一种从金醋中分离金醋多肽提取物的方法及其产品的制作方法

专利名称：一种从金醋中分离金醋多肽提取物的方法及其产品的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种食用醋中活性组分的分离方法，具体的讲，涉及一种采用膜分离技术从金醋中分离获得金醋多肽提取物的方法，属于生物工程领域。
背景技术：
短链多肽在生命过程中所起的作用比氨基酸更加积极，人体内蛋白质合成分解代谢过程。近几年的科学研究发现，人体吸收蛋白质的主要形式不是以氨基酸，而是以短肽的形式吸收的，这是人体吸收蛋白质机制研究的重大突破，具有如下特点1、不需消化，直接吸收。通常，短肽是人体自身合成的，是人体讲所吃的营养进行酶促水解。在体外已经合成好了，进入人体后不需进行二次降解，直接吸收。2、吸收迅速，口服剂如同针剂。口服进入人体，其速度如同火箭一样，有的科学家把它称为“生物导弹”，快速地穿过人体的口腔、胃，直接进入小肠，被小肠吸收，最终进入人体血液循环系统、器官及细胞组织，迅速发挥其生理作用和生物学功能。3、以完整的形式吸收。短肽自身有一层保护膜，人服用时，不会受到人体中的促酶、胰酶、淀粉酶、消化酶、胃蛋白酶及消化系统中的酸碱物质的损害或二次水解，短肽是以完整的形式被人体吸收和利用的。4、短肽具有百分之百被人体吸收的特点。吸收后，不会有任何排泄物，全部被人体吸收和利用。5、短肽具有主动被人体吸收的特点。短肽自身具有极强的活性和能量，它的主动吸收、迫使吸收，就是自身的活性和能量在起作用。因此，它在被人体吸收时，不是人体要耗费自身的能量去吸收它，而是多肽以自身的能量让人体吸收。6、短肽具有优先被人体吸收的特点。人体平常所食的营养物质，在吸收上，与短肽的竞争中，短肽具有优先吸收的特点，这与其主动吸收的特点是分不开的。7、短肽在被人体吸收时，对氨基酸有保护作用。可保护氨基酸不受破坏，因此，肽与氨基酸的混合物是人体吸收蛋白质的最佳吸收机制。8、短肽在人体中表现出载体的作用。可将人平常所食的营养物质，特别是钙等对人体有益的微量元素，吸附、粘贴、装载在本体上。9、短肽可在人体中起运输工具的作用。可将人平常所食的各种营养物质吸附在本体上后，然后运载输送到人体各个细胞、器官、组织，通本体一起被人体吸收和利用，发挥各自不同的功能作用。10、短肽被人体吸收后，在人体中起着信使作用。它作为神经递质传递信息，让人体各系统、器官、组织发挥各自和整体作用。“山西老陈醋”是我国四大名醋之首，国家原产地域保护产品。食醋的主要成分是醋酸，化学名称是乙酸，结构简式为CH3cooh。酿醋主要是以粮食为原料及菌种发酵。经过糖化、酒精发酵、醋酸发酵及后续消毒灭菌、加工包装而成，具有色香味俱佳的特点。金醋是老陈醋传统酿造工艺与高科技改良工艺相结合酿得的产品，它富含多种维生素和10余种对人体有益营养的有机酸及人体不可缺少的微量元素等营养物质，其中20 余种人体必需氨基酸的含量远高于普通老陈醋。与此同时，氨基酸在医学领域被誉为“人体黄金”，它是构建生物机体的众多生物活性大分子之一，是一切生命之原。在金醋的研发基础上衍生出一系列功能醋、保健醋、生物醋、日化醋系列金醋高端产品，标志着山西老陈醋走向创新的开始，这一伟大的科技成果将引领人类健康革命的趋向。金醋系列产品挖掘人类保健秘方，精选绿色谷物和名贵中药材为主要原料，采用传统工艺和现代生物工程技术精心酿造而成，不添加任何防腐成分。其色如琥珀，入口香浓纯熟、绵软甜酸、熏香扑鼻，品后醋香持久，回味生津，且酸度达到6度以上，比一般老陈醋存储时间更长。其食疗、药用价值非常，对上百种疾病均有极好的辅助疗效，是男女老幼皆宜的防病强身延年益寿的保健佳品。它具有降低高血脂、高血压、高血粘、高胆固醇的功效，并能缓解预防各种心脑血管疾病和各种慢性病，诸如活血通络、清理软化血管、疏通微循环，对中老年人，尤其是对患有慢性病或多种慢性病者有显著的保健作用。如果对金醋中的成分进行分析分离，以获得更多的金醋短肽分子或多肽分子的组合物，这样可以更加提高金醋的利用价值。虽然食用金醋、老陈醋或各种醋酸饮料具有很好的保健功能，但在食用过程中也存在诸多问题第一，由于金醋或老陈醋中有机酸的含量较高，总酸含量至少在5%以上，pH值较低，只有2. 7左右，如此高的酸度直接服用对牙齿、口腔以及胃粘膜有较大的刺激作用，很多消费者难以接受，也不宜长期定量的服用，并且长期喝醋也容易引起牙齿的腐蚀和脱钙寸。