专利名称：日本血吸虫(中国大陆株)mfs4基因的克隆、表达和dna疫苗的制作方法
技术领域：
本发明属于生物基因领域，具体涉及日本血吸虫(中国大陆株)MFS4基因的基因序列、日本血吸虫(中国大陆株)MFS4基因的克隆、以及在大肠杆菌中的表达、日本血吸虫(中国大陆株)MFS4基因DNA疫苗的构建及小鼠免疫保护试验。
东方田鼠(Microtus fortis)在分类学上隶属于啮齿目仓鼠科(Cricetidae)田鼠亚科(Microtinae)田鼠属(Microtus)，分布于我国西北、东北及南方16个省区，是血吸虫病流行区洞庭湖洲上广泛分布的一个优势鼠种，在我国有四个亚种。东方田鼠是至今在我国血吸虫病疫区发现的唯一一种感染日本血吸虫尾蚴后不致病的哺乳类动物。近年来研究证实，日本血吸虫流行区野生东方田鼠、非日本血吸虫流行区野生东方田鼠和室内繁殖的东方田鼠均具有抗日本血吸虫病现象。
为探讨东方田鼠抗日本血吸虫感染机制，将新鲜东方田鼠血清通过尾静脉注射被动转移给昆明系小鼠后，与对照组比较，小鼠体内血吸虫虫荷、粪便虫卵数、毛蚴孵出率，均具显著性意义变化。为进一步研究东方田鼠血清中哪些成分和因子与东方田鼠抗日本血吸虫感染相关，以ELISA方法检测东方田鼠抗血吸虫可溶性童虫抗原不同亚型的抗体，结果提示东方田鼠血清中IgG3抗体可能在其抗日本血吸虫感染中发挥重要作用，实验结果也表明，东方田鼠正常血清中存在有较高水平的抗日本血吸虫成虫可溶性抗原的IgG3亚类抗体，其OD值是抗BSA的31倍，而小鼠阴性血清为1.7倍。以上研究结果表明体液免疫在东方田鼠抗血吸虫病中发挥了重要的作用，IgG3抗体可能是东方田鼠血清中抗血吸虫病的重要成分。
本发明根据东方田鼠对日本血吸虫感染具有天然抵抗力这一特性，利用未感染日本血吸虫尾蚴的实验室繁殖的洞庭湖种群东方田鼠血清的IgG3抗体筛选日本血吸虫(中国大陆株)成虫cDNA文库，结果得到了东方田鼠血清IgG3抗体相关的日本血吸虫特异性抗原基因MFS4，并对其作为血吸虫病候选疫苗分子作了研究。
本发明应用实验室繁殖洞庭湖种群的健康东方田鼠血清和羊抗小鼠IgG3免疫筛选日本血吸虫(中国大陆株)成虫cDNA文库，经过初筛和多轮复筛，获得一阳性克隆，应用RACE技术对这一克隆的cDNA片段进行扩增。利用NCBI的Blast进行基因序列的同源性分析，结果无显著同源性基因(Score值＜50bits)，表明该基因为一血吸虫新基因。该日本血吸虫(中国大陆株)MFS4基因的核苷酸序列及相应的氨基酸序列见序列1gtatcatatc gttaacgcgc tccagttttg tttttgccca ggtattata atg gcg gtt 58Met Ala Val1ggt ggt cag aaa aag gtc act aaa ggg ggg aag aaa gga ggc aaa aag106Gly Gly Gln Lys Lys Val Thr Lys Gly Gly Lys Lys Gly Gly Lys Lys5 10 15aaa acg gct gat cca ttc tct aaa aag gag tgg tat gat atc aag gct154Lys Thr Ala Asp Pro Phe Ser Lys Lys Glu Trp Tyr Asp Ile Lys Ala20 25 30 35cca gct atg ttt cct aaa agg aca tgt gca aga acg ctt gtc aca cga202Pro Ala Met Phe Pro Lys Arg Thr Cys Ala Arg Thr Leu Val Thr Arg40 45 50act cag ggt act cgc ata gcc agt gaa gca ctt aag ggt cgt gtt gtt250Thr Gln Gly Thr Arg Ile Ala Ser Glu Ala Leu Lys Gly Arg Val Val55 60 65aca ctt agt ctt ggg gat ctg agc gaa aag aac gaa gaa gtc ttc cgt298Thr Leu Ser Leu Gly Asp Leu Ser Glu Lys Asn Glu Glu Val Phe Arg70 75 80aaa ttc aag ctt caa atc gaa gat gtc cag ggg cgt cat tgt cta aca 346Lys Phe Lys Leu Gln Ile Glu Asp Val Gln Gly Arg His Cys Leu Thr85 90 95aat ttc cac gga tta gaa ctt act cga gac aaa cta tgt tca gtt gtt 394Ash Phe His Gly Leu Glu Leu Thr Arg Asp Lys Leu Cys Ser Val Val100 105 110 115gtt aag tgg cgg tca act ata gaa gcg cac gtc gac gtc aaa aca aca 442Val Lys Trp Arg Ser Thr Ile Glu Ala His