专利名称：一种以发夹式dna为探针的可视化塑料基生物芯片及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物芯片领域，具体地涉及一种以发夹式DNA为探针的可视化塑料基生物芯片及其制备方法和应用。
背景技术：
目前已开发的生物芯片大多是将探针分子固定在玻片或硅片等基片上，或是利用探针分子去捕获标记过的靶标物，或是在捕获无标记的靶标物之后再额外加入信号报道单元(即形成夹心式的传感构型)(例如J. Am. Chem. Soc. 2001，123:5194-5205.)，来实现对靶标物的信号响应。然而，无论是采用标记靶标物，还是采用额外加入信号报道单元，均增加了生物芯片在操作过程中的复杂性和对专业仪器的依赖性，大大降低了生物芯片的可实用性。把所有修饰以及信号单元都集中在探针分子上，即采用分子信标(经功能单元修饰的探针分子)作为探针，是实现对靶标物便捷、灵敏检测的一种可行性途径。
分子信标(beacon)通常是指一段具有特殊碱基序列的双标记核苷酸链(DNA)， 由于其链两端的碱基序列互补配对，从而形成茎环相连的发夹状结构(hairpin) (Nat. Biotechnol.，1996，14:303-308.)。通常在分子信标一端修饰上荧光基团，另一端修饰上荧光猝灭基团。当DNA呈发夹状折叠时，两端修饰基团相距较近，发生荧光猝灭而没有信号； 当加入靶标物后，分子信标构型发生翻转即发夹结构被打开，荧光基团与猝灭基团距离变远，从而产生荧光信号。相对于传统的直链DNA探针，分子信标以操作简单、无需对靶标物标记、灵敏度高等特点，在液相生物分析与检测领域得到了广泛的应用。
尽管如此，将分子信标固定在塑料基片上，利用其与靶标物的特异性结合来诱导构型转变，进而实现对靶标物的可视化灵敏检测，仍然存在诸多挑战。如要兼顾探针发夹结构的稳定性和探针中功能片段与靶标物的结合强度，还需兼顾信号标记单元在探针构型翻转前后与基片间距离的远近。其次，分子信标探针在塑料基片上的密度、其构型的稳定性 (与温度及缓冲液盐离子浓度等有关)也需要系统研究与反复的优化。再次，针对不同靶标物，为了降低背景信号，需要优化信号单元与探针链间的连接长度和选择合适的封闭溶液。 目前，将分子信标固定在塑料基片表面上进行可视化的分析与检测尚未见报道。发明内容
因此，本发明的目的是提供一种以发夹式DNA为探针的可视化塑料基生物芯片。
本发明的再一目的是提供一种发夹式DNA塑料基生物芯片的制备方法。
本发明的再一目的是提供一种应用发夹式DNA塑料基生物芯片的应用。
进行分子信标的研究和应用时，茎干区和环状区的序列设计是关键所在。过长的茎干会使发夹结构过于稳定而给出假阴性结果，过短则使发夹结构不稳定，容易给出假阳性结果。就序列碱基来说，应该使茎干区稳定状态适当，而环状区则应该避免任何可能的二级结 构，否则分子信标茎一环结构将受到影响。在本发明中我们主要对探针末端(生物素修饰的一端)链长、分子信标探针茎干区互补配对的碱基个数进行了优化。
此外，分子信标探针的浓度，缓冲液的PH值、镁离子的浓度，封闭液、封闭液的浓度对分子信标探针的固定、发夹结构的形成、背景信号的降低和目标信号的增强有重要的影响。本发明中我们主要对分子信标探针的浓度、首次封闭液和封闭液的浓度进行了优化。
根据本发明的发夹式DNA塑料基生物芯片包括
1)透明的塑料基片(PC，PMMA，PET等)；