第二，有些特定体质或身体条件不好的人不能食用金醋或老陈醋。例如，患有胃溃疡、胆囊炎、肾炎、低血压、胆石症、骨损伤等疾病的人不宜吃醋；胃酸过多的人也不宜喝醋； 空腹时不宜吃醋。这种情况限制了金醋或老陈醋的应用。第三，金醋或老陈醋以及制备的醋酸饮料还存在携带不便的问题，并且其中黄酮等成分的存在导致容易被氧化而不能长期保存。中国发明专利CN100467036C公开了一种山楂醋酸软胶囊的制备方法，其利用不饱和的植物油与饱和植物油的混合油对浓缩山楂醋酸进行乳化改性成为稳定的乳化物料， 并被包裹于明胶皮层中而得到软胶囊，但该专利中并没有涉及金醋或山西老陈醋中功能性产品的分离及其制备方法。刘军等在《微孔膜过滤在食醋生产中应用的研究》一文公开了利用微孔膜过滤提高食醋的澄清度和降低了微生物含量的技术方案，但是并没有改变食醋的酸度和色率，也没有公开能够分离出其他功能产品的方法。本发明的目的在于将利用现代科技手段将金醋或山西老陈醋开发成适合不同人群的功能性产品，以提高金醋的利用价值和金醋对人类的效用。

发明内容
为了解决现有技术中金醋应用过程中的限制，开发适用于不同人群的金醋产品， 以及更好发挥金醋的保健功效，本发明提供了一种从金醋中分离不同金醋多肽提取物的方法。此方法操作简便、成本低廉，分离得到的金醋多肽提取物可以进一步加工成食品、保健品或药品。本发明所述的金醋多肽提取物是指在金醋中提取的含有多肽组分的提取物，该提取物还含有总酸、全糖和铵盐。在膜分离技术中，以压力差为推动力的膜过滤可区分为超滤膜过滤、微孔膜过滤和逆渗透膜过滤三类。它们的区分是根据膜层所能截留的最小粒子尺寸或分子量大小。以膜的额定孔径范围作为区分标准时，则微孔膜(MF)的额定孔径范围为0.02 10 μ m;超滤膜(UF)为0. 001 0. 02 μ m ；逆渗透膜(RO)为0. 0001 0. 001 μ m。经过反复研究发现， 本发明从金醋中分离获得金醋多肽提取物的方法中优选为将待分离的金醋进行超滤处理， 超滤膜最适于金醋溶液中溶质的分离和增浓。因此，本发明提供了一种采取膜分离技术分离金醋中的生物活性组分金醋多肽提取物的方法，更具体地讲，就是利用不同分子量的超滤膜将待分离的金醋进行超滤处理。 本发明的一种从金醋中分离获得金醋多肽提取物的方法，与现有技术相比，它包括如下步骤第一步，将待分离金醋原液中的乙酸浓度调节至3% 5%之间，用微孔滤膜过滤去除金醋中残留不溶物，得滤液一；第二步，用截流分子量为350Da的超滤膜超滤滤液一，将分子量大于350Da的组分截留得滤液二，收集分子量小于350Da的组分得滤液三；第三步，用截流分子量为3500Da的超滤膜超滤滤液二，将分子量大于3500Da的成分截留得到滤液四，收集分子量在350Da 3500Da的组分得滤液五；第四步，滤液三、滤液四和滤液五分别通过浓缩而得到金醋多肽提取物A、金醋多肽提取物B和金醋多肽提取物C。膜过滤是以压力为驱动力，在被处理金醋原液流经表面具有孔径的不对称的结构滤膜时，可以实现不同分子量物质的分离。膜过滤处理金醋原液操作方便、可靠性高、不发生相变、能耗低，并且分离效率高。一方面，本发明对上述第二步中的超滤的条件进行了优选，优选地，上述方法中， 所述的第二步中的超滤的条件为(1)超滤的进液口压力为1.0-2. 5MPa Pa，出液口压力为1. 0-2. OMPa，超滤初期采用较低压力，然后慢慢升压；在超滤过程中，采用周期性压力波动，压力波动差为
0.1-0. 2MPa ；(2)料液流速为1. 5-4. Om/s，超滤过程中，采用周期性流量波动，流速波动差为
1.0-2. 5m/s ；(3)在超滤系统中间歇通入高压惰性气体，形成气液脉冲流，周期为1-2小时通气一次，每次1分钟；(4)料液温度为40-55摄氏度；(5)料液 pH 值为 2. 0-3. 5 ；(6)当料液原液被浓缩1/15-1/10时，再加入水或稀醇溶液超滤1_2次；(7)反冲洗条件反冲洗压力为1. 5-2. OMPa,反冲洗周期为1_2小时，反冲洗时间为4-lOmin，当将超滤组件并联使用交替反冲的方法时，其中一套或几套进行正常的超滤并分流出一部分滤液来反冲另外一套或几套组件的超滤膜，间隔一段时间后交换进行，一般