Val Asp Val Lys Thr Thr120 125 130gat gga tac tta ctt cgt ttc ttt att atc acg ttc act cca agt gta 490Asp Gly Tyr Leu Leu Arg Phe Phe Ile Ile Thr Phe Thr Pro Ser Val135 140 145cca cgg tct gaa agg ctc cac tct tat gct cag acc aca cgc ata aaa 538Pro Arg Ser Glu Arg Leu His Ser Tyr Ala Gln Thr Thr Arg Ile Lys150 155 160cgg att cgc gct cgc ctt gtt gag ata atc cag caa gag gtt tct act 586Arg Ile Arg Ala Arg Leu Val Glu Ile Ile Gln Gln Glu Val Ser Thr165 170 175tgc gat ctg aaa gag gtc gtt aat aag ctt att cca gat tcc att gca 634Cys Asp Leu Lys Glu Val Val Asn Lys Leu Ile Pro Asp Ser Ile Ala180 185 190 195caa gac gct cga aaa gcg gca tca tgg ata tat cca cta ggt gag aca 682Gln Asp Ala Arg Lys Ala Ala Ser Trp Ile Tyr Pro Leu Gly Glu Thr200 205 210ttt atc cgc aaa gtt aag gtt tta aaa aga cca aaa gct gat ctc gct 730Phe Ile Arg Lys Val Lys Val Leu Lys Arg Pro Lys Ala Asp Leu Ala215 220 225cgg ctc atg gaa ctt cat ggt gaa tca aag tca act gcc cct ggt gag 778Arg Leu Met Glu Leu His Gly Glu Ser Lys Ser Thr Ala Pro Gly Glu230 235 240act gta tcc cgt cca gat cac tat gaa cct ccg aaa gtt gat tca gtg 826Thr Val Ser Arg Pro Asp His Tyr Glu Pro Pro Lys Val Asp Ser Val245 250 255taattcaata aagaatttca tccggaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 871DNA序列分析表明该基因(MFS4)的开放阅读框含780bp，编码259个氨基酸。基因的起始密码子符合Kozak序列特征，3’端非翻译序列含有一个多聚核苷酸化信号AATAAA。MFS4基因编码产物的第23-223氨基酸区段与核糖体蛋白3A家族有60％同源性，其理论等电点(pI)为9.1，推测蛋白质分子量为29kD。利用PSORT在线预测蛋白质信号肽软件分析，在N端未发现信号肽的存在，以Tmpred软件也未预测出蛋白质跨膜区的存在。
将MFS4基因亚克隆至原核表达质粒pET28a(+)中，构建重组表达质粒pET28a/MFS4，转化BL21(DE3)表达菌后，用IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳分析显示，重组质粒获得高效表达，融合蛋白分子量大约在35kD左右。Western-blotting实验显示重组抗原可被日本血吸虫成虫粗抗原免疫小鼠血清识别，而载体表达蛋白不与抗体发生反应，表明该融合蛋白具有良好的抗原性，为进一步开展动物免疫实验提供了基础。
进一步将MFS4基因亚克隆至真核表达质粒pcDNA3中，构建成重组质粒pcDNA3/MFS4，转化TG1细菌后，扩大培养，制备纯化的重组质粒DNA作为DNA疫苗免疫6-7周龄的昆明系小鼠，每次每鼠腿部肌肉注射100ug DNA，共免疫三次，每次间隔二周，末次免疫2周后攻击日本血吸虫尾蚴，攻击后6周剖杀小鼠，门静脉灌洗收集成虫，肝脏用8％KOH消化后计算每克肝组织所荷虫卵数。结果含MFS4基因的pcDNA3/MFS4重组质粒DNA免疫鼠的虫荷数为17.13，质粒pcDNA3 DNA免疫鼠平均每鼠虫荷数为24.27，减虫率为28.6％。重组质粒免疫鼠平均每克肝组织含虫卵数为7258.49个，质粒DNA免疫鼠为9370.11个，减卵率为21.73％。
图3Western-blotting检测表达目的蛋白，用感染血吸虫小鼠血清检测，在pET28a(+)/MFS4表达产物的35kD处出现一阳性反应条带。