2)固定在上述基片上呈阵列分布的DNA信标探针(hairpin DNA);所述分子信标探针是一种呈发夹结构的双标记核苷酸链，其一端修饰联接基团(例如，氨基、羟基、醛基等)以固定在基片上，其中联接基团与探针链通过6-12碳的烷基链相连；另一端修饰信号报道基团，其中探针链端与信号报道基团通过6-18碳的烷基链相连，以显示识别反应的发生；另外，探针链两端部分碱基(5-10对)互补配对以形成茎(stem)-环(loop)相连的发夹构型。当该型芯片与靶标物(target)接触时，靶标物能诱导DNA探针发生构型转变，从而产生响应信号。若该型芯片生物芯片进一步遭受银染色或酶催化底物显影处理，即可获得可视化的目标信号。
根据本发明的发夹式DNA塑料基生物芯片，所述信号报道基团为金纳米粒子或钼纳米粒子(l_20nm)、生物素、酶(例如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AKP)以及葡萄糖氧化酶(GOD))等。
根据本发明的发夹式DNA塑料基生物芯片的制备方法包括以下步骤
I)塑料基片表面活化处理；通过光学或化学方法在基片表面产生高密度活性基团 (例如羧基、巯基、羟基、醛基、氨基等);
2)分子信标探针的固定，所述分子信标探针是一种呈发夹结构的双标记核苷酸链，其一端修饰联接基团(例如，氨基、羟基、醛基等)以固定在基片上，其中联接基团与探针链通过6-12碳的烷基链相连；另一端修饰信号报道基团(例如，金或钼纳米粒子米粒子、生物素、酶等)，其中探针链端与信号报道基团通过6-18碳的烷基链相连，以显示识别反应的发生；另外，探针链两端部分碱基(5-10对)互补配对以形成茎(stem)-环(loop)相连的发夹构型；
3)基片的首次封闭，加入封闭型溶液(例如，20mM磷酸盐+150mM NaCl+2%BSA, pH=7. 4的缓冲溶液)到固定分子信标探针的芯片中封闭2小时；然后冲洗基片表面，并吹干待用。
本发明的发夹式DNA塑料基生物芯片的可以用于检测重金属离子(Hg2+，Pb2+等)、 活性蛋白质、活性小分子、特定序列的DNA，其检测步骤如下
1)靶标物的捕获，将含有靶标物的样品溶液引入到首次使用的塑料芯片表面，或将首次使用的芯片插入含有靶标物的样品溶液中浸泡广2小时，使靶标物与信标探针充分结合，再清洗、吹干待用；
2)基片的二次封闭在芯片显影处理之前，需将其浸没入封闭型溶液(例如，20mM 磷酸盐+0. 1%明胶+0. 1%吐温20，pH=7. 4)，然后冲洗芯片，吹干待用；
3)芯片显影 处理将显影液(可溶性银盐与还原剂组成的混合液或含底物的缓冲液(例如四甲基联苯胺一 TMB))滴加到基片表面固定有靶标分子的区域，然后，每十分钟更换一次显影液直至在基片表面出现明显信号点或信号线。
4)芯片检测结果的定性和定量分析依据目测或者采用普通的成像或透照工具 (例如数码照相机、平板扫描仪、胶片阅片器等)对芯片检测结果进行定性或定量分析。
根据本发明的具体实施方式
，发夹式DNA新型塑料基生物芯片包括
I)透明的塑料基片(PC，PMMA, PET等)；
2)固定在上述塑料基片上的分子信标探针(hairpin probe)0所述分子信标是一种呈发夹结构的双标记核苷酸探针，其一端修饰联接基团以固定在基片上，另一端修饰信号报道单元(金纳米粒子、生物素、酶等小分子等)以显示识别反应的发生；另外探针两端部分碱基序列互补配对。在正常情况下，当靶标物不出现的时候，分子信标探针呈茎环相连的发夹状构型(即探针处于“闭环状态“)，信号水平很低(如图-1所示)。
3)靶标物(target)的出现会引起固定在基片上分子信标探针构型的转变，从而产生可视化信号响应。当加入靶标物后，分子信标探针与靶标物特异性结合，分子信标探针的构型发生翻转，发夹结构被打开，形成比分子信标的茎环结构更稳定的双链体、四链体等构型(即探针处于“开环状态“)。此时信号单元(金纳米粒子、生物素、酶等)与塑料基片间的距离发生明显改变，而这种变化可通过比色法(如金纳米银染增强的方法或酶催化底物沉积的方法)将信号”显影放大“实现对靶标物定性定量检测(如图-1所示)。
