用以改变的氨基酸位置的数目及定位的选择是灵活的，且可以取决于用来鉴别具有理想活性(例如相对于供体可变区而言基本相同的或更高的结合亲和力)的变更可变区的预期用途和所想要的效率。在这方面，掺入经变更的可变区群体中的变化的数目越大，则对展示出理想活性(例如，与供体基本相同的或高于供体的结合亲和力)的至少一个物种的鉴别更有效。或者，如果使用者具有关于某些氨基酸残基或位置不均衡地有助于结合亲和力的影响的经验或实际数据，那么可希望产生变更可变区的有限群体，其集中在那些经鉴别的残基或位置之内或周围的变化。例如，若需要⑶R移植的可变区，则经变更的可变区的大的不同的群体可以包括在供体和受体框架与所有单一 CDR氨基酸位置变化之间的所有非相同框架区位置。或者，中间差异的群体可以包括子集，例如仅为要与所有单一 CDR氨基酸位置变化一起掺入(例如，为了增加人源化抗体或抗原结合片段的亲和力)的近侧非相同框架位置的子集的子集，。例如，通过另外包括所有成对的CDR氨基酸位置变化，可进一步增加上述群体的差异。相比而言，可以类似地进行构建集中在预定残基或位置(其在少至一个框架和/或一个⑶R氨基酸残基位置处掺入变体残基)上的群体，用于筛选和鉴别变更的抗体可变区。与上述群体一样，通过另外扩展所选择用以改变的位置，以包括在框架和CDR区中的任一个或两者中的其它有关位置，可以进一步增加这样的集中群体的差异。在可以另外采用的框架区和CDR中的任一个或两者中，存在从很少变化到许多变化的范围的许多其它组合，所有这些组合将产生经变更的可变区群体，可以筛选该群体以鉴别具有所想要活性(例如，对内皮因子的结合活性)的至少一个CDR移植的变更的可变区。基于本文中提供的教导和引导，本领域技术人员应知道或者可确定，在框架或供体CDR或其子集中哪个所选的残基位置可进行改变以产生用于筛选和鉴别本发明的变更的抗体的群体。编码氨基酸的密码子是本领域已知 的。另一种人源化抗体的方法包括称作“超人源化(superhumanization)”的方法。超人源化包括下述步骤得到由非人成熟抗体基因编码的主题可变区的肽序列，并鉴别在非人抗体可变区内的至少2个⑶R的第一组规范⑶R结构类型。规范⑶R结构类型是通过Chothia (CITE)命名的结构类型。Chothia及其同事发现，许多抗体的⑶R的关键部分采用几乎相同的肽主链构象，尽管在氨基酸序列水平的差异巨大。因此，Chothia为每条链中的每个CDR定义了一个或几个“规范结构”。每个规范结构主要为形成环的氨基酸残基的连续区段指定一组肽主链扭转角。在鉴定规范CDR结构类型以后，也得到人抗体的人抗体可变区的肽序列文库。该文库含有种系核酸区段编码的人种系可变区序列，且可能包括成熟的人抗体序列。在任一种情况下，所述方法都包括，鉴别出在人可变区序列文库内的每个序列的至少两个CDR的规范CDR结构类型(即，第二组规范CDR结构类型)。如下从该文库中选择出候选序列的子集通过比较第一组规范⑶R结构类型与第二组规范⑶R结构类型(即，比较在可变区内的相应位置处的小鼠规范CDR结构类型与人规范CDR结构类型)，并选择这样的人序列其中就分别在非人与人可变区内的相应位置处的⑶R序列而言，第二组规范⑶R结构与第一组规范CDR结构类型相同。本方法使用这些候选的人可变区序列作为构建嵌合分子的基础，所述嵌合分子包括与来自候选的人可变区序列的构架区结合的来自非人可变区的至少两个CDR序列(例如小鼠CDR)。该构建的结果是，所述嵌合抗体含有在可变区的相应位置处用于置换每个人CDR序列的每个非人CDR序列，使得嵌合抗体的框架序列不同于候选的人框架序列。在两个水平上评价每个结构域与候选的人抗体序列的主题CDR的相似性。首先，寻找三维构象完全一样的⑶R肽主链。试验性确定主题⑶R的原子坐标几乎是不可能的，因此如下近似确定三维相似性确定主题⑶R的Chothia规范结构类型，并从进一步分析中排除具有不同规范结构的候选序列。其次，分析主题CDR与剩余的人候选CDR之间的残基对残基的同源性，并选择具有最高同源性的候选序列。选择最高同源性是基于，用于评级具有与主题非人可变区相同的规范结构的候选人可变区的各种标准。用于评级所选择组的成员的标准，可以是氨基酸序列同一性或氨基酸同源性或两者。氨基酸同一性是通过氨基酸残基的位点对位点匹配得到的简单评分。氨基酸同源性所确定的相似性是特征性的残基结构中的位点对位点的相似性。例如，根据 Henikoff 和 Henikoff, (1992) Amino acid substitution matrices from proteinblocks, Proc. Natl. Acad. Sci 89: 10915-10919 所描述的表和规程,或通过 Henikoff和Henikoff，(1996)所描述的BLOSUM系列，可以对同源性评分。步骤如下
a)确定出主题抗体的重链和轻链可变结构域的肽序列。可以用几种方法中的任一种方法确定出这些序列，例如在传统cDNA克隆后对各个基因进行DNA测序；对已经通过聚合酶链反应从主题杂交瘤系的逆转录物或DNA扩增得到的克隆产物进行DNA测序；或对纯化的抗体蛋白进行肽测序。b)将Kabat编号系统(Kabat等，同上，1991)应用于主题非人抗体的重链及轻链序列。确定出主题非人抗体的每一个CDR的规范结构类型。如下完成此确定根据Chothia和 Lesk (1987)、Chothia 等人(1992)、Tomlinson 等人(1995)、Martin 和 Thornton (1996)和Al-Lazikani等人(1997)所讨论的指南,检查肽序列。 每一个⑶R规范结构确定的显著特点如下。对于重链⑶R1，目前已知有三种规范结构类型。对新序列的指定是直截了当的，因为每种规范结构类型具有不同的残基数目。如在Al-Lazikani等人(1997)中所描述的，当将Kabat编号指定给序列时,对于各个规范结构，残基31-35的编号如下
规范结构类型I: 31、32、33、34、35。规范结构类型2: 31、32、33、34、35、35a。规范结构类型3: 31、32、33、34、35、35a、35b。对于重链⑶R2，目前已知有四种规范结构类型。一些结构类型具有独特的残基数目，从它们的位点52-56的独特的Kabat编号，可以将它们轻易地区别开，即
规范结构类型I: 52、53、54、55、56。规范结构类型4: 52、52a、52b、52c、53、54、55、56。重链⑶R2的规范结构类型2与3具有相同的残基数目，因此必须通过它们序列内的线索进行区别，如在Chothia等(1992 )中所讨论的。含有这些线索的片段的Kabat编号为52、52a、53、54、55。规范类型2在52a位点为Pro或Ser，在55位点为GLy或Ser, M在其它位点没有限制。规范类型3在54位点为Gly、Ser、Asn或Asp，而在其它位点没有限制。在大多数情况下，这些标准足以进行正确的指定。另外，对于规范类型2，构架残基71通常是Ala、Val、Leu、Ile或Thr,而对于规范类型3,通常是Arg。重链⑶R3是所有⑶R中变化最多的一种⑶R。它是通过淋巴细胞特有的遗传学过程(一些具有随机性质)所生成。因此，难以预测⑶R3的规范结构。在任何情况下，人种系V基因片段都不编码⑶R3的任何部分；因为V基因片段终止于Kabat位点94，而位点95至102编码⑶R3。因为这些原因，选择候选人序列时通常不考虑⑶R3的规范结构。对于轻链⑶R1，在K链上目前已知有⑶Rl的六种规范类型结构。每种规范类型结构具有不同的残基数目，因此，从残基位点27-31的Kabat编号，显而易见给新序列指定的规范类型结构。规范结构类型I: 27、29、30、31。
规范结构类型2: 27、28、29、30、31。规范结构类型3: 27、27a、27b、27c、27d、27e、27f、28、29、30、31。规范结构类型4: 27、27a、27b、27c 、27d、27e、28、29、30、31。规范结构类型5: 27、27a、27b、27c、27d、28、29、30、31。规范结构类型6: 27、27a、28、29、30、31。对于轻链⑶R2，在K链上已知⑶R2只有一种规范结构类型，因此，除了特殊的主题抗体序列外，指定是自动的。对于轻链CDR3，在K链上已经描述了 CDR3的最多到6种规范结构类型，但其中三种是罕见的。三种常见的规范结构类型可以通过它们的长度来区别，反映为残基位点91-97的Kabat编号
规范结构类型I 91、92、93、94、95、96、97 (在位点95处必须是Pro，在位点90处必须是 Gin、Asn 或 His)。规范结构类型3: 91、92、93、94、95、97.
