专利名称：与大脑衰老、阿尔茨海默病相关的蛋白质及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及motifilin，AK4，NDRG2，enolase 2,myosin,heme binding proteinl, 如氨基酸序列7所示的未命名蛋白质，如氨基酸序列8所示的未命名蛋白质，如氨基酸序列9所示的未命名蛋白质在筛选预防、治疗、缓解大脑衰老的药物中的应用。本发明还涉及 UCH-Ll在筛选、制备用于预防、治疗、缓解与tau蛋白磷酸化有关的疾病如大脑衰老的药物中的应用，以及UCH-Ll激动剂在制备预防、治疗、缓解与tau蛋白磷酸化有关的疾病如大脑衰老的药物中的应用。本发明还涉及UCH-L3在筛选、制备用于预防、治疗、缓解与tau蛋白磷酸化有关的疾病如大脑衰老、阿尔茨海默病等的药物中的应用，以及UCH-L3激动剂在制备预防、治疗、缓解与tau蛋白磷酸化有关的疾病如大脑衰老、阿尔茨海默病等的药物中的应用。
背景技术：
1.衰老和快速老化模型小鼠(SAM)大脑衰老伴随认知功能的降低，而且大脑衰老是阿尔茨海默病等神经退行性疾病的主要危险因素。在大脑衰老过程中会出现大脑萎缩，特定脑区如海马、皮层、杏仁核等神经元选择性丢失，神经元纤维缠结(NFT)、老年斑和脂褐质形成等神经病理学改变 (Anderton, 1997 ；Esiri，2007)。科学家们对衰老发生机制进行了大量研究，并提出了一些假说，但衰老发生的原因和分子机制目前仍不十分清楚。而且，临床上还缺乏有效预防、缓解和治疗大脑衰老的有效药物。SAM是日本京都大学Takeda等人通过对AKR/J系小鼠进行筛选得到的品系，包括快速老化的P系(SAMP)和抗快速老化的R系(SAMR)两大系(Takeda等人，1981)。SAMP系在青年期便出现脱毛、活动低下、白内障、角膜混浊、骨质疏松等老化现象，而且寿命明显缩短。其中SAMP8的主要特征为中枢学习记忆功能呈增龄性加速衰退(Butterfield和Poon， 2005)。文献报道，SAMP8小鼠在6月龄时就开始出现学习记忆功能衰退，并随增龄而加重。 在SAMP8小鼠海马和皮层中，线粒体功能紊乱和氧化应激损伤在脑内病理改变出现之前即已发生(Pallas等人，2007 ;Sureda等人，2006)。另外，SAMP8在增龄过程中脑内有大量 β -淀粉样蛋白沉积(Petursdottir等人，1981)，脑内与学习记忆功能相关的神经递质也发生改变(Flood等人，1998)。因此，SAMP8小鼠是研究衰老及衰老相关疾病如阿尔茨海默病的良好动物模型。而SAMRl亚系有着相对正常的生存期，常被用作正常对照。2.蛋白质组学蛋白质组学是基因组时代产生的一门重要学科，通过对不同状态下组织或细胞中蛋白质组成、表达水平与修饰状态的差异比较，寻找疾病特异性生物学标志物，为疾病的诊断和治疗提供新的蛋白靶点。蛋白质组学整个研究过程包括样品处理、蛋白质的分离、蛋白质图谱分析、差异蛋白质鉴定等步骤。当前，蛋白质组分析以双相电泳(2DE)和质谱分析 (MS)为技术基础。2DE中的第一相等点聚焦电泳和第二相垂直十二烷基磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳分别将各种蛋白质按电点和分子量的不同进行分离，MS可对差异蛋白进行鉴定(Pandey和Marm，2000 ；Smith，2000)。