专利名称：一种可用于光动力疗法的光敏微胶囊及其制备方法
技术领域：
本发明属于光敏聚合物薄膜材料技术领域，具体涉及一种可用于光动力疗法的光 敏微胶囊及其制备方法。
背景技术：
癌症是威胁人类生命的主要疾病之一。目前控制和综合治疗癌症是各国卫生战略 的重点，也是世界关注的研究热点。传统的癌症治疗手段，即手术、放疗和化疗经过不断改 进，可以控制、治愈多种肿瘤，但仍然存在很大缺陷，例如，手术会严重损害患者的功能或形 貌，放疗和化疗则会有较大的毒副作用。兴起于上世纪90年代的光动力疗法(PDT)是一种局部处理病灶组织的光化学反 应。近年来，PDT作为一种治疗浅层癌的有效方法，以其对特定肿瘤细胞的良好的靶向性、 安全性，以及局部损伤性等优势，成为了颇受各国学者重视的一种新型癌症治疗法。然而， 用于PDT疗法的许多光敏剂具有疏水性，限制了 PDT的临床实践。为解决此问题，多种亲水 性的载体被引入到PDT中，如凝胶、脂质体、胶质等。其中，利用层层自组装技术构筑的亲水 性天然聚电解质微胶囊引起了普遍关注，特别是其具有独特的大小、形貌、组成和通透性的 可控性，此外还具有较大的内腔结构来包覆功能小分子。负载了光敏药物小分子的光敏微 胶囊可以在特定波长光照条件下，使光敏分子到达激发态，通过系间窜跃变为三线态，这部 分光敏分子与周围氧分子通过能量转移发生反应，产生可导致细胞不可逆损伤或死亡的单 线态氧，完成PDT治疗过程。目前，利用层层自组装技术制备的微胶囊已有报道。如，国际专利(W09947252)以 三聚氰胺甲醛(MF)为模板，交替吸附带有相反电性的聚苯烯胺和聚苯乙烯磺酸钠，最后溶 去MF制得中空微胶囊。上述专利是采用了非生物降解与相容的壁材，无法在生物医药领域 实践。国际专利(wo2008(^8M6)构筑了具有良好生物相容性的海藻酸钠(ALG)/壳聚糖 (CHI)包覆磁性狗304纳米粒子的微胶囊，其微胶囊粒径大于100 μ m，无法实现体内送药。 国内专利(CN101703490)公开了一种以榄香烯等脂溶性药物为囊芯，CHI或其季铵盐/ λ 角叉胶或ALG为壁材来包覆磁性纳米粒子或光敏纳米粒子的聚合物/无机纳米粒子杂化的 微纳米载药胶囊。另有文献报道李峻柏等人通过直接浸渍法，制备了一种负载了小分子光 敏剂HB的光敏微胶囊，该胶囊受光激发后对肿瘤细胞产生了高毒性。但是上述报道中，小 分子光敏粒子随机吸附于囊壁材料上或者富集于胶囊内部，这样的光敏粒子会随着富集浓 度的加大而团聚，进而导致光敏效率下降或单线态氧产率减少。此外，吸附的小分子光敏粒 子在到达病灶部位前很容易由囊壁孔道泄露，降低单线态氧产量，并容易对正常组织造成 毒副作用。因此，在光敏微胶囊中实现光敏剂的预固定就显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中的问题，提供一种具有生物相容性及高效光活 性的光敏微胶囊及其制备方法，将直接接枝了小分子光敏剂的天然聚合物作为壁材，采用层层自组装技术制备微胶囊。本发明的光敏微胶囊有效预固定了光敏剂分子，并可定量控 制光敏剂含量，单线态氧产率高，微胶囊粒径均一、性能可控。本发明的一种可用于光动力疗法的光敏微胶囊，其特征在于，是囊壁材料中含有 以化学键直接接枝光敏剂的天然聚合物聚糖(CHI)或葡聚糖的多层囊壁自组装的中空胶曩。