规范结构类型 5: 91、92、93、94、95、96、96a、97。在鉴别出主题非人抗体的规范⑶R结构类型后，鉴别出具有与主题抗体同样的规范结构类型组合的相同链类型(重链或轻链)的人基因，以形成人序列的候选集合。这些基因片段的绝大多数已经被阐明，并已经被指定到一种规范结构类型(Chothia等人，1992，Tomlinson 等人，1995)。对于重链，评价了⑶Rl和⑶R2与小鼠规范结构类型的一致性，排除了不一致的基因。对于轻链，首先评价了每个人序列的CDRl和CDR2与主题抗体的规范结构类型的一致性。如下评价候选的V K基因的残基89-95形成与主题抗体一样的规范结构类型的CDR3的能力使所述基因与J区融合，并将CDR3的规范CDR结构类型的确定标准应用于所述融合的序列，并排除不符合的序列。或者，当主题抗体的可变结构域具有人基因组所没有的规范结构类型时，则考虑用于比较的是这样的人种系V基因其具有三维上相似的、但不同的规范结构类型。这样的情况经常出现在鼠抗体的K链⑶Rl上，包括下面描述的两个实施例。在鼠抗体的这个⑶R处，已经观察到所有6种可能的规范结构类型，而人基因组只编码规范类型2、3、4和6。在这些情况下，可以选择用于比较的是这样的规范CDR结构类型其具有在主题非人序列的氨基酸残基长度的两倍内的氨基酸残基长度。例如，如果在主题抗体中发现I型规范结构，那么用于比较的是具有规范结构类型2的人VK序列。如果在鼠抗体中发现的是5型规范结构，那么用于比较的是具有规范结构类型3或4的人Vk序列。成熟的、重排的人抗体序列可被考虑用于序列比较。在多种情况下，可以有这种考虑，所述情况包括但不限定于下述情况其中，成熟的人序列(I)与种系非常接近；(2)已知在人体内没有免疫原性；或(3)含有与主题抗体相同的的、但在人种系中没有发现的规范结构类型。对于每一个具有匹配的规范结构类型的候选V基因，也评估与主题序列的残基对残基的序列同一性和/或同源性，以评级候选人序列。例如，评估的残基如下=(I)Kappa()轻链 CDR 氨基酸残基位置是 CDRl (26-32)、CDR2 (50-52)、CDR3 (91-96);和(2)重链⑶R氨基酸残基位置是⑶Rl (31-35)和⑶R2 (50-60)。另外，也可以考虑重链⑶R3氨基酸残基位置95至102。
首先，通过主题序列与候选人序列之间的相同氨基酸残基的数目，将残基对残基的同源性评分。从最高评分前25%的候选序列中，选出用于随后构建转化抗体的人序列。在适当时，诸如当一些候选序列具有相似的同一性评分时，还可以根据需要另外考虑非一致的氨基酸残基之间的相似性。在评分中添加了主题残基与目标残基之间的脂肪族与脂肪族、芳香族与芳香族或极性与极性的匹配。在另一个实施例中，使用氨基酸置换矩阵，例如Henikoff和Henikoff的BL0SUM62矩阵，可以进行序列同源性的定量评估。从已知的人种系J片段组中，可以选出⑶R3序列的C末端构架区的目标序列。通过使用上面提及的特异地用于评估候选的V基因的评分标准评估每个J片段的残基对残基的同源性(就CDR3与J重叠的序列位点而言)，选出J肽序列。从最高评分的前25%候选序列中，选出用于随后构建转化抗体的J基因片段肽序列。
作为一个实例，嵌合的可变链含有来自主题非人序列的至少两个CDR以及来自候选人序列的框架序列。在另一个实施例中，嵌合的轻链含有来自主题非人序列的三个CDR以及来自候选人序列的框架序列。在其它实施例中，嵌合的重链含有含有来自主题重链的至少两个CDR以及来自候选人重链的框架序列，或者，嵌合的重链含有来自主题重链的每一个CDR以及来自候选人重链的框架序列。在另一个实施例中，嵌合抗体重链含有来自主题非人序列的CDRl和2以及CDR3的残基50-60以及来自候选人重链的CDR的残基61-65，以及候选人序列的框架序列。在另一个实施例中，嵌合的重链序列含有来自主题非人序列的每一个CDR ;来自主题序列的框架序列27-30，以及来自候选序列的框架序列。然而，在所有情况下，嵌合抗体分子含有的框架序列与候选人可变结构域的框架序列的差异不超过10个氨基酸残基。当希望增加的人源化抗体的亲和力时，可以额外地用其它氨基酸置换转化抗体的CDR内的残基。通常，改变CDR中的不超过4个氨基酸残基，更通常地，改变CDR中的不超过2个残基，但是重链CDR2除外，这时可以改变多达10个残基。通过常规方法，例如本文所述的那些(例如，Biacore),可以测量亲和力的变化。在美国专利号6，881，557 (它通过引用整体并入本文)中，更详细地描述了超人源化抗体的方法。使用本领域已知的常规技术，可以构建和生产人源化抗体和抗原结合片段。另外，经常可以大量生产重组制备的抗体，特别当使用高水平表达载体时。使用本领域已知的常规技术，可以对抗体测序。在一个方面，将一个或多个CDR的氨基酸序列插入合成序列(例如，人抗体(或其抗原结合片段)框架的合成序列)中，以产生这样的人抗体其会限制用非人抗体治疗人患者时的不利副反应。也可以将一个或多个⑶R的氨基酸序列插入合成序列(例如，结合蛋白诸如AVIMER )中，以产生用于施用给人患者的构建体。根据要治疗的动物的物种，可以改进这样的技术。例如，就兽医学应用而言，可以合成抗体、抗原结合片段或结合蛋白，用于施用给非人动物(例如，灵长类动物、牛、马
-Tf- ) o在另一个方面，使用本领域公知的技术，诸如在本文中提供和并入的那些技术，可以将编码一个或多个⑶R的氨基酸序列的核苷酸插入(例如，通过重组技术)编码抗体、抗原结合片段或结合蛋白的现有多核苷酸的限制性内切核酸酶位点中。为了表达，表达系统是这样的系统其利用GS系统(Lonza)，使用谷氨酰胺合成酶基因作为选择标记。简而言之，使用GS系统(Lonza)，使用谷氨酰胺合成酶基因作为选择标记，通过电穿孔(250V)，在CHO细胞中进行转染。在含有10%透析的胎牛血清(FCS，含有
2mM谷氨酰胺)的DMEM (Sigma)中，培养野生型CHO细胞。通过电穿孔，用300呢线性化的DNA，转染6xl07 CHO细胞。在电穿孔以后，将细胞重新悬浮于含有谷氨酰胺的DMEM中，涂布在36x96-孔平板(50耵/孔)上，在5% CO2中在37 °C温育。次日，加入150W/孔的选择性培养基(没有谷氨酰胺的DMEM)。在大约3周以后，使用无关的抗体作为阴性对照，通过ELISA (参见下面)筛选菌落。在24-孔平板中繁殖生产>20l^g/ml的所有菌落，然后在双份T25烧瓶中繁殖。为了高水平生产，最广泛使用的哺乳动物表达系统是这样的系统其利用由二氢叶酸还原酶缺陷型(“dhfr-”)中国仓鼠卵巢细胞提供的基因扩增操作。所述系统是技术人员众所周知的。所述系统是基于脱氢叶酸盐还原酶“過/r”基因，该基因编码DHFR酶，该酶催化脱氢叶酸盐向四氢叶酸盐的转化。为了实现高产量，用含有功能性DHFR基因(以及编码目标蛋白的基因)的表达载体转染dhfr- CHO细胞。在该情况下，目标蛋白是重组抗体重链和/或轻链。
通过增加竞争性DHFR抑制剂甲氨蝶呤(MTX)的量，重组细胞会通过扩增過/r基因来产生抗性。在标准情况下，采用的扩增单元远远大于過/r基因的大小，结果共扩增抗体重链_。当希望大规模生产蛋白(诸如抗体链)时，考虑采用的细胞的表达水平和稳定性。在长期培养中，重组CHO细胞群体在扩增过程中丧失在它们的特异性抗体生产力方面的同质性，即使它们源自单个亲代克隆。本申请提供了编码本文所述的抗体或抗原结合片段的分离的多核苷酸(核酸)、含有这种多核苷酸的载体以及用于将这种多核苷酸转录和翻译成多肽的宿主细胞和表达系统。本申请也提供了质粒、载体、转录或表达盒形式的构建体，其包含至少一个上述的多核苷酸。本申请也提供了重组宿主细胞，其包含一个或多个上述的构建体。编码本文所述的任意抗体或其抗原结合片段的核酸按照提供的那样自身形成本申请的一个方面，本文所述的抗体或其抗原结合片段的生产方法也形成本申请的一个方面，所述方法包括从来源的编码核酸进行表达。通过在适当条件下培养含有所述核酸的重组宿主细胞，可以方便地进行表达。在通过表达来生产以后，使用任意合适的技术，可以分离和/或纯化抗体或抗原结合片段，然后适当地使用。可以从例如它们的天然环境中，以基本上纯的或同质的形式提供、分离和/或纯化本文所述的特定抗体、抗原结合片段和编码核酸和载体。在核酸的情况下，除了编码具有所需功能的多肽的序列以外，游离的或基本上游离的核酸或基因来源。核酸可以包括DNA或RNA，且可以是完全或部分合成的。纯化方法是本领域众所周知的。用于在多种不同的宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是众所周知的。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、酵母和杆状病毒系统。在本领域中可用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、HeLa细胞、幼仑鼠肾细胞、NSO小鼠骨髓瘤细胞和许多其它细胞。常见的细菌宿主是大肠杆菌。
抗体和抗体片段在原核细胞(诸如大肠杆菌)中的表达在本领域中是非常确定的。关于综述，参见例如 Pliickthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991)。在培养的真核细胞中的表达也是本领域技术人员可利用的，作为生产本文所述的抗体和抗原结合片段的一个选择，最新的综述参见，例如Raff, M. E. (1993)Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576;Trill J. J.等人(1995) Curr. Opinion Biotech 6: 553-560,它们中的每一篇通过引用整体并入本文。可以选择或构建合适的载体，其含有适当调节的序列，包括启动子序列、终止子序列、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标志物基因和适当的其它序列。载体可以是适当的质粒、病毒载体，例如曬菌体或曬粒。关于其它细节，参见，例如，Molecular Cloning: aLaboratory Manual:第 2 版，Sambrook 等人，1989, Cold Spring Harbor LaboratoryPress。许多已知的核酸操作技术和方法，例如核酸构建体的制备、诱变、测序、将DNA导入细胞中和基因表达以及蛋白的分析，详细描述在Short Protocols in Molecular Biology,第 2版，Ausubel 等人编，John Wiley & Sons, IggZtjSambrook等人和Ausubel等人的方法和公开内容通过引用整体并入本文，且是本领域众所周知的。