专利名称：一种非小细胞肺癌标志物及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种肿瘤标志物及其应用。
背景技术：
肺癌是呼吸系统常见的恶性肿瘤，被认为是癌症中的第一杀手。目前我国肺癌的 5年生存率仅10%，只有15%的患者在确诊时病变局限，而大部分确诊时已失去手术机会， 因此预后极差，病死率极高。
肺癌的高病死率主要原因是由于无法做到早期诊断所致，因此，早期诊断肺癌是不失时机、及时规范治疗并改善其预后的最有效措施。目前影像学和纤维支气管镜检查是诊断肺癌的主要手段，与两者相比，肿瘤标志物检测具有简便、费用相对低、没有射线危害、风险小、病人容易接受等优点。在临床上肿瘤标志物已成为肿瘤患者早期发现的重要检查指标之一。不但能提高早期诊断率，还对肺癌的治疗效果及预后判断起着重要指导作用。目前，常见的肿瘤标志物如CEA、CA125和CYFRA21-1等，被单独用于检测肿瘤包括非小细胞肺癌细胞或者联合应用， 但是其特异性、敏感性有待进一步提高。因此，寻找更多特异性敏感性更高的肺癌标志物，对目前诊断和治疗肺癌都有重大意义，已成为肺癌防治的当务之急。STAT3是在1994年作为白细胞介素-6 (IL-6)信号传递中的急性期反应因子 (APRF)被纯化的，是一种存在于细胞浆与酪氨酸磷酸化信号通道耦联的双功能蛋白，广泛表达于不同类型的细胞和组织中。编码STAT3的基因在人类定位于第12号染色体(ql3至 ql4_l)。在正常情况下，STAT3信号途径的激活是一个瞬时的过程，并受严密调控，参与细胞的增殖、分化及凋亡等，其持续激活却可致细胞异常增殖和恶性转化，阻止细胞凋亡，参与人类恶性肿瘤的发生发展和演进全过程。近年来发现STAT3在多种恶性肿瘤组织与细胞系中均有异常表达和活性增强。但STAT3其在肺癌患者尤其是非小细胞肺癌患者的组织及血液中的表达情况，及作为一种新的肺癌诊断的标志物可行性，以及其相关应用，目前尚无文献报道。
发明内容
本发明的发明目的之一在于针对上述存在的问题，提供新的非小细胞肺癌诊断标志物。本发明采用的技术方案是这样的该标志物为STAT3。进一步的该标志物还包括CEA、CA125和CYFRA21-1，即采用STAT3与CEA、CA125 和CYFRA21-1作为标志物物四项联检。发明人主要通过以下的实验研究，为上述内容进行了充分的证明
采用免疫组化、荧光定量PCR等方法测定人肺腺癌细胞A549和正常人胚肺细胞MRC -5 中STAT3、CEA、CA125蛋白和mRNA的表达，同时对STAT3分别与CEA、CA125的相关性进行比较。免疫组织化学染色图像分析结果提示STAT3蛋白、CEA蛋白、CA125蛋白在人肺腺癌细胞A549中的表达水平均明显高于它们各自在正常人胚肺细胞MRC-5中的表达，它们各自在两组细胞中的表达差异有显著统计学意义。STAT3蛋白与CEA蛋白及CA125蛋白在人肺腺癌细胞A549中的表达呈正相关。荧光定量PCR技术结果显示STAT3、CEA、CA125和GAPDH 扩增产物特异；扩增效率分别为96. 97%,98. 71%,95. 17和％ 96. 76%。STAT3 mRNA.CEA mRNA、CA125 mRNA在人肺腺癌细胞A549中的表达水平均明显高于它们各自在正常人胚肺细胞MRC-5中的表达，经统计学分析，它们各自在两组细胞中的表达差异具有统计学意义。STAT3 mRNA与CEA mRNA及CA125 mRNA在人肺腺癌细胞A549中的表达呈正相关。本发明的发明目的之二在于提供STAT3作为非小细胞肺癌标志物在制备非小细胞肺癌诊断试剂中的应用。作为优选所述诊断试剂为试剂盒。进一步的所述试剂盒包括
以常规方法特异性扩增SATA3基因或转录本的引物； 或/和特异性识别STAT3基因或转录本的探针； 或特异性结合STAT3蛋白的抗体或配体。更进一步的所述试剂盒还包括 DNA提取试剂；
或/和其他聚合酶链反应(PCR)试剂； 或酶联免疫检测(如ELISE)试剂。发明人主要通过以下的实验研究，为上述内容进行了充分的证明