本发明提出的上述可用于光动力疗法的光敏微胶囊，采用如下技术方案1)光敏囊壁材料的制备将聚合物天然壳聚糖(CHI)或葡聚糖配制成浓度为1 50mg/mL的聚合物溶液A， 调节PH至4-9 ；将光敏剂配成浓度为1 50mg/mL的光敏剂溶液B ；将溶液A缓慢滴加到 溶液B中，混合反应并同时加以搅拌，其中溶液A与溶液B的体积比为(1 40) 1，搅拌 速度为500 lOOOrpm，在25 80°C条件下反应1 3天；将上述反应物用截留分子量为 7000的透析袋透析5 20天，经水洗/离心2 3次后，将得到的沉淀物冷冻干燥2 4 天，得到粉末状光敏聚合物产物；溶于去离子水中，配制成浓度为0. 1 lOmg/mL的光敏聚 合物水溶液。2)光敏微胶囊的制备采用层层自组装的方法，在带有电荷的微球模板上组装带有相反电荷的聚电解 质，交替吸附多层，然后组装步骤1)中的光敏聚合物，去核后得到中空的光敏微胶囊，分散 于去离子水溶液中保存。步骤1)中制备溶液A或B时所用的溶剂为可溶解相应物质的常用溶剂，可以是去 离子水、醇、醋酸、氢氧化钠水溶液等。步骤1)所述的调节pH所用试剂为碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液或2-(N-吗啡啉)乙 磺酸(MEQ缓冲液。步骤1)中所述的光敏剂为带有可与相应的聚合物缩合反应的活性基团的光敏物 质，活性基团如氨基、羧基、卤素取代基等，以实现光敏物质的预固定。所述的光敏剂优选玫 瑰红、荧光素或9-氯甲基蒽，但并不限于上述光敏剂。步骤2、所述的微球模板为表面带正电荷的三聚氰胺甲醛(MF)微球，表面带负电 荷的聚苯烯微粒(PS)、聚乳酸或用聚乙烯亚胺(PEI)或聚-4-乙烯基苯磺酸钠(PSQ处理 的SiO2微球、CaCO3, MnCO3等无机晶体。所述的带电荷的模板可直接吸附与其带有相反电 荷的聚电解质物质，本领域的技术人员可根据现有文献自行制备。步骤2、所述的聚电解质溶液分别为带负电荷的聚电解质为海藻酸钠、硫酸葡聚 糖或羧甲基纤维素钠，其水溶液浓度为lmg/mL ；带正电荷的聚电解质为壳聚糖、聚赖氨酸， 其水溶液浓度为lmg/mL，或按步骤1)的方法制备的光敏聚合物的水溶液。步骤2)所述的去核方法取决于所选模板材料的性质，其中，MF微球在pH< 1. 6的 酸性条件下分解；碳酸盐模板可用盐酸或络合剂去除；PS球可在THF中溶解；SiO2微球可用 氢氟酸去除等；本领域的技术人员可根据现有文献自行查阅去除模板方法。在特定波长光照下，光敏微胶囊响应产生单线态氧将200L光敏微胶囊的去离子 水分散液置于电子顺磁共振仪，以40 μ L浓度为2. OM的2，2，6，6-四甲基哌啶为单线态氧 捕获剂，在550nm波长激光照射下，检测到单线态氧的生成。与现有技术相比较，本发明具有以下有益效果
1)以化学键直接接枝具有高单线态氧量子产率的光敏分子到天然聚合物上，将此 光敏聚合物作为一种囊壁材料组装光敏微胶囊，能够固定光敏剂分子，并防止其局部团聚， 可以维持高效单线态氧量子产率。本发明方法简单易行，所得光敏聚合物材料具有较高的 表面电荷，易于组装胶囊。2)本发明所制备的光敏微胶囊水分散性好，粒径均一，在特定波长光照下具有高 的单线态氧量子产率，可杀死肿瘤细胞，可潜在应用于PDT中。3)本发明所提供的制备光敏微胶囊的材料，为天然聚电解质，安全无害，原料易 得。制备的光敏微胶囊尺寸、组成、通透性易控制，工艺简单，可重复性强。
