日本血吸虫Ago蛋白、基因、小RNA及其用途的制作方法

专利名称：日本血吸虫Ago蛋白、基因、小RNA及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及日本血吸虫Ago蛋白、基因及其小RNA及其用途。背景资料血吸虫病由血吸虫感染引起，包括日本血吸虫(Schistosoma japonic·)，曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)禾口埃及血吸虫(Schistosoma haematobium),在世界上有 76 个国家和地区遭受危害，受感染者约1.5亿。在我国流行的是日本血吸虫。血吸虫病的流行给人民身体健康和经济发展造成了巨大的损失。因此，防治血吸虫病、开发研制治疗血吸虫病和抗血吸虫的药物具有巨大的社会和经济效益。研制新的治疗血吸虫病和抗血吸虫的药物，首先必须找到合适的药物作用靶位。 近十余年，研究表明小编码 RNA，包括 siRNA(small interfering RNA)、miRNA(microRNA) 和piRNA(piwi interacting RNA)，在生物体生长发育过程中起着重要的调控作用。随着对小编码RNA研究的不断深入，越来越多与之相互作用的蛋白也开始引起人们的关注。Arg0naUte(Ag0)蛋白是其中重要一员，它通过与小编码RNA选择性结合，在生物体生长发育过程中发挥着重要作用。Ago蛋白是约IOOkD的碱性蛋白家族，其成员通常含 PAZ (PIffI-Argonaute-Zwi 11 Ie)和PIWI两个结构域，因此，通常将Ago蛋白分成PAZ和PIWI 两个亚家族。大多数生物都有多种Ago家族蛋白，不同的Ago通常具有不同的功能。目前， 未见有关日本血吸虫Ago蛋白的研究报道，但利用体外合成的小干扰RNA分子可成功将血吸虫虫体体内基因敲降，并在血吸虫不同发育时期表达一系列非编码小RNA分子，{可引用 ^^E^^JCW. :In vitro and in vivo evaluation of small interference RNA-mediated gynaecophoral canal protein silencing in Schistosoma japonicum. Cheng G, Fu Z, Lin J, Shi Y, Zhou Y, Jin Y, Cai Y.J Gene Med. 2009May ； 11 (5) :412-21}.提示 Ago 蛋白在血吸虫的生长发育中可能发挥着重要作用。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一类日本血吸虫Ago基因、蛋白及小RNA及其用途。为此，一方面，本发明公开了一类日本血吸虫Ago蛋白，为如下(a)或(b)的蛋白质(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1 3所示的蛋白质中之一；(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸或修饰且具有抗细胞凋亡活性的由(a)衍生的蛋白质中之一。另一方面，本发明还公开了一种编码本发明所述日本血吸虫Ago蛋白的基因。在一实施例里，所述基因为SEQ ID N0. 4 6所示核酸序列中之一。另一方面，本发明还公开了一种包含上述基因的重组表达载体。在一些实施方式中，所述重组表达载体可为原核表达载体或真核表达载体，其中优选真核表达载体。另一方面，本发明还公开了一种包含本发明所述重组表达载体的转化体。另一方面，本发明公开了一种日本血吸虫小RNA分子，分别具有如下特征(a)具有SEQ ID NO. 7-15所示核酸序列中之一；或(b)由(a)的小RNA分子发生一个或几个核酸置换、缺失或插入而形成的具有(a) 相同种子序列的小RNA分子。所述种子序列通常为物种间非常保守的2-6核苷酸，一般位于小RNA的第2_8位。较佳地，所述小RNA分子的核酸序列为SEQ ID NO. 7 15所示核酸序列中之一。另一方面，本发明公开了一种编码上述小RNA分子的基因，为SEQ IDN0. 16-25所示的核苷酸序列中之一；或与SEQ ID NO. 16-25所示的核苷酸序列中每条序列的互补序列中之一；或与SEQ ID NO. 16-25所示的核苷酸序列中每条序列有至少70%同源性、且编码相同小RNA分子序列中之一；较佳地，所述基因是具有SEQ ID NO. 16-25所示的核酸序列。