专利名称：PPARα基因V227A变异的重组质粒的构建方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，是涉及一种PPAR α基因V227A变异的重组质粒的构建方法，可在制备增强PPAR α基因活性的药物中的应用。
背景技术：
xLM, it ^ M W ±1 M ^ # 舌 ^ #(peroxisome proliferator-activated receptor, PPARs)是一类由配体激活的核转录因子，属于核受体超家族的成员。PPARa是 PPARs的一个亚型，在脂肪代谢和调节炎症、免疫以及细胞分化等方面具有重要作用，从而参与脂肪性肝病的发病机制。PPAR α基因有多个单核苷酸多态性位点。结合文献及本课题组前期研究的结果，PPAR α亦存在V227A基因多态性，即PPARa基因892位碱基发生T — C的突变而导致第227位氨基酸由缬氨酸变为丙氨酸(Alanine，A)。Chan E等研究发现，中国人PPAR α 227Α携带者(突变型)的频率为4%，而马来西亚人为0. 6%，亚裔印度人为0.3%。进一步研究发现，PPARa 227Α携带者胆固醇和甘油三酯水平(5. 21mmol/l 和1. 09mmol/l)较野生型(5. 38mmol/l和1. 19mmol/l)水平降低。该研究还发现，PPARa V227A多态性可调节机体对多不饱和脂肪酸摄入的反应。我们前期研究发现PPARa基因227A携带者体重、体重指数(Body mass index, BMI)、臀围、腰围、腰臀比、体脂含量、腹壁脂肪厚度明显低于非227A携带者(P <0. 05)。多因素Logistic回归分析筛选出腰围和腰臀比是PPAR α基因V227A多态性两个有重要意义的影响因素。因此推测PPAR α基因V227A突变型即227Α携带者对肥胖的发病可能是一保护性因素。第227位氨基酸位于PPAR α基因的DNA结合区域和配体结合区域之间，PPAR α ￥227々的变异可能引起？ 々1^功能的变化，由前期的研究结果可以推测，、PPARα 227 A携带者可能较V227携带者有更高的活性，但具体的功能变化尚需进一步的实验研究。因此， 有必要构建PPARa V227A野生型和突变型基因的真核表达载体，并建立稳定转染细胞的模型，以进一步探索PPARa V227A变异在体内外的生物学功能。
发明内容
本发明的目的是提供pEGFP-Nl-PPAR α 227Α重组真核表达载体，所述编码序列为 SEQ ID NO:I0本发明的第二个目的是提供pEGFP-Nl-PPARa V227A重组真核表达载体的构建方法，通过以下步骤实现
1. PCR引物采用引物设计软件Primer Premier 5.0，根据PPARa基因cDNA序列 ((NCBI Reference Sequence: NM_005036. 4)上所需突变的碱基及pEGFP-m的多克隆酶切位点和PPARα基因两侧的酶切位点来设计。pEGFP-m的多克隆酶切位点所述编码序列为 SEQ ID N0:2，所述引物编码序列分别为SEQ ID N0:3、4、5、6、7。PFl (SEQ ID NO:3) 5' -attfftcffac atg gtg gac acg gaa age cca_3'(其具有fe/l酶切位点)PR2 (SEQ ID N0:4) 5' -Xcaggatcccg gta cat gtc cct gta gat c_3'、其具有 BamHI酶切位点)
PF2 (SEQ ID NO:5): 5' -gaacaaggtcaaagcccgggc-3'(其具有第 227 位密码子的点突变)
PRl (SEQ ID NO:6) 5，-gcccgggctttgaccttgttc-3，(其具有第 227 位密码子的点突变)
P3 (SEQ ID NO:7) 5' -tcaaagc ccgggccatc ctctcagg-3'o2. PPAR α基因野生型和突变型片段的制备
(1)DNA模板的制备取人外周血1ml，采用通用基因组小量抽提试剂盒抽提外周血
DNA ；