因而，另一个方面提供了一种宿主细胞，其含有本文公开的核酸。另一个方面提供了一种方法，所述方法包括将这样的核酸导入宿主细胞中。所述导入可以采用任何可利用的技术。对于真核细胞，合适的技术可以包括，例如，磷酸钙转染、DEAE葡聚糖、电穿孔、月旨质体介导的转染和使用逆转录病毒或其它病毒(例如，牛痘，或者对于昆虫细胞，杆状病毒)的转导。对于细菌细胞，合适的技术可以包括，例如，氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体的转染。在导入之后，可以造成或允许核酸的表达，例如通过在基因表达条件下培养宿主细胞。在一个实施方案中，将核酸整合进宿主细胞的基因组(例如染色体)中。根据标准技术，通过包含促进与基因组的重组的序列，可以促进整合。根据需要，可以初始化Ig增强，以使表达最大化。本申请也提供了一种方法，所述方法包括在表达系统中使用上述的构建体，以便表达上述的抗体或其抗原结合片段。本申请也涉及分离的核酸，诸如重组DNA分子或克隆的基因或其简并变体、突变体、类似物或其片段，它们编码本文所述的结合内皮因子的抗体或抗原结合序列。在一个方面，本申请提供了一种核酸，其编码本文所述的结合内皮因子的抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段的重组DNA分子或克隆的基因的完整DNA序列可以可操作地连接到表达控制序列上，后者可以导入适当宿主中。本申请因此延伸至单细胞宿主，所述宿主被抗体的克隆基因或包含编码抗体的Vh和/或 '或其部分的DNA序列的重组DNA分子转化。另一个特征是，本文公开的DNA序列的表达。如本领域众所周知的，可以如下表达DNA序列将它们可操作地连接至适当表达载体中的表达控制序列上，并采用该表达载体来转化适当的单细胞宿主。DNA序列与表达控制序列的这种可操作连接当然地包括(如果不是DNA序列的一部分)在DNA序列上游的正确读码框中，提供起始密码子ATG。可以以分离的和/或纯化的形式(例如，编码具有所需功能的多肽的多核苷酸以外的来源的游离的或基本上游离的多核苷酸)提供多核苷酸和载体。本文使用的“基本上纯的”和“基本上游离的”表示，含有少于例如约20%或更少外来物、约10%或更少外来物、约5%或更少外来物、约4%或更少外来物、约3%或更少外来物、约2%或更少外来物或约1%或更少外来物 溶液或悬浮液。多种宿主/表达载体组合可以用于表达本发明的DNA序列。有用的表达载体，例如，可以由染色体的、非染色体的和合成的DNA序列的区段组成。合适的载体包括、但不限于SV40和已知的细菌质粒的衍生物，例如，大肠杆菌质粒col El、Pcrl、Pbr322、Pmb9和它们的衍生物，质粒诸如RP4 ;噬菌体DNA，例如，噬菌体入的众多衍生物，例如，NM989和其它噬菌体DNA，例如，M13和丝状单链噬菌体DNA ;酵母质粒诸如2u质粒或其衍生物；可用于真核细胞中的载体，诸如可用于昆虫或哺乳动物细胞中的载体；源自质粒和噬菌体DNA的组合的载体，诸如已经被修饰成采用噬菌体DNA或其它表达控制序列的质粒；等。本文也提供了一种重组宿主细胞，其包含一种或多种多核苷酸构建体。编码本文提供的抗体或抗原结合片段的多核苷酸形成本申请的一个方面，抗体或抗原结合片段的生产方法也形成本申请的一个方面，所述方法包括从多核苷酸进行表达。例如，通过在适当条件下培养含有所述多核苷酸的重组宿主细胞，可以实现表达。然后使用任意合适的技术，可以分离和/或纯化抗体或抗原结合片段，并适当地使用。多种表达控制序列(控制可操作地连接到它上的DNA序列的表达的序列)中的任一种可以用于这些载体中，以表达DNA序列。这样的有用的表达控制序列包括，例如，SV40的早期或晚期启动子、CMV、牛痘、多瘤或腺病毒、Iac系统、trp系统、TAC系统、TRC系统、LTR系统、噬菌体\的主要操纵基因和启动子区、fd外壳蛋白的控制区、3-磷酸甘油酸酯激酶或其它糖酵解酶的启动子、酸性磷酸酶的启动子(例如，Pho5)、酵母交配因子的启动子和已知控制原核或真核细胞的基因或它们的病毒和它们的不同组合的表达的其它序列。用于在多种不同的宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是众所周知的。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、酵母和杆状病毒系统。在本领域中可用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、NSO小鼠骨髓瘤细胞和许多其它细胞。一种常见的细菌宿主是，例如，大肠杆菌。抗体或抗原结合片段在原核细胞(诸如大肠杆菌)中的表达在本领域中是非常确定的。关于综述，参见例如 PlUckthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991)。在培养的真核细胞中的表达也是本领域技术人员可利用的(Raff, M. E. (1993) Curr. OpinionBiotech. 4: 573-576; Trill J. J.等人(1995) Curr. Opinion Biotech 6: 553-560)。多种单细胞宿主细胞也可用于表达DNA序列。这些宿主包括众所周知的真核和原核宿主，诸如在组织培养物中的大肠杆菌、假单胞菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属、真菌(诸如酵母)和动物细胞(诸如CH0、YB/20、NS0、SP2/0、R1. 1、B_W和L-M细胞、非洲绿猴肾细胞(例如，COS I、COS 7、BSC1、BSC40和BMT10))、昆虫细胞(例如，Sf9)和人细胞和植物细胞的菌株。应当理解，并非所有载体、表达控制序列和宿主同样好地起表达DNA序列的功能。也并非所有宿主对相同的表达系统同样好地起作用。但是，无需过多实验，本领域技术人员能够选择适当的载体、表达控制序列和宿主，以实现希望的表达，而不脱离本申请的范围。例如，在选择载体时，必须考虑宿主，因为所述载体必须在所述宿主中发挥功能。还会考虑载体的拷贝数、控制该拷贝数的能力以及由所述载体编码的任意其它蛋白(诸如抗生素标志物)的表达。本领域普通技术人员可以选择适当的载体、表达控制序列和宿主，以实现希望的表达，而不脱离本申请的范围。例如，例如，在选择载体时，考虑宿主，因为所述载体必须在所述宿主中发挥功能。还可以考虑载体的拷贝数、控制该拷贝数的能力以及由所述载体编码的任意其它蛋白(诸如抗生素标志物)的表达。本申请也提供了在本文别处所述的质粒、载体、转录或表达盒形式的构建体，它们包括至少一个上述的多核苷酸。可以选择或构建合适的载体，其含有适当的调节序列，包括启动子序列、终止子序列、聚腺苷酸化序列、增强子序列、选择标记和适当的其它序列。载体可以是适当的质粒、病毒载体，例如适当的噬菌体、噬粒等。关于其它细节，参见，例如，Molecular Cloning: a Laboratory Manual:第 2 版，Sambrook 等人，1989，ColdSpring Harbor Laboratory Press。许多已知的核酸操作技术和方法，例如核酸构建体的制备、诱变、测序、将DNA导入细胞中和基因表达以及蛋白的分析，详细描述在=ShortProtocols in Molecular Biology,第 2 版，Ausubel 等人编，John Wiley & Sons, 1992。Sambrook等人和Ausubel等人的方法和公开内容通过引用整体并入本文。在选择表达控制序列时，通常考虑多种因素。这些因素包括，例如，系统的相对强度、它的可控性和它与要表达的特定DNA序列或基因的相容性，特别是在潜在二级结构方面。通过考虑例如它们与选择的载体的相容性、它们的分泌特征、它们的正确折叠蛋白的能力、和它们的发酵需要以及由要表达的DNA序列编码的产物对宿主的毒性和表达产物的纯化容易性，选择合适的单细胞宿主。另一个方面提供了一种宿主细胞，其含有一种或多种本文公开的多核苷酸。另一个方面提供了通过任意可利用的技术将这样的一种或多种多核苷酸导入宿主细胞中的方法。对于真核细胞，合适的技术可以包括，例如，磷酸钙转染、DEAE葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染和使用逆转录病毒或其它病毒(例如，牛痘，或者对于昆虫细胞，杆状病毒)的转导。对于细菌细胞，合适的技术可以包括，例如，氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体的转染。在导入之后，可以造成或允许一个或多个多核苷酸的表达，例如通过在从一个或多个多核苷酸表达一种或多种多肽的条件下培养宿主细胞。可以使用可诱导的系统，并通过加入活化剂来诱导表达。在一个实施方案中，可以将多核苷酸整合进宿主细胞的基因组(例如染色体)中。根据标准技术，通过包含促进与基因组的重组的序列，可以促进整合。在另一个实施方案中，所述核酸维持在宿主细胞中的附加型载体上。本文提供了这样的方法，所述方法包括在表达系统中使用上述的构建体，以便表达特定多肽。考虑到这些和其它因素，本领域技术人员能够构建多种载体/表达控制序列/宿主组合，它们在发酵或大规模动物培养中表达所述DNA序列。除了克隆以外，或作为克隆的替代，可以重组地/合成地制备编码抗体、抗原结合片段或结合蛋白的多核苷酸。可以将多核苷酸设计成具有抗体、抗原结合片段或结合蛋白的适当密码子。一般而言，如果序列要用于表达，可以选择对于目标宿主而言优选的密码子。可以从通过标准方法制备的重叠寡核苷酸装配完整多核苷酸，并装配成完整编码序列。参见，例如，Edge, Nature, 292:756 (1981) ;Nambair等人，Science, 223:1299 (1984)；Jay 等人，J. Biol. Chem. , 259:6311 (1984)。将非天然氨基酸位点特异性地掺入蛋白中的一般方法，参见Christopher J.Noren, Spencer J. Anthony-Cahi11, Michael C. Griffith, Peter G. Schultz,Science, 244:182-188( 1989年4月)。该方法可以用于产生具有非天然氨基酸的类似物。如上所述，除了克隆以外，可以合成地制备编码抗体或其抗原结合片段的DNA序列。可以将所述DNA序列设计成具有抗体或抗原结合片段氨基酸序列的适当密码子。一般而言，如果序列要用于表达，可以选择对于目标宿主而言优选的密码子。可以从通过标准方法制备的重叠寡核苷酸装配完整序列，并装配成完整编码序列。参见，例如，Edge，Nature,292:756 (1981) ;Nambair等人，Science, 223:1299 (1984) Jay等人，J. Biol. Chem., 259:6311 (1984)，它们中的每一篇通过引用整体并入本文。C.免疫原性的计算机分析