M标准蛋白分子量；1pET28a(+)表达产物；2pET28a(+)/MFS4表达产物图4日本血吸虫(中国大陆株)MFS4基因阳性克隆的PCR鉴定MDNA Maker 2,000；1阳性克隆的PCR产物图5阳性克隆重组质粒pBluescript IISK(+)的PCR鉴定MDNA Maker 2,000；1重组质粒的PCR产物图6阳性克隆重组质粒pBluescript IISK(+)的酶切分析MDNA Maker 2,000；1重组质粒的酶切产物
1.2日本血吸虫中国大陆株安徽品系尾蚴中国农科院上海家畜寄生虫病研究所钉螺室提供。
1.3质粒、菌种pBluescript IISK(+)克隆载体、大肠杆菌Y1090、TGI由中国农科院上海家畜寄生虫病研究所保存。pGEM-T Easy克隆载体购自Promega公司。
1.4文库日本血吸虫成虫cDNA文库采用定向克隆法将目的cDNA片段插入到λZipLox载体中，雌、雄文库库容量分别为3.74×106、3.28×106，重组率都在96％以上，插入片段多在0.5-2kb之间。
1.5主要试剂及工具酶HRP-羊抗小鼠IgG3为美国Caltag公司产品；5′RACE试剂盒、Super Script II RnaseH-反转录酶购自Gibco BRL公司；T4 DNA连接酶，购自Promega公司；限制性内切酶EcoRI、HindIII、DNA Marker DL15000、DNA Marker DL2000、dNTP Mixture为TaKaRa公司产品。Tag Plus I DNA聚合酶，购自上海生工生物工程有限公司。T3、T7及Sp6启动子引物购自上海华美生物公司。1.65′RACE的引物AAP(Abridged Anchor Primer)5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3’AUAP(Abridged Universal Amplification Primer)5’-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3’MFS4-GSP15’-GGTTCATAGTGTTCTGA-3’ (750--767)MFS4-GSP25’-GGAGCCTTTCAGACCGTGGTACA-3’(444--467)MFS4-GSP35’-CGACGTGCGCTTCTATAGTT-3’ (366--386)MFS4-GSP45’-GGCTATGCGAGTACCCTGAGTT-3’ (159--181)引物GSP1、GSP2、GSP3、GSP4是MFS4基因片段5’RACE特异的反向引物，括号内的数字表示该引物在此基因片段中的位置。引物由上海基康生物技术有限公司合成。2.方法2.1东方田鼠阴性血清制备摘眼球采血，室温静置1小时后，于4℃以4000g离心10min，取上清，然后收集血清，-20℃保存备用。
2.2血清中大肠杆菌抗体预吸收制备大肠杆裂解液贮存于-20℃备用。将血清按1∶10稀释到含3％牛血清白蛋白的TNT中，每0.1ml血清加入0.5ml大肠杆菌裂解液，混合后于4℃摇床振荡过夜后离心去沉淀，反复吸收3次。被吸收过的血清，直接用于免疫筛选或加入0.05％叠氮钠，保存于4℃备用。
2.3免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA表达文库制备大肠杆菌Y1090感受态细胞。将约3×103个噬菌体吸附于200ul Y1090感受态细胞后加人顶层琼脂，混匀后铺LB平板，42℃培养4小时。将NC膜浸润10mMIPTG，自然风干后覆盖于平板上，37℃下培养。做好标记，用TNT缓冲液洗去残存的琼脂和菌体。换液时均用TNT缓冲液洗涤。该NC膜用3％牛血清白蛋白封闭液室温下封闭30分钟。将它和吸收过的东方田鼠血清室温下作用1小时后，用辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG3反应液中(稀释度1∶1000)室温作用1.5小时。再用DAB显色液显色10分钟。观察并从平板的相应位置挑出阳性克隆，放入1mlSM中，于4℃放置若干小时，洗脱的噬菌体颗粒，以同样方法进行复筛。
2.4阳性克隆的扩增将阳性克隆噬菌体吸附于E.Coli Y1090感受态细胞，于LB平板上37℃培养过夜，用3ml SM收集噬菌体DNA。4000g，4℃离心10分钟。上清加入RNA酶A 1μl于37℃温育15分钟，加入等体积的含2％聚乙二醇和2mol/L NaCl的噬菌体稀释液，冰浴1小时。以10000g，4℃离心10分钟，回收噬菌体DNA，加入0.5mlTE(pH8.0)溶解沉淀，再加入5ul 10％SDS于68℃温育5分钟，加入10ul 5mol/L NaCl，用酚∶氯仿和氯仿各抽提一次。取水相，加入等体积异丙醇，混匀后于-70℃放置15分钟。于4℃以12000g离心15分钟。用70％乙醇洗涤沉淀，并将乙醇去净，将DNA溶于50ul TE(pH8.0)中。
2.5阳性克隆的PCR扩增鉴定以阳性克隆噬菌体为模板进行PCR，按以下体系进行Template 1μl
10×PCR buffer 5μldNTP混合物 6μlSP6引物0.5μlT7引物 0.5μlTag PlusI DNAase(4u/μl) 0.5μlddH2O 36.5μl依次加入以上各反应物，混匀后轻微离心，再覆盖2滴矿物油，进行PCR扩增。PCR条件94℃预变性5min；然后94℃ 1min，55℃ 55s，72℃ 1min，共30个循环；循环结束后72℃延伸10min。PCR反应结束后，取2μl PCR扩增反应产物于1％的琼脂糖凝胶上电泳分析。