6是工作10-20分钟，反冲2-5分钟；(8)化学清洗周期为1-2个月，化学清洗药剂一般为稀酸、稀碱或表面活性剂，清洗工作压力0. 05-1. OMPa，在化学清洗剂清洗后，再用水冲洗至近中性。作为本发明的第二个方面，本发明对上述第三步中的超滤的条件进行了优选，优选地，上述方法中，所述的第三步中的超滤的条件为(1)超滤的进液口压力为0. 5-2. OMPa,出液口压力为0. 2-1. 5MPa，超滤初期采用较低压力，然后慢慢升压，在超滤过程中，采用周期性压力波动，压力波动差为
0.15-0.25MPa ；(2)料液流速为1. 0-3. Om/s，超滤过程中，采用周期性流量波动，流速波动差为
1.0-1. 5m/s ；(3)在超滤系统中间歇通入高压惰性气体，形成气液脉冲流，周期为1-2小时通气一次，每次5分钟；(4)料液温度为35-55摄氏度；(5)料液 pH 值为 3. 5-6. 0 ；(6)当料液原液被浓缩1/15-1/10时，再加入水或稀醇溶液超滤1_2次；(7)反冲洗条件反冲洗压力为1. 5-3. 5MPa,反冲洗周期为1_2小时，反冲洗时间为2-lOmin，当将超滤组件并联使用交替反冲的方法时，其中一套或几套进行正常的超滤并分流出一部分滤液来反冲另外一套或几套组件的超滤膜，间隔一段时间后交换进行，一般是工作10-25分钟，反冲1-3分钟。(8)化学清洗周期为1-2个月，化学清洗药剂一般为稀酸、稀碱或表面活性剂，清洗工作压力0. 05-1. 2MPa，在化学清洗剂清洗后，再用水冲洗至近中性。本发明所提供的分离工艺主要是根据山西金醋中生物活性分子的分子量对金醋的成分进行分离。经过本发明所提供的分离方法分离后，金醋中生物活性分子将被分成三个部分含有分子量小于350Da多肽分子的组分，即金醋多肽提取物A ；分子量大于3500Da 多肽分子的组分，即金醋多肽提取物B ；含有分子量在350 3500Da之间的多肽分子的组分，即金醋多肽提取物C。优选地，可以进一步将金醋多肽提取物A改造成绿色有机酸类食品添加剂，制成新式水果醋饮料；将金醋多肽提取物B用于用于制作咀嚼片；将金醋多肽提取物C制成口服液或静脉注射液原料。作为本发明的第一种功能性产品的制备，就是将滤液三进行浓缩获得金醋多肽提取物A (含有分子量小于350Da多肽分子的组分)，进一步制备成绿色有机酸类食品添加剂或新式水果醋饮料。作为本发明的第二种功能性产品的制备，就是将上述制备方法中的滤液四进行浓缩，即得到金醋多肽提取物B (含有分子量大于3500Da多肽分子的生物活性组分)，然后制备成的咀嚼片。由于金醋多肽提取物B中含有大量未被消化的大肽段，蛋白质及少量糖类， 营养成分丰富，但其在正常情况不容易被生物体快速吸收，考虑将其作成咀嚼片的方式用于人体保健。金醋多肽提取物B原料冻干粉末呈块状，有黏性，有一定的吸湿性，可以用于干法制片，具体过程如下首先将金醋多肽提取物B干燥品用粉碎机粉碎，过100目筛；然后，加辅料，包括但不限于金醋多肽提取物B干燥品、微粉硅胶、微晶纤维素和乳糖中的一种或多种；最后，混合均勻后进行压片，制备获得咀嚼片。作为本发明的一个优选实施例，本发明的咀嚼片中含有金醋多肽提取物B、微粉硅胶和微晶纤维素，并且金醋多肽提取物B 微粉硅胶微晶纤维=10 1 2;作为本发明的另一个优选实施例，本发明的咀嚼片中含有金醋多肽提取物B、微粉硅胶、微晶纤维素和乳糖，并且金醋多肽提取物B 微晶纤维素乳糖=10 2 2。根据成片情况看，以上配方压成的片剂成型较好，基本符合条件。但有两处可继续改进第一，由于原料有一定吸湿性，故可考虑加上包衣；第二，由于制出的片剂口感一般， 考虑加入一定量的食用香精作为矫味剂。作为本发明的第三种功能性产品的制备，就是将上述方法中滤液五进行浓缩得到金醋多肽提取物C(含有分子量为350-3500Da多肽分子的组分)。基于短肽在人体内部的重要作用，本发明人将金醋多肽提取物C制备成口服液。在本发明所采用的技术方案中，我们从众多的可药用的辅料中选择了丙二醇、甘油、乙醇、聚乙二醇-300、聚乙二醇-400中的一种或其两种作为本发明的必备辅料成分。我们在实验过程中意外发现，当金醋多肽提取物C的溶液在含有上述的任一种或两种辅料存在的情况下，金醋多肽提取物C对光和热的稳定性显著提高。另外，在本发明技术方案的制剂配方中，蔗糖、甜蜜素、阿斯巴甜或香精等矫味剂的加入，大大改善了金醋多肽提取物C 口服溶液的口感，这是我们结合金醋多肽提取物C本身的理化性质和苦味特性，通过大量实验，从众多可药用的辅料中选择出来的口感最好的矫味剂。