(2)野生型片段的PCR扩增根据上海生工生物工程技术服务有限公司购置的DNAPCR 试剂盒操作说明进行，选择的引物为PFl和冊2。反应条件为94°C预变性5分钟，然后 940C变性45 SJ4°C退火45 S，72°C延伸45 S，30个循环，最后72°C 10分钟，得到扩增片段I，长度为14Mbp。扩增产物进行电泳、回收、纯化。经测序证实为野生型序列；
(3)突变型片段的PCR扩增PCR扩增分两步进行，采用上述相同的反应体系，引物为 PF1+PR1,反应条件为94°C预变性5分钟，然后94°C变性45 S，53°C退火45 S，72°C延伸 45 5，30个循环，最后721 10分钟，得到扩增片段A，长度为689bp。另一个反应体系为引物为PF2+PR2，反应条件相同，得到扩增片段B，长度为756bp。扩增产物用l.Og / L琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。融合PCR反应体系中，引物为PF1、PR2和P3，模板为A和B。反应条件为94°C预变性5分钟，然后94°C变性45 S，53°C退火45 S，72°C延伸45 S，30个循环，最后72°C 10分钟，得到扩增产物片段II为14Mbp，扩增产物进行电泳、回收、纯化。经测序证实为突变型序列。3. pEGFP-Nl-PPARa 227A (突变型)重组质粒的构建
将PPARa V227A突变型纯化片段经DNA测序鉴定后克隆到pEGFP-Nl质粒中SalY和 BamWl位点之间，连接后，以氯化钙沉淀法转化大肠杆菌DH5 a，接种于含有卡那霉素抗性的琼脂平皿，挑取阳性菌落，接种于3ml含有卡那霉素的LB液体培养基中过夜，抽提质粒。本发明的另一个目的是提供pEGFP-Nl-PPARa V227A重组真核表达载体EGFP/ PPARa V227A融合蛋白的表达方式，通过以下步骤实现
1.转染L02细胞
将培养的L02细胞按3X IO5个细胞/孔加入M孔板，培养M小时后按照 Lipofectamine 2000试剂盒进行试剂说明书进行转染。2. Western blot检测融合蛋白的表达
收集转染后的细胞，用全细胞蛋白提取试剂盒。取蛋白提取物，加入SDS上样缓冲液调整蛋白浓度，煮沸10分钟，进行SDS-PAGE.，并转移至PVDF膜，用5%的脱脂奶粉封闭2小时，将已封闭的膜，浸入1:1000倍稀释的兔抗人PPARa —抗(用5%脱脂奶粉的TBST配制)中，4°C摇晃过夜，次日取出漂洗3次，再浸入1:2000稀释的HRP-Goat-Anti-Rabbit-IgG 二抗(用TBST配制)结合2小时，洗膜后作ECL化学发光，X线曝光显影。本发明的再一个目的是提供这种融合基因载体在制备增强PPARa基因活性的药物中的应用。本发明提供的融合基因载体，可增强PPARα基因的活性，提高PPARa基因药物靶标的作用。发明的有益之处是(1)本发明所构建的含PPARa基因V227A变异的重组真核表达载体的构建方法，不仅能特异性靶向PPARa基因的研究，还可以大量扩增，并可将其有效片段克隆到其他载体上，具有操作简单、应用方便、副作用小、成本低等优点。(2)所述载体上还有绿色荧光蛋白报告基因，可通过绿色荧光来判断转染效率。(3) pEGFP-Nl-PPARa V227A重组真核表达载体可增强PPARα基因的活性，以扩大PPARα基因作为药物靶标的作用。说明书附图
图1为重组质粒pEGFP-Nl-PPARa V227A的酶切电泳图。图2为稳定表达EGFP/PPARa V227A融合蛋白的L02细胞倒置显微镜下观察结果。图3为pEGFP-Nl-PPARaV227A转染L02细胞后PPARa蛋白的表达。
具体实施例方式本发明结合附图和实施例作进一步的说明。实施例1 研究PPAR α基因V227A变异的生物学功能的真核表达载体的构建
(1)根据Genebank提供的人PPAR α的基因序列所需突变的碱基及pEGFP_Nl的多克隆酶切位点和PPARa两侧最近的酶切位点，设计并合成引物，PRl和PF2位于突变位点处， 都引入一个突变位点，即将第227位密码子的点突变(gtc突变为gcc)；其中PFl设在具有 SalI限制性内切酶位点处；PR2位于BamHI限制性内切酶位点处。引物序列为