2.6PCR产物与pBluescript IISK(+)克隆载体的连接和转化克隆载体与目的DNA的连接将质粒载体pBluescript IISK(+)、PCR产物分别用EcoRI、HindIII酶切后，电泳，用Silver Beads DNA胶回收试剂盒回收线性质粒和目的片段。按以下体系进行连接pIISK(+)载体 2μl目的基因片段 3μl10×Ligation Buffer1μlT4 DNA连接酶 1μl水 3ul总体积 10μl混匀后，16℃连接过夜。取5μl连接反应物，加入到200μl新鲜制备的TGI感受态细胞中，轻轻混匀，置冰上20min。于42℃水浴热激细胞45~50sec(其间不要摇动离心管)。热激后，立即转移至冰上放置2min。向离心管中加入800μl SOC培养基，混匀后将管转移至37℃摇床上温育1.5h(~150r/min)。取转化好的菌液200μl涂布于加有Ampicillin、X-gal和IPTG的LB平板上，37℃温箱中培养16～24h，进行蓝白斑筛选。2.7阳性克隆的鉴定及测序挑取经初步兰白斑筛选认为阳性的菌落，碱裂解法小量制备质粒DNA，-20℃保存备用。PCR鉴定取5μl质粒溶液作为PCR模板以T3及T7为引物进行PCR反应，同时以蓝斑质粒作对照。取5μl PCR扩增产物于1％的琼脂糖凝胶上电泳。同时用EcoRI、Hind III对制备的质粒进行酶切鉴定，酶切产物于1％的琼脂糖凝胶上电泳分析。经鉴定为重组的质粒用Sangers双脱氧核糖核酸末端终止法测序。2.8日本血吸虫中国大陆株MFS4全长基因的克隆日本血吸虫虫体总RNA制备用日本血吸虫中国大陆株安徽品系尾蚴，按2500条/只的量攻击感染新西兰大白兔，6周后无菌收集虫体，用高压灭菌的PBS洗两次，放入小冻存管中，液氮中速冻贮存备用。按Trizol试剂盒使用说明提取血吸虫虫体总RNA。
5′RACE扩增基因5′端按5′RACE试剂盒说明书介绍的方法进行。cDNA第一链制备与纯化cDNA第一链由目的基因片段特异的引物GSP1引导合成。每25μl反应体系中，含有5μgRNA，2.5mM MgCl2，20mM KCl，20mM Tris-Cl(PH8.4)，10mM DTT，100mM cDNA primer(GSP1)，400μMdNTP，200 U SupperscriptII RT。合成反应在42℃进行50分钟，然后在70℃加热15分钟终止反应。用酶消化法去除模板RNA后。加入120μl平衡至室温的Binding buffer(6M NaI)，混匀后加到cDNA纯化柱上，13000g离心20秒；用0.4ml预冷的Washing buffer洗柱4次，每次13000g离心20秒；然后用0.4ml预冷的70％乙醇洗柱4次，每次13000g离心20秒；最后一次70％乙醇洗柱后，13000g离心1分钟；最后加50μl预热到65℃的去离子水，13000g离心20秒收集纯化的cDNA第一链。dC-tailed cDNA的制备依次加入各反应物，DEPC-treated water 6.5μl5×tailing buffer5.0μl2mM dCTP 2.5μl纯化的cDNA第一链 10.0μl94℃作用2-3分钟后冰上冷却1分钟，短暂离心收集反应物，加入1μlTdT(terminal deoxynucleotidyl transferase)，温和混匀，37℃作用10分钟后，65℃ 10分钟灭活TdT，-20℃保存。PCR扩增PCR反应体系(50ul)为10×PCR buffer 5.0μl25mM MgCl23.0μl10mM dNTPmix10μlnested GSP2(10μM) 2.0μlAbridged Anchor Primer(10μM) 2.0μldC-tailed cDNA 5.0μlTag PlusI DNAase(4u/μl)0.5μlddH2O 31.5μl条件为94℃预变性5min；然后94℃1min，48℃55sec，72℃1min，共30个循环；循环结束后72℃延伸10min。PCR结束后取10μl电泳检查。巢式PCR取巢式引物GSP3和引物AUAP，以第一轮的PCR产物为模板进行扩增。从50μl反应体系中取出5μl，稀释100倍后作为第二轮PCR产物的模板。PCR扩增条件为94℃预变性5min；然后94℃1min，50℃55s，72℃1min，共30个循环；循环结束后72℃延伸10min。取巢式引物GSP4和引物AUAP，以第二轮的PCR产物为模板，进行扩增。从50μl反应体系中取出5μl，稀释100倍后作为第三轮PCR产物的模板。PCR扩增条件为94℃预变性5min；然后94℃1min，55℃55s，72℃1min，共30个循环；循环结束后72℃延伸10min。PCR结束后取10μl与第一轮和第二轮的PCR产物一起电泳检测。