如果需要的话，可以评估本文所述的抗体或其抗原结合片段的免疫原性，并根据需要，去免疫化(即通过改变一个或多个T细胞表位,使所述抗体具有更低的免疫反应性)。通过使用软件和专门的数据库，可以分析在本文所述的人源化的抗-内皮因子抗体和抗原结合片段中存在的免疫原性和T-细胞表位。示例性的软件和数据库包括由英格兰的Antitopeof Cambridge开发的iTope 。iTope 是一种用于分析肽与人MHC II类等位基因的结合的计算机技术。所述iTope 软件会预测肽与人MHC II类等位基因的结合，并从而提供这样的“潜在T细胞表位”的位置的初步筛选。iTope "软件会预测肽的氨基酸侧链和34个人MHC II类等位基因的结合槽内的特定结合槽之间的有利相互作用。通过计算机产生9聚体肽(它们重叠一个氨基酸，所述氨基酸跨实验抗体可变区序列)，获取关键结合残基的位置。可以相对于34个MHC II类同种异型中的每一个，测试每个9聚体肽，并基于它们与MHC II类结合槽的潜在“拟合”和相互作用，进行评分。相对于>50%的MHC II类等位基因产生高平均结合评分(在iTope 评分函数中，>0. 55)的肽，被视作潜在T细胞表位。在这样的区域中，分析在MHC II类槽内的肽结合所用的核心9氨基酸序列，以测定MHC II类槽残基(P1、P4、P6、P7和P9 )和可能的T细胞受体(TCR)接触残基(P_1、P2、P3、P5、P8 )。在鉴别任何T-细胞表位以后，可以导入氨基酸残基变化、置换、添加和/或删除，以去除鉴别的T-细胞表位。可以做出这样的变化，从而在仍然去除鉴别的表位的同时，保持抗体结构和功能。示例性的变化可以包括、但不限于保守的氨基酸变化。利用重组MHC分子与合成肽的可溶性复合物的技术，已经得到应用。这些试剂和方法可以用于鉴定人或实验动物受试者的外周血样中能结合特定MHC-肽复合物的T细胞克隆的存在，但是这些试剂和方法不适于筛选各种MHC同种异型的多种潜在表位。T细胞活化的生物学测定，提供了一个解读受试肽/蛋白序列引起免疫应答的能力的实用选择。该类方法的实例包括使用针对细菌蛋白葡萄球菌激酶的T细胞增殖测定，然后用合成肽刺激T细胞系的表位作图。类似地，使用破伤风毒素蛋白的合成肽进行的T细胞增殖试验，已经导致该毒素的免疫显性表位区域的确定。在一个实施方案中，可以如下确定受试蛋白的T-细胞表位利用分离的人免疫细胞子集，促进它们的体外分化，并在合成的目标肽存在下培养细胞，测量培养的T细胞中任何诱导的增殖。也可以使用其它技术。这样的技术包括，小心地应用细胞分离技术和使用多种细胞因子补充物的细胞培养，以得到所需的免疫细胞子集(树突细胞、CD4+和/或CD8+T细胞)。在另一个实施方案中，可以如下确定T细胞表位在抗体中的存在将所述抗体加给分离的人免疫细胞子集，并评估它们的体外分化，测量培养的T细胞中任何诱导的增殖。也可以使用计算机技术来确定多种治疗性蛋白的MHC II类配体。但是，由于诸如需要蛋白水解加工和其它生理步骤(所述步骤导致免疫原性肽体内呈递)等原因，通过基于计算机的方案可定义的整个肽库的子集具有最终的生物学相关性。因而，离体人T-细胞活化试验可以用于确定多肽的蛋白序列中能够支持T细胞活化并因此与该蛋白的免疫原性在生物学上最相关的区域。本文使用的“T-细胞表位”表示这样的氨基酸序列，其能够结合MHC II类、能够刺激T细胞和/或也在与MHC II类的复合物中结合(不必可测得地活化)T细胞。根据本文提供的方法，测试合成肽或整个抗体的引起体外培养的人T细胞产生增殖反应的能力。所述T细胞存在于外周血单核细胞(PBMC)层内，后者易于通过熟知的方法 从全血样本获得。此外，所述PBMC制备物含有生理比例的T细胞和抗原呈递细胞，并因此是在体外进行替代免疫反应的良好材料来源。在这样的试验的操作中，靠近2. 0或大于2. 0的刺激指数是诱导的增殖的一个有用的度量。但是，刺激指数可能随抗体或其抗原结合片段而异，且可以参照每种抗体或其抗原结合片段和对应的肽文库的基线来建立。在这样的测试的一个实施例中，可以常规地如下衍生出刺激指数(SI):将所测定的针对受试肽的增殖分值(例如，如果使用例如3H-胸苷掺入，每分钟的放射性计数)除以在未与受试肽接触的细胞中测得的分值。不引起反应的肽可能产生SI = 1.0，而在0.8-1. 2的范围内的SI值也可能是常见的。为了确保所记录分值的可信性，可将许多技术方法结合入此类试验的操作中。通常，所有的测定均至少一式三份地进行，并计算平均分值。如果所计算的SI =>
2.0，则可对三份中的单个分值检查偏离数据的证据。使受试肽以至少两种不同的浓度与细胞接触，并且所述浓度之间一般最少有两倍浓度差异。这样的浓度范围会提供所述试验的动力学范围的偏置，并且在单个时间点(例如在第7天)测定时可能是有用的。在一些试验中，可进行多时程测定，也可以使用在最少两种不同的浓度提供的肽免疫原进行这些测定。同样，在每个试验板中可包括对照肽，其中所述对照肽预期对大多数PBMC供体样本为反应性的。流感血细胞凝集素肽307-319序列PKYVKQNTLKLA (SEQ ID NO: 104)和衣原体HSP60肽序列KVVDQIKKISKPVQH (SEQ ID NO: 105)是用于这样的试验中的对照肽的实例。替代地，或额外地，所述试验也可以使用有效的完整蛋白抗原如来自Keyhole Limpet的血蓝蛋白，预期所有的PBMC样本对所述抗原会显示明显大于2. 0的SI。用于这样的用途的其它对照抗原是本领域众所周知的。本文公开的方法可以提供抗体或其抗原结合片段的表位图谱，其中所述图谱与可能的MHC同种异型的宽范围相关。所述图谱可以具有足够的代表性，使得可以设计或选择经修饰的蛋白，对于可能施用所述蛋白的患者中的大多数而言，所述蛋白的引起T细胞驱动的免疫应答的能力消失或至少改善。改善可以表示，与未修饰的蛋白相比，免疫应答减少(即，减少的免疫原性)(例如减少了约I. 5倍、减少了约2倍、减少了约5倍、减少了约10倍、减少了约20倍、减少了约50倍、减少了约100倍、减少了约200倍、减少了约500倍或更多，或它们中的任意范围)。或者，具有减少的免疫原性的抗体或其抗原结合片段可以表示，与未修饰的蛋白相比，它的引起免疫应答的能力的减少百分比(例如减少了约1%、减少了约2%、减少了约3%、减少了约4%、减少了约5%、减少了约10%、减少了约20%、减少了约50%、减少了约100%和它们中的任意范围)因此，在筛选方法的实践中，从具有足够免疫多样性的供体库中收集来自原初供体PBMC衍生的T细胞，以提供在人群中至少大于90%的MHC II类库(HLA-DR)的样本。如果欲对给定的合成肽(或抗体)检测原初T细胞应答，在实践中使该肽(或抗体)与源自多个分别供体的PBMC制品接触；对于实践目的而言，供体的数量(或“供体库”大小)不可能小于20个不相关个体，并且供体库中的所有样本根据它们的MHC II类单倍型进行预选择。本文使用的术语“原初供体”表示以前没有暴露(无论是在环境中、通过疫苗接种，还是通过其它方式，例如，输血)于本文所述的抗体或其抗原结合片段的受试者。
当筛选T-细胞表位时，可以从外周血样本获得T细胞，所述外周血样本来自没有接受所述蛋白治疗的多个不同健康供体。如果需要的话，使用常规试验(诸如ELISA，其使用抗体来鉴别一种或多种多肽的存在与否)，可以测试患者血液样品中特定多肽的存在。所述试验使用体外培养的PBMC来进行，其中使用本领域已知的常规方法，并包括，使PBMC与目标蛋白的代表性的合成肽物质(即文库)或整个蛋白(诸如抗体)接触，在合适的温育时间后，测量诱导的T细胞活化，诸如细胞增殖。测定可以通过任意合适的方法来进行，并且可以例如使用H3-胸苷掺入来进行，由此易于通过实验室仪器测定H3在细胞物质中的积累。与在未处理的PBMC样本中看到的相应值相比，可以检查PBMC样品和合成肽的每种组合或整个蛋白的细胞增殖程度。也可参照在用预期具有增殖作用的一种或多种肽或整个蛋白处理以后所看到的增殖反应。关于此，有利地使用具有已知的宽MHC限制性的肽或整个蛋白，尤其是对DP或DQ同种型具有MHC限制的肽表位，尽管本发明不限于这样的限制的肽或蛋白的应用。在上面，例如关于流感血细胞凝集素和衣原体HSP60，已经描述了这样的肽。在一个非限制性实施例中，使用本文所述的方法，绘制T-细胞表位的图谱，并随后修改。为了促进表位图谱的组装，生产了合成肽的文库。每个肽的长度为15个氨基酸残基，且每个与该系列中的下一个肽重叠12个氨基酸残基，即在该系列中的每个连续肽渐增地添加另外3个氨基酸用于分析。以此方式，肽的任一特定相邻对会反映连续序列的18个氨基酸。在下面的实施例I中例证了使用原初T细胞试验确定T-细胞图谱的一种方法。据提示，通过确定T-细胞图谱的方法鉴别出的每种肽能够结合MHC II类，并以足够的亲和力与至少一种同源TCR结合，从而引起在试验系统中可检测到的增殖爆发。在另一个非限制性实施例中，评估加工抗体以产生T-细胞表位的可能性，所述生T-细胞表位能够结合MHC II类，并以足够的亲和力与至少一种同源TCR结合，从而引起在试验系统中可检测到的增殖爆发。以多种方法中的任一种，包括使用重组方法，可以制备本文所述的分子。本文提供的蛋白序列和信息可以用于推论编码氨基酸序列的多核苷酸(DNA)。这可以例如使用计算机软件工具(诸如DNAtar软件套件[DNAtar Inc, Madison, Wis., USA]或类似的工具)来实现。在本文中预见到编码多肽或重要的同系物、变体、截短、延长或它们的进一步修饰的任意这样的多核苷酸。本文提供了绘制T-细胞表位的图谱(鉴别T-细胞表位)的方法，和修饰所述表位使得被修饰的序列减少(部分地或完全地)T-辅助应答的诱导的方法。修饰包括，在编码修饰的多肽的多核苷酸的密码子中产生的氨基酸置换、删除或插入，以影响类似的变化。编码氨基酸残基的密码子是本领域众所周知的。可能使用重组DNA方法来实现靶序列的定向诱变，许多这样的技术是可得到的、描述在本文中和本领域已知的，诸如描述在上面。一般而言，定位诱变技术是众所周知的。简而言之，采用噬菌体载体，其产生用于寡核苷酸指导的PCR诱变的单链模板。