PFl 5' -attfftcffac atg gtg gac acg gaa age cca_3'(其具有 5 /1 醇切位点) PR2: 5' -tcoggatcccg gta cat gtc cct gta gat c_3'(其具有召a HI 酶切位点) PF2: 5' -gaacaaggtcaaagcccgggc-3'(其具有第227位密码子的点突变) PRl 5’ -gcccgggctttgaccttgttc-3，(其具有第227位密码子的点突变) P3 5， -tcaaagc ccgggccatc ctctcagg-3'。(2)取人外周血anl，提取DNA。(3) PCR扩增，获得PPAR α 227位氨基酸野生型片段；即10氺PCR Buffer 5 μ 1，， 2mmol/L dNTP 5 μ 1，弓| 物 PFl 禾口 PR2 各 2 μ 1，Taq DNA Polymerase 0. 2 μ l,25mmol/L MgCl2 4 μ 1，模板DNA 2111，加(1(1!120至5(^1。反应条件为94°C预变性5分钟，然后94°C 变性45 SJ4°C退火45 S，72°C延伸45 S，30个循环，最后72°C 10分钟，得到扩增片段I， 长度为14Mbp。(4)PCR扩增，进行PPAR α V227A的定点诱变；即PCR扩增分两个反应体系进行， 第一个反应体系即10*PCR Buffer 5μ 1, 2mmol/L dNTP 5 μ 1，引物PF1+PR1 各2 μ 1，Taq DNA Polymerase 0. 2 μ l,25mmol/L MgCl2 4 μ 1，模板 DNA 2 μ 1，力口 ddH20 至 50 μ 1。反应条件为94°C预变性5分钟，然后94°C变性45 S，53°C退火45 S，72°C延伸45 S，30个循环， 最后72°C 10分钟，得到扩增片段A，长度为689bp。第二个反应体系即10*PCR Buffer 5μ 1, 2mmol/L dNTP 5 μ 1，引物 PF2+PR2 各 2 μ 1，Taq DNA Polymerase 0. 2 μ l,25mmol/L MgCl2 4 μ 1，模板DNA 2111，加(1(1!120至5(^1。反应条件为94°C预变性5分钟，然后94°C 变性45 S，53°C退火45 S，72°C延伸45 S，30个循环，最后72°C 10分钟，得到扩增片段B， 长度为75^ρ。
(5)融合PCR，获得PPAR α 227位氨基酸突变型片段；即10*PCR Buffer 5 μ 1， 2mmol/L dNTP 5 μ 1，PFl 禾口 PR2 各 2 μ 1，P3 2 μ 1，Taq DNA Polymerase 0.2 μ l,25mmol/ LMgCl2 4 μ 1，步骤4)获得的片段Α、Β回收产物各Ιμ ，加ddH20至50μ1。反应条件为 94°C预变性5分钟，然后94°C变性45 S，53°C退火45 S，72°C延伸45 S，30个循环，最后 720C 10分钟，得到扩增产物片段II为14Mbp。(6)琼脂糖凝胶电泳，胶回收步骤幻获得的I片段和步骤幻获得的II)片段。(7)将载体pEGFP-Nl用SalY和汉警HI进行双酶切，用回收试剂盒回收。(8)将步骤6)获得的DNA I和II用SalX和Ba·进行双酶切，用回收试剂盒回收。(9)将步骤7)和8)获得的产物进行连接，即10*T4 DNA Ligase Buffer 1μ 1, 线性化的 pEGFP-Nl 2 μ 1，PPAR α V227 或 PPARa 227Α 片段 6 μ 1，Τ4 DNA Ligase 1 μ 1，力口双蒸水至20 μ 1，16 °C反应过夜。(10)将步骤9)获得的链接产物转化至大肠杆菌DH5 α，g卩取20 μ 1连接产物即重组质粒 pEGFP-Nl- PPAR α V227、pEGFP_Nl_ PPAR α 227Α 加入 200 μ 1 感受态细胞悬液，轻轻摇勻，冰浴30分钟；42°C 90秒，迅速置于冰上冷却3分钟，分别加入37°C预热800 μ 1 LB 液体培养基，混勻后37°C振荡培养45分钟，各取400 μ 1涂布于含卡那霉素的LB固体培养基上，37 °C培养过夜。(11)分别挑取单克隆菌落，接种于3ml含卡那霉素的LB液体培养基中，37°C培养过夜。