苯甲酸钠、尼泊金类、山梨酸及其钾盐和钙盐等防腐剂的加入可有效防止药液中细菌的滋生。本发明的制备工艺为将处方量的稳定剂置于适宜的容器中，加入处方量的金醋多肽提取物C，水浴加热使其溶解，再将处方量添加剂用少量水溶解后，加入到上述的含药混合溶液中，加水至全量，搅拌均勻，过滤，分装灭菌即得。本发明提供的金醋多肽提取物C 口服溶液的用法用量为口服，每日三次，一次 5mg-1000mg(含有分子量为350_3500Da多肽分子的组分)。本发明金醋多肽提取物C(含有分子量为350-3500Da多肽分子的组分)口服溶液的优点在于药物以分子状态分散在介质中，分散度大、吸收快，能迅速发挥药效；服用方便，易于分剂量，特别适用于老年患者，能减少药物的刺激性，有利于提高药物的生物利用度。避免普通制剂在胃肠道局部药物浓度过高，刺激胃肠粘膜等缺点，减少不良反应，提高患者用药的依从性，具有服用方便、吸收快、生物利用度高等特点。发明人还将分子量在含有金醋多肽提取物C制备成静脉注射液形式，本发明的所述的静脉注射液剂含有金醋多肽提取物C和药物可接受的载体。本发明多提供的静脉注射液具有稳定性高，复溶性好的特点。金醋多肽提取物C的水溶性较差，我们通过大量的实验筛选出下面的辅料成分和合适的范围，运用下面的制备工艺，有效的解决了金醋多肽提取物C中多肽分子的组分复溶后澄明度不合格的问题。金醋多肽提取物C的组分冻干粉针剂的载体可以选自甘露醇、乳糖、右旋糖苷20、右旋糖苷60、右旋糖苷80、NaCl、葡萄糖、山梨醇中的一种或多种。金醋多肽提取物C和药物可接受的载体之间的重量比可以是 1 0.1-10，优选为1 1-5。金醋多肽提取物C在注射液中的含量规格是1-lOOmg，金醋多肽提取物C组分的含量规格优选为5mg、10mg、20mg、50mg。
本发明所述注射液的制备方法，包括下列步骤(1)除热原在注射用水加入注射用活性炭于60-200°C加热30-40分钟滤过；(2)配制药液将金醋多肽提取物C加注射用水适量，溶解，加入药物可接受载体， 加注射用水到规定量；(3)除菌将步骤b的滤液用除菌滤器进行正压除菌滤过；(4)灌装用管制西林瓶进行无菌灌装；(5)注射液灭菌；(6)质检。本发明还对上述注射液的制备方法进行了优选，优选地，它包括如下步骤(1)除热原；注射用水中加入注射剂用活性炭，在60-200°C加热30分钟，用滤膜过滤，收集滤液，备用；(2)配制药液称取原料，加乳酸适量溶解，加上述注射用水，浓度为0. 2g/ml。然后，加入经过规定量的预先经过除菌除热原处理的药物可接受的载体混勻，再加注射用水至规定体积；(3)除菌将上述滤液按无菌操作法用除菌滤器进行正压除菌滤过，用0.22 μ M微孔滤膜过滤，滤液进行热原检查和半成品含量检查然后分装；(4)罐装管制西林瓶的处理选用截留分子量为1万至20万的超滤膜(平均孔径为2nm到0. 1 μ m)，除去相对分子质量为几万至几百万的热原，则应再使用热原吸附剂除去小分子质量的热原，包括相对分子量约2000的类脂A ；罐装在100级洁净区进行灌装， 加塞；(5)注射液的灭菌湿热灭菌，压力125MPa，灭菌20min ；(6)质检澄明度检查、热原检测(参见2010版药典，鲎试剂检测)、无菌检测(参见2010版药典，主要为将注射剂加入培养基中无菌条件下培养14天，不得见到有细菌出现)。本发明的注射剂具有稳定性好，疗效优良，使用方便的特点，比水针剂具有更好的稳定性，以下通过实验说明本发明的有益效果。总之，本发明与现有技术相比，具有如下技术优势1、采用膜过滤工艺分离金醋中的生物活性成分，可最大限度的保证分离得到成分的生物活性，使其营养价值和医药价值不受影响。2、膜过滤工艺操作简单，重现性高，不仅可以保证各个批次之间的工艺稳定性，更具有价格低廉等优势。3、采用本分离工艺可以使350 3500Da的多肽组分中寡肽含量占到金醋中的寡肽含量的50%左右，分离效率较高。4、本分离工艺所得的三种金醋多肽提取物，均可作为新的功能性产品开发的原料，为金醋的深层次加工提供了良好的借鉴效果，开拓了进醋的品牌影响。