利用Real-Time PCR、酶联免疫吸附(Elise)等方法，分别检测了在肺癌及其配对的正常组外周血中STAT3的mRNA表达水平，及外周血清中STAT3、CEA、CA125及CYFRA21-1蛋白的表达。发现STAT3的mRNA和蛋白在外周血中都有较高水平的表达，且与肺癌的病理类型及分化程度有密切相关性，与有无淋巴结转移无相关。分析STAT3的表达和患者的临床特征之间的相关性表明，STAT3参与了肺癌的发生和发展的过程。本实验还提示STAT3蛋白与CEA、CA125、CYFRA21-1对非小细胞肺癌具有相同的诊断价值，准确性无明显差异。应用 STAT3+CEA+CA125+CYFRA21-1四项联检准确性明显高于CEA+CA125+CYFRA21-1三项联检， 达到较高的诊断价值。本发明的发明目的之三在于提供STAT3作为小细胞肺癌标志物在制备治疗非小细胞肺癌的药物中的应用。作为优选所述治疗非小细胞肺癌的药物为采用RNA干扰技术制得的 siRNA-STAT3。进一步的所述siRNA_STAT3的核苷酸序列为
5 ’ -GATCCCCGACTCCAGTGGTAATCTACTTCAAGAGAGTAGATTACCACTGGAGTCTTTTTA-3’。发明人利用基因重组技术，针对STAT3基因编码区、能在体内转录产生发夹状小干扰RNA (siRNA)的真核表达载体PSUPER-STAT3构建成功；并将其成功转染入真核细胞中，为进一步深入关于肺癌RNAi的实验研究及抗肿瘤的基因治疗奠定了基础。利用A549 细胞株，在分子水平上，体内转录产生的针对STAT3基因的siRNA可抑制A549细胞的STAT3 mRNA的表达，并抑制A549细胞的生长，促进其凋亡。运用RNAi技术，可以有效地抑制STAT3的基因表达，诱导细胞凋亡，为肺癌的分子机制研究和基因治疗奠定基础，提供了制备相关
靶向药物的应用。
图1是STAT3蛋白在A549细胞中的表达(PV法X 200)； 图2是STAT3蛋白在MRC-5细胞中的表达(PV法X 200)；
图3是CEA蛋白在A549细胞中的表达(PV法X 200)； 图4是CEA蛋白在MRC-5细胞中的表达(PV法X 200)； 图5是CA125蛋白在A549细胞中的表达(PV法X 200)； 图6是CA125蛋白在MRC-5细胞中的表达(PV法X 200)； 图7是STAT3、CEA、CA125蛋白在A549和MRC-5细胞中的表达(i 士 s)； 图8-1是STAT3基因的熔解曲线； 图8-2是CEA基因的熔解曲线； 图8-3是CA125基因的熔解曲线； 图8-4是GAPDH基因的熔解曲线； 图9-1是STAT3基因的扩增曲线和标准曲线； 图9-2是CEA基因的扩增曲线和标准曲线； 图9-3是CA125基因的扩增曲线和标准曲线； 图9-4是GAPDH基因的扩增曲线和标准曲线；
图 10 是 STAT3 mRNA、CEA mRNA、CA125mRNA 在 A549 和 MRC-5 细胞中的表达( 士 s)；
图11-1是STAT3的Real-time PCR的扩增曲线；
图11-2是STAT3的Real-time PCR的熔解曲线；
图11-3是GAPDH的Real-time PCR的扩增曲线；
图11-4是GAPDH的Real-time PCR的熔解曲线；
图12-1是STAT3的Real-time PCR的标准曲线；
图12-2是GAPDH的Real-time PCR的标准曲线；
图13是各组样本外周血中STAT3 mRNA的表达；
图14是各组样本血清中STAT3蛋白的表达；
图15是血清STAT3蛋白的表达与肺癌病理组织类型的关系；
图16是在不同肿瘤组织分化程度中血清STAT3蛋白的表达；
图17是血清STAT3蛋白在有无淋巴结转移组中的表达；
图18是STAT3 mRNA及STAT3蛋白的ROC曲线；
图19-1是CEA蛋白在各组样本中的表达；
图19-2是CA125蛋白在各组样本中的表达；
图19-3是CYFRA2-1蛋白在各组样本中的表达；
图 20 是血清 CEA、CA125、CYFRA21-1 的 ROC 曲线；
图21是STAT3与CEA、CA125、CYFRA21-1 ROC曲线下面积的比较；
图 22-1 是 STAT3+CEA+CA125+CYFRA21-1 四项联检的 ROC 曲线；图22-2是CEA+CA125+CYFRA21-1三项联检的ROC曲线；
图23是利用重组DNA技术构建含目的基因的重组质粒pSUPER - siRNA - STAT3的过程示意图M是转染24h空白质粒组细胞的凋亡情况； 图25是转染24h空白对照组细胞的凋亡情况； 图26是转染24h重组质粒STAT-I组细胞的凋亡情况； 图27是转染24h重组质粒STAT-2组细胞的凋亡情况； 图28是转染4 空白质粒组细胞的凋亡情况； 图四是转染4 空白对照组细胞的凋亡情况； 图30是转染4 重组质粒STAT-I组细胞的凋亡情况； 图31是转染4 重组质粒STAT-2组细胞的凋亡情况； 图32是转染7 空白质粒组细胞的凋亡情况； 图33是转染7 空白对照组细胞的凋亡情况； 图；34是转染7 重组质粒STAT-I组细胞的凋亡情况； 图35是转染7 重组质粒STAT-2组细胞的凋亡情况。