另一方面，本发明还提供了一种特异性识别日本血吸虫Ago蛋白的抗体，其特征在于所述抗体的免疫原为本发明上述蛋白。另一方面，本发明还提供了日本血吸虫Ago蛋白在制备防治和/或治疗日本血吸虫病药物中的用途。此外，本发明还提供了日本血吸虫小RNA分子在制备血吸虫病诊断试剂中或制备防治和/或治疗日本血吸虫病药物中的用途。本发明首次公开了日本血吸虫Ago蛋白和日本血吸虫小RNA分子。本发明所提供的日本血吸虫Ago蛋白和日本血吸虫小RNA分子可作为抗血吸虫药物的作用靶点，从而在开发研制预防或治疗血吸虫病的药物的过程中发挥重要作用。另外，本发现中的血吸虫小 RNA分子可作为血吸虫病诊断的标志分子。


图1日本血吸虫Ago蛋白的表达；图2特异性抗体识别日本血吸虫Ago蛋白；图3日本血吸虫小RNA分子在血吸虫病中的检测。
具体实施例方式下文将进一步详细讨论本发明的多个方面。在本发明中，术语“日本血吸虫Ago蛋白，，指具有日本血吸虫具Ago家族蛋白特征的SEQ ID 1-3所示氨基酸序列的蛋白质。该术语还包括具有与日本血吸虫Ago蛋白相同功能的SEQ ID 1-3序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为 1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代， 以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个相似或相近的氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。
在本发明中，术语“编码日本血吸虫Ago蛋白的基因”指编码具有日本血吸虫Ago 蛋白家族的核苷酸序列，如SEQ ID 4-6所示的核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID 4-6序列中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID 4-6所示核苷酸序列的同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQ ID 1-3所示的氨基酸序列。在本发明中，术语“日本血吸虫一组小RNA分子”指具有日本血吸虫具SEQ ID 7-15所示核酸序列的小分子。该术语还包括具有与日本血吸虫小RNA分子相同功能的SEQ ID 7-15序列的变异形式。这些变异形式包括核酸的缺失、插入和/或取代，以及在3末端和/或5末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)核酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的核酸进行取代时，通常不会改变分子的功能。又比如，在3末端和/或5末端添加一个或数个相似或相近的核酸通常也不会改变分子的功能。在本发明中，术语“编码日本血吸虫小RNA基因”指编码具有日本血吸虫小RNA序列(SEQ ID 7-15)基因的核酸序列，如SEQ ID 16-25所示的核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID 16-25序列中，有一个或多个位于小RNA非编码区的序列发生变化，也能编码出SEQ ID 7-15所示的小RNA序列。本发明包括编码本发明所述蛋白的DNA以及含有这些DNA的载体、转化体。本发明中，转化体(transformant)，即带有异源DNA分子的受体细胞。本发明还包括通过合成和重组技术生产本发明所述蛋白的方法。通过本领域已知的方法可以分离和纯化多核苷酸(DNA或RNA)、载体、宿主细胞和生物体。用于本发明的载体可以是如噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或逆转录病毒载体。可用于克隆和/或表达本发明的多核苷酸的载体是能在需复制和/或表达多核苷酸的宿主细胞中复制和/或表达多核苷酸的载体。