噬菌体载体(例如M13)是可商业得到的，它们的应用通常是本领域众所周知的。类似地，双链质粒也常规地用于定位诱变中，这会消除将目标多核苷酸从噬菌体转移至质粒的步骤。可以使用携带希望的突变序列的合成寡核苷酸引物来指导从该模板体外合成修饰的(希望的突变体)DNA,并使用异源双链体DNA来转化感受态大肠杆菌，用于生长选择和所需克隆的鉴别。或者，可以在PCR反应使一对引物与双链载体的2条单独的链对合，以同时合成具有希望的突变的两条对应互补链。在一个实施方案中，可以采用Quick Change定位诱变方法,该方法使用质粒DNA模板。使用含有希望的突变的2种合成寡核苷酸引物，可以实现含有插入片段的插入靶基因的质粒模板的PCR扩增。通过诱变级PfuTurbo DNA聚合酶，在温度循环中延长寡核苷酸引物，每种引物与载体的相反链互补。寡核苷酸引物掺入以后，制备含有交错切口的突变质粒。用Dpn I处理扩增的未甲基化的产物，以消化甲基化的亲代DNA模板，并选择用于含有突变的新合成的DNA。由于从大多数大肠杆菌菌株分离出的DNA被dam甲基化，它对Dpn I消化是敏感的，所述Dpn I对甲基化的和半甲基化的DNA是特异性的。将反应产物转化进大肠杆菌的高效率菌株中，以得到含有希望的修饰的质粒。用于将氨基酸修饰导入多肽中的其它方法是本领域众所周知的，且也可以用于本文中。对所述蛋白的合适修饰可包括，特定残基或残基组合的氨基酸置换。为了消除T-细胞表位，在所预测的氨基酸序列内的合适位点或氨基酸残基处进行氨基酸置换，以实现T-细胞表位活性的减小或消除。在实践中，合适的位点或氨基酸残基优选地等同于在MHC II类结合槽内所提供的口袋之一内结合的氨基酸残基。这样的修饰可能改变在所述肽的所谓的“P1”或“P1锚”位置处在裂缝的第一口袋内的结合。肽的Pl锚残基和MHC II类结合槽的第一口袋之间的结合相互作用的质量，被公认为整个肽的总结合亲和力的主要 决定因素。在氨基酸序列的该位置的适当置换，通常会掺入不易容纳到所述口袋中的氨基酸残基(例如，置换为更亲水的残基)。所述肽中处于如下位置的氨基酸残基也被考虑到并落入本发明的范围内所述位置为与在MHC结合裂缝内的其它口袋区域结合的位置。应当理解，在给定的潜在T-细胞表位内的单个氨基酸修饰代表可以用于消除一个或多个T-细胞表位的途径。可以预见到在单个表位内的修饰组合，且在单独定义的表位彼此重叠的情况下，可能是适当的。此外，氨基酸修饰(在给定的表位内单独地，或在单个表位内组合地)可以发生在非对应于MHC II类结合槽的“口袋残基”的位置，而是在所述氨基酸序列内的任意位点处。基于所述多肽的已知结构特征，参照使用本领域已知且在本文中描述的计算机技术产生的同源结构或结构方法，可以做出修饰。可以考虑恢复变体分子的结构或生物活性的改变(修饰)。此类补偿性改变还可以包括对多肽中的特定氨基酸残基的删除或添加(插入)。另外，可以做出这样的修饰，所述修饰改变分子的结构和/或降低分子的生物活性，并也消除T-细胞表位，从而减少分子的免疫原性。在本文中预见到所有类型的修饰。
从蛋白分子中去除表位的另一种方法是，协同使用本文描绘的原初T细胞活化试验方案以及根据在WO 02/069232 (它也通过引用全部并入本文中)中描述的方案开发出的计算机工具。该软件在多肽-MHC II类结合相互作用水平上模拟抗原呈递过程，以提供对任一特定多肽序列的结合分值。对在人群中存在的许多主要MHC II类同种异型，测定这样的分值。由于该方案能够测试任意多肽序列，可以在多肽与MHC II类结合槽相互作用的能力方面预测氨基酸置换、添加或删除的后果。由此，可以设计这样的新序列组合物，其含有减少数目的能够与MHC II类相互作用并从而作为免疫原性的T-细胞表位发挥作用的氨基酸。在使用任一种给定供体样本的生物试验可以评估与最多4种DR同种异型的结合的情况下，计算机方法可同时使用超过40种同种异型测试相同的多肽序列。在实践中，该方案能够指导新序列变体的设计，所述新序列变体在与多种MHC同种异型相互作用的能力方面有所改变。本领域技术人员清楚置换的多种备选集合可达到去除不需要的表位的目的。但是，认为所得到的序列与本文公开的具体组合物密切同源，并因此落入本申请的范围。关于表位作图和使用基于生物学的T细胞活化试验任选地重新测试，使用用于鉴 别MHC II类配体的计算机工具和缺乏MHC II类配体的序列类似物的设计的组合方案，是本申请的另一种方法和实施方案。根据该实施方案的一般方法包括以下步骤
i)使用原初T细胞活化试验和合成肽(它们合起来包括目标蛋白序列)，鉴别能够活化T细胞的表位区域；
ii)使用模拟肽配体与一种或多种MHC同种异型结合的计算方案，分析在步骤(i)中鉴别出的表位区域，并从而鉴别在表位区域内的MHC II类配体；
iii)使用模拟肽配体与一种或多种MHC同种异型结合的计算方案，鉴别在表位区中所包含的MHC配体的序列类似物，所述序列类似物不再结合MHC II类或以降低的亲和力结合更少数目的MHC同种异型；和任选地，
iv)使用原初T细胞活化试验和合成肽(它们全部或合起来包含在目标蛋白中鉴别的表位区)，并在原初T细胞活化试验中与野生型(亲本)序列平行地测试所述序列类似物。在一个实施方案中，制备修饰的抗体或其抗原结合片段(与未修饰的抗体或其抗原结合片段相比，其表现出降低的免疫原性)的方法包括在抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列内，鉴别出至少一个T-细胞表位，并修饰在至少一个鉴别出的T-细胞表位内的至少一个氨基酸残基。在另一个实施方案中，通过下述方法，生产修饰的抗体或其抗原结合片段(与未修饰的抗体或其抗原结合片段相比，其表现出降低的免疫原性)，所述方法包括在抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列内，鉴别出至少一个T-细胞表位，并修饰在至少一个鉴别出的T-细胞表位内的至少一个氨基酸残基。在另一个实施方案中，选择修饰的抗体或其抗原结合片段(与未修饰的抗体或其抗原结合片段相比，其表现出降低的免疫原性)的方法包括在抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列内，鉴别出至少一个T-细胞表位，修饰在至少一个鉴别出的T-细胞表位内的至少一个氨基酸残基，并选择修饰的抗体或其抗原结合片段，其与未修饰的抗体或其抗原结合片段相比表现出降低的免疫原性。通过表位区域，可以进一步表征本文所述的T-细胞表位。这样的区域包括表位核心、N-端和C-端。本文使用的“表位核心”表示，T-细胞表位的核心9-聚体氨基酸序列。所述表位核心可以另外包括在N-端和/或C-端上邻近所述核心9-聚体氨基酸序列的O、1、2或3个氨基酸残基。因而，在某些实施方案中，所述表位核心的长度范围可以是约9个氨基酸至约15个氨基酸。本文使用的“N-端”表示，邻近表位核心的N-端的氨基酸，且包括邻近表位核心的N-端并在其上游的至少1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。本文使用的“C-端”表示邻近表位核心的C-端的氨基酸，且包括邻近表位核心的C-端并在其下游的至少1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。在一个实施方案中，修饰的抗体或其抗原结合片段含有I个或多个修饰。
在一个实施方案中，修饰的抗体或其抗原结合片段含有2个修饰。在一个实施方案中，修饰的抗体或其抗原结合片段含有3个修饰。在一个实施方案中，修饰的抗体或其抗原结合片段含有4个修饰。在一个实施方案中，修饰的抗体或其抗原结合片段含有5个修饰。在一个实施方案中，修饰的抗体或其抗原结合片段含有6个修饰。在一个实施方案中，修饰的抗体或其抗原结合片段含有7个修饰。在一个实施方案中，修饰的抗体或其抗原结合片段含有8个修饰。在一个实施方案中，修饰的抗体或其抗原结合片段含有9个修饰。在一个实施方案中，修饰的抗体或其抗原结合片段含有10个修饰。在一个实施方案中，修饰的抗体或其抗原结合片段含有最多20个修饰。本文提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包含具有如SEQ ID NO: 93所示的氨基酸序列的轻链可变区(VKlAA)和具有如SEQ ID NO: 89所示的氨基酸序列的重链可变区(VH1A2)。本文提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包含具有如SEQ ID NO: 88、89、90、91和92中的任一个所示的氨基酸序列的重链可变区。本文提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包含具有如SEQ ID NO: 93、94、95、
96、97、100、102和103中的任一个所示的氨基酸序列的轻链可变区。本文提供了一种结合内皮因子的抗体或其抗原结合片段，其包含具有如SEQ IDNO: 89所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 93所示的氨基酸序列的轻链可变区，其中
(i )所述重链可变区另外包含一个或多个选自下述的修饰用丙氨酸(A)或丝氨酸(S)置换在位置49处的甘氨酸(G);用异亮氨酸(I)置换在位置51处的丙氨酸(A);用精氨酸(R)或天冬酰胺(Q)置换在位置52b处的赖氨酸(K);用缬氨酸(V)置换在位置78处的亮氨酸(L),其中使用Kabat编号系统；和
(ii)所述轻链可变区另外包含一个或多个选自下述的修饰用亮氨酸(L)置换在位置4处的甲硫氨酸(M);用缬氨酸(V)置换在位置19处的丙氨酸(A);用丝氨酸(S)置换在位置22处的苏氨酸(T);用异亮氨酸(I)置换在位置48处的丙氨酸(A);和用丝氨酸(S)置换在位置51处的苏氨酸(T)，其中使用Kabat编号系统。本文提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包含具有如SEQ ID NO: 88、89、90、91和92所示的氨基酸序列的重链可变区；和具有如SEQ ID NO: 93、95、96、97、100、102或103所示的氨基酸序列的轻链可变区。
除了前述的实施例和实施方案以外，在本文中预见到修饰的抗体或其抗原结合片段，其具有在ー个或多个T-细胞表位中的一个或多个氨基酸修饰。在一个非限制性实施例中，本文提供了抗体或其抗原结合片段，其具有在至少ー个T-细胞表位中的至少ー个修饰。在另ー个非限制性实施例中，本文提供了抗体或其抗原结合片段，其具有在1、2、3、4、5、6或7个本文所述的T-细胞表位的中的至少ー个氨基酸修饰。其它非限制性实施例这样的抗体或其抗原结合片段，其具有在超过ー个T-细胞表位中的超过ー个氨基酸修饰。在本文中预见到在任意数目的上述抗体或其抗原结合片段、T-细胞表位中的氨基酸修饰的任意组合。