图1、对比例1和实施例1中制备的纯壳聚糖CHI和接枝了光敏剂壳聚糖囊壁材料 RB-CHI的傅里叶红外谱图。图2、实施例1中制备的光敏微胶囊的扫描电镜图。图3、实施例1中制备的光敏微胶囊的荧光共聚焦图片。图4、对比例2和实施例1中制备的空白微胶囊和光敏微胶囊的电子顺磁共振波谱 图。以下结合附图和实例来对本发明作进一步说明。
具体实施例方式实施例1光敏囊壁材料的制备A 将0. Ig的CHI加入25mL的体积比为1 %乙酸水溶液中，在200 IOOOrpm的 搅拌转速下搅拌12h以上，以MES缓冲液调节pH = 5 6 ；B:将0.028g的RB (玫瑰红)溶于25mL无水甲醇溶液中，在搅拌速度为200 IOOOrpm下，加入催化剂1-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺， 活化羧基约30min ；C 将A步骤的CHI乙酸溶液缓慢滴加进B步骤的RB无水甲醇溶液中，并同时以搅 拌速度为500 IOOOrpm加以搅拌1 3天，温度控制在25 60°C ；D 将C步骤的反应物用截留分子量为7000的透析袋透析5 20天，经水洗/离 心2 3次后，将得到的沉淀物冷冻干燥2 4天，得到粉末状淡粉色的光敏聚合物产物 RB-CHI。E 将D步骤的RB-CHI溶于去离子水中，配制成浓度为lmg/mL的RB-CHI溶液；光敏微胶囊的制备A 取ImL表面带正电荷的MF微球模板的水分散液于1. 5mL的离心管中，放入离心 机中离心分离3 lOmin，移去上层水溶液；B 带负电荷的电解质溶液ALG(海藻酸钠)吸附在离心管中加入1. 5mL配好并 过滤的lmg/mL的ALG溶液，振动摇勻，让球型粒子MF均勻分散在聚合物溶液中，静止放置 1 2h，中间还需振动摇勻2 3次，使得吸附更好更完全地进行；C 水洗离心分离7 8min，移去上层液，加入1. 5mL去离子水振动摇勻，然后离心分离。然后移去上层液再加入1. 5mL去离子水，重复振动摇勻离心分离步骤，总共进行 2 3次水洗；D 带正电荷的电解质溶液CHI吸附移去上述C步骤中水洗/离心后的上层液，加 入配好并过滤的lmg/mL的CHI溶液1. 5mL，振动摇勻，让球型粒子均勻分散在聚合物溶液 中，静止放置1 2h，中间还需振动摇勻2 3次，使得吸附更好更完全地进行；E 重复B D步骤，交替吸附5个双层，在最后一层使用上述制备的正电性光敏聚 合物溶液RB-CHI作为囊壁组成；F 去核向组装好10层的微胶囊中加入ImL浓度为0. IM的盐酸溶液，振动摇勻， 放置20 60min直至离心管内的悬浮液变透明，再离心分离移去上层液；水洗后，振动摇 勻，得到中空的光敏微胶囊，于去离子水溶液中保存。如图1，对比纯壳聚糖CHI和接枝了光敏剂的壳聚糖RB-CHI的傅里叶红外谱图， 接枝反应以前，1655cm"1和1599CHT1处的峰归因于CHI分子链上的C = 0、N-H键。CHI与 RB反应后，在1643cnT1和1548CHT1处出现了明显的吸收峰，分别归属于C = O伸缩振动和 N-H伸缩振动，是酰胺键的特征峰。与CHI在1595cm—1处的自由氨基吸收峰不同。此外，在 1730cm—1处没有新的峰出现，证明没有脂基生成，这也说明CHI链上的N-H基团是主要的活 性反应基团，能与RB的羧基发生脱水缩合反应。上述检测结果说明通过缩合反应，小分子的光敏分子成功接枝到了聚合物壳聚糖 上。如图2，在空气中干燥的中空光敏微胶囊表面出现许多不规则褶皱，粒径分布均 一，分散性好。