一般说来，多核苷酸和/或载体可用于任何真核或原核细胞，包括哺乳动物细胞(如人(如HeLa)、猴(如Cos)、兔(如兔网织红细胞)、大鼠、仓鼠(如CH0、NS0和幼仓鼠肾细胞)或小鼠细胞(如L细胞))、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞或细菌细胞(如大肠杆菌)。有关适用于多种类型宿主细胞的适当载体的例子可参见例如 F. Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience(1992)禾口 Sambrook et al. (1989)。可以使用含有这些多核苷酸的宿主细胞来大量表达可用于例如药物、诊断试剂、疫苗和治疗剂的蛋白质。已开发出多种方法用于经由互补的粘性末端使DNA与载体可操作相连。例如，可在欲插入载体DNA内的DNA区段添加互补的同聚体序列片段。然后通过互补同聚体尾之间的氢键连接载体和DNA区段以形成重组DNA分子。含有一或多种限制性位点的合成接头提供了另一种连接DNA区段与载体的方法。 用噬菌体T4DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I处理通过内切核酸酶限制性消化产生的 DNA区段，所述的两种聚合酶用其3'，5’-核酸外切活性除去突出的Y-单链末端，并用其聚合活性补平3’-凹端。因此，这些活性的联合产生了平端DNA区段。然后在能催化平端 DNA分子连接的酶，如噬菌体T4DNA连接酶的存在下将平端区段与大摩尔过量的接头分子一起保温。因此，反应产物是末端携有聚合接头序列的DNA区段。然后用适当的限制性酶裂解这些DNA区段，并连接至已用酶裂解的表达载体中，所述酶能产生与所述DNA区段相容的末端。从多个商家可以买到含有多个限制性内切核酸酶位点的合成接头。多核苷酸插入物可操作地连接于同表达多核苷酸的宿主细胞相容的适当启动子上。启动子可以是强启动子和/或诱导型启动子。列举的一些启动子的例子包括噬菌体久 PL启动子、大肠杆菌lac、trP、phoA、tac启动子、SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒 LTR启动子。其它适当启动子是本领域技术人员已知的。表达重组载体进一步含有转录起始、终止位点，并在转录区含有用于翻译的核糖体结合位点。重组载体表达的转录物的编码部分可包括位于起点处的翻译起始密码子和适当地位于被翻译多肽的末端的终止密码子 (UAA，UGA 或 UAG)。如上所述，表达载体可包括至少一个选择标记。所述标记包括对真核细胞培养物而言的二氢叶酸还原酶、G418、谷氨酰胺合酶或新霉素抗性；以及用于大肠杆菌和其它细菌培养的四环素、卡那霉素或氨卞青霉素抗性基因。适当宿主的代表性例子包括但不限于细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌细胞；真菌细胞，如酵母细胞(如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母)；昆虫细胞，如果蝇S2和夜蛾SF9细胞；动物细胞，如CH0，C0S，NS0，293 和Bowes黑素瘤细胞；和植物细胞。上述宿主细胞的适当培养基和培养条件是本领域已知的。本发明还包括含有本发明的核苷酸序列的宿主细胞，所述核苷酸序列经本领域已知的技术与一或多种异源控制区(如启动子和/或增强子)可操作相连。可以选择能调节插入的基因序列的表达，或能按照所需的特殊方式修饰和加工基因产物的宿主菌株。在某些诱导物的存在下，某些启动子启动的表达会升高；因此，可以控制经基因改造的多肽的表达。另外，不同宿主细胞具有特征性的和特殊的翻译、翻译后加工和修饰(如磷酸化、裂解) 蛋白质的机制。可以选择适当的细胞系以确保对表达的外源蛋白质进行合乎需要的修饰和加工。通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它方法，即可将本发明的核酸和核酸重组载体导入宿主细胞。所述方法描述于多个标准的实验室手册中，如Davis et al. ,BasicMethods In Molecular Biology (1986)。编码本发明的蛋白的多核苷酸可以与含有选择标记的载体连接以在宿主中增殖。 一般说来，可在沉淀物，如磷酸钙沉淀物或其与带电脂质的复合物中导入质粒载体。如果载体是病毒，可使用适当的包装细胞系在体外对其进行包装，再转导至宿主细胞。