5′RACE PCR产物的克隆和鉴定PCR产物与pGEM-T Easy克隆载体按前法进行连接和转化，筛选、鉴定阳性克隆，并进行测序分析。3.结果3.1阳性克隆的筛选及PCR扩增鉴定初筛共铺板26个，从大约8万个噬菌班中筛选出5个阳性克隆，经过多轮复筛确定2个阳性克隆。对其中一个阳性克隆以T7及SP6为引物进行PCR扩增，其产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示扩增产物大小分别约为830bp(图4)。3.2阳性克隆重组质粒pBluescript IISK(+)的PCR、酶切鉴定经过EcoRI，HindIII双酶切的PCR产物与同样酶切消化的pBluescript IISK(+)质粒连接后，以T3及T7为引物进行PCR鉴定，结果PCR扩增出的片段与预期分子量大小一致，约为830bp(图5)。用EcoRI和Hind III对其进行酶切分析，结果获得的片段与预期的一致如(图6)。3.4核苷酸序列测定经过PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒，以Sangers双脱氧核糖核酸末端终止法测序，利用NCBI的Blast进行基因序列的同源性搜索，结果无显著同源性(Score值＜50bits)，为血吸虫新基因序列，命名为MFS4基因，见序列1。3.5 5’RACE扩增产物重组质粒pGEM-T的PCR、酶切鉴定利用5’RACE技术对外源片段进行全长cDNA的克隆，将第三轮PCR产物同pGEM-T载体连接。PCR鉴定结果，扩增产物大小约为300bp。利用在T载体插入位点两侧的NotI限制性内切酶位点进行酶切分析，得到插入片段大小约为300bp。3.6测序结果与分析测序后，进行序列拼接。结果分析表明MFS4的开放阅读框为780bp，编码259个氨基酸，见序列2。Met Ala Val Gly Gly Gln Lys Lys Val Thr Lys Gly Gly Lys Lys Gly1 5 10 15Gly Lys Lys Lys Thr Ala Asp Pro Phe Ser Lys Lys Glu Trp Tyr Asp20 25 30Ile Lys Ala Pro Ala Met Phe Pro Lys Arg Thr Cys Ala Arg Thr Leu35 40 45Val Thr Arg Thr Gln Gly Thr Arg Ile Ala Ser Glu Ala Leu Lys Gly50 55 60Arg Val Val Thr Leu Ser Leu Gly Asp Leu Ser Glu Lys Asn Glu Glu65 70 75 80Val Phe Arg Lys Phe Lys Leu Gln Ile Glu Asp Val Gln Gly Arg His85 90 95Cys Leu Thr Asn Phe His Gly Leu Glu Leu Thr Arg Asp Lys Leu Cys100 105 110Ser Val Val Val Lys Trp Arg Ser Thr Ile Glu Ala His Val Asp Val115 120 125Lys Thr Thr Asp Gly Tyr Leu Leu Arg Phe Phe Ile Ile Thr Phe Thr130 135 140Pro Ser Val Pro Arg Ser Glu Arg Leu His Ser Tyr Ala Gln Thr Thr145 150 155 160Arg Ile Lys Arg Ile Arg Ala Arg Leu Val Glu Ile Ile Gln Gln Glu165 170 175Val Ser Thr Cys Asp Leu Lys Glu Val Val Asn Lys Leu Ile Pro Asp180 185 190Ser Ile Ala Gln Asp Ala Arg Lys Ala Ala Ser Trp Ile Tyr Pro Leu195 200 205Gly Glu Thr Phe Ile Arg Lys Val Lys Val Leu Lys Arg Pro Lys Ala210 215 220Asp Leu Ala Arg Leu Met Glu Leu His Gly Glu Ser Lys Ser Thr Ala225 230 235 240Pro Gly Glu Thr Val Ser Arg Pro Asp His Tyr Glu Pro Pro Lys Val245 250 255Asp Ser Val全长基因的起始密码子都符合Kozak序列特征(Kozak，1991)，3’端非翻译序列都包含一个多聚核苷酸化信号(AATAAA)。MFS4基因编码产物的23-223氨基酸区段与核糖体蛋白3A家族有60％同源性，其理论等电点(pI)为9.1，理论分子量29KD，利用PSORT在线预测蛋白质信号肽软件分析，在N端未发现信号肽的存在，以Tmpred软件也未预测出蛋白质跨膜区的存在。二日本血吸虫(中国大陆株)MFS4基因DNA疫苗的构建及小鼠免疫保护试验1实验材料pcDNA3真核表达载体，由中国农科院上海家畜寄生虫病研究所、农业部动物寄生虫学重点开放实验室保存。实验动物为昆明系小鼠，雄性、6周龄，购自中科院上海分院实验动物中心。