具体实施例方式
下面结合附图，对本发明作详细的说明。为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(NEW YORKiCold Spring Harbor Laboratory Press 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。材料
人肺腺癌AM9细胞株、正常人胚肺MRC-5细胞株，由泸州医学院中心实验室提供。免疫组化
分别取已培养人肺腺癌细胞A549和正常人胚肺细胞MRC-5三天的培养液各5ml， 3000rpm离心5min，取上清液，置-80度冰箱待测。将已消毒的18mm2盖玻片置于6孔板中，按2X 104/ml的细胞密度分别将人肺腺癌细胞A549和正常人胚肺细胞MRC-5接种于盖玻片上进行细胞爬片，5天后进行免疫细胞组织化学染色鉴定。用PBS清洗标本3次，每次 5min，4%的多聚甲醛固定20min，空气干燥5min,PBS清洗标本3次，每次5min，0. 5%Triton X-IOO ( DPBS配)孵育1次20 min, PBS清洗标本3次，每次5min。3% 去离子水孵育 IOmin,阻断内源性过氧化物酶。PBS清洗标本3次，每次5min。滴加一抗(兔抗人STAT3多克隆抗体的稀释度为1:100 ；兔抗人CEA多克隆抗体稀释度为1:200 ；兔抗人CA125多克隆抗体稀释度为1:200)，用PBS代替一抗作为阴性对照，4°C冰箱过夜，PBS清洗标本4次，每次5 min。二抗工作液PV-6001 (湿盒)孵育37°C 30 min，PBS清洗标本4次，每次5 min。 DAB显色(避光，镜下观察至棕色)，所有标本都使用苏木精进行复染。
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选定阳性细胞的标准细胞中出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性表达，染色对比度好、背景清晰、定位准确；在Olympus Bx60光学显微镜100倍视野下观察整张切片的染色表达情况，在表达阳性切片中每个切片随机选择5个阳性染色区域，在200倍视野下，在统一光源、光圈、亮度、对比度、色彩饱和度及关闭白平衡条件下拍摄照片；将数码照片输入计算机，运用IPP6.0图像分析软件测定每张照片的MOD值，取每张切片的5个视野所测得MOD 值的平均值进行比较分析。MOD值代表染色强度，可较为准确的反映阳性产物表达的相对浓度，并且有较好的重复性，因此本实验采取MOD作为定量分析的检查指标。RNA抽提和cDNA的合成
总RNA从人肺腺癌细胞A549和正常人胚肺细胞MRC-5中使用总RNA提取试剂盒(离心柱型)，按厂商提供的说明抽提出。RNA标本提取后取2μ 1用微量核酸定量仪测量0拟60/ 0D280 (R)值，判断其纯度。R值在1.纩2.1者视为合格，可进行后续实验。按说明使用 ReverTra Ace组合型(BRK100RT)将部分总RNA逆转录为cDNA。荧光定量PCR
荧光定量PCR引物应用生物信息学手段和ABI公司primer express 3. 0软件进行引物设计，由上海生工生物工程有限公司合成引物。具体序列见下表(表1)。表1 STAT3、CEA、CA12-5、GAPDH 引物序列
反应体系为 25μ 1，包括2XMix(包括 Taq 酶、dNTP、Mg2+、STORGreen I 等)12. 5μ 1, 上下游引物各 1. 0μ 1，cDNA2. 0 μ 1，ddH208. 5 μ 1。反应程序为起始变性95°C，2分钟；接下去40个循环，每一个循环95°C变性5 秒，59. 5°C退火20秒，72°C延伸15秒；在循环第二步采集荧光，扩增结束后进行溶解曲线分析65°C 30s, +0. 5°C /循环&实时荧光检测，60循环。实验步骤中增加熔解曲线分析，分析产物峰是否为单峰。应用上述制备的标准品进行荧光定量PCR，按荧光定量PCR仪定量测定程序绘制标准曲线，用Bio-Rad IQ5分析软件对标准曲线、扩增效率进行分析计算。本试验采用相对定量法检验基因的表达变化。相对定量法有两种相对标准曲线定量法和Ct值比较法，本实验采用Ct值比较法。按照下列公式计算样本中STAT3 mRNA、CEA mRNA、CA125 mRNA的相对表达量 Δ Ct=目的基因Ct值一内参基因Ct值