通过众所周知的技术可以鉴定出被成功转化的细胞，即含有本发明的DNA重组载体的细胞。例如，可培养导入表达重组载体所得的细胞以产生所需多肽。收集并裂解细胞， 使用如 Southern(1975) J. Mol. Biol. 95，503 或 Berent et al (1985) Biotech. 3，208 所述的方法，检测其DNA内容物中DNA的存在。或者，使用抗体检测上清液中蛋白质的存在。通过众所周知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化本发明的人重组chemer in 蛋白较为有利，所述方法包括硫酸按或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析、疏水电荷作用层析和凝集素层析。 在一些实施方案中，可使用高效液相层析(HPLC)进行纯化。在一些实施方案中，可使用上述的一种或多种层析方法纯化本发明的所述蛋白。 在其它实施方案中，可使用下述的一种或多种层析柱纯化本发明的人重组chemerin蛋白，所述层析柱有Q sepharose FF 柱、SP sepharose FF 柱、Q sepharose High Performance 柱、Blue sepharose FF柱、Blue 柱、Phenyl Sepharose FF柱、DEAE Sepharose FF或Methyl 柱。另外，可使用国际公开号W000/44772(全文列入本文作为参考)中描述的方法纯化本发明所述蛋白。本领域技术人员可以容易地改动其中所述的方法以用于纯化本发明所述蛋白。可以从包括例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞的原核或真核宿主经重组技术产生的产物中回收本发明所述蛋白。在本发明中，可以使用一系列本领域已知的方法来制备针对日本血吸虫Ago蛋白的抗体。例如，将提纯的日本血吸虫Ago蛋白产物或它的抗原片段注射入动物体内，产生多克隆抗体。同样，表达日本血吸虫Ago蛋白或它的抗原片段的细胞也可以用来对动物免疫而产生抗体。本发明制备的抗体也可以是单克隆抗体，这些单克隆抗体可以用杂交瘤技术制备。在本发明中，应用日本血吸虫Ago蛋白和/或一组小RNA分子，可以作为血吸虫治疗药物的作用靶位，从而在开发研制预防或治疗血吸虫病的药物的过程中发挥重要作用。 另外，本发现中的血吸虫小RNA分子可作为血吸虫病诊断的标志分子。无需进一步描述，可以相信本领域技术人员可使用上文的描述和下文性的实施例来制备和利用本发明中检测到的改变并且实践所要求的方法。因此，下述工作实施例具体描述了本发明的某些实施方案，不能将其看成是对其余内容的限制。实施例1日本血吸虫Ago蛋白基因的克隆(1)日本血吸虫总RNA抽提。日本血吸虫尾蚴感染新西兰大耳兔14天后，收集日本血吸虫童虫，液氮中保存待用。利用Trizol法提取血吸虫总RNA，并利用DNA酶处理所得总RNA，去除基因组污染。(2)日本血吸虫Agol蛋白的RACE和RACE扩增和全长克隆以人和鼠的Ago蛋白氨基酸序列查询日本血吸虫EST库中(http://www.ncbi. nlm. nih. gov/BLAST)获得1个日本血吸虫的相应EST片段(GenBank登录号AY809756. 1)， 长701bp，不含完整的0RF。以该EST序列为模板设计合成5' RACE引物(5GSP1 :5 ‘ -GAC TAG GTC GAG AAG TGC CTTGAA TAC CA-3' ；5GSP2 5' -ACG CAT GCT TCA CGT ATT GCA CGG AGT TC-3' ；5GSP 3 5' -CGA GCA GGT GGC TCA AAC TGT ATA AGG TG-3' ；5GSP4 5' -CAACTT GGT CCG CTG GTC CGT TAC CAA TC-3)，具体实验步骤按 5‘ -Full RACE Kit 操作手册进行。将RACE产物克隆到pMD19-T Vector中，挑选阳性克隆，进行序列测定分析。根据生物信息学分析获得的日本血吸虫EST片段(GenBank登录号AY809756. 1) 设计引物(3GSP1 5' -GTG GGA TGA TAA TAG ATT CAG CG-3 ；3GSP25' -GTT ATG TCA TAC ATA TGT ACG TTG-3，进行；TRACE扩增。