因此，蛋白质组学它具有高分离度， 高通量，高自动化等优势。目前，有2项SAM小鼠相关的脑蛋白质组学报道一项是对4月龄和12月龄SAMP8小鼠全脑蛋白进行差异蛋白质组学分析(Wang等，2008)；另一项比较了 6月龄SAMP8和同龄SAMRl小鼠海马中蛋白表达的差异(Poon等，2004)。这2项研究虽然发现了一些表达差异的蛋白质，但是每一项研究仅仅侧重于SAMP8小鼠脑蛋白质表达的种属变化或增龄变化的其中一个方面，并不全面。鉴于SAMP8小鼠在5月龄时处于发病前驱期，15月龄时处于症状体症明显的发病期。因此，选择与学习 记忆密切相关的2个脑区—— 海马和皮层，全面分析5月龄、15月龄SAMP8小鼠与同龄SAMRl小鼠蛋白表达的差异，以及 2种小鼠在增龄过程中的蛋白表达变化，将为发现脑衰老相关的新蛋白提供线索，并为脑衰老治疗提供新的药物靶点。3.过度磷酸化tau蛋白在神经退行性疾病中的病理作用Tau蛋白的异常过度磷酸化是引起大脑衰老，阿尔茨海默病及其他tau蛋白病 (tauopathies)的主要原因之一。而由异常过度磷酸化tau蛋白聚积形成的NFT是它们的一个主要病理特征(G0mez_Ramos 和 ΜοΓ η，1998)。微管是神经元骨架成分，由微管蛋白及微管相关蛋白组成。Tau蛋白是神经元中含量最高的微管相关蛋白，主要分布于轴突。正常脑中tau蛋白的主要功能是与微管蛋白结合促进其聚合形成微管，并与形成的微管结合，维持微管稳定性，建立细胞极性，维持神经元内的轴突运输(Lee等人，2001)。Tau蛋白为磷蛋白，每分子正常tau蛋白含有2 3 个磷酸基，tau蛋白的正常磷酸化对其发挥上述生理功能起重要的调节作用(Johnson和 Stoothoff, 2004)。而异常过度磷酸化的tau蛋白不仅丧失其正常的生物学活性，还使其变成具有细胞毒性的分子，与微管蛋白竞争结合正常tau蛋白及其它微管相关蛋白，并促使其自身沉积形成NFT，使微管解聚，轴突转运功能受损，引起突触退化丢失神经元功能损伤， 最终导致脑神经退行性病变(Goedert等人，2006)。Tau蛋白的磷酸化水平受到蛋白激酶的磷酸化和磷酸酶的去磷酸化作用的双重调节。目前认为参与tau蛋白磷酸化的激酶包括糖原合成酶激酶3 β (GSK_3i3)、周期蛋白依赖性蛋白激酶5(CDK5)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)等，其中GSK_3i3被认为是最为重要的(Gong等人，2005)。已知与大脑衰老、阿尔茨海默病有关的tau蛋白磷酸化位点约有 30个，发生率较高的几个位点如丝氨酸199位点(Serl99)、Ser202、Ser396、苏氨酸231位点(Thr231)等均是GSK-3i3的催化位点。而在蛋白磷酸酶方面，蛋白磷酸酶2A(PP2A)是脑中介导磷酸化tau蛋白去磷酸化的关键磷酸酶，PP2A占脑中总的tau蛋白磷酸酶活性的 70%左右，而PP1、PP2B和PP5各占10%左右。Serl99、Ser202和Ser396位点的去磷酸化均由PP2A所介导(Liu等人，2005)。 4.泛素C末端水解酶(UCH)家族介绍 泛素-蛋白酶体系统(UPS)是真核细胞内非溶酶体性蛋白质降解的又一重要途径，在UPS系统中，要降解的蛋白质首先和泛素分子结合形成一条多聚泛素链，才能被蛋白酶体识别并降解。在生理条件下，细胞中大部分氧化蛋白质、受损蛋白质或发生错误折叠的蛋白质的降解主要依赖于UPS系统(Goldberg，2003 ；Hochstrasser，1996)。最近研究发现，磷酸化和非磷酸化的tau蛋白均是UPS系统的降解底物(Zhang等人，2005 ；Ren等人， 2006)，而且tau蛋白的过度磷酸化是其被UPS系统降解的一个主要信号(Kosik和ShimuraH,2005)。UCH家族是UPS系统中重要的去泛素化酶家族，主要水解与蛋白结合的或游离的多聚泛素链，形成游离的可重新利用的泛素分子，使其重新参与UPS途径(Johnston和 Burrows, 2006).截至目前，该家族有6个成员UCH-Ll 6，而大多数研究主要集中在 UCH-Ll 禾口 UCH-L3 上。UCH-Ll是脑内含量最 丰富的蛋白之一，大约占脑内可溶性蛋白的2% (Wilkinson 等人，1989)。研究发现，UCH-Ll的表达水平在阿尔茨海默病患者的额皮质中明显降低 (Choi等人，2004)；在阿尔茨海默病患者的海马以及早老素-I(PSl)突变引起的遗传性阿尔茨海默病病人的额皮层中，UCH-Ll发生明显氧化(Butterfield等人，2006 ；SuItana等人，2006)。此外，在APP/PS1双转基因鼠中，UCH-Ll的蛋白水平和酶活性明显降低(Gong等人，2006 ；Lansbury, 2006)。UCH-L3与UCH-Ll的氨基酸序列有52 %的同源性，广泛表达于各组织(Kurihara 等人，2001)，虽然UCH-L3的蛋白表达水平比UCH-Ll低，但UCH-L3具有更强大的水解功能， 在体外其酶活性是UCH-Ll的200倍(Liu等人，2002)。目前，UCH-L3的研究主要集中在视网膜变性以及精子发生上(Sano等人，2006 ；KwOn，2007)。而UCH-L3与大脑衰老、阿尔茨海默病的关系目前还没有报道。综上，已公开的数据显示tau蛋白的过度磷酸化是引起大脑衰老，阿尔茨海默病的主要原因之一，UCH-Ll和UCH-L3所属的UPS系统在清除异常蛋白质、受损蛋白中发挥重要作用。然而，截止目前，尚未有关于UCH-Ll和UCH-L3是否参与了病理状态下神经元中过度磷酸化tau蛋白聚积的相关研究。因此，研究UCH-Ll和UCH-L3对神经元中磷酸化tau 蛋白聚积的调节作用是诊断、治疗大脑衰老和阿尔茨海默病等tau蛋白磷酸化相关疾病的新尝试，而且也为开发预防、治疗、缓解大脑衰老及阿尔茨海默病等的药物提供必要依据。
发明内容
针对现有技术及现有药物或试剂的不足，本发明涉及用于预防、治疗、缓解大脑衰老和/或阿尔茨海默病的药物。本发明的第一方面，提供了如氨基酸序列1所示的motifilin;如氨基酸序列2所示的AK4 ；如氨基酸序列3所示的NDRG2 ；如氨基酸序列4所示的enolase 2 ；如氨基酸序列 5所示的myosin ；如氨基酸序列6所示的heme binding protein 1 ；如氨基酸序列7所示的未知蛋白质；如氨基酸序列8所示的未命名蛋白质；如氨基酸序列9所示的未知蛋白质在筛选预防、治疗、缓解大脑衰老的药物中的应用。如实施例中所述，我们在比较同龄SAMP8和SAMRl小鼠的脑蛋白质组中发现，与同龄SAMRl小鼠相比，5、15月龄SAMP8小鼠海马和皮层中的3个mitofilin亚型往碱性端发生偏移，AK4明显增加，如氨基酸序列7所示的未命名蛋白质(gi 112847201)的N端46个氨基酸缺失。此外，我们比较2种小鼠在5月龄和15月龄时的蛋白表达图谱时发现，NDRG2 在2种小鼠海马和皮层的增龄过程中显著增加；enolase 2，如氨基酸序列8所示的未命名蛋白质(gi I 74214304)，如氨基酸序列9所示的未命名蛋白质(gi| 7417823)在2种小鼠的皮层中随增龄降低；myosin在2种小鼠的皮层中随增龄增加。如背景技术中所述，SAMP8小鼠是一种快速衰老模型小鼠，以中枢学习记忆功能呈增龄性加速衰退为主要特征，是研究衰老的良好动物模型。因此，本发明的motifilin、AK4、 NDRG2、enolase 2、myosin、heme binding protein 1、如氛基酸序列 7 所示的未命名蛋白质、如氨基酸序列8所示的未命名蛋白质、如氨基酸序列9所示的未命名蛋白质与大脑衰老密切相关，可成为治疗大脑衰老的药物靶点，有效用于筛选预防、治疗、缓解大脑衰老的药物。本发明的 第二方面，提供了如氨基酸序列10所示的UCH-Ll在制备预防、治疗、缓解与tau蛋白磷酸化有关的疾病如大脑衰老的药物中的应用。如实施例中所述，UCH-Ll的抑制剂能够直接增加正常神经元中以及拟阿尔茨海默病神经元模型中磷酸化tau蛋白的聚积；而且，UCH-Ll的抑制剂还能够通过作用于调节tau 蛋白磷酸化水平的酶(活化GSK-3i3和抑制PP2A)发挥作用，即UCH-Ll的抑制剂不仅能够直接而且能够间接增加正常神经元中以及拟阿尔茨海默病神经元模型中磷酸化tau蛋白的聚积。如背景技术中所述，tau蛋白的过度磷酸化是引起大脑衰老、阿尔茨海默病的主要原因之一，由过度磷酸化tau蛋白聚积形成的NFT是它们的一个主要病理特征。因此，本发明的UCH-Ll可有效用于制备预防、治疗、缓解与tau蛋白磷酸化有关的疾病的药物。较佳地，用于制备预防、治疗、缓解大脑衰老的药物。本发明的第三方面，提供了如氨基酸序列10所示的UCH-Ll的激动剂在制备预防、 治疗、缓解与tau蛋白磷酸化有关的疾病如大脑衰老的药物中的应用。如实施例中所述，UCH-Ll的抑制剂不仅能够直接而且能够间接增加正常神经元中以及拟阿尔茨海默病神经元模型中磷酸化tau蛋白的聚积。如背景技术中所述，tau蛋白的过度磷酸化是引起大脑衰老、阿尔茨海默病的主要原因之一。因此，本发明的UCH-Ll的激动剂可有效用于制备预防、治疗、缓解与tau蛋白磷酸化有关的疾病的药物。较佳地，用于制备预防、治疗、缓解大脑衰老的药物。本发明的第四方面，提供了如氨基酸序列10所示的UCH-Ll在筛选预防、治疗、缓解与tau蛋白磷酸化有关的疾病如大脑衰老的药物中的应用。如实施例中所述，UCH-Ll的抑制剂不仅能够直接而且能够间接增加正常神经元中以及拟阿尔茨海默病神经元模型中磷酸化tau蛋白的聚积。如背景技术中所述，tau蛋白的过度磷酸化是引起大脑衰老，阿尔茨海默病的主要原因之一。因此，本发明的UCH-Ll可成为治疗与tau蛋白磷酸化有关的疾病的药物靶点，有效用于筛选预防、治疗、缓解与tau蛋白磷酸化有关的疾病的药物。较佳地，用于筛选预防、治疗、缓解大脑衰老的药物。本发明的第五方面，提供了如氨基酸序列11所示的UCH-L3在制备预防、治疗、缓解与tau蛋白磷酸化有关的疾病如大脑衰老、阿尔茨海默病等的药物中的应用。