根据本发明的芯片经银染色处理或添加底物后可显色；经显影处理之后，该种芯片可通过目测或采用成像或透照工具，实现对多种靶标物的定性或定量检测分析。
因此，根据本发明的发夹式DNA塑料基生物芯片通过包括以下步骤的方法制备
I)塑料基片表面活化处理；
2)分子信标探针的固定，所述分子信标是一种呈发夹结构的双标记核苷酸探针， 所述分子信标探针是一种呈发夹结构的双标记核苷酸链，其一 端修饰联接基团以固定在基片上，其中联接基团与探针链通过6-12碳的烷基链相连；另一端修饰信号报道基团，其中探针链端与信号报道基团通过6-18碳的烷基链相连，以显示识别反应的发生；另外，探针链两端部分碱基(5-10对)互补配对以形成茎(stem)-环(loop)相连的发夹构型，将含有分子信标探针5 20μ M的缓冲溶液引入到基片表面，将分子信标探针固定在芯片表面并形成阵列；
3)基片的首次封闭，加入封闭型溶液(20mM磷酸盐+150mMNaCl+2%BSA，pH=7. 4的缓冲溶液)到固定分子信标探针的芯片中封闭2小时；然后冲洗基片表面，并吹干待用；
根据本发明的具体实施方式
，所述发夹式DNA塑料基生物芯片通过包括以下步骤的方法制备
I)塑料基片表面活化处理将塑料基片放入紫外臭氧系统辐射1(Γ30分钟，使其表面改性产生高密度羧基活性基团，根据需要可将羧基进一步转化成不同的活性基团(例如硫醇、醛基、氨基等)；然后将表面带有羧基的塑料基片浸入特定活化溶液中(例如EDC浓度为O. 02g/mL、NHS浓度为O. 0025g/mL、pH=6的IOOmM磷酸盐PBS缓冲溶液)活化处理I 5 小时，后用特定清洗溶液(例如20mM PBS缓冲溶液)冲洗基片表面，并用惰性气体将基片吹干待用。
2)分子信标探针的固定将含有分子信标探针(hairpin DNA) 5 20 μ M的缓冲溶液(通常不同探针分子需使用不同的缓冲溶液，检测金属离子和凝血酶的分子信标固定缓冲液20mMTris+50mM MgCl2, PH=7. 4 ;检测DNA的分子信标固定缓冲液IOmMTris+250mMNaCl+100mMMgCl2, PH=7. 4)，通过PDMS模板或通过喷墨打印的方式引入到基片表面，然后将基片转移到湿盒中温育10小时，通过多种共价键合方式将分子信标探针固定在芯片表面并形成阵列(例如，通过席夫碱反应将氨基修饰的探针分子固定在醛基修饰的基片表面、通过酰胺反应将氨基修饰的探针分子固定在羧基修饰的基片表面、通过磷酸酯化反应将含磷酸基团的探针分子固定在羟基修饰的基片表面)；然后用特定的清洗溶液(20mM PBS缓冲溶液)冲洗基片表面，并用惰性气体N2将基片吹干待用。
3)基片的首次封闭经PDMS模板的通道加入特定的封闭型溶液(20mM磷酸盐 +150mM NaCl+2%BSA, pH=7. 4的缓冲溶液)到固定分子信标探针的芯片中封闭2小时；；然后用清洗型缓冲液(20mM磷酸盐+150mM NaCl, pH=7. 4)冲洗基片表面，并用惰性气体N2将基片吹干待用。
因此，根据本发明的发夹式DNA塑料基生物芯片通过包括以下步骤的方法应用
I)靶标物的捕获将含有靶标物的样品溶液引入到首次使用的塑料芯片表面，或将首次使用的芯片插入含有靶标物的样品溶液中浸泡广2小时，使靶标物与信标探针充分结合，再清洗、吹干待用；
2)基片的二次封闭在芯片显影处理之前，需将其浸没入封闭型溶液(例如，20mM 磷酸盐+0. 1%明胶+0. 1%吐温20，pH=7. 4)，然后冲洗芯片，吹干待用；
3)芯片显影处理将显影液滴加到基片表面固定有靶标物的区域，直至在基片表面出现明显信号点或信号线。