将RACE产物克隆到pMD19_T Vector中，挑选阳性克隆，进行序列测定分析。将3、RACE和5、RACE扩增获得的序列进行电子延伸，根据电子延伸的全长的Agol 序列，设计引物(Forwa rd CCG GAA TTC ATG CTG AAT ATG TAT GGAACT ATT ；Reverse CCC GCT CGA GTG AAT GGA GGT TGA CTG GTG)，利用日本血吸虫cDNA为模板，进行扩增，获得的 PCR产物进行测序分析，进一步验证全长cDNA的获得。(2)日本血吸虫Ago2和Ago 3蛋白的RACE和RACE扩增和全长克隆Ago3
根据Genbank登录号为AY814744. 1和AY813675. 1的序列分别设计针对Ago2和 Ago 3 的 3，RACE 引物(Agol :3GSP1ATG TCA CTC ACC CAG CTC CCA CTC, 3GSP2TAT TTT ACC GCG ATG GCG TGT CAGA ；Ago3 =GSPl :5~CAC GGA ATG TGGAAC CAG GAA CT ，GSP2 :5~TTC CCA TTT AGC TGC ATT TCG TG 3、)，根据试剂盒说明书进行套式PCR，反应条件94°C，3分钟，然后94°C，30秒；53°C，20秒；72°C，3分钟，进行20循环扩增，最后72°C 10分钟。PCR 产物克隆到PMDTM19-T载体，并将重组质粒转入到大肠杆菌感受态细胞DH5 α。利用GSP2、 3~RACE试剂盒inner引物为引物进行PCR鉴定，将阳性重组克隆送北京六和华大基因科技股份公司上海测序部测序分析。按照SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒说明书处理日本血吸虫总 RNA获得5、RACE cDNA模板。Genbank登录号为AY813675. 1序列设计5、RACE引物GSPl 5~GCC TTC ATG AGA ACA AAT ATA GAA ATC A3~， GSP2 :5~TTC TGA ACG ACG ATA AAT GTA ATA GCA G3~ ；Genbank登录号为ΑΥ814744. 1 设计5、RACE引物5GSP1 :GTG AAT AAC TCG AGC GTT AAC AAC CAC AGG 5'，5GSP2 :ATG CTG CAA CCG ATT GCT TTA GCT CTT C。根据试剂盒说明书进行套式PCR，将第二轮PCR按上述3’ RACE方法克隆、序列测定分析。将;T RACE和5、RACE扩增获得的Ago2和Ago 3片段进行电子延伸，根据电子延伸的结果设计引物(Ago2 =Forward CGA GCT CCA TGT CTC AGA GAG GTTTCT, Rever se ATT TGC GGC CGC CTA CAG ATA AM CAT CCC AT ；Ago3 =ForwardCGC GGA TCC ATG GAG GAC GGG AGC TCG AAT, Rever se CGG AAT TCTTAC AAG AAA AAC ATT CCA TC)，利用日本血吸虫 cDNA为模板，进行扩增，获得的PCR产物进行测序分析进一步验证全长cDNA的获得。实施例2日本血吸虫Ago蛋白重组表达和抗体制备(1)日本血吸虫Agol蛋白的重组表达和抗体制备根据;TRACE和RACE扩增结果，选取PIWI保守功能域设计引物，sense 5 ‘ CTCGAATTCTCTTGGTGCAGATGTTAC 3' (2306-2323bp), anti-sense 5' GCGAAGCTTATGCGTTTAAAATTATGC 3‘ (3102_3119bp) 并在上下游引物分别引入Hindlll、EcoR I酶切位点序列，利用14d cDNA为模板进行PCR 扩增，利用Spin Column DNA Gel Extraction Kit回收扩增产物并对PCR产物进行酶切处理，将酶切处理的PCR纯化产物连接到经相同酶切处理的表达载体pET28b(+)上，构建重组质粒pET28M+)-agol，并转化到大肠杆菌BL21中培养。挑取阳性克隆分别进行PCR、酶切鉴定和测序验证。将验证为正确的单克隆转至500mlLB培养基中37°C培养，以200rpm摇瓶培养诱导他。离心收集菌体，超声裂解菌体蛋白，通过M柱纯化蛋白，纯化产物用SDS-PAGE 电泳检测分析。将纯化后蛋白免疫昆明系小鼠制备多克隆抗体。具体为，应用206佐剂乳化纯化蛋白，免疫剂量为50 μ g/只/次，每隔14天背部皮下多点强化免疫1次，共4次，在第8周收集动物血清，-20°C保存备用。(2)日本血吸虫Ago2和Ago 3蛋白的重组表达和抗体制备根据;T RACE和RACE 扩增结果，设计引物，上游引入BamHI酶切位点，下游引入终止密码子TAA以及HindIII酶切位点(Ago2 =Forward CGC GGA TCC ATG TTA CAT TGTTTA TAT AGA, Rever se CCC AAG CTT CTA TAG ATA AAA CAT CCC ；Ago3 =ForwardCGC GGA TCC ATG GAG GAC GGG AGC TCG AAT, Rever se CCC AAG CTT TTA TTGCTG TAT GTC ATC AGT)。将 32d 血吸虫虫体总 RNA 反转录为cDNA以该cDNA为模板PCR扩增出约为717bp目标基因片段，将片段以及pET28a (+)均用BamHI和HindIII双酶切后回收。将该回收目标片段连接到pET28a(+)，连接产物转化B121。挑选单克隆经PCR和酶切鉴定均为阳性后送阳性克隆到北京六和华大基因科技股份公司上海测序部测序测序。构建重组表达载体pET28a-SjAG03，转化BL21。将以PCR、酶切和测序鉴定均为阳性的菌pET28a-SjAG03/BL21接种于LB培养基，37°C，200rpm振荡培养，当0D600 = 1.0时加入终浓度为0. 8mmol/L的IPTG诱导表达。在IPTG诱导后0h、lh、 au3h、4h、5h、不同时间点分别收集菌液，确定最佳诱导时间和相关诱导表达条件；同时以 SDS-PAGE电泳分析经超声波裂解后的菌体蛋白，判定其表达状况。选择最佳表达时间大量表达蛋白，超声波裂解收集蛋白，BBST NTA Resin蛋白纯化柱纯化重组蛋白。将纯化的重组蛋白与206佐剂乳化抗原(体积比55 45)混合均勻，用30ug/只的剂量将重组蛋白免疫昆明系小鼠，每两周免疫一次，共免疫三次后收获抗体。昆明鼠免疫前和每次免疫后7d后进行采血，共采血4次。将免疫前、一免后7d、二免后7d、三免后7d血清1 200稀释，用酶联免疫吸附剂测定(ELISA)检测抗体效价。三免14d后收获抗血清，-20°C保存，获得针对Ago2和Ago3的抗体。(3) Western Blot法检测抗体特异性日本血吸虫总蛋白进行SDS-PAGE电泳，半干转法进行转膜；5%的脱脂奶粉溶液(溶于PBST中)中室温封闭2小时；免疫所得抗血清作为一抗进行孵育，4°C孵育过夜；PBST洗涤三次，每次5分钟，然后抗兔IgG (AP标记)室温孵育1-2小时，PBST洗涤三次，进行底物显色，结果分别如图1和图2。实施例3RNA干扰Ago蛋白影响日本血吸虫的存活将新西兰大白兔腹部贴片感染 8000条日本血吸虫的尾蚴，感染14天后将其剖杀，用37°C预热的灭菌PBS (加入双抗)在无菌条件下以门静脉灌洗法收集虫体，再用37°C预热PBS洗虫体两遍，然后再用37°C预热的 0.5%水解乳蛋白溶液洗两次，去除洗液，添加童虫培养基分至12孔培养板于37°C含有5% C02细胞培养箱中进行体外培养，每孔培养基为anl，虫体约为100条。培养4h后，换新鲜培养基，加入新鲜兔红细胞和 SiRNA(Si :sense 5' ACG CGU AAA UC⑶GA GAU ATT 3'， antisense 5' UAU CUC ACG AUU UAC GCG UTT 3' ；S2 :sense 5' GGG UAA AUC UGG UAA UAU ATT 3' ,antisense 5' UAU AUUACC AGA UUU ACC CTT 3' ；S3 :AG0_3075CCT GM ACA TT AAG AGT AA, sense 5' CCU GAA ACA UUA AGA GUA ATT 3'，antisense 5' UUA CUC UUA AUG UUUCAG GTT 3 ；Negat ive cont rol sense 5'-UUC UCC GM CGU GUC AC⑶TT-3， antisense 5' -ACG UGA CAC GUU CGG AG AATT-3，)。实验共设空白，阴性对照，阳性对照，Si，S2，S3共6组，每组设3个重复孔，加入的siRNA终浓度为ΙΟΟηΜ，24h后更换一次童虫培养基，加入新鲜兔红细胞，以及siRNA。培养4 后观察虫体，去除培养基，收集虫体，液氮保存。结果表明SiRNA持续干扰日本血吸虫三天后，观察虫体存活率以及虫体活力发现空白组存活率较高，虫体活动较活跃，而干扰组存活率仅为空白组的52. 4%,39. 2-58. 4%, 虫体活力较低。实施例4日本血吸虫小RNA分子的发现收集血吸虫不同发育时期虫体(14天到32天)，雌雄虫分开(图3)，利用Trizol 提取总RNA，将提取的总RNA按图2进行18_30nt大小的筛选，扩增，，在;T和5、端分别加上接头，将加接头的分子进行扩增，扩增结果利用solexia进行序列测定。将Solexa测序所得35nt小RNA进行分析，鉴定miRNA。
实施例5日本血吸虫小RNA分子在血吸虫病诊断中的应用将小鼠感染日本血吸虫，在感染后的14天，对小鼠采血。利用Trizol分离血液中的总RNA，根据实施例4研究获得小RNA分子设计引物，将分离的总RNA进行逆转录，获得 cDNA,以此cDNA为模板，扩增上述研究发现的小分子RNA，将扩增的小分子RNA进行序列测定。结果表明应用本研究获得小RNA分子，利用Stem-loop RT-PCR技术可检测到感染血吸虫的宿主血液中存在此分子(图4)，提示这些小分子可作为血吸虫病诊断的潜在标致分子。本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的参考文献皆全文列入本文作为参考。
权利要求
1.一种日本血吸虫Ago蛋白，其特征在于其为如下(a)或(b)的蛋白质(a)其氨基酸序列如SEQID NO. 1 3所示的蛋白质中之一；(b)(a)中所述氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸或修饰且具有抗细胞凋亡活性的由(a)衍生的蛋白质中之一。
2.一种编码权利要求1所述日本血吸虫Ago蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于所述基因的核酸序列为SEQID N0.4 6中之一。
4.一种包含权利要求2所述基因的重组表达载体。
5.一种包含权利要求4所述重组表达载体的转化体。
6.一种日本血吸虫小RNA分子，其特征在于其为如下(a)或(b)的小RNA分子(a)具有SEQID NO. 7 15所示核酸序列中之一；或(b)由(a)的小RNA分子发生一个或几个核酸置换、缺失或插入而形成的具有(a)相同种子序列的小RNA分子。
7.一种编码权利要求6所述小RNA分子的基因，其特征在于其核苷酸序列为SEQ ID NO. 16 25所示的核苷酸序列中之一；或与SEQ ID NO. 16 25所示的核苷酸序列中每条序列的互补序列中之一；或与SEQ ID NO. 16 25所示的核苷酸序列中每条序列有至少 70%同源性、且编码相同小RNA分子序列中之一。
8.一种特异性识别权利要求1所述日本血吸虫Ago蛋白的抗体，其特征在于所述抗体的免疫原为本发明上述蛋白。
9.权利要求1所述日本血吸虫Ago蛋白在制备防治和/或治疗日本血吸虫病药物中的用途。
10.权利要求6所述小RNA分子在制备血吸虫病诊断试剂中或制备防治和/或治疗日本血吸虫病药物中的用途。
全文摘要
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及日本血吸虫Ago蛋白、基因及小RNA及其用途。本发明首次公开了一种日本血吸虫Ago蛋白，其特征在于其为如下(a)或(b)的蛋白质(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO.1～3所示的蛋白质；(b)(a)中所述氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸或修饰且具有抗细胞凋亡活性的由(a)衍生的蛋白质。
文档编号A61K38/17GK102329386SQ20111024755
公开日2012年1月25日 申请日期2011年8月25日 优先权日2011年8月25日
发明者程国锋, 罗荣 申请人:中国农业科学院上海兽医研究所