具体实施例方式以下通过具体实施例进一步描述本发明，但本发明不仅仅限于以下实施例。在本发明的范围内或者在不脱离本发明的内容、精神和范围内，对本发明所述的金醋多肽提取物、制备方法和用途仅仅进行名称上的变更、替换，对于本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明范围之内。实施例1 一种从金醋中分离获得金醋多肽提取物的方法第一步，将待分离金醋原液中的乙酸浓度调节至3% 5%之间，用微孔滤膜过滤去除金醋中残留不溶物，得滤液一；第二步，用截流分子量为350Da的超滤膜超滤滤液一，将分子量大于350Da的组分截留得滤液二，收集分子量小于350Da的组分得滤液三；超滤的条件为(1)超滤的进液口压力为1. 5MPa,出液口压力为1. 2MPa，超滤初期采用较低压力， 然后慢慢升压；在超滤过程中，采用周期性压力波动，压力波动差为0. 1-0. 15MPa ；(2)料液流速为1. 5 3. 5m/s，超滤过程中，采用周期性流量波动以便在膜通道内产生脉动或不稳定流，流速波动差为1. 5 2. Om/s ；(3)在超滤系统中间歇通入高压惰性气体，如氮气或氩气，形成气液脉冲流，周期为2小时通气一次，每次1分钟；(4)料液温度为45摄氏度；(5)料液 pH 值为 2. 5 ；(6)当料液原液被浓缩1/15-1/10时，再加入水或稀醇溶液超滤1次，稀醇溶液为 0. 5%的乙醇。(7)反冲洗条件反冲洗压力为1. 5-2. OMPa,反冲洗周期为1小时，反冲洗时间为 %iin，当将超滤组件并联使用交替反冲的方法时，其中一套或几套进行正常的超滤并分流出一部分滤液来反冲另一套或几套组件的超滤膜，间隔一段时间后交换进行，一般是工作 10分钟，反冲2分钟；(8)化学清洗周期为1个月，化学清洗药剂稀碱，稀碱为0. 4%的氢氧化钠溶液，清洗工作压力0. 05-1. OMPa，在化学清洗剂清洗后，再用水冲洗至近中性。第三步，用截流分子量为3500Da的超滤膜超滤滤液二，将分子量大于3500Da的成分截留得到滤液四，收集分子量在350Da 3500Da的组分得滤液五；超滤的条件为(1)超滤的进液口压力为0. 8MPa,出液口压力为0. 5MPa，超滤初期采用较低压力， 然后慢慢升压，在超滤过程中，采用周期性压力波动，压力波动差为0. 15-0. 20MPa ；(2)料液流速为2. 0 3. Om/s，超滤过程中，采用周期性流量波动以便在膜通道内产生脉动或不稳定流，流速波动差为1. 0 1. 5m/s ；(3)在超滤系统中间歇通入高压惰性气体，如氮气或氩气，形成气液脉冲流，周期为2小时通气一次，每次5分钟；(4)料液温度为45摄氏度；(5)料液 pH 值为 4. 5 ；(6)当料液原液被浓缩1/15-1/10时，再加入水或稀醇溶液超滤2次；(7)反冲洗条件反冲洗压力为1. 5-3. 5MPa,反冲洗周期为2小时，反冲洗时间为 2-lOmin，当将超滤组件并联使用交替反冲的方法时，其中一套或几套进行正常的超滤并分流出一部分滤液来反冲另一套或几套组件的超滤膜，间隔一段时间后交换进行，一般是工作25分钟，反冲3分钟。
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(8)化学清洗周期为2个月，化学清洗药剂一般为稀酸、稀碱或表面活性剂，清洗工作压力0. 05-1. OMPa，在化学清洗剂清洗后，再用水冲洗至近中性。第四步，滤液三、滤液四和滤液五分别通过浓缩而得到金醋多肽提取物A、金醋多肽提取物B和金醋多肽提取物C。经过检测金醋多肽提取物C中含有金醋多肽45. 00%，总酸17. 78%，全糖(以葡萄糖计)36. 22%，铵盐1.00%。实施例2 —种从金醋中分离获得金醋多肽提取物的方法第一步，将待分离金醋原液中的乙酸浓度调节至3% 5%之间，用微孔滤膜过滤去除金醋中残留不溶物，得滤液一；第二步，用截流分子量为350Da的超滤膜超滤滤液一，将分子量大于350Da的组分截留得滤液二，收集分子量小于350Da的组分得滤液三；超滤的条件为(1)超滤的进液口压力为1.5MPa，出液口压力为1. 2MPa，超滤初期采用较低压力， 然后慢慢升压；在超滤过程中，采用周期性压力波动，压力波动差为0. 1-0. 2MPa ；(2)料液流速为1. 5 4. Om/s，超滤过程中，采用周期性流量波动以便在膜通道内产生脉动或不稳定流，流速波动差为1. 0 2. 5m/s ；(3)在超滤系统中间歇通入高压惰性气体，如氮气或氩气，形成气液脉冲流，周期为1-2小时通气一次，每次1分钟；(4)料液温度为45摄氏度；(5)料液 pH 值为 2.5 ；(6)当料液原液被浓缩1/15-1/10时，再加入水或稀醇溶液超滤1_2次。(7)反冲洗条件反冲洗压力为1. 5-2. OMPa，反冲洗周期为1_2小时，反冲洗时间为4-lOmin，当将超滤组件并联使用交替反冲的方法时，其中一套或几套进行正常的超滤并分流出一部分滤液来反冲另一套或几套组件的超滤膜，间隔一段时间后交换进行，一般是工作10-20分钟，反冲2-5分钟；(8)化学清洗周期为1-2个月，化学清洗药剂一般为稀酸、稀碱或表面活性剂，清洗工作压力0. 05-1. OMPa，在化学清洗剂清洗后，再用水冲洗至近中性。第三步，用截流分子量为3500Da的超滤膜超滤滤液二，将分子量大于3500Da的成分截留得到滤液四，收集分子量在350Da 3500Da的组分得滤液五；超滤的条件为(1)超滤的进液口压力为0. 8MPa,出液口压力为0. 5MPa，超滤初期采用较低压力， 然后慢慢升压，在超滤过程中，采用周期性压力波动，压力波动差为0. 15-0. 25MPa ；(2)料液流速为1. 0 3. Om/s，超滤过程中，采用周期性流量波动以便在膜通道内产生脉动或不稳定流，流速波动差为1. 0 1. 5m/s ；(3)在超滤系统中间歇通入高压惰性气体，如氮气或氩气，形成气液脉冲流，周期为1-2小时通气一次，每次5分钟；(4)料液温度为45摄氏度；(5)料液 pH 值为 4. 5;(6)当料液原液被浓缩1/15-1/10时，再加入水或稀醇溶液超滤1_2次；
(7)反冲洗条件反冲洗压力为1. 5-3. 5MPa，反冲洗周期为1_2小时，反冲洗时间为2-lOmin，当将超滤组件并联使用交替反冲的方法时，其中一套或几套进行正常的超滤并分流出一部分滤液来反冲另一套或几套组件的超滤膜，间隔一段时间后交换进行，一般是工作10-25分钟，反冲1-3分钟。(8)化学清洗周期为1-2个月，化学清洗药剂一般为稀酸、稀碱或表面活性剂，清洗工作压力0. 05-1. 2MPa，在化学清洗剂清洗后，再用水冲洗至近中性。第四步，滤液三、滤液四和滤液五分别通过浓缩而得到金醋多肽提取物A、金醋多肽提取物B和金醋多肽提取物C。经过检测金醋多肽提取物C中含有金醋多肽50. 30%，总酸15. 78%，全糖(以葡萄糖计)33. 22 %，铵盐0. 70 %。实施例3: 口服液的制备
金醋多肽提取物C
乙醇蔗糖
苯甲酸钠尼泊金甲酯香精
50mg IOml 60g 1.2g 2. 5g 0. 5g
加水至1000ml 制备工艺处方量的稳定剂置于适宜的容器中，加入实施例2制备的金醋多肽提取物C (即含有分子量在350-3500Da之间的多肽分子的组分，下同)，水浴加热使其溶解，再将处方量添加剂用少量水溶解后，加入到上述的含药混合溶液中，加水至全量，搅拌均勻， 过滤，分装灭菌即得。
实施例4 口服液制备
金醋多肽提取物C
聚乙:
-300
蔗糖
尼泊金乙酯
制备工艺同实施例1。 实施例5 口服液制备
25mg 200ml 70g 1.5g 加水至1000ml金醋多肽提取物C200mg
聚乙二醇-300300ml
阿斯巴甜IOg
加水至IOOOml制备工艺同实施例1。实施例6 金醋多肽提取物C注射剂金醋多肽提取物C IOOg右旋糖苷2050g加注射用水至 IOOOml第一，除热原注射用水中加入注射剂用活性炭，在60-200°C加热30分钟，用滤膜过滤，收集滤
液，备用。第二，配制药液称取实施例2制备的金醋多肽提取物C，加乳酸适量溶解，加上述注射用水，浓度为0. 2g/ml。然后，加入经过规定量的预先经过除菌除热原处理的药物可接受的载体混勻， 再加注射用水至规定体积。第三，除菌将上述滤液按无菌操作法用除菌滤器进行正压除菌滤过，用0. 22μΜ微孔滤膜过滤，滤液进行热原检查和半成品含量检查然后分装。第四，罐装管制西林瓶的处理选用截留分子量为1万至20万的超滤膜(平均孔径为2nm到 0. 1 μ m)，除去相对分子质量为几万至几百万的热原，则应再使用热原吸附剂除去小分子质量的热原，包括相对分子量约2000的类脂A。罐装在100级洁净区进行灌装，加塞。第五，注射液的灭菌；湿热灭菌，压力125MPa，灭菌20min第六，质检澄明度检查、热原检测(参见2010版药典，鲎试剂检测)、无菌检测 (参见2010版药典，主要为将注射剂加入培养基中无菌条件下培养14天，不得见到有细菌出现)。实施例7 金醋多肽提取物C注射剂金醋多肽提取物C 50g乳糖50g加注射用水至IOOOml除辅料与实施例6不同外，其他同实施例6。实施例8金醋多肽提取物B的咀嚼片金醋多肽提取物B5g