根据MFS4全长cDNA序列设计引物上游引物5′-ATGGATCCAACGCGCTCCAGTTTTGT-3′下游引物5′-ATGCGGCCGCCCGGATGAAATTCTATATT-3′引物由上海基康生物公司合成。2实验方法2.1 MFS4基因的RT-PCR扩增按前述方法收集日本血吸虫中国大陆株成虫，提取虫体总RNA，并反转录成cDNA。MFS4基因的RT-PCR扩增按以下体系进行MFS4基因反转录产物1μl10×PCR Buffer5μldNTP混合物6μl上、下游引物 各0.5μlTag PlusI DNAase(4u/μl) 0.5μlddH2O36.5μl条件为94℃预变性5min，94℃ 30s；50℃ 55s；72℃ 1min，共30个循环，循环结束后72℃自动延伸10min。PCR结束后，取5μl反应产物于1％的琼脂糖凝胶上进行电泳检查。2.2小量制备真核表达载体pcDNA3质粒将pcDNA3质粒DNA转化大肠杆菌TGI感受态细胞，铺含Ampicillin的LB平板，37℃培养16h，挑单菌落于3ml LB(含Ampicillin)培养基中，37C摇床培养过夜，用碱裂解法小量制备质粒DNA，-20℃保存备用。2.3重组表达质粒pcDNA3/MFS4的构建将PCR产物、pcDNA3载体分别用BamHI，NotI酶切后，电泳，用SilverBeads DNA胶回收试剂盒回收小片段目的基因和线性质粒DNA。取2μl质粒载体DNA、3μl目的基因、1μl 10×Rapid Ligation Buffer、1μl T4 DNA连接酶，3ul ddH2O，总体积为10μl，混匀后，4℃连接过夜。取5μl连接产物，转化大肠杆菌TGI感受态细胞，将菌液涂布于含Ampicillin的LB固体培养基上，37℃温箱培养过夜。挑选阳性克隆进行PCR、酶切鉴定。将经PCR、酶切鉴定为阳性的克隆测序，确认MFS4基因正确插入pcDNA3真核表达载体。2.4重组真核表达质粒的纯化将阳性的重组质粒克隆扩大培养，以碱裂解法大量抽提质粒DNA，并用PEG8000进一步纯化质粒DNA。最后用400μl TE(pH8.0)溶解沉淀，贮存于-20℃以备用。2.5动物免疫保护实验将小鼠随机分为两组，实验组15只接种纯化的重组真核表达质粒DNA，对照组15只接种纯化的pcDNA3质粒DNA。小鼠用腿部肌肉注射法免疫，剂量为100ugDNA/鼠，共免疫三次，每次间隔两周。末次免疫后两周，用腹部盖玻片法接种尾蚴，剂量为40±2条/鼠。攻击6周后，解剖小鼠，肝门静脉冲洗法收集成虫，计数。用以下公式计算减虫率 解剖后每鼠取肝脏2g，剪碎后用8％KOH(20ml)消化，60℃水浴4-6h。取400μl消化液在显微镜下计数，按以下公式计算减卵率。(EPG为平均每克肝组织中所荷虫卵数) 3.结果MFS4基因的RT-PCR扩增以反转录的cDNA第一链为模板，用两条特异性引物扩增出的PCR产物，经1％的琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示扩增产物的大小为850bp左右，与预期分子量大小一致。
重组真核表达质粒pcDNA3/MFS4的鉴定(见
图1)以T7、SP6为引物进行PCR，扩增产物的分子量与预期分子量大小一致。进一步用BamH I、Not I进行酶切鉴定，得到约850bp左右的片段。测序分析表明，MFS4正确插入pcDNA3真核表达载体。
动物免疫实验结果表1 pcDNA3-MFS4重组质粒免疫小鼠后抗血吸虫感染结果Tablel.Worm and egg counting reduction rate induced by pcDNA3-MFS4 in mice组别 平均虫荷数(x±s)减虫率 平均卵荷数减卵率GroupWorm burden(x±s) Worm reduction PEPG(x±s) Egg reductionPrate(％) rate(％)实验组 17.13±4.46 28.64％ ＜0.057258.49±787.65 21.73％ ＜0.05Experiment对照组 24.27±5.40 9370.11±2020.43Control实验组和对照组的小鼠攻击感染后均存活。从表1可看出，用pcDNA3/MFS4重组质粒免疫的小鼠，平均每鼠的虫荷数为17.13，质粒pcDNA3免疫的小鼠虫荷数为24.27，实验组明显低于对照组，减虫率为28.64％；实验组小鼠平均每克肝组织含虫卵数为7258.49，对照组为9370.11，减卵率为21.73％。三日本血吸虫(中国大陆株)MFS4基因在大肠杆菌中的表达1实验材料pET28a(+)原核表达载体由中国农科院上海家畜寄生虫病研究所，农业部动物寄生虫学重点实验室保存提供。2实验方法重组质粒pET28a/MFS4的构建将前述重组质粒pcDNA3/MFS4及pET28a(+)质粒分别用BamHI、NotI酶切后，用Silver Beads DNA胶回收试剂盒回收目的DNA片段。取2μlpET28a(+)载体、3μl目的基因片段、1μl 10×Rapid Ligation Buffer、1μl T4 DNA连接酶、3ul水，总体积为10μl，混匀后，4℃连接过夜。取5μl连接反应液，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，用含Kanamycin的LB平板筛选。37℃温箱培养过夜。重组质粒pET28a/MFS4的鉴定挑克隆后按前述方法用PCR及酶切鉴定，并将鉴定为阳性的克隆测序分析，以确定外源基因片段是否正确插入pET28a载体中。诱导目的蛋白的表达将含有目的基因重组质粒的细菌，划线接种于含Kanamycin的LB平板上。挑选生长良好的克隆，接种至3ml LB培养基(含50ug/ul Kanamycin)中，37℃摇床培养过夜。按1/100的比例转移到另一LB(含50ug/ulKanamycin)培养基中，37℃快速振荡培养至细菌生长对数期OD600＝0.6～1.0时，加入IPTG至1mmol/L，37℃快速振荡培养，并在加入IPTG后0h、2h、4h、6h、8h、10h后分别取出1ml细菌培养物，12000rpm离心1min，弃去上清液，沉淀中加入100ul 1×SDS-PAGE上样缓冲液，充分混匀悬浮细菌，100℃煮样品5min，离心取上清液，保存于-20℃或直接进行SDS-PAGE电泳。将准备好的样品进行SDS-PAGE分析和Western blotting检测。3结果重组质粒pET28a/MFS4的鉴定将BamH I、Not I构建的pET28a/MFS4质粒用PCR鉴定，其扩增产物的分子量约850bp，合乎预期的分子量。进一步用限制性内切酶BamHI、Not I进行酶切，结果得到约850bp左右的片段。诱导MFS4基因的特异性表达从SDS-PAGE电泳结果看，表达的融合蛋白分子量在预计的35KD左右，并且发现诱导10h后蛋白表达基本达到最高水平(见图2)。
Western-blotting检测表明，将重组质粒和空载体分别诱导表达的产物进行SDS-PAGE，再转移到NC膜上，用小鼠抗日本血吸虫成虫粗抗原血清免疫杂交，结果重组质粒诱导表达的融合蛋白与抗体呈阳性反应，而空载体的表达产物不与抗体反应，证明该融合蛋白具有良好的抗原性(见图3)。
权利要求
1.一种编码日本血吸虫(中国大陆株)MFS4基因的核苷酸序列，其特征在于它具有如下的核苷酸序列及相应的氨基酸序列gtatcatatc gttaacgcgc tccagttttg tttttgccca ggtattata atg gcg gtt 58Met Ala Val1ggt ggt cag aaa aag gtc act aaa ggg ggg aag aaa gga ggc aaa aag106Gly Gly Gln Lys Lys Val Thr Lys Gly Gly Lys Lys Gly Gly Lys Lys5 10 15aaa acg gct gat cca ttc tct aaa aag gag tgg tat gat atc aag gct154Lys Thr Ala Asp Pro Phe Ser Lys Lys Glu Trp Tyr Asp Ile Lys Ala20 25 30 35cca gct atg ttt cct aaa agg aca tgt gca aga acg ctt gtc aca cga202Pro Ala Met Phe Pro Lys Arg Thr Cys Ala Arg Thr Leu Val Thr Arg40 45 50act cag ggt act cgc ata gcc agt gaa gca ctt aag ggt cgt gtt gtt250Thr Gln Gly Thr Arg Ile Ala Ser Glu Ala Leu Lys Gly Arg Val Val55 60 65aca ctt agt ctt ggg gat ctg agc gaa aag aac gaa gaa gtc ttc cgt298Thr Leu Ser Leu Gly Asp Leu Ser Glu Lys Asn Glu Glu Val Phe Arg70 75 80aaa ttc aag ctt caa atc gaa gat gtc cag ggg cgt cat tgt cta aca346Lys Phe Lys Leu Gln Ile Glu Asp Val Gln Gly Arg His Cys Leu Thr85 90 95aat ttc cac gga tta gaa ctt act cga gac aaa cta tgt tca gtt gtt394Asn Phe His Gly Leu Glu Leu Thr Arg Asp Lys Leu Cys Ser Val Val100 105 110 115gtt aag tgg cgg tca act ata gaa gcg cac gtc gac gtc aaa aca aca442Val Lys Trp Arg Ser Thr Ile Glu Ala His Val Asp Val Lys Thr Thr120 125 130gat gga tac tta ctt cgt ttc ttt att atc acg ttc act cca agt gta 490Asp Gly Tyr Leu Leu Arg Phe Phe Ile Ile Thr