如图3，实施例1中制备的光敏微胶囊的荧光共聚焦显微镜图片显示胶囊外周展 示出红色的荧光光环，直接证明了接枝了光敏剂的壳聚糖RB-CHI作为囊壁被包覆在胶囊 上，有效固定了光敏剂，并保持了荧光特性。如图4，对比未吸附光敏聚合物质的空白微胶囊(对比例2)和光敏微胶囊的电子 顺磁共振(ESR)波谱图，对于光敏微胶囊，随着照射时间的增加，ESR信号强度迅速增加，随 后速率减慢，最终达到一个平台。而空白微胶囊未产生代表单线态氧的ESR信号。说明本 发明制备的光敏微胶囊能有效产生单线态氧，可潜在用于PDT中。实施例2光敏囊壁材料的制备A 将0. 5g的CHI溶于50mL的1 %乙酸溶液中，以碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液调节 pH = 5 6 ；B 将0. 05g的荧光素溶于5mL无水甲醇溶液中，搅拌速度为200 IOOOrpm ；C 将A步骤的CHI乙酸溶液缓慢滴加进B步骤的荧光素无水甲醇溶液缓中反应 48h以上，并同时以搅拌速度为500 1000rpm，60 80°C真空下得到反应物；D 将C步骤的反应物用截留分子量为7000的透析袋透析5 20天，经水洗/离 心2 3次后，将得到的沉淀物冷冻干燥1 2天，得到粉末状光敏聚合物产物。E 将D步骤的粉末状光敏聚合物产物溶于去离子水中，配制成浓度为lmg/mL的光 敏聚合物水溶液待用；光敏微胶囊的制备
A 取ImL表面带有负电荷的PS微粒模板于1. 5mL的离心管中，放入离心机中离心 分离3 lOmin，移去上层水溶液；B 带正电荷的CHI水溶液吸附在离心管中加入1. 5mL配好并过滤的lmg/mL的 CHI水溶液。振动摇勻，让PS微粒模板均勻分散在聚合物溶液中，静止放置1 池，中间还 需振动摇勻2 3次，使得吸附更好更完全地进行；C 水洗离心分离7 8min，移去上层液，加入1. 5mL去离子水振动摇勻，然后离 心分离。然后移去上层液再加入1. 5mL去离子水，重复振动摇勻离心分离步骤，总共进行 2 3次水洗；D 带负电荷的硫酸葡聚糖水溶液吸附移去上述C步骤中水洗/离心后的上层 液，加入配好并过滤的lmg/mL的硫酸葡聚糖水溶液1. 5mL,振动摇勻，让PS微粒均勻分散 在聚合物溶液中，静止放置1 2h，中间还需振动摇勻2 3次，使得吸附更好更完全地进 行；E 重复B D步骤，交替吸附5个双层，在胶囊最外层再使用上述制备的正电性光 敏聚合物溶液作为囊壁组成；F 去核向组装好的光敏微胶囊中加入ImL的THF溶液，振动摇勻，放置20 60min直至离心管内的悬浮液变透明，再离心分离移去上层液；水洗后，振动摇勻，得到中 空的光敏微胶囊，于去离子水溶液中保存。实施例3A 将Ig的葡聚糖溶于40mL的NaOH水溶液中，以MES缓冲液调节pH = 5 6 ；B 将0. 06g的9-氯甲基蒽溶于2mL甲苯溶液中，搅拌速度为500 IOOOrpm ；C:将A步骤的葡聚糖溶液缓慢滴加进B步骤的9-氯甲基蒽溶液中，并同时以搅拌 速度为100 600rpm加以搅拌1_3天，在队保护下，控制温度40 80°C反应；D 将C步骤的反应物用截留分子量为7000的透析袋透析5 20天，经水洗/离 心2 3次后，将用环己烷萃取得到的沉淀物冷冻干燥1 2天，得到粉末状的光敏聚合物 产物。E 将D步骤的光敏聚合物配制成lmg/mL的光敏聚合物水溶液待用；光敏微胶囊的制备A 取ImL已用PSS处理的CaCO3粒子水溶液于1. 5mL的离心管中，放入离心机中 离心分离3 lOmin，移去上层水溶液；B 带正电荷的聚赖氨酸溶液吸附在离心管中加入1. 