专利名称：黄花苜蓿延伸因子2MfEF2及其编码基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，涉及一种黄花苜蓿延伸因子2MfEF2及其编码基因和应用。
背景技术：
环境中的非生物胁迫，例如干旱、盐碱、冷害和热害等影响植物的生长和发育，造成农作物的减产，也影响林木、果树、花卉、园艺观赏植物的正常生长和品质，培育耐逆的植物品种是种植业的主要目标之一。然而，植物耐逆性是一个数量性状，涉及至少几百个基因的作用，因此从耐逆性强的植物中分离耐性基因是十分必要的。EF2基因所编码的延伸因子EF2是一个依赖GTP水解的易位酶，介导蛋白合成时核糖体的易位，每水解一个GTP，核糖体便在mRNA上前进3个碱基。它利用GTP水解释放的能量，将氨酰tRNA从核糖体上的A位点转移到P位点，从而介导肽链的延伸。EF2是生物细胞蛋白质合成所必需的，它的变化对蛋白的合成有重要影响。目前已从多种植物克隆了EF2基因，但还没有从非常耐寒、耐旱的黄花苜蓿中克隆。Guo等(2002)发现，EF2的突变会阻碍拟南芥低温信号的传导，并降低其抗冻性；EF2的突变只影响植 物在低温((TC)条件下合成蛋白质，而对植物在室温下合成蛋白质无影响。证明EF2在植物冷信号传导中起重要作用，从而调控植物抗冷性。黄花苜猜(Medicago sativasubsp.falcata)是一种非常耐寒的豆科牧草种质，在寒冷的西伯利亚也有分布，从中克隆抗寒基因，能为转基因育种提供更为优良的目的基因，而且对于农林植物抗逆分子育种尤为重要和迫切。
发明内容
为克服现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种黄花苜蓿延伸因子 2MfEF2。本发明的另一目的在于提供编码所述的黄花苜蓿延伸因子2MfEF2的基因。本发明的再一目的在于提供所述的黄花苜蓿延伸因子2MfEF2的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现:一种黄花苜蓿延伸因子2MfEF2，其氨基酸序列如下所示:MVKFTADELRRIMDYKHNIRNMSVIAHVDHGKSTLTDSLVAAAGIIAQEVAGDVRMTDTRADEAERGITIKSTGISLYYEMTDESLKRFKGERNGNEYLINLIDSPGHVDFSSEVTAALRITDGALVVVDCVEGVCVQTETVLRQALGERIRPVLTVNKMDRCFLELQVDGEEAYQTFSRVIENANVIMATYEDPLLGDVMVYPEKGTVAFSAGLHGWAFTLTNFAKMYASKFGVDESKMMERLWGENFFDPATKKWTTKNTGSASCKRGFVQFCYEPIKQIINTCMNDQKDKLWPMLTKLGVTMKSDEKDLMGKPLMKRVMQTWLPASTALLEMMIFHLPSPHTAQRYRVENLYEGPLDDQYANAIRNCDPEGPLMLYVSKMIPASDKGRFFAFGRVFAGKVSTGLKVRIMGPNFVPGEKKDLYVKSVQRTVIWMGKRQETVEDVPCGNTVALVGLDQFITKNATLTNEKEVDAHPIRAMKFSVSPVVRVAVQCKVASDLPKLVEGLKRLAKSDPMVVCTIEESGEHIVAGAGELHLEICLKDLQDDFMGGAEIIKSDPVVSFRETVLDRSIRTVMSKSPNKHNRLYMEARPLEDGLAEAIDEGTIGPRDDPKNRSKILSEQYGWDKDLAKKIWCFGPETTGPNMVVDMCKGVQYLNEIKDSVVAGFQWASKEGVLSEENMRGICFEVCDVVLHTDAIHRGGGQIIPTARRVFYASQLTAKPRLLEPVYMVEIQAPEQALGGIYSVLNQKRGHVFEEMQRPGTPLYNIKAYLPVIESFGFSSQLRAATSGQAFPQCVFDHWDTMTSDPLEAGSQAAQLVMDIRKRKGLKEQMTPLSEFEDKL编码所述的黄花苜蓿延伸因子2MfEF2的核苷酸序列如下所示: ATGGTGAAGTTCACAGCTGATGAGTTACGTCGTATTATGGACTACAAGCACAACATTCGTAATATGTCTGTCATTGCTCATGTTGACCACGGAAAATCAACTCTAACCGACTCTCTAGTCGCTGCTGCGGGAATTATTGCCCAGGAAGTTGCAGGTGATGTCCGTATGACTGACACCCGTGCTGATGAAGCTGAGCGTGGTATTACAATCAAGTCTACCGGTATCTCACTCTACTATGAAATGACTGATGAATCTCTCAAGAGGTTCAAGGGGGAGCGTAATGGAAATGAGTATCTCATTAATCTCATTGATTCCCCTGGGCACGTCGACTTCTCATCTGAGGTTACTGCTGCACTCCGTATTACTGATGGAGCACTTGTGGTAGTTGACTGTGTGGAAGGTGTATGTGTCCAAACTGAAACTGTGCTGCGACAAGCTCTTGGAGAAAGGATTAGGCCTGTTCTTACAGTTAATAAGATGGACAGGTGCTTCCTTGAGCTCCAGGTTGATGGAGAGGAGGCATACCAGACCTTTTCAAGGGTGATTGAGAATGCTAATG TGATTATGGCTACATATGAAGATCCACTTCTTGGTGATGTTATGGTGTATCCAGAGAAAGGAACAGTTGCTTTTTCTGCTGGTTTGCATGGTTGGGCTTTTACTCTGACCAACTTTGCAAAAATGTATGCCTCAAAATTTGGCGTTGACGAGTCCAAGATGATGGAGAGGCTCTGGGGTGAAAATTTCTTTGATCCTGCCACAAAAAAATGGACCACCAAGAATACTGGTTCAGCTTCGTGCAAGCGTGGGTTTGTTCAGTTCTGTTATGAGCCTATCAAGCAGATCATCAACACTTGTATGAATGATCAGAAGGATAAGTTGTGGCCTATGCTCACAAAGCTAGGGGTCACCATGAAGTCTGATGAGAAGGACCTGATGGGTAAGCCATTGATGAAACGTGTTATGCAAACCTGGTTGCCAGCAAGTACTGCCCTACTAGAAATGATGATCTTTCATCTTCCCTCACCACATACTGCCCAGAGGTACCGTGTTGAGAATTTGTATGAGGGCCCCCTTGACGATCAATATGCAAATGCTATCAGAAACTGTGATCCTGAAGGACCTCTGATGCTTTATGTGTCAAAGATGATTCCAGCATCTGATAAAGGAAGGTTTTTTGCTTTTGGCCGTGTGTTTGCCGGTAAGGTTTCCACAGGTTTGAAGGTCAGAATTATGGGACCAAATTTTGTCCCTGGAGAGAAGAAAGATCTGTACGTGAAAAGTGTCCAGAGAACTGTTATTTGGATGGGAAAGAGACAGGAGACTGTTGAGGATGTGCCTTGTGGTAACACTGTTGCTTTGGTTGGTTTGGATCAATTTATTACAAAGAATGCTACATTGACAAATGAGAAGGAAGTTGATGCCCACCCTATCCGAGCTATGAAGTTTTCCGTCTCCCCTGTTGTGCGTGTTGCTGTTCAGTGCAAGGTTGCTTCAGATCTTCCCAAGCTTGTTGAAGGTCTCAAACGTTTGGCTAAGTCAGATCCTATGGTTGTTTGTACTATTGAGGAGTCTGGGGAACACATTGTTGCTGGTGCAGGAGAGCTTCATCTTGAGATCTGTTTGAAAGATTTGCAGGATGATTTCATGGGTGGTGCTGAGATTATTAAATCTGACCCTGTTGTGTCATTCAGGGAGACTGTTCTTGATAGATCAATCCGCACAGTGATGAGTAAATCACCCAACAAGCACAACCGGCTGTACATGGAAGCAAGACCATTGGAGGATGGACTTGCAGAGGCCATTGATGAGGGCACAATAGGACCAAGGGATGATCCCAAGAATCGTTCTAAGATCTTGTCCGAACAGTATGGTTGGGACAAGGATCTTGCCAAGAAAATTTGGTGTTTTGGCCCTGAGACCACCGGGCCCAACATGGTGGTTGATATGTGTAAGGGAGTTCAGTATTTGAATGAAATCAAGGATTCCGTGGTTGCTGGATTCCAGTGGGCATCAAAAGAAGGTGTTTTGTCGGAAGAAAACATGAGAGGCATCTGCTTTGAAGTATGTGATGTTGTCCTGCACACTGATGCTATCCACAGAGGAGGTGGTCAGATCATTCCTACTGCTAGGAGGGTCTTCTATGCCTCACAGCTCACAGCCAAACCCAGGCTTCTGGAGCCTGTTTA CATGGTGGAAATCCAAGCTCCTGAGCAAGCTCTTGGTGGTATCTACAGTGT TCTGAATCAGAