专利名称：一种应用生物反应器及片状载体生产狂犬疫苗的方法
技术领域：
本发明涉及生物制品技术领域，应用于狂犬疫苗的生产。
背景技术：
狂犬病是由狂犬病毒引起的人兽共患疾病，人和所有的温血动物对狂犬病病毒都易感。一旦发病100%死亡，唯一有效的方法是接种有效的人用狂犬病疫苗。目前应用的人用狂犬病疫苗有人二倍体细胞疫苗(HDCV)；原代地鼠肾细胞人用狂犬病疫苗(PHKCV)；精制鸡胚细胞人用狂犬病疫苗(PCECV);Ver0细胞人用狂犬病疫苗(PVRV);鸭胚人用狂犬病疫苗 (PDEV)等。我国生产的人用狂犬病疫苗有PHKCV和PVRV两种。目前我国批准生产的灭活疫苗或减毒活疫苗除了乙肝疫苗外全部是用哺乳动物细胞繁殖病毒方法制备的，哺乳动物细胞无论对于病毒性疫苗和基因工程重组产品都是重要的细胞基质，国际上早在80年代就开始研制Vero细胞狂犬病疫苗和小儿麻痹疫苗Vero 细胞乙脑疫苗，肾综合征出血热疫苗和狂犬病疫苗在国内已经研制成功，Vero细胞SARS疫苗及Vero细胞脊髓灰质炎疫苗的研究取得了较大进展，这些疫苗的开发经验证明我国哺乳动物细胞疫苗的研制技术已日趋成熟，只是培养规模和设备比较落后，仍停留在转瓶或细胞工厂培养的水平，欧美等西方发达国家主要是采用生物反应器高密度培养动物细胞生产病毒性疫苗，具有质量好、产量高、成本低等优点，在生产过程中易于监控重复性好，符合 GMP管理要求。《中国生物技术产业发展报告》一书指出细胞大规模培养技术作为生物制药中最为关键的技术已成为我国生物技术药物产业化最难跨越的“门槛”。目彰常见动物细胞生物反应器的种类 气升式(airlift)生物反应器；
中空纤维管(hollow-fiber)生物反应器； 流化床(fluidiz-bed)生物反应器(FBR)； 搅拌罐(stir-tank)生物反应器(STR)； 固定床(fixed-bed)生物反应器； 填充床(packed-bed)生物反应器。微载体是指直径在60-250 μ m,能适用于贴壁细胞生长的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。自Van Wezel用DEAE-S^hadex A 50研制的第一种微载体问世以来，国际市场上出售的微载体商品的类型已经达十几种以上，包括液体微载体、 大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、PHEMA微载体、甲壳质微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等。常用商品化微载体有三种CytodeXl、2、3，Cytopore和 Cytoline。微载体培养是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易。目前微载体培养广泛用于培养各种类型细胞，生产疫苗、蛋白质产品，如293细胞、成肌细胞、Vero细胞、CHO细胞。中国专利公开号为CN102000326的专利申请，公开了一种生产人用狂犬病疫苗的方法，该专利所用的培养细胞为人二倍体细胞，人二倍体细胞由于受代次限制且细胞生长缓慢，所以用于狂犬疫苗的生产周期较长，病毒收获量较低。中国专利公开号为 CN101716341A的专利申请，公开了一种人用二倍体细胞狂犬灭活疫苗及其制备方法，该专利所用细胞也为人二倍体细胞，狂犬病毒毒株为PM株。中国专利公开号为CN1390604 的申请专利，公开了大规模连续生产病毒疫苗的方法，该专利所用的生物反应器为 CelligenPlus,规模仅为5. (Γ7. 5L，不适合于大规模的狂犬疫苗生产，且载体为聚酯切片 Fibra-Cel Disks。
发明内容
本发明提供一种应用生物反应器及片状载体生产狂犬疫苗的方法，以解决目前狂犬疫苗生产中存在的生产周期较长、病毒收获量较低，不适合于大规模生产的问题。本发明采取的技术方案是包括下列步骤
⑴在具有固定床篮式搅拌系统的Celligen 310型14L生物反应器中，以BioNOC II cell culture disks为载体，培养Vero细胞，接种密度为0. 5 2X 106cells/ml ；
⑵在细胞生长到5X IO7个/ml时，按1 :100 1 :500比例接种aGV或CTN-IV狂犬病毒，使病毒感染细胞；
⑶调节反应器控制参数CO2压为5% 10%、pH至7. 4 7. 8、温度为30°C !35°C、溶氧20% 90%、葡萄糖浓度25 40uM、搅拌速率在20 lOOrpm，收获病毒液； ⑷进行病毒的浓缩、灭活、纯化、冻干等步骤制成狂犬疫苗。目前由于国家标准的提高，狂犬疫苗的生产都趋于应用生物反应器进行生产，以使各项指标达到中国药典标准。目前市场上生物反应器和载体种类繁多，其中以美国NBS 公司生产的生物反应器质量好、技术水平较高，应用比较广泛，相应的使用美国NBS公司配套的聚酯切片Fibra-Cel Disks也较多，但本发明在大量的试验研究过程中发现应用NBS 公司的CELLIGEN 310型14L生物反应器搭配台湾賽宇細胞科技股份有限公司的BioNOC II cell culture disks培养Vero细胞效果最好，细胞密度可达到5X 108/ml，病毒滴度可达IX 109FFU/ml，这个细胞密度和病毒滴度是在同等的培养条件下使用其他载体无法达到的，这一发现直接简化了后续的纯化工作，解决了狂犬疫苗生产中的两个技术难点疫苗效力和宿主细胞DNA残留量。1、本发明应用Vero细胞作为病毒培养用细胞。Vero细胞是广谱宿主细胞，在国内已经由国家批准作为疫苗生产用细胞，已经广泛的应用于多种疫苗的生产，且生长速度较人二倍体细胞快，更适合于应用于大规模的疫苗生产；
2、本发明所用狂犬病毒毒株为aGV株或CTN-IV株。生产用疫苗株是生产出高质量疫苗的关键，我国应用的疫苗株主要为aG株(地鼠肾细胞的狂犬病疫苗)，CTN-IV株，两个疫苗株均属于基因I型，本发明适应的aGV株同PV 株同源性为92%，同CVS比较，同源性为91%，同街毒株的比较为84%。本毒种采用小鼠脑腔攻击毒力测定法测得毒力能够达到8. 21gLD5(l/ml，这样能够保证制备出更高滴度的狂犬病毒用于疫苗的生产，为后续纯化工作奠定基础。3、本发明应用美国NBS公司的CELLIGEN 310型14L细胞培养生物反应器。CELLIGEN 310型14L细胞培养生物反应器是目前世界上最先进的动、植物细胞培养系统，其特点是适合贴壁培养细胞和悬浮细胞；适合各种动物细胞、昆虫细胞和植物细胞等；灌流式的培养过程；低(无)剪切力搅拌，无气泡通气；通过持续检测摄氧率实时检测细胞浓度；其灌流式培养属于连续培养，细胞保留在反应器系统中，收获培养液的同时不断加入新鲜培养基。灌流式培养的主要优点是连续灌注的培养基可以提供充分的营养成分， 并带走代谢产物。同时，细胞保留在反应器中，可以达到很高的细胞密度。同其他方法相比， 灌流式培养的病毒产率可以提高一个数量级，并可以大大降低劳动力的消耗。现有技术规模仅为5. (Γ7. 5L，单次病毒收获液量较小，而本发明为14L，更适于生产。4、本发明应用台湾賽宇細胞科技股份有限公司的BioNOC II cell culture disks。BioNOC II cell culture disks适用于动物细胞和植物细胞的生长，其表面由 100%聚脂纤维素制成，为5 mm宽和10 mm长的条形片状载体，具有亲水性三维多孔隙生长表面，适合细胞生长，一克BioNOC II cell culture disks能够提供大约1. O χ IO9 个细胞生长的空间，也就是2，400 cm2/g。，该三维多孔隙生长表面具提高提供细胞增生的表面积、增强细胞贴附能力等特性，能够促进细胞贴附、增强细胞增生和扩散、细胞产量随之增加。在本发明的应用中Vero细胞密度可达5X IO8个/ml从而能够制备高滴度的狂犬病毒。而目前应用较多的的聚酯切片Fibra-Cel Disks，一克仅能提供3 χ IO5个细胞的生长空间，所能提供细胞生长表面积为1，200cm2/g。本发明优点是培养的细胞密度高、病毒滴度和产量高以及生产成本低，此反应器通过加入BioNOC II cell culture disks增加可供细胞贴壁生长的表面积，再通过创造良好的培养条件使细胞培养密度达到5 X IO8个/ml，病毒滴度相应的大幅度成对数增加，最高可达IXlO9FFU /ml，大幅度地降低了生产成本，适用于狂犬疫苗的大批量生产。
图 1 为应用 BioNOCII cell culture disks 与 NBS Fibra-Cel Disks 培养细胞增殖曲线比较。图 2 为应用 BioNOCII cell culture disks 与 NBS Fibra-Cel Disks 培养病毒滴度比较。
具体实施例方式细胞非洲绿猴肾(Vero)细胞；
毒种aGV (毒力大于 7. 51gLD50/ml)或 CTN-IV 株； 复苏工作种子批Vero细胞，用3L转瓶进行传代、扩增； 具有固定床篮式搅拌系统的Celligen 310型14L生物反应器； 以 BioNOC II cell culture disks 为载体。实施例1
(1)将具有固定床篮式搅拌系统的Celligen 310型14L生物反应器灭菌后组装完备， 加入细胞培养液，加入BioNOC II cell culture disks微载体15g/L，培养液中小牛血清含量5%、调节PH至7. 0、温度33°C、搅拌速度速度20rpm过夜；接种经3L转瓶扩增的Vero 细胞，接种密度为0. 5 X 106cellS/ml，调节CO2压为5%、pH至7. 2，温度为35°C、溶氧20%、葡萄糖浓度25uM、搅拌速率在20rpm ；
(2)当细胞密度增至5X107cellS/ml接种aGV病毒，接种比例为1:100，
(3)通过生化分析仪检测葡萄糖和乳酸含量等参数，调节反应器控制参数C02压为 5%、pH至7. 4，温度为30°C、溶氧20%、葡萄糖浓度25uM、搅拌速率在20rpm ；每间隔M小时取样测定病毒毒力及抗原含量，以此进行病毒收获，当测得毒力高于IX 107FFU/ml时开始收获单次病毒液，收获期持续15天，其中5天病毒毒力持续在IX 108FFU/ml，毒力下降至 1 X 106FFU/ml时停止收获；
(4 )收获病毒液进行合并、超滤浓缩、灭活、纯化、冻干、分装成狂犬疫苗成品。实施例2
(1)将具有固定床篮式搅拌系统的Celligen310型14L生物反应器灭菌后组装完备， 加入细胞培养液，加入BioNOC II cell culture disks微载体18g/L，培养液中小牛血清含量8%、调节PH至7. 2、温度35°C、搅拌速度速度35rpm过夜；接种经3L转瓶扩增的Vero 细胞，接种密度为1. 3X 106cellS/ml，调节CO2压为8%、pH至7. 3，温度为36°C、溶氧55%、葡萄糖浓度35uM、搅拌速率在60rpm ；
(2)当细胞密度增至5X107cellS/ml接种aGV病毒，接种比例为1:300，
(3)通过生化分析仪检测葡萄糖和乳酸含量等参数，调节反应器控制参数C02压为8%、 PH至7. 6，温度为33°C、溶氧55%、葡萄糖浓度35uM、搅拌速率在60rpm ；每间隔M小时取样测定病毒毒力及抗原含量，以此进行病毒收获，当测得毒力高于IX 107FFU/ml时开始收获单次病毒液，收获期持续15 20天，其中5 10天病毒毒力持续在1 X IO8 1 X IO9FFU/ ml，毒力下降至lX106FFU/ml时停止收获；