T-细朐表位和同种异型频率
在抗原内发现的单个表位可以优选地由特定MHC II类同种异型来呈现，类似地，在相同抗原内的其它特定表位根本不可能呈现在MHC II类分子上。已经证实，特定表位与特定MCH II类分子的这种关联依赖于个体的MHC II类同种异型。当修饰抗体或其抗原结合片段(为了去除T-细胞表位)时，也可以考虑特定表位与特定同种异型的关联。对于特定同种异型(例如，对于具有某些MHC II类同种异型的特定受试者群体)，这样的考虑可以实现抗体或其抗原结合片段的高度特异性的修饰。通过本领域已知的基因分型方法，可以容易地确定一位或多位受试者的MHC II类同种异型，从而容易地鉴别T-细胞表位与给定同种异型的关联，用于在抗体或其抗原结合片段的修饰中进行考虑，定制为该同种异型。在下面的实施例中，更详细地描述了 T-细胞表位和MHC II类同种异型之间的关联的鉴别。在本文中预见到修饰的抗体或其抗原结合片段，其具有T-细胞表位修饰，所述修饰定制为关于特定表位所鉴别出的MHC II类关联。D.杭-内皮因子抗体
通过本领域技术人员已知的多种方法，包括、例如，重组和化学合成，可以实现编码FR和/或CDR的所有核酸和所有选择的氨基酸位置变化的同时掺入。例如，同时掺入可以如下实现例如，化学地合成受体可变区的核苷酸序列，与编码供体CDR的核酸融合到一起，并将许多对应的氨基酸密码子掺入在选择出的用于携带可变氨基酸残基的位置处。本文提供了结合内皮因子的抗体和其抗原结合片段。也提供了这样的抗体和其抗原结合片段，它们结合内皮因子，并抑制(部分地或完全地)或控制/治疗(部分地或完全地)血管生成/新生血管形成、小血管膨胀和/或与过度血管生成有关的疾病。类似地，在抑制或结合内皮因子的含义内，也包括抑制内皮因子功能(例如，信号传递、结合、活化等)。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段通过结合内皮因子来抑制血管生成。本申请也提供了可以用于生产抗体的细胞系、用于生产所述细胞系的方法、用于表达抗体或其抗原结合片段和纯化它们的方法。可以认识到，使用常规方法(包括，但不限于ELISA)，使用本文提供的或本领域已知的试验，可以测试使用本文所述方法制备的特异性地结合内皮因子的抗体和其抗原结合片段的结合内皮因子的能力。使用常规方法，包括但不限于Biacore或表面等离子体共振，也可以测定本文所述抗体的亲和カ。通过人源化TRC105抗体的Vh和ん序列，构建出本文所述的抗体及其抗原结合片段。为了实现该人源化，建立并分析了 TRC105的Vh和ん链的三维模型。然后将Vh和^序列单个地与人种系序列数据库相对比，基于它们与TRC105的Vh和ん序列的同源性，从所述数据库中选出人Vh和^序列。为人源化选出的人^序列是02/012 (VK1-39) (SEQ IDNO. 2)。02/012与TRC105具有65%的序列同一性，所述基因在人种系所有组成部分中高度表达。为人源化选出的人Vh序列是VH3-15(SEQ ID NO. 40)。VH3-15与TRC105具有70%的序列同一性，并以合理的频率在人种系所有组成部分中表达。在TRC105的三维模型中，检查在TRC105和人序列之间不同的氨基酸位置，以确定考虑将哪个置换用于修饰。基于三维模型分析的氨基酸选择标准包括、但不限于，例如，与氨基酸有关的空间效应、氨基酸的相关电荷和氨基酸在可变重链和/或轻链内的位置。将为人框架区鉴别和提议的置换掺入02和VH3-15人框架区中，并将TRC105的CDR移植进对应的02和VH3-15人框架区中，得到许多人源化抗体或其抗原结合片段。另外，轻链的FR-4源自人J种系序列Jk4。类似地，重链的FR-4源自人J种系序列JH4。本文描述了结合内皮因子的人源化抗体和抗原结合片段。也本文描述了结合内皮因子并抑制血管生成的人源化抗体和抗原结合片段。如上所述制备本文所述的抗体和抗原结合片段。抗体和其抗原结合片段可以具有可变重(Vh)链、可变轻(\)链、二者或其结合部 列或其结合部分。这样的Vh链可以具有如SEQ ID NO: 44-62中的任一个所示的框架区序列。在另ー个实施方案中，所述ん链具有如SEQ ID NO: 3-5中的任一个所示的氨基酸序列或其结合部分。这样的ん链可以具有如SEQ ID NO: 6-38中的任一个所示的框架区序列。本文提供了ー种抗体或其抗原结合片段，其包含具有如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的轻链可变区和具有如SEQ ID NO: 41所示的氨基酸序列的重链可变区。本文提供了ー种抗体或其抗原结合片段，其包含具有如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的轻链可变区和具有如SEQ ID NO: 41所示的氨基酸序列的重链可变区，其中所述重链可变区另外包含ー个或多个选自下述的修饰用丙氨酸(A)置换在位置49处的甘氨酸(G);用丝氨酸(S)置换在位置76处的天冬酰胺(N);用精氨酸(R)置换在位置77处的苏氨酸(T);用缬氨酸(V)置换在位置78处的亮氨酸(L);用异亮氨酸(I)置换在位置82a处的天冬酰胺(N);用异亮氨酸(I)或亮氨酸(L)置换在位置89处的缬氨酸(V);用精氨酸(R)或甘氨酸(G)置换在位置94处的苏氨酸(T);用苏氨酸(T)置换在位置108处的亮氨酸(U;用亮氨酸(L)置换在位置109处的缬氨酸(V);和用丙氨酸(A)置换在位置113处的丝氨酸(S)，其中使用Kabat编号系统；且所述轻链可变区另外包含一个或多个选自下述的修饰用谷氨酰胺(Q)置换在位置I处的天冬氨酸(D);用缬氨酸(V)置换在位置3处的谷氨酰胺(Q);用亮氨酸(L)置换在位置4处的甲硫氨酸(M);用丝氨酸(S)置换在位置5处的苏氨酸(T);用苯丙氨酸(F)置换在位置36处的酪氨酸(Y);用脯氨酸(P)置换在位置46处的亮氨酸(L);用色氨酸(W)置换在位置47处的亮氨酸(L);用缬氨酸(V)或丙氨酸(A)置换在位置60处的丝氨酸(S);用丝氨酸(S)置换在位置70处的天冬氨酸(D);用酪氨酸(Y)置换在位置71处的苯丙氨酸(F);用丙氨酸(A)置换在位置100处的谷氨酰胺(G);和用亮氨酸(L)置换在位置106处的异亮氨酸(I)，其中使用Kabat编号系统。本文提供了一种结合内皮因子的抗体或其抗原结合片段，其包含具有如SEQ IDNO: 41、42或43所示的氨基酸序列的重链可变区；和具有如SEQ ID NO: 3、4或5所示的氨基酸序列的轻链可变区。ー种抗体或其抗原结合片段可以包含具有如SEQ ID NO: 41所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的轻链可变区。ー种抗体或其抗原结合片段可以包含具有如SEQ ID NO: 41所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列的轻链可变区。ー种抗体或其抗原结合片段可以包含具有如SEQ ID NO: 41所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的轻链可变区。ー种抗体或其抗原结合片段可以包含具有如SEQ IDNO: 42所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的轻链可变区。ー种抗体或其抗原结合片段可以包含具有如SEQ ID NO: 42所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列的轻链可变区。ー种抗体或其抗原结合片段可以包含具有如SEQ ID NO: 42所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQID NO: 5所示的氨基酸序列的轻链可变区。ー种抗体或其抗原结合片段可以包含具有如SEQ ID NO: 43所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的轻链可变区。ー种抗体或其抗原结合片段可以包含具有如SEQ ID NO: 43所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列的轻链可变区。ー种抗体或其抗原结合片段可以包含具有如SEQ ID NO: 43所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列的轻链可变区。这样的抗体可以结合内皮因子和抑 制血管生成。在任一个这样的实施方案中，所述重链可变区可以另外包含ー个或多个选自下述的修饰用丝氨酸(S)置换在位置76处的天冬酰胺(N);用精氨酸(R)置换在位置77处的苏氨酸(T);用异亮氨酸(I)置换在位置82a处的天冬酰胺(N);用异亮氨酸(I)或亮氨酸(L)置换在位置89处的缬氨酸(V);用甘氨酸(G)置换在位置94处的苏氨酸(T);用苏氨酸(T)置换在位置108处的亮氨酸(L);用亮氨酸(L)置换在位置109处的缬氨酸(V);和用丙氨酸(A)置換在位置113处的丝氨酸(S);且所述轻链可变区可以另外包含ー个或多个选自下述的修饰用谷氨酰胺(Q)置换在位置I处的天冬氨酸(D);用缬氨酸(V)置换在位置3处的谷氨酰胺(Q);用丝氨酸(S)置换在位置5处的苏氨酸(T);用苯丙氨酸(F)置换在位置36处的酪氨酸(Y);用缬氨酸(V)或丙氨酸(A)置换在位置60处的丝氨酸(S);用丝氨酸(S)置换在位置70处的天冬氨酸(D);用丙氨酸(A)置换在位置100处的甘氨酸(G);和用亮氨酸(L)置换在位置106处的异亮氨酸(I)，其中使用Kabat编号系统。本文提供了一种结合内皮因子的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含
(i)SEQ ID NO: 66 的 CDRl、SEQ ID NO: 67 的 CDR2 和 SEQ ID NO: 68 的 CDR3 ；
(ii)重链FRl，其具有SEQID NO: 44的氨基酸序列或包含ー个或多个保守置换的SEQID NO: 44的氨基酸序列；