4)芯片检测结果的定性和定量分析依据目测或者采用普通的成像或透照工具对芯片检测结果进行定性或定量分析。
根据本发明的具体实施方式
，所述发夹式DNA塑料基生物芯片通过包括以下步骤的方法进行应用
I)靶标分子的捕获将含有靶标分子(金属离子、蛋白质、DNA)的缓冲溶液 (通常不同靶标物需使用不同的缓冲溶液，金属离子20mM Tris, PH=7. 4 ;凝血酶20mM Tris+0. 1%BSA, PH=7. 0 ；target DNA 10mM Tris+250mM NaCl+100mMMgCl2, PH=7. 4)，滴加或通过PDMS模板引入到基片表面固定有分子信标探针的区域，然后将基片转移到湿盒中温育0. 5^3小时使靶标分子与分子信标探针充分结合，再用同样的缓冲溶液冲洗基片，并用惰性气体N2吹干待用。
2)基片的二次封闭在芯片显影处理之前，需将其浸没入特定的封闭型溶液(例如 20mM磷酸盐+0. 1%明胶+0. 1%吐温20，pH=7. 4)处理0. 5-4小时，然后用清洗型溶液(例如 20mM磷酸盐+150mMNaCl，pH=7. 4)冲洗芯片；若下一步采用银染色法显影，则基片在显影前还需用二次去离子水彻底清洗；最后用惰性气体N2将芯片吹干待用。
3)芯片显影处理通常塑料基生物芯片是采用金纳米粒子催化银沉积或酶催化底物沉淀等显色反应来实现信号的显影。具体而言，将显影液(可溶性银盐与还原剂组成的混合液或含底物的缓冲液(例如四甲基联苯胺一 TMB))滴加到基片表面固定有靶标分子的区域，然后将芯片避光显影处理，每十分钟更换一次显影液直至在基片表面出现明显信号点或信号线。
4)芯片检测结果的定性和定量分析对该类生物芯片的定量分析可通过目测完成，即目测信号的明暗度(灰度)，颜色越深对应靶标物的浓度越高。对该类生物芯片进行定量分析，需首先建立各种靶标物的标准信号响应曲线，即首先将一系列靶标物浓度已知的芯片通过照相或扫描或透照的方式，统一处理成数字图像，再利用图像处理软件获得信号点或线的平均亮度或灰度信息，建立该种靶标物的标准信号响应曲线；然后采用同样方式获得未知浓度靶标物的数字图像；根据标准信号响应曲线，获得未知靶标物的浓度信息。
本发明提供一种发夹式DNA塑料基生物芯片的制备、检测及应用技术。本发明的优越性在于由此所制备的生物芯片具备成本低廉、应用便以及灵敏度高等优点，是实施现场快速检测与分析的理想工具。
图。
图1为构型变换的传感单元设计示意图。图2为检测目标DNA链的塑料基DNA生物芯片的结构示意图。图3为检测凝血酶(thrombin)和重金属离子Pb2+的塑料基生物芯片的结构示意图4为检测重金属离子Hg2+的塑料基生物芯片的结构示意图。图5为检测目标DNA链的塑料基DNA生物芯片的显影扫描图片，其中(A)为图像与(B)为响应曲线。
图6为检测完全配对、一个碱基错配、两个碱基错配、三个碱基错配、完全不匹配目标DNA的信号扫描图片，其中(K)为图像与(B)为相应信号分析。
图7为检测凝血酶(thrombin)的塑料基DNA生物芯片的显影扫描图片，其中(A) 为图像与(B)为响应曲线。
图8为检测铅离子的塑料基生物芯片的显影扫描图片，其中(A)为图像与(B)为响应曲线。
图9为检测汞离子的塑料基生物芯片的显影扫描图片，其中(A)为图像与(B)为响应曲线
图10为塑料基生物芯片不同探针末端链长对target DNA的识别图像(A)与信号分析(B)。
图11为塑料基生物芯片不同探针链对Pb2+识别图像(A)与信号分析(B)。
图12为塑料基生物芯片不同浓度的探针链对Pb2+识别图像(A)与信号分析(B)。
图13为塑料基生物芯片不同封闭液对Pb2+识别图像(A)与信号分析(B)。
图14为塑料基生物芯片不同浓度的封闭液对Pb2+识别图像(A)与信号分析(B)。