(4 )收获病毒液进行合并、超滤浓缩、灭活、纯化、冻干、分装成狂犬疫苗成品。实施例3
(1)将具有固定床篮式搅拌系统的Celligen310型14L生物反应器灭菌后组装完备， 加入细胞培养液，加入BioNOC II cell culture disks微载体20g/L，培养液中小牛血清含量10%、调节PH至7. 4、温度37°C、搅拌速度速度50rpm过夜；接种经3L转瓶扩增的Vero 细胞，接种密度为2X106cellS/ml，调节CO2压为10%、pH至7. 4，温度为37°C、溶氧90%、葡萄糖浓度40uM、搅拌速率在IOOrpm ；
(2)当细胞密度增至5X107cellS/ml接种aGV病毒，接种比例为1:500，
(3)通过生化分析仪检测葡萄糖和乳酸含量等参数，调节反应器控制参数C02压为 10%、pH至7. 8，温度为35°C、溶氧90%、葡萄糖浓度40uM、搅拌速率在IOOrpm ；每间隔M 小时取样测定病毒毒力及抗原含量，以此进行病毒收获，当测得毒力高于IX 107FFU/ml时开始收获单次病毒液，收获期持续15 20天，其中5 10天病毒毒力持续在1 X IO8 lX109FFU/ml，毒力下降至lX106FFU/ml时停止收获；
(4 )收获病毒液进行合并、超滤浓缩、灭活、纯化、冻干、分装成狂犬疫苗成品。实施例4 6
将实施例广3中步骤(2)中接种CTN-IV病毒株。对比实验例(1)准备两台Celligen 310型14L生物反应器，灭菌后组装完备，加入细胞培养液，分别加入 BioNOC II cell culture disks 和 NBS Fibra-Cel Disks 微载体 20g/L，两台生物反应器培养条件相同，均为培养液中小牛血清含量10%、调节pH至7. 4、温度37°C、搅拌速度速度50rpm过夜；接种经3L转瓶扩增的Vero细胞，接种密度为2X 106cells/ml，调节 CO2压为10%、pH至7. 4，温度为37°C、溶氧90%、葡萄糖浓度40uM、搅拌速率在IOOrpm ；每间隔M小时取样测定细胞密度。(2)当两个反应器细胞密度增至5X107cellS/ml时接种aGV病毒，接种比例为1 200。(3)调节两反应器控制参数，使反应条件一致C02压为10%、pH至7. 8，温度为 35°C、溶氧90%、葡萄糖浓度40uM、搅拌速率在lOOrpm。每间隔M小时取样测定病毒毒力；
对比实验结果
图 1 为应用 BioNOC II cell culture disks 与 NBS Fibra-Cel Disks 培养细胞增殖曲线比较。图中所示横坐标为细胞培养天数，纵坐标为细胞密度。应用上述两种载体培养的起始细胞密度均为2. OXlOfVml，应用BioNOC II cell culture disks培养的细胞从第 8天开始就已经达到1. OX 108/ml，细胞密度持续升高，第10天到第20天细胞密度持续在 4. OX 108 5. OX lOVml之间，且最高可达5. OX 108/ml，第19天开始有下降趋势；而应用NBS Fibra-Cel Disks培养的细胞从第9天开始达到1. OX 108/ml，但细胞密度增长缓慢，第11 天到第20天细胞密度持续在2. OX 108、. OX 108/ml之间，且最高只达到4. OX 108/ml。图 2 为应用 BioNOC II cell culture disks 与 NBS Fibra-Cel Disks 培养病毒滴度比较。图中所示横坐标为病毒培养天数，纵坐标为病毒滴度，病毒滴度采用免疫荧光法检测。应用上述两种载体培养的起始病毒滴度均为6.0 X 106FFU/ml，应用BioNOC II cell culture disks培养的病毒滴度从第10天开始就已经达到2. OX 108FFU/ml，且病毒滴度持续升高，到第13天达到最高1. lX109FFU/ml，之后陆续下降，到第17天病毒滴度降至 107FFU/ml ；而应用NBS Fibra-Cel Disks培养的病毒滴度从第12天开始达到2. OX IO8FFU/ ml，到第14天达到最高6.0X108FFU/ml，之后陆续下降，到第17天病毒滴度降至IO7FFU/ ml ο对比实验结论