(iii)重链FR2，其具有SEQID NO: 45的氨基酸序列或包含丙氨酸(A)对位置49处的甘氨酸(G)的置換的SEQ ID NO: 45的氨基酸序列，其中使用Kabat编号系统；和
(iv)重链FR3，其具有SEQID NO: 47的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 47的氨基酸序列
Ca)用丝氨酸(S)置换在位置76处的天冬酰胺(N)；
(b)用精氨酸(R)置换在位置77处的苏氨酸(T)；
(c)用缬氨酸(V)置换在位置78处的亮氨酸(L)；(d)用异亮氨酸(I)置换在位置82a处的天冬酰胺(N)；
Ce)用异亮氨酸(I)或亮氨酸(L)置换在位置89处的缬氨酸(V);和(f)用精氨酸(R)或甘氨酸(G)置换在位置94处的苏氨酸(T)，其中使用Kabat编号系统；和
(V)重链FR4，其具有SEQ ID NO: 56 的氨基酸序列或包含ー个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 56的氨基酸序列
Ca)用苏氨酸(T)置换在位置108处的亮氨酸(L)；
(b)用亮氨酸(L)置换在位置109处的缬氨酸(V);和
(C)用丙氨酸(A)置换在位置113处的丝氨酸(S)，其中使用Kabat编号系
统；
且所述轻链可变区包含
(i)SEQ ID NO: 63 的 CDRl、SEQ ID NO: 64 的 CDR2 和 SEQ ID NO: 65 的 CDR3 ；
(ii)轻链FRl，其具有SEQID NO: 6的氨基酸序列或包含ー个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 6的氨基酸序列
Ca)用谷氨酰胺(Q)置换在位置I处的天冬氨酸(D)；
(b)用缬氨酸(V)置换在位置3处的谷氨酰胺(Q)；
(c)用亮氨酸(L)置换在位置4处的甲硫氨酸(M);和
(d)用丝氨酸(S)置换在位置5处的苏氨酸(T);其中使用Kabat编号系统；
和
(iii)轻链FR2，其具有SEQID NO: 20的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 20的氨基酸序列
Ca)用苯丙氨酸(F)置换在位置36处的酪氨酸(Y)；
(b)用脯氨酸(P)置换在位置46处的亮氨酸(L);和(C)用色氨酸(W)置换在位置47处的亮氨酸(L),其中使用Kabat编号系
统；和
(iv)轻链FR3，其具有SEQID NO: 28的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 28的氨基酸序列
Ca)用缬氨酸(V)或丙氨酸(A)置换在位置60处的丝氨酸(S)；
(b)用丝氨酸(S)置换在位置70处的天冬氨酸(D);和
(b)用酪氨酸(Y)置换在位置71处的苯丙氨酸(F)，其中使用Kabat编号系
统；和
(V)轻链FR4，其具有SEQ ID NO: 35的氨基酸序列或包含ー个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 35的氨基酸序列
Ca)用丙氨酸(A)置换在位置100处的甘氨酸(G);和
(b)用亮氨酸(L)置换在位置106处的异亮氨酸(I)，其中使用Kabat编号系统。本文提供的抗体或其抗原结合片段可以包含具有在SEQ ID NO: 66中所示的氨基酸序列的重链可变区⑶R1、具有在SEQ ID NO: 67中所示的氨基酸序列的重链可变区⑶R2、具有在SEQ ID NO: 68中所示的氨基酸序列的重链可变区⑶R3、具有在SEQ ID NO:63中所示的氨基酸序列的轻链可变区CDR1、具有在SEQ ID NO: 64中所示的氨基酸序列的轻链可变区⑶R2和具有在SEQ ID NO: 65中所示的氨基酸序列的轻链可变区⑶R3。在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段结合内皮因子，并包含具有在SEQ ID NO: 44中所示的氨基酸序列的重链可变区FR1、具有在SEQ ID NO: 45中所示的氨基酸序列的重链可变区FR2、具有在SEQ ID NO: 47中所示的氨基酸序列的重链可变区FR3、具有在SEQ ID NO: 56中所示的氨基酸序列的重链可变区FR4。在另ー个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段结合内皮因子，并包含具有在SEQ ID NO: 44中所示的氨基酸序列的重链可变区FR1、具有在SEQ ID NO: 46中所示的氨基酸序列的重链可变区FR2、具有在SEQ ID NO: 48中所示的氨基酸序列的重链可变区FR3、具有在SEQ ID NO: 56中所示的氨基酸序列的重链可变区FR4。
·
在另ー个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含具有在SEQ ID NO: 6中所示的氨基酸序列的轻链可变区FR1、具有在SEQ ID NO: 20中所示的氨基酸序列的轻链可变区FR2、具有在SEQ ID NO: 28中所示的氨基酸序列的轻链可变区FR3和具有在SEQ IDNO: 35中所示的氨基酸序列的轻链可变区FR4。在另ー个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段结合内皮因子，并包含具有在SEQ ID NO: 6中所示的氨基酸序列的轻链可变区FR1、具有在SEQ ID NO: 21中所示的氨基酸序列的轻链可变区FR2、具有在SEQ ID NO: 29中所示的氨基酸序列的轻链可变区FR3和具有在SEQ ID NO: 35中所示的氨基酸序列的轻链可变区FR4。在另ー个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段结合内皮因子，并包含具有在SEQ ID NO: 7中所示的氨基酸序列的轻链可变区FR1、具有在SEQ ID NO: 21中所示的氨基酸序列的轻链可变区FR2、具有在SEQ ID NO: 29中所示的氨基酸序列的轻链可变区FR3和具有在SEQ ID NO: 35中所示的氨基酸序列的轻链可变区FR4。本文提供了ー种抗体或其抗原结合片段，其包含具有如SEQ ID NO: 42所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列的轻链可变区。本文提供了一种结合内皮因子的抗体或其抗原结合片段，其包含具有如SEQ IDNO: 4所示的氨基酸序列的轻链可变区和具有如SEQ ID NO: 42所示的氨基酸序列的重链可变区，其中，所述重链可变区另外包含ー个或多个选自下述的修饰用丙氨酸(A)置換在位置49处的甘氨酸(G);用丝氨酸(S)置换在位置76处的天冬酰胺(N);用精氨酸(R)置换在位置77处的苏氨酸(T);用缬氨酸(V)置换在位置78处的亮氨酸(L);用异亮氨酸(I)置换在位置82a处的天冬酰胺(N);用异亮氨酸(I)或亮氨酸(L)置换在位置89处的缬氨酸(V);用苏氨酸(T)或甘氨酸(G)置换在位置94处的精氨酸(R);用苏氨酸(T)置换在位置108处的亮氨酸(L);用亮氨酸(L)置换在位置109处的缬氨酸(V);和用丙氨酸(A)置换在位置113处的丝氨酸(S)，其中使用Kabat编号系统；且所述轻链可变区另外包含一个或多个选自下述的修饰用谷氨酰胺(Q)置换在位置I处的天冬氨酸(D);用缬氨酸(V)置换在位置3处的谷氨酰胺(Q);用亮氨酸(L)置换在位置4处的甲硫氨酸(M);用丝氨酸(S)置换在位置5处的苏氨酸(T);用苯丙氨酸(F)置换在位置36处的酪氨酸(Y);用亮氨酸(L)置换在位置46处的脯氨酸(P);用亮氨酸(L)置换在位置47处的色氨酸(W);用缬氨酸(V)或丙氨酸(A)置换在位置60处的丝氨酸(S);用丝氨酸(S)置换在位置70处的天冬氨酸(D);用苯丙氨酸(F)置换在位置71处的酪氨酸(Y);用丙氨酸(A)置换在位置100处的谷氨酰胺(G);和用亮氨酸(L)置换在位置106处的异亮氨酸(I),其中使用Kabat编号系统。本文提供了一种结合内皮因子的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，
其中所述重链可变区包含
(i)SEQ ID NO: 66 的 CDRl、SEQ ID NO: 67 的 CDR2 和 SEQ ID NO: 68 的 CDR3 ；
(ii)重链FRl，其具有SEQID NO: 44的氨基酸序列或包含一个或多个保守置换的SEQID NO: 44的氨基酸序列；
(iii)重链FR2，其具有SEQID NO: 45的氨基酸序列或包含丙氨酸(A)对位置49处的甘氨酸(G)的置换的SEQ ID NO: 45的氨基酸序列，其中使用Kabat编号系统；和
(iv)重链FR3，其具有SEQID NO: 47的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置 换的SEQ ID NO: 47的氨基酸序列
Ca)用丝氨酸(S)置换在位置76处的天冬酰胺(N)；
(b)用精氨酸(R)置换在位置77处的苏氨酸(T)；
(c)用缬氨酸(V)置换在位置78处的亮氨酸(L)；
Cd)用异亮氨酸(I)置换在位置82a处的天冬酰胺(N)；
Ce)用异亮氨酸(I)或亮氨酸(L)置换在位置89处的缬氨酸(V);和(f)用苏氨酸(T)或甘氨酸(G)置换在位置94处的精氨酸(R)，其中使用Kabat编号系统；和
(V)重链FR4，其具有SEQ ID NO: 56的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 56的氨基酸序列
Ca)用苏氨酸(T)置换在位置108处的亮氨酸(L)；
(b)用亮氨酸(L)置换在位置109处的缬氨酸(V);和
(C)用丙氨酸(A)置换在位置113处的丝氨酸(S)，其中使用Kabat编号系
统；
且所述轻链可变区包含
(i)SEQ ID NO: 63 的 CDRl、SEQ ID NO: 64 的 CDR2 和 SEQ ID NO: 65 的 CDR3 ；
(ii)轻链FRl，其具有SEQID NO: 6的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 6的氨基酸序列
Ca)用谷氨酰胺(Q)置换在位置I处的天冬氨酸(D)；
(b)用缬氨酸(V)置换在位置3处的谷氨酰胺(Q)；
(c)用亮氨酸(L)置换在位置4处的甲硫氨酸(M);和