(12)各取1.5ml菌液离心收集菌体，采用质粒抽提试剂盒(PureLink HiPure plasmid Minipr印)提取质粒，然后用fe/I和及进行双酶切鉴定，结果参见图1，图中， 条带 M: marker ；条带 1 pEGFP-Nl plasmid;条带 2: pEGFP-Nl plasmid digested by Sail and BamHL·(13)所提质粒DNA经fe/I和及进行双酶切鉴定，选出正确质粒，命名为 pEGFP-Nl- PPARa V227 禾P pEGFP-Nl- PPARa 227A。(14)按照步骤1)至步骤13)的操作构建质粒pEGFP-Nl- PPAR a V227和pEGFP_Nl_ PPARa 227A。 实施例2 pEGFP-Nl- PPAR a V227和pEGFP-附-PPAR a 227A重组真核表达载体转染L02肝细胞株
(1)转染L02细胞
将培养的L02细胞按3X IO5个细胞/孔加入M孔板，培养M小时后按照 Lipofectamine 2000试剂盒进行试剂说明书进行转染。分别将0. 8 μ g的重组质粒 pEGFP-Nl- PPAR α V227 和 pEGFP-附-PPAR α 227Α 溶于 50 μ 1 Opti-MEM 培养基，形成 0. 02 μ g/ μ 1 的浓度。取 Lipofectamine 2000 脂质体 6 μ 1 溶于 100 μ 1 Opti-MEM 培养基， 混勻，室温下放置5分钟。将稀释好的Lipofectamine 2000脂质体50 μ 1分别逐滴加入重组质粒pEGFP-Nl-PPAR α V227和pEGFP_Nl_PPAR α 227Α中，轻轻吹打混勻，室温放置20 分钟。在等待的20分钟内，将M孔板换成Opti-MEM培养基，每孔加入500 μ 1。20分钟后将上述Lipofectamine 2000脂质体与重组质粒的混合液逐滴加入M孔板中，轻轻摇晃混勻。6小时后换液，每孔加入1. 5ml含10%胎牛血清的DMEM培养基。将M孔板放入二氧化碳培养箱中培养。M小时后按1:6的比例传代，每孔加入0. 7ml含10%胎牛血清的DMEM 培养基。将转染后的L02细胞用G418筛选稳定转染的细胞，结果参见图2，A/B :G418筛选后稳定表达pEGFP-Nl空质粒的L02细胞；C/D :G418筛选后稳定表达EGFP/PPAR α V227融合蛋白的L02细胞；E/F :G418筛选后稳定表达EGFP/PPARa 227A融合蛋白的L02细胞；A/ C/E为普通光镜下观察结果；B/D/F为荧光下观察结果。(2) Western blot检测融合蛋白的表达
收集转染后的细胞，用全细胞蛋白提取试剂盒。取蛋白提取物，加入SDS上样缓冲液调整蛋白浓度，煮沸10分钟，进行SDS-PAGE.，并转移至PVDF膜，用5%的脱脂奶粉封闭2小时，将已封闭的膜，浸入1:1000倍稀释的兔抗人PPARa —抗(用5%脱脂奶粉的TBST配制)中，4°C摇晃过夜，次日取出漂洗3次，再浸入1:2000稀释的HRP-Goat-Anti-Rabbit-IgG 二抗(用TBST配制)结合2小时，洗膜后作ECL化学发光，X线曝光显影。结果参见图3， 条带1为转染野生型重组质粒pEGFP-Nl-PPARa V227组；条带2为转染突变型重组质粒 pEGFP-Nl-PPAR a 227A组；条带3为转染空质粒pEGFP-Nl组；条带4为未处理的L02细胞。实施例3:PPARa V227A变异的生物学功能检测
采用转染野生型重组质粒pEGFP-Nl-PPARa V227和突变型重组质粒 pEGFP-Nl-PPARa 227A的L02细胞株(以下简称“野生组”和“突变组”)，探讨PPAR α基因 V227A变异对L02细胞株生物学功能的影响。将细胞分为野生组、突变组、空质粒组和对照组四组，每组L02细胞根据是否用PPAR α激动剂WY14643干预共分为8组，各组细胞分别用MTT和流式细胞仪检测细胞增殖和凋亡情况。( 1)细胞增殖与活性测定