5mL配好并过滤的lmg/mL 的聚赖氨酸溶液。振动摇勻，让CaC03粒子均勻分散在聚合物溶液中，静止放置1 池，中 间还需振动摇勻2 3次，使得吸附更好更完全地进行；C 水洗离心分离7 8min，移去上层液，加入1. 5mL去离子水振动摇勻，然后离 心分离。然后移去上层液再加入1. 5mL去离子水，重复振动摇勻离心分离步骤，总共进行 2 3次水洗；D 带负电荷的羧甲基纤维素钠溶液吸附移去上述C步骤中水洗后的上层液，加 入配好并过滤的lmg/mL负电性羧甲基纤维素钠水溶液1. 5mL，振动摇勻，让球型粒子均勻 分散在聚合物溶液中，静止放置1 2h，中间还需振动摇勻2 3次，使得吸附更好更完全 地进行；
E 重复B D步骤，交替吸附5个双层，在最外层再使用上述制备的正电性光敏聚 合物水溶液作为囊壁组成；F 去核在组装好10层的微胶囊离心管内加入ImL浓度为0. 2M的EDTA溶液，振 动摇勻，放置20 60min直至离心管内的悬浮液变透明，再离心分离移去上层液；水洗后， 振动摇勻，得到中空的光敏微胶囊，于去离子水溶液中保存。实施例4光敏囊壁材料的制备A 将0. 2g的CHI加入25mL的体积比为1 %乙酸水溶液中，在200 IOOOrpm的 搅拌转速下搅拌12h以上，以MES缓冲液调节pH = 5 6 ；B:将0.028g的RB (玫瑰红)溶于25mL无水甲醇溶液中，在搅拌速度为200 IOOOrpm下，加入催化剂1-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺， 活化羧基约30min ；C 将A步骤的CHI乙酸溶液缓慢滴加进B步骤的RB无水甲醇溶液中，并同时以搅 拌速度为500 IOOOrpm加以搅拌1 3天，温度控制在25 60°C ；D 将C步骤的反应物用截留分子量为7000的透析袋透析5 20天，经水洗/离 心2 3次后，将得到的沉淀物冷冻干燥2 4天，得到粉末状淡粉色的光敏聚合物产物 RB-CHI。E 将D步骤的RB-CHI溶于去离子水中，配制成浓度为lmg/mL的RB-CHI溶液；光敏微胶囊的制备A 取ImL表面带正电荷的MF微球模板的水分散液于1. 5mL的离心管中，放入离心 机中离心分离3 lOmin，移去上层水溶液；B 带负电荷的电解质溶液ALG吸附在离心管中加入1. 5mL配好并过滤的lmg/mL 的ALG溶液，振动摇勻，让球型粒子MF均勻分散在聚合物溶液中，静止放置1 池，中间还 需振动摇勻2 3次，使得吸附更好更完全地进行；C 水洗离心分离7 8min，移去上层液，加入1. 5mL去离子水振动摇勻，然后离 心分离。然后移去上层液再加入1. 5mL去离子水，重复振动摇勻离心分离步骤，总共进行 2 3次水洗；D 带正电荷的电解质溶液CHI吸附移去上述C步骤中水洗/离心后的上层液，加 入配好并过滤的lmg/mL的CHI溶液1. 5mL，振动摇勻，让球型粒子均勻分散在聚合物溶液 中，静止放置1 2h，中间还需振动摇勻2 3次，使得吸附更好更完全地进行；E 重复B D步骤，交替吸附2个双层，在第3 5个双层中，使用上述制备的正 电性光敏聚合物溶液RB-CHI代替CHI作为囊壁组成，步骤同B D，即形成含有三层光敏剂 层的光敏微胶囊(ALG/CHI)2(ALG/RB-CHI)3 ；F 去核向组装好10层的微胶囊中加入ImL浓度为0. IM的盐酸溶液，振动摇勻， 放置20 60min直至离心管内的悬浮液变透明，再离心分离移去上层液；水洗后，振动摇 勻，得到中空的光敏微胶囊，于去离子水溶液中保存。对比例1所述的对比例1为天然的聚合物壳聚糖固体粉末。对比例2