具体实施方式
实施例1、塑料基片表面活化处理
1)将塑料基片浸入乙醇或水中超声清洗3飞分钟，然后吹干待用；
2)将洁净的塑料基片放入紫外臭氧清洗机(例如UVOCS、Novascan PSD系列紫外臭氧清洗机)的拖盘上(辐照平台上)，并调整拖盘高度使塑料基片距紫外灯管的距离在 2 10cm，启动电源，利用高强度的紫外光照射塑料基片1(Γ30分钟(在紫外光照射的同时会在辐照箱内会产生低浓度的臭氧)，再让塑料基片在辐照箱静置5 20分钟，即可在基片表面产生高密度的COOH基团；
3)将光照处理后的基片快速转移到新配置的EDC-NHS溶液中(其中EDC浓度为 O. 01-0. 03g/mL、NHS浓度为O. 002-0. 003g/mL、磷酸盐浓度为lOOmM，pH=6)，使基片表面在该溶液中浸泡I 6小时，注意在浸泡过程中需间隔震荡溶液，使基片表面的COOH充分活化形成活泼酯；最后用20mM磷酸盐缓冲溶液(PH=7. 4)冲洗基片，并将其吹干待用。
实施例2、塑料基DNA生物芯片的制备及其对目标DNA链和含错配碱基DNA链的检测
表I
权利要求
1.一种发夹式DNA塑料基生物芯片，其特征在于，1)透明的塑料基片；2)固定在上述基片上呈阵列分布的DNA信标探针，所述分子信标探针是一种呈发夹结构的双标记核苷酸链，其一端修饰联接基团以固定在基片上，其中联接基团与探针链通过6-12碳的烷基链相连，另一端修饰信号报道基团，其中探针链端与信号报道基团通过6-18 碳的烷基链相连，以显示识别反应的发生；另外，探针链两端5-10对碱基互补配对以形成茎-环相连的发夹构型。
2.根据权利要求1所述的发夹式DNA塑料基生物芯片，其特征在于，所述信号报道基团为金纳米粒子或钼纳米粒子，粒径为l_20nm ;生物素；酶；或葡萄糖氧化酶。
3.一种发夹式DNA塑料基生物芯片的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤1)塑料基片表面活化处理；2)分子信标探针的固定，所述分子信标探针是一种呈发夹结构的双标记核苷酸链，其一端修饰联接基团以固定在基片上，其中联接基团与探针链通过6-12碳的烷基链相连；另一端修饰信号报道基团，其中探针链端与信号报道基团通过6-18碳的烷基链相连，以显示识别反应的发生；另外，探针链两端5-10碱基对互补配对以形成茎环相连的发夹构型；3)基片的首次封闭，加入封闭型溶液到固定分子信标探针的芯片中封闭2小时；然后冲洗基片表面，并吹干待用。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，封闭型溶液为0mM磷酸盐+150mM NaCl+2%BSA, pH=7. 4 的缓冲溶液。
5.权利要求1所述发夹式DNA塑料基生物芯片用于检测重金属离子、活性蛋白质、活性小分子或特定序列的DNA的应用。
全文摘要
本发明涉及生物芯片领域，具体地涉及一种以发夹式DNA为探针的可视化塑料基生物芯片及其制备和使用方法。所述生物芯片包括以下特征1)透明的塑料基片；2)固定在上述基片上的具有发夹构型且内嵌信号报道基团的DNA信标探针；3)当该芯片与靶标物接触时,靶标物能诱导DNA探针发生构型转变，从而产生响应信号。该型生物芯片以塑料基片为固体载片，以比色检测法为芯片信号的读出方法，不需在检测过程中额外加入信号报道分子；因此该型生物芯片具备成本低廉、应用便以及灵敏度高等优点，是实施现场快速检测与分析的理想工具。
文档编号C12Q1/68GK103045460SQ20121059450
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日
发明者李运超, 时晓利 申请人:北京师范大学