Phe Thr Pro Ser Val135 140 145cca cgg tct gaa agg ctc cac tct tat gct cag acc aca cgc ata aaa 538Pro Arg Ser Glu Arg Leu His Ser Tyr Ala Gln Thr Thr Arg Ile Lys150 155 160cgg att cgc gct cgc ctt gtt gag ata atc cag caa gag gtt tct act 586Arg Ile Arg Ala Arg Leu Val Glu Ile Ile Gln Gln Glu Val Ser Thr165 170 175tgc gat ctg aaa gag gtc gtt aat aag ctt att cca gat tcc att gca 634Cys Asp Leu Lys Glu Val Val Asn Lys Leu Ile Pro Asp Ser Ile Ala180 185 190 195caa gac gct cga aaa gcg gca tca tgg ata tat cca cta ggt gag aca 682Gln Asp Ala Arg Lys Ala Ala Ser Trp Ile Tyr Pro Leu Gly Glu Thr200 205 210ttt atc cgc aaa gtt aag gtt tta aaa aga cca aaa gct gat ctc gct 730Phe Ile Arg Lys Val Lys Val Leu Lys Arg Pro Lys Ala Asp Leu Ala215 220 225cgg ctc atg gaa ctt cat ggt gaa tca aag tca act gcc cct ggt gag 778Arg Leu Met Glu Leu His Gly Glu Ser Lys Ser Thr Ala Pro Gly Glu230 235 240act gta tcc cgt cca gat cac tat gaa cct ccg aaa gtt gat tca gtg 826Thr Val Ser Arg Pro Asp His Tyr Glu Pro Pro Lys Val Asp Ser Val245 250 255taattcaata aagaatttca tccggaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa871
2.一种如权利要求1所述的日本血吸虫(中国大陆株)MFS4基因的核苷酸序列的克隆方法，其特征在于用东方田鼠健康血清结合抗小鼠IgG3抗体免疫筛选日本血吸虫c-DNA文库，获得日本血吸虫MFS4基因完整ORF的核苷酸序列。
3.一种如权利要求1所述的日本血吸虫(中国大陆株)MFS4基因的核苷酸序列的编码序列在大肠杆菌中的表达方法，其特征在于所使用的宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)，原核表达质粒pET28a(+)。
4.一种如权利要求1所述的日本血吸虫(中国大陆株)MFS4基因的核苷酸序列的编码序列在真核生物中的表达方法，其特征在于所使用的宿主菌为大肠杆菌TG1，真核表达质粒pcDNA3。
5.一种防治日本血吸虫病的DNA疫苗，其特征在于它是由日本血吸虫(中国大陆株)MFS4基因和真核表达质粒组成。
6.根据权利要求5所述的一种防治日本血吸虫病的DNA疫苗，其特征在于其中的真核表达质粒是pcDNA3。
全文摘要
本发明涉及生物基因领域，具体涉及日本血吸虫(中国大陆株)MFS4基因的基因序列、免疫筛选、在大肠杆菌中的表达、DNA疫苗的构建及小鼠免疫保护试验。本发明基于我们对东方田鼠抗日本血吸虫病机理研究的发现，用健康东方田鼠血清IgG3抗体免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库，获得一个阳性克隆，用RACE技术扩增出含ORF的基因。同源性序列分析表明其为一个新基因(MFS4)，开放阅读框含780bp，编码259个氨基酸。将MFS4基因亚克隆至原核表达质粒pET28a(+)中，构建重组表达质粒pET28a/MFS4，在BL21(DE3)表达菌中获得高效表达，融合蛋白分子量约35kD，具有良好的抗原性；将该基因亚克隆至真核表达质粒pcDNA3中，构建成重组质粒pcDNA3/MFS4，制备DNA疫苗免疫昆明系小鼠，获得28.6％的减虫率、21.73％的减卵率。
文档编号C12N15/70GK1477202SQ0311573
公开日2004年2月25日 申请日期2003年3月11日 优先权日2003年3月11日
发明者林矫矫, 傅志强, 张亮, 苑纯秀, 刘金明, 冯新港, 蔡幼民 申请人:中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所, 上海动物生物技术研究中心, 农业部动物寄生虫学重点开放实验室, 中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究