(d)用丝氨酸(S)置换在位置5处的苏氨酸(T);其中使用Kabat编号系统；
和
(iii)轻链FR2，其具有SEQID NO: 21的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 20的氨基酸序列
Ca)用苯丙氨酸(F)置换在位置36处的酪氨酸(Y)；
(b)用亮氨酸(L)置换在位置46处的脯氨酸(P);和(C)用亮氨酸(L)置换在位置47处的色氨酸(W),其中使用Kabat编号系
统；和(iv)轻链FR3，其具有SEQ ID NO: 29的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 28的氨基酸序列
Ca)用缬氨酸(V)或丙氨酸(A)置换在位置60处的丝氨酸(S)；
(b)用丝氨酸(S)置换在位置70处的天冬氨酸(D);和
(b)用苯丙氨酸(F)置换在位置71处的酪氨酸(Y),其中使用Kabat编号系
统；和
(V)轻链FR4，其具有SEQ ID NO: 35的氨基酸序列或包含一个或多个选自下述的置换的SEQ ID NO: 35的氨基酸序列
Ca)用丙氨酸(A)置换在位置100处的甘氨酸(G);和
(b)用亮氨酸(L)置换在位置106处的异亮氨酸(I)，其中使用Kabat编号系统。可变结构域的主要部分包括3个⑶R区域以及它们的插入框架区。所述部分也可以包括第一和第四框架区中的任一个或二者的至少约50%，所述50%是第一框架区的C-端50%和第四框架区的N-端50%。在可变结构域的主要部分的N-端或C-端末端处的其它残基可以是，通常与天然存在的可变结构域区域无关的那些残基。例如，通过重组DNA技术构建本文所述的人源化的内皮因子抗体和抗原结合片段，可以导入由导入的连接物编码的N-或C-端残基，以促进克隆或其它操作步骤。其它操作步骤包括，导入连接物来使可变结构域与其它蛋白序列相连，所述其它蛋白序列包括免疫球蛋白重链、其它可变结构域(例如在双体的生产中)或在下面更详细地讨论的蛋白标记。人源化的内皮因子CDR3区域(其具有基本上如本文所述抗体的CDR3区域所示的氨基酸序列)将被负载在允许所述CDR3区域与内皮因子结合的结构中。用于负载CDR3的结构可以是抗体重链或轻链序列或其主要部分，其中所述⑶R3区域位于这样的位置所述位置与由重排的免疫球蛋白基因编码的天然存在的V1^P'抗体可变结构域的CDR3区域相对应。在一个非限制性实施例中，本文提供了抗体或其抗原结合片段，其包含可变重链和/或可变轻链，所述可变重链的⑶R3具有如SEQ ID NO: 68所示的氨基酸序列，所述可变轻链的⑶R3具有如SEQ ID NO: 65所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述可变重链具有如SEQ ID NO: 40所示的氨基酸序列，但是⑶R3被置换为如SEQ ID NO: 68所示的CDR3氨基序列。在另一个实施方案中，所述可变轻链具有如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序 列，但是⑶R3被置换为如SEQ ID NO: 65所示的⑶R3氨基酸序列。另外，这样的含有⑶R3的可变区/链可以包含例如如上所述的一个或多个FR氨基酸序列(或这样的含有一个或多个额外修饰的FR)，其中所述抗体或抗原结合片段在每个VH和VL区域中具有3个CDR和4个FR，具有对内皮因子的特异性结合活性，且能够抑制血管生成。另外，也可以置换在这些可变区内的不同的抗体J区段，用于实现可变区链内的其它变化。在一个方面，通过进一步替代FR4序列，也可以制备本文所述的可变重链和轻链。在一个实施方案中，所述重链FR4序列可以置换下述之一
SEQIDN0:IKabat-编号|l03|l04|l05|l06|l07|l08|l09|ll0|lll|ll2|ll3
76萊自 JHl、JH4 或 JH5 的 FRM4ff~G~Q~G~T~L~~T~ VS S
77系自 JH2 的 FRM4ff~G~R~G~T~L~~Τ~VS S
78I来白 JH3 的 FRM4|ff |& |q |g |t |m |v |t |v |s |s
权利要求
1.一种抗体或其抗原结合片段，其包含具有如SEQ ID NO: 89所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 93所示的氨基酸序列的轻链可变区。
2.一种结合内皮因子的抗体或其抗原结合片段，其包含具有如SEQ ID NO: 89所示的氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO: 93所示的氨基酸序列的轻链可变区，其中 所述重链可变区另外包含一个或多个选自下述的修饰用丙氨酸(A)或丝氨酸(S)置换在位置49处的甘氨酸(G);用异亮氨酸(I)置换在位置51处的丙氨酸(A);用精氨酸(R)或天冬酰胺(Q)置换在位置52b处的赖氨酸(K);用缬氨酸(V)置换在位置78处的亮氨酸(L),其中使用Kabat编号系统；和 所述轻链可变区另外包含一个或多个选自下述的修饰用亮氨酸(L)置换在位置4处的甲硫氨酸(M);用缬氨酸(V)置换在位置19处的丙氨酸(A);用丝氨酸(S)置换在位置22处的苏氨酸(T);用异亮氨酸(I)置换在位置48处的丙氨酸(A);和用丝氨酸(S)置换在位置51处的苏氨酸(T)，其中使用Kabat编号系统。
3.根据权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其包含具有如SEQID NO: 88、89、90、91或92所示的氨基酸序列的重链可变区；和具有如SEQ ID NO: 93、94、95、96、97、100、102或103所示的氨基酸序列的轻链可变区。
4.根据权利要求I所述的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、scFv片段、单链结合多肽、Fd片段、可变重链、可变轻链或dAb片段。
5.一种组合物，其包含根据权利要求I所述的抗体或抗原结合片段和可接受的载体或赋形剂。
6.一种核酸，其包含编码根据权利要求I所述的抗体或抗原结合片段的核苷酸序列。
7.根据权利要求I所述的抗体或其抗原结合片段，其被治疗标记、诊断标记或二者进一步标记。
8.一种治疗受试者的血管生成有关疾病的方法，所述方法包括施用根据权利要求I所述的抗体或其抗原结合片段的组合物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段被治疗标记、可检测标记或二者标记。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述血管生成有关疾病是特征在于血管生成/新生血管形成的眼病、糖尿病肾病、IBD、类风湿性关节炎、骨关节炎、癌症或转移。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述眼病是黄斑变性。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述眼病是糖尿病视网膜病变。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述癌症是实体瘤。
14.根据权利要求10所述的方法，其中所述癌症是基于上皮的肿瘤。
15.根据权利要求10所述的方法，其中所述癌症选自肺癌、妇科恶性肿瘤、黑素瘤、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、结直肠癌、前列腺癌、肾癌、头部癌症、胰腺癌、肝癌(肝细胞癌)、子宫癌、颈部癌症、肾癌(肾细胞癌)、肉瘤、骨髓瘤和淋巴瘤。
16.根据权利要求8所述的方法，所述方法另外包括施用一种或多种血管生成抑制剂。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述血管生成抑制剂是化学疗法、VEGF受体抑制剂、VEGF抑制剂或其组合。
18.根据权利要求8所述的方法,其中以约0.Ol mg/kg、约0.05 mg/kg、约0.1 mg/kg、约 0. 5 mg/kg、约 I mg/kg、约 5 mg/kg、约 10 mg/kg、约 20 mg/kg、约 30 mg/kg、约 40 mg/kg、约50 mg/kg、约60 mg/kg、约70 mg/kg、约80 mg/kg、约90 mg/kg、约100 mg/kg、约125mg/kg、约150 mg/kg、约175 mg/kg或约200 mg/kg的量,施用抗体或其抗原结合片段的组合物。
19.一种诊断方法，其包括 a)提供来自待测患者的实体瘤的癌细胞或血浆样品； b)检测至少一种基因或基因广物在样品中的表达，所述基因或基因广物选自其表达已经与对血管生成抑制剂的敏感性或抗性相关联的基因或基因产物集合，其中所述至少一种基因或基因产物选自下述的一种或多种基因或基因产物VEGF、VEGF受体、HIF-I a、胎盘生长因子受体和⑶105 ;和 c)对比在患者样品中检测到的至少一种基因或基因产物的表达水平和已经与对血管生成抑制剂的敏感性或抗性相关联的至少一种基因或基因产物的表达水平。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述血管生成抑制剂选自VEGF受体抑制剂、VEGF抑制剂和内皮因子抑制剂。
21.—种试剂盒，其包含用于检测已经与对血管生成抑制剂的敏感性或抗性相关联的一个或多个基因在癌细胞或人血浆样品中的表达水平的试剂，所述基因选自VEGF、VEGF受体、HIF-I a、胎盘生长因子受体和内皮因子。
22.根据权利要求21所述的试剂盒，其中所述试剂盒含有抗体或其抗原结合片段。
全文摘要
本申请涉及人源化的和人源化的/去免疫化的抗-内皮因子抗体和其抗原结合片段的组合物。一个方面涉及抗体，所述抗体具有在可变重链、可变轻链或二者的至少一个框架区的至少一个氨基酸残基中的一个或多个修饰。另一个方面涉及抗体，所述抗体结合内皮因子，并抑制血管生成。另一个方面涉及人源化抗体的去免疫化以降低免疫原性。另一个方面涉及人源化的和人源化的/去免疫化的结合内皮因子的抗体用于检测、诊断或治疗与内皮因子、血管生成或其组合有关的疾病或病症的用途。
文档编号A61K39/395GK102762227SQ201080054202
公开日2012年10月31日 申请日期2010年9月29日 优先权日2009年9月30日
发明者C.托伊尔, M.瓦斯克斯 申请人:特雷康制药公司