ΔΔ Ct= ACt-(随机阴性对照样品Ct值一该样品内参Ct值) 目的基因的相对总量为2_ΔΔα
Ct值(threshold cycle)是指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数，Ct值与STAT3 mRNA,CEA mRNA、CA125 mRNA的表达水平呈负相关，即Ct值增加，表示 STAT3 mRNA、CEA mRNA、CA125 mRNA 水平下降。
统计学分析
采用SPSS16. 0统计学软件对所得实验数据进行统计学分析，实验数据均用 士 s表示，组间比较用t检验，双变量计量资料相关性分析用Pearson相关检验；以P<0. 05差异有统计学意义，P<0. 01差异有显著统计学意义。
实施例1 :STAT3蛋白在人肺腺癌细胞A549和正常人胚肺细胞MRC-5中的表达情况免疫组织化学染色结果显示，阳性表达呈棕黄色或棕褐色颗粒状沉积于阳性部位。 STAT3蛋白在人肺腺癌细胞A549中的阳性表达信号主要位于细胞质，少数位于细胞核，呈明显的棕黄色或棕褐色颗粒状染色(如附图1)。在正常人胚肺细胞MRC-5中亦见程度较弱地表达于细胞质，呈淡黄色着色(如附图2)。该蛋白在人肺腺癌细胞A549和正常人胚肺细胞MRC-5中表达的MOD值间行t检验，P=O. 006 (P<0. 01)，两者差异有显著统计学意义，提示STAT3蛋白在人肺腺癌细胞A549中的表达水平明显高于正常人胚肺细胞MRC-5。见下表 (表 2)。表2 STAT3蛋白在A549和MRC-5细胞中的表达( 士 s)
权利要求
1.一种非小细胞肺癌标志物，该标志物为STAT3。
2.根据权利要求1所述的非小细胞肺癌标志物，其特征在于该标志物还包括CEA、 CA125 和 CYFRA21-1。
3.权利要求1所述的非小细胞肺癌标志物在制备非小细胞肺癌诊断试剂中的应用。
4.如权利要求3所述的非小细胞肺癌标志物在制备非小细胞肺癌诊断试剂中的应用， 其特征在于所述诊断试剂为试剂盒。
5.如权利要求4所述的非小细胞肺癌标志物在制备非小细胞肺癌诊断试剂中的应用， 其特征在于所述试剂盒包括以常规方法特异性扩增SATA3基因或转录本的引物；或/和特异性识别STAT3基因或转录本的探针；或特异性结合STAT3蛋白的抗体或配体。
6.如权利要求5所述的非小细胞肺癌标志物在制备非小细胞肺癌诊断试剂中的应用， 其特征在于所述试剂盒还包括DNA提取试剂；或/和其他聚合酶链反应(PCR)试剂；或酶联免疫检测(如ELISE)试剂。
7.权利要求1所述的非小细胞肺癌标志物在制备治疗非小细胞肺癌的药物中的应用。
8.权利要求1所述的非小细胞肺癌标志物在制备治疗非小细胞肺癌的药物中的应用， 其特征在于所述治疗非小细胞肺癌的药物为采用RNA干扰技术制得的siRNA-STAT3。
9.如权利要求8所述的非小细胞肺癌标志物在制备治疗非小细胞肺癌的药物中的应用，其特征在于所述siRNA-STAT3的核苷酸选自下组(a):具有下述核苷酸序列5，-GATCCCCGACTCCAGTGGTAATCTACTTCAAGAGAGTAGATTACCACT GGAGTCTTTTTA-3，(b)将(a)的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代、缺失或添加形成的，具有抗非小细胞肺癌活性的药物。
全文摘要
本发明公开了一种非小细胞肺癌肿瘤标志物，属于生物技术领域，该标志物为STAT3，还可以包括CEA、CA125和CYFRA21-1，证实了STAT3在外周血和血清中的高表达，并公开了STAT3在制备非小细胞肺癌诊断试剂中的应用发明人利用，并利用基因重组技术，针对STAT3基因编码区、能在体内转录产生发夹状小干扰RNA(siRNA)的真核表达载体PSUPER-STAT3构建成功；并将其成功转染入真核细胞中，为进一步深入关于肺癌RNAi的实验研究及抗肿瘤的基因治疗奠定了基础；运用RNAi技术，可以有效地抑制STAT3的基因表达，诱导细胞凋亡，为肺癌的分子机制研究和基因治疗奠定基础，提供了制备相关靶向药物的应用。
文档编号A61P35/00GK102321760SQ201110247340
公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月26日 优先权日2011年8月26日
发明者宋本艳, 王传辉, 王超, 王鸿程, 蓝秀, 辛彩霞 申请人:泸州医学院附属医院