微晶纤维素30g
甘露醇60g
氧化铁红1. 5
4%PVPK3。乙醇溶液40g 硬脂酸锌 Ig制备工艺取实施例2制备的金醋多肽提取物B作为原料，将金醋多肽提取物B、 氧化铁红先过120目筛，微晶纤维素、甘露醇过100目筛，然后将氧化铁红与金醋多肽提取物B按等量递加法混合均勻，混合后过100目筛2次，然后将上述的混合粉再与甘露醇按等量递加法混合均勻，每次混合后过80目筛，然后将所有内加的原辅料加入4% PVPK30乙醇溶液制粒，干燥后加入处方量的硬脂酸锌混合均勻，压片即得。实施例7金醋多肽提取物B咀嚼片的制备
金醋多肽提取物B5g
微晶纤维素30g
甘露醇60g
氧化铁红1. 5
4%PVPK3。乙醇溶液40g
硬脂酸锌Ig制备工艺取实施例2制备的金醋多肽提取物B作为原料，将金醋多肽提取物B、 氧化铁红先过120目筛，微晶纤维素、甘露醇过100目筛，然后将氧化铁红与金醋多肽提取物B按等量递加法混合均勻，混合后过100目筛2次，然后将上述的混合粉再与甘露醇按等量递加法混合均勻，每次混合后过80目筛，然后将所有内加的原辅料加入4% PVPK30乙醇溶液制粒，干燥后加入处方量的硬脂酸锌混合均勻，压片即得。实施例8金醋多肽提取物C对STZ糖尿病小鼠糖化血红蛋白的影响1、实验目的本研究通过观察金醋多肽提取物C对链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠糖化血红蛋白的影响，以探讨金醋多肽提取物C对糖尿病的疗效。2、动物模型的建立选用SD大鼠90只，雄性，体重Q50 士 20)g，由中山大学动物实验中心提供。所有大鼠适应性喂养一周后，禁食12h，按照65mg/kg腹腔内一次性注射链脲佐菌素(STZ)。STZ 临用前用枸橼酸钠缓冲液(0. lmol/L, PH4. 5)配制成2%的STZ注射剂，IOmin内用完。全部大鼠在同一动物房内分笼饲养，标准饮食。连续喂养2周，测血糖和糖化血红蛋白，其中糖尿病大鼠(DM大鼠)的选择标准需同时满足如下三个条件大鼠血糖高于16.7mmol/L。3、分组与给药成模DM大鼠随机分成一个模型组和6个给药组，另外增设1个正常组，正常组选用SD大鼠，每组10只，各组均采取灌胃给药方式。具体分组及给药如下正常对照组灌胃同体积的纯化水；模型对照组灌胃同体积的羧甲基纤维素钠；吡格列酮组灌胃ang/(kg. d)吡格列酮金醋多肽提取物C低剂量组灌胃200mg/(kg.d)实施例2制备的金醋多肽提取物 C；金醋多肽提取物C中剂量组灌胃400mg/(kg.d)实施例2制备的金醋多肽提取物 C；金醋多肽提取物C高剂量组灌胃400mg/(kg.d)实施例2制备的金醋多肽提取物 C04、实验方法与指标检测DM大鼠模型成功后，继续喂养12周，期间按照上述给药方案进行给药，并进行严密观察。末次给药后，大鼠取血，迈瑞全自动生化分析仪检测血糖；使用日本TOSOH公司 HLC-723G7糖化血红红蛋白分析仪检测糖化血红蛋白。收集数据，用SPSS12. 0软件处理，数据用均数加减标准差表示，两组间差异性显著比较用t检验。血糖水平是衡量糖尿病的指标，血糖浓度越大表示糖尿病的病情越严重；糖化血红蛋白水平与糖尿病的恶化程度正相关。5.实验结果5. 1金醋多肽提取物C对DM大鼠血糖的影响实验结果表明(具体参见表1)与模型组比较，各治疗组在降低血糖方面具有极显著性性差异。这表明本发明提取分离的金醋多肽提取物C具有降低血糖的功效。表1金醋多肽提取物C对DM大鼠血糖的影响
权利要求