细胞增殖与活性用MTT法测定。步骤如下MTT检测前，先将细胞铺96孔板，每孔加入细胞约10000个，实验分为8组野生组、突变组、空质粒组和对照组，每组再分为WY14643 干预组和不干预组；待细胞贴壁后加入WY14643，使之终浓度为100 μ mol/L ；48小时后进行 MTT检测。每孔加入MTT，使其终浓度为0. 5mg/ml，加入MTT后置37°C二氧化碳培养箱中继续培养；4小时后取出96孔板，弃去上清，每孔加入200 μ 1 DMS0，振荡或摇晃5_10分钟至结晶完全溶解；在570nm波长下用全自动酶标仪检测其吸光值。(2)流式细胞仪测定细胞凋亡
流式细胞仪ArmexinV和PI双染色被用来检测细胞的凋亡和坏死。具体方法如下将细胞处理后用胰酶消化，调整L02细胞浓度为IO6个/ml ；取200μ 1，4°C下IOOOrpm离心5min， 用预冷的PBSlml洗涤2次，4°C下IOOOrpm离心；将细胞重悬于IOOul binding buffer，加入2ul Annexin-V-FITC (20 μ g/ml)，轻轻混勻，避光冰上放置15分钟。转至流式检测管， 加入400μ1 PBS，每个样品临上机前加入Iul ΡΙ(50 μ g/ml)，同时以不加Annexin V-FITC 及PI的一管作为阴性对照，2分钟后迅速检测。
权利要求
1.一种含有人PPARa基因V227A的编码序列的载体，所述编码序列为SEQ ID N0:1。
2.根据权利要求1所述载体的构建方法，其特征是通过以下步骤实现的pEGFP-Nl-PPARa V227A重组质粒的构建抽取人外周血lml，采用通用基因组小量抽提试剂盒抽提外周血DNA，基因扩增采用PCR法，PCR产物经测序证实为PPAR α基因V227 序列，进一步经融合PCR技术诱导PPARa基因V227A点突变，PCR产物经电泳、回收和纯化，将PPAR α野生型和突变型纯化片段经DNA测序鉴定后克隆到pEGFP_Nl质粒中Mil和 BamHI位点之间，连接后，以氯化钙沉淀法转化大肠杆菌DH5 α，接种于含有卡那霉素抗性的琼脂平皿，挑取阳性菌落，接种于3ml含有卡那霉素的LB液体培养基中过夜，抽提质粒。
3.根据权利要求2所述的载体的构建方法，其特征是所述PCR法中使用了五种引物， 其中弓I物PFl: 5' -attfftCffac atg gtg gac acg gaa age cca_3',其具有酶切位点； 弓I物 PR2: 5' -Xcaggatcccg gta cat gtc cct gta gat c_3',其具有fefflHI 酶切位点； 引物PF2: 5’ -gaacaaggtcaaagcccgggc-3'，其具有第227位密码子的点突变；引物I3Rl: 5’ -gcccgggctttgaccttgttc-3’，其具有第 227 位密码子的点突变；引物 P3: 5’ -tcaaagc ccgggccatc ctctcagg-3'。
4.根据权利要求1所述的载体的表达方法，其特征是通过以下步骤实现的(1)转染L02细胞将培养的L02细胞按3X IO5个细胞/孔加入M孔板，培养M小时后按照 Lipofectamine 2000试剂盒进行试剂说明书进行转染；(2)Western blot检测融合蛋白的表达收集转染后的细胞，用全细胞蛋白提取试剂盒，取蛋白提取物，加入SDS上样缓冲液调整蛋白浓度，煮沸10分钟，进行SDS-PAGE.，并转移至PVDF膜，用5%的脱脂奶粉封闭2小时，将已封闭的膜，浸入1 :1000倍稀释的兔抗人PPARa —抗中，先用5%脱脂奶粉的TBST 配制，4°C摇晃过夜，次日取出漂洗3次，再浸入1 :2000稀释的HRP-Goat-Anti-Rabbit-IgG 二抗结合2小时，洗膜后作ECL化学发光，X线曝光显影。
5.根据权利要求1所述的载体在制备增强PPARα基因活性的药物中的应用。
全文摘要
本发明提供一种pEGFP-N1-PPARα227A变异的重组质粒，通过生物技术构建含PPARα基因V227A变异的重组真核表达载体，不仅能用于特异性靶向PPARα基因的研究，还可以大量扩增，并可将其有效片段克隆到其他载体上，具有操作简单、应用方便、副作用小、成本低等优点。本发明提供的载体含有绿色荧光蛋白报告基因，可通过绿色荧光来判断转染效率，在制备增强PPARα基因活性的药物中的应用。
文档编号A61P43/00GK102199618SQ201110083838
公开日2011年9月28日 申请日期2011年4月2日 优先权日2011年4月2日
发明者厉有名, 陈韶华 申请人:浙江大学