如实施例中所述，我们在比较同龄SAMP8和SAMRl小鼠的脑蛋白质组中发现，与同龄SAMRl小鼠相比，5、15月龄SAMP8小鼠海马和皮层中的UCH-L3表达明显降低。UCH-L3 酶活性检测实验中发现，5、15月龄SAMP8小鼠海马、皮层及血清中UCH-L3酶活性与同龄 SAMRl小鼠相比均显著降低。进一步，细胞实验中发现，UCH-L3的抑制剂能够直接增加正常神经元中以及拟阿尔茨海默病神经元模型中磷酸化tau蛋白的聚积；而且，UCH-L3的抑制剂还能够通过作用于调节tau蛋白磷酸化水平的酶(活化GSK-3i3和抑制PP2A)发挥作用， 即UCH-L3的抑制剂不仅能够直接而且能够间接增加正常神经元中以及拟阿尔茨海默病神经元模型中磷酸化tau蛋白的聚积。如背景技术中所述，SAMP8小鼠是一种快速衰老模型小鼠。tau蛋白的过度磷酸化是引起大脑衰老，阿尔茨海默病的主要原因之一，由过度磷酸化tau蛋白聚积形成的NFT是它们的一个主要病理特征。因此，本发明的UCH-L3可有效用于制备预防、治疗、缓解与tau 蛋白磷酸化有关的疾病的药物。较佳地，用于制备预防、治疗、缓解大脑衰老和/或阿尔茨海默病的药物。本发明的第六方面，提供了如氨基酸序列11所示的UCH-L3的激动剂在制备预防、 治疗、缓解与tau蛋白磷酸化有关的疾病如大脑衰老、阿尔茨海默病等的药物中的应用。如实施例中所述，5、15月龄SAMP8小鼠海马和皮层中UCH-L3的水平与同龄SAMRl 小鼠相比明显降低，5、15月龄SAMP8小鼠海马、皮层及血清中UCH-L3酶活性与同龄SAMRl 小鼠相比也显著降低。另外，UCH-L3的抑制剂不仅能够直接而且能够间接增加正常神经元中以及拟阿尔茨海默病神经元模型中磷酸化tau蛋白的聚积。如背景技术中所述，tau蛋白的过度磷酸化是引起大脑衰老，阿尔茨海默病的主要原因之一。因此，本发明的UCH-L3的激动剂可有效用于制备预防、治疗、缓解与tau蛋白磷酸化有关的疾病的药物。较佳地，用于制备预防、治疗、缓解大脑衰老和/或阿尔茨海默病的药物。本发明的第七方面，提供了如氨基酸序列11所示的UCH-L3在筛选预防、治疗、缓解与tau蛋白磷酸化有关的疾病如大脑衰老、阿尔茨海默病等的药物中的应用。如实施例中所述，5、15月龄SAMP8小鼠海马和皮层中UCH-L3的水平与同龄SAMRl 小鼠相比明显降低，5、15月龄SAMP8小鼠海马、皮层及血清中UCH-L3酶活性与同龄SAMRl 小鼠相比也显著降低。另外，UCH-L3的抑制剂不仅能够直接而且能够间接增加正常神经元中以及拟阿尔茨海默病神经元模型中磷酸化tau蛋白的聚积。如背景技术中所述，tau蛋白的过度磷酸化是引起大脑衰老，阿尔茨海默病的主要原因之一。因此，本发明的UCH-L3可成为治疗与tau蛋白磷酸化有关的疾病的药物靶点，有效用于筛选预防、治疗、缓解与tau 蛋白磷酸化有关的疾病的药物。较佳地，用于筛选预防、治疗、缓解大脑衰老和/或阿尔茨海默病的药物。本发明为筛选抗大脑衰老、阿尔茨海默病的药物提供平台，并为进一步研究 UCH-LU UCH-L3对神经元中磷酸化tau蛋白聚积的调控作用，以及制备预防、治疗、缓解与 tau蛋白磷酸化有关的疾病如大脑衰老、阿尔茨海默病等的药物奠定必要的基础。名词和术语1、UCH-Ll抑制剂购自Calbiochem公司，代号LDN57444，结构式如下
权利要求
1.如氨基酸序列1所示的motifilin在筛选预防、治疗、缓解大脑衰老的药物中的应用。
2.如氨基酸序列2所示的AK4在筛选预防、治疗、缓解大脑衰老的药物中的应用。
3.如氨基酸序列3所示的NDRG2在筛选预防、治疗、缓解大脑衰老的药物中的应用。
4.如氨基酸序列4所示的enolase2在筛选预防、治疗、缓解大脑衰老的药物中的应用。
5.如氨基酸序列5所示的myosin在筛选预防、治疗、缓解大脑衰老的药物中的应用。
6.如氨基酸序列6所示的hemebinding protein 1在筛选预防、治疗、缓解大脑衰老的药物中的应用。
7.如氨基酸序列7所示的未命名蛋白质在筛选预防、治疗、缓解大脑衰老的药物中的应用。
8.如氨基酸序列8所示的未命名蛋白质在筛选预防、治疗、缓解大脑衰老的药物中的应用。
9.如氨基酸序列9所示的未命名蛋白质在筛选预防、治疗、缓解大脑衰老的药物中的应用。
10.如氨基酸序列10所示的UCH-Ll在制备预防、治疗、缓解大脑衰老的药物中的应用。
11.如氨基酸序列10所示的UCH-Ll在制备预防、治疗、缓解与tau蛋白磷酸化有关的疾病的药物中的应用。
12.如氨基酸序列10所示的UCH-Ll的激动剂在制备预防、治疗、缓解大脑衰老的药物中的应用。
13.如氨基酸序列10所示的UCH-Ll的激动剂在制备预防、治疗、缓解与tau蛋白磷酸化有关的疾病的药物中的应用。
14.如氨基酸序列10所示的UCH-Ll在筛选预防、治疗、缓解大脑衰老的药物中的应用。
15.如氨基酸序列10所示的UCH-Ll在筛选与tau蛋白磷酸化有关疾病的药物中的应用。
16.如氨基酸序列11所示的UCH-L3在制备预防、治疗、缓解大脑衰老和/或阿尔茨海默病的药物中的应用。
17.如氨基酸序列11所示的UCH-L3在制备预防、治疗、缓解与tau蛋白磷酸化有关的疾病的药物中的应用。
18.如氨基酸序列11所示的UCH-L3的激动剂在制备预防、治疗、缓解大脑衰老和/或阿尔茨海默病的药物中的应用。
19.如氨基酸序列11所示的UCH-L3的激动剂在制备预防、治疗、缓解与tau蛋白磷酸化有关的疾病的药物中的应用。
20.如氨基酸序列11所示的UCH-L3在筛选预防、治疗、缓解大脑衰老和/或阿尔茨海默病的药物中的应用。
21.如氨基酸序列11所示的UCH-L3在筛选与tau蛋白磷酸化有关疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及motifilin，AK4，NDRG2，enolase 2，myosin，heme binding protein1，以及3个新蛋白质在筛选预防、治疗、缓解大脑衰老的药物中的应用。本发明还涉及UCH-L1在筛选、制备用于预防、治疗、缓解与tau蛋白磷酸化有关的疾病如大脑衰老的药物中的用途，以及UCH-L1激动剂在制备预防、治疗、缓解与tau蛋白磷酸化有关的疾病如大脑衰老的药物中的用途。本发明还涉及UCH-L3在筛选、制备用于预防、治疗、缓解与tau蛋白磷酸化有关的疾病如大脑衰老、阿尔茨海默病等的药物中的用途，以及UCH-L3激动剂在制备预防、治疗、缓解与tau蛋白磷酸化有关的疾病如大脑衰老、阿尔茨海默病等的药物中的用途。
文档编号A61K31/404GK102309752SQ20111013191
公开日2012年1月11日 申请日期2011年5月20日 优先权日2010年5月20日
发明者朱蕾, 王晓良 申请人:中国医学科学院药物研究所