1.一种从金醋中分离金醋多肽提取物的方法，其特征在于它包括如下步骤第一步，将待分离金醋原液中的乙酸浓度调节至3% 5%之间，用微孔滤膜过滤去除金醋中残留不溶物，得滤液一；第二步，用截流分子量为350Da的超滤膜超滤滤液一，将分子量大于350Da的组分截留得滤液二，收集分子量小于350Da的组分得滤液三；第三步，用截流分子量为3500Da的超滤膜超滤滤液二，将分子量大于3500Da的成分截留得到滤液四，收集分子量在350Da 3500Da的组分得滤液五；第四步，滤液三、滤液四和滤液五分别通过浓缩而得到金醋多肽提取物A、金醋多肽提取物B和金醋多肽提取物C。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第二步中的超滤的条件为(1)超滤的进液口压力为1.0-2. 5MPa,出液口压力为1. 0-2. OMPa，超滤初期采用较低压力，然后慢慢升压；在超滤过程中，采用周期性压力波动，压力波动差为0. 1-0. 2MPa ；(2)料液流速为1.5-4. Om/s，超滤过程中，采用周期性流量波动，流速波动差为 1. 0-2. 5m/s ；(3)在超滤系统中间歇通入高压惰性气体，形成气液脉冲流，周期为1-2小时通气一次，每次1分钟；(4)料液温度为40-55摄氏度；(5)料液pH 值为 2. 0-3. 5 ；(6)当料液原液被浓缩1/15-1/10时，再加入水或稀醇溶液超滤1-2次；(7)反冲洗条件反冲洗压力为1.5-2.OMPa，反冲洗周期为1_2小时，反冲洗时间为 4-lOmin，当将超滤组件并联使用交替反冲的方法时，其中一套或几套进行正常的超滤并分流出一部分滤液来反冲另外一套或几套组件的超滤膜，间隔一段时间后交换进行，一般是工作10-20分钟，反冲2-5分钟；(8)化学清洗周期为1-2个月，化学清洗药剂一般为稀酸、稀碱或表面活性剂，清洗工作压力0. 05-1. OMPa，在化学清洗剂清洗后，再用水冲洗至近中性。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第三步中的超滤的条件为(1)超滤的进液口压力为0.5-2. OMPa,出液口压力为0. 2-1. 5MPa，超滤初期采用较低压力，然后慢慢升压，在超滤过程中，采用周期性压力波动，压力波动差为0. 15-0. 25MPa ；(2)料液流速为1.0-3.Om/s，超滤过程中，采用周期性流量波动，流速波动差为 1. 0-1. 5m/s ；(3)在超滤系统中间歇通入高压惰性气体，形成气液脉冲流，周期为1-2小时通气一次，每次5分钟；(4)料液温度为35-55摄氏度；(5)料液pH 值为 3. 5-6. 0 ；(6)当料液原液被浓缩1/15-1/10时，再加入水或稀醇溶液超滤1-2次；(7)反冲洗条件反冲洗压力为1.5-3.5MPa，反冲洗周期为1_2小时，反冲洗时间为 2-lOmin，当将超滤组件并联使用交替反冲的方法时，其中一套或几套进行正常的超滤并分流出一部分滤液来反冲另外一套或几套组件的超滤膜，间隔一段时间后交换进行，一般是工作10-25分钟，反冲1-3分钟。(8)化学清洗周期为1-2个月，化学清洗药剂一般为稀酸、稀碱或表面活性剂，清洗工作压力0. 05-1. 2MPa，在化学清洗剂清洗后，再用水冲洗至近中性。
4.一种食品添加剂，它包括如权利要求1所述的金醋多肽提取物A。
5.一种咀嚼片，它包含如权利要求1所述的金醋多肽提取物B。
6.如权利要求5所述的咀嚼片，其特征在于它还含有微粉硅胶和微晶纤维素。
7.如权利要求6所述的咀嚼片，其特征在于，金醋多肽提取物B微粉硅胶微晶纤维 =10 1 2。
8.一种口服液，它包含如权利要求1所述的金醋多肽提取物C。
9.如权利要求7所述的口服液，其特征在于，它含有防腐剂，还含有丙二醇、甘油、乙醇、聚乙二醇-300和聚乙二醇-400中的一种或其两种。
10.一种注射液，它包含如权利要求1所述的金醋多肽提取物C。
11.如权利要求1、8或9所述的金醋多肽提取物C在制备治疗糖尿病的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种从金醋中分离获得金醋多肽提取物的方法，属于生物工程领域。为了解决现有技术中金醋应用过程中的限制，开发适用于不同人群的金醋产品，以及更好发挥金醋的保健功效，本发明提供了一种从金醋中分离不同金醋多肽提取物的方法，具体涉及使用特定超滤膜处理的工艺将金醋中的多肽提取物按照350Da以下，350-3500Da之间和大于3500Da分为三种不同的金醋多肽提取物。该方法操作简便、成本低廉，分离得到的金醋多肽提取物可以进一步加工成食品、保健品或药品。
文档编号A61P3/10GK102276687SQ20111017977
公开日2011年12月14日 申请日期2011年6月29日 优先权日2011年6月29日
发明者王建忠 申请人:王建忠