以上两组对比试验说明应用BioNOC II cell culture disks比应用NBS Fibra-Cel Disks培养的细胞密度和病毒毒力都要高很多，且细胞高密度和病毒高滴度的持续时间均较长。所以应用 BioNOC II cell culture disks 比应用 NBS Fibra-Cel Disks 更适合于 NBS的Celligen 310型14L生物反应器进行狂犬疫苗的生产。
权利要求
1.一种应用生物反应器及片状载体生产狂犬疫苗的方法，其特征在于包括下列步骤 ⑴在具有固定床篮式搅拌系统的Celligen 310型14L生物反应器中，以BioNOC II cell culture disks为载体，培养Vero细胞，接种密度为0. 5 2X 106cells/ml ；⑵在细胞生长到5X IO7个/ml时，按1 :100 1 :500比例接种aGV或CTN-IV狂犬病毒，使病毒感染细胞；⑶调节反应器控制参数CO2压为5% 10%、pH至7. 4 7. 8、温度为30°C !35°C、溶氧20% 90%、葡萄糖浓度25 40uM、搅拌速率在20 lOOrpm，收获病毒液； ⑷进行病毒的浓缩、灭活、纯化、冻干等步骤制成狂犬疫苗。
2.根据权利要求1所述的应用生物反应器及片状载体生产狂犬疫苗的方法，其特征在于步骤⑴中加入BioNOC II cell culture disks微载体为15 20g/L。
3.根据权利要求1所述的应用生物反应器及片状载体生产狂犬疫苗的方法，其特征在于步骤⑴调节生物反应器参数C02压为5% 10%、pH至7. 2 7. 4，温度为 37°C、 溶氧20% 90%、葡萄糖浓度25 40uM、搅拌速率在20 lOOrpm。
4.根据权利要求1所述的应用生物反应器及片状载体生产狂犬疫苗的方法，其特征在于步骤⑶收获病毒液方法当测得毒力高于lX107FFU/ml时开始收获单次病毒液，收获期持续15 20天，其中5 10天病毒毒力持续在IX IO8 1 X 109FFU/ml，毒力下降至 1 X 106FFU/ml时停止收获。
全文摘要
本发明涉及一种应用生物反应器及片状载体生产狂犬疫苗的方法，属于生物制品技术领域。在具有固定床篮式搅拌系统的Celligen310型14L生物反应器中以台湾赛宇細胞科技股份有限公司的BioNOCII cellculturedisks为载体培养细胞，通过特定的上罐细胞密度、所加病毒和生物反应器设定参数制备高滴度的狂犬病毒，生产狂犬疫苗。该方法具有培养的细胞密度高、病毒滴度和产量高以及生产成本低的优点，此反应器通过加入BioNOCII cellculturedisks增加可供细胞贴壁生长的表面积，再通过创造良好的培养条件使细胞培养密度达到5×108个/ml，病毒滴度相应的大幅度成对数增加，最高可达1×109FFU/ml，大幅度地降低了生产成本，适用于狂犬疫苗的大批量生产。
文档编号A61P31/14GK102240400SQ201110137119
公开日2011年11月16日 申请日期2011年5月25日 优先权日2011年5月25日
发明者丁丽丽, 井伟东, 刘岩, 姜文波, 崔文广, 李宇辉, 杨屹, 苑志刚, 苗丽, 蔡月红, 郭秀侠 申请人:长春生物制品研究所