8
制备步骤与实施例2相同，以MF为模板，交替吸附5个双层ALG/CHI，最后得到第 一、三、五、七、九层为ALG吸附层，第二、四、六、八、十层为CHI吸附层的中空微胶囊。
权利要求
1.一种可用于光动力疗法的光敏微胶囊，其特征在于，是囊壁材料中含有以化学键直 接接枝光敏剂的天然聚合物聚糖(CHI)或葡聚糖的多层囊壁自组装的中空胶囊。
2.按照权利要求1的可用于光动力疗法的光敏微胶囊的制备方法，其特征在于，包括 以下步骤1)光敏囊壁材料的制备将聚合物天然壳聚糖(CHI)或葡聚糖配制成浓度为1 50mg/mL的聚合物溶液A，调节 PH至4-9 ；将光敏剂配成浓度为1 50mg/mL的光敏剂溶液B ；将溶液A缓慢滴加到溶液B 中，混合反应并同时加以搅拌，其中溶液A与溶液B的体积比为(1 40) 1，搅拌速度为 500 lOOOrpm，在25 80°C条件下反应1 3天；将上述反应物用截留分子量为7000的 透析袋透析5 20天，经水洗/离心2 3次后，将得到的沉淀物冷冻干燥2 4天，得到 粉末状光敏聚合物产物；溶于去离子水中，配制成浓度为0. 1 10mg/mL的光敏聚合物水溶 液；2)光敏微胶囊的制备采用层层自组装的方法，在带有电荷的微球模板上组装带有相反电荷的聚电解质，交 替吸附多层，然后组装步骤1)中的光敏聚合物，去核后得到中空的光敏微胶囊；步骤1)所述的调节PH所用试剂为碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液或2-(N-吗啡啉)乙磺酸 (MES)缓冲液；步骤1)中所述的光敏剂为带有可与相应的聚合物缩合反应的活性基团的光敏物质。
3.按照权利要求2的制备方法，其特征在于，所述的光敏剂优选玫瑰红、荧光素或9-氯甲基蒽。
4.按照权利要求2的制备方法，其特征在于，带有电荷的微球模板为表面带正电荷的 三聚氰胺甲醛(MF)微球，表面带负电荷的聚苯烯微粒(PS)、聚乳酸或用聚乙烯亚胺(PEI) 或聚-4-乙烯基苯磺酸钠(PSS)处理的SW2微球、CaCO3、MnCO3。
5.按照权利要求2的制备方法，其特征在于，带电荷聚电解质溶液为带负电荷的聚电 解质为海藻酸钠、硫酸葡聚糖或羧甲基纤维素钠，其水溶液浓度为lmg/mL ；带正电荷的聚 电解质为壳聚糖、聚赖氨酸，其水溶液浓度为lmg/mL，或按步骤1)的方法制备的光敏聚合 物的水溶液。
全文摘要
本发明公开了一种可用于光动力疗法的光敏微胶囊及其制备方法，属于光敏聚合物薄膜材料技术领域。首先，制备光敏剂分子接枝聚合物的光敏聚合物材料；然后采用层层自组装技术，在微球模板上组装带相反电荷的聚电解质材料，去核后制备出囊壁材料中含有以化学键直接接枝光敏剂的天然聚合物聚糖(CHI)或葡聚糖的多层囊壁自组装的中空胶囊。本发明的光敏微胶囊水分散性好，粒径均一；具有良好的生物相容性；固定了光敏分子，在特定波长光照下单线态氧量子产率高，能有效杀死肿瘤细胞，可潜在应用于PDT中，工艺简单，易于操作。
文档编号A61K47/36GK102133208SQ20111006482
公开日2011年7月27日 申请日期2011年3月17日 优先权日2011年3月17日
发明者王晓磊, 郑言贞, 陈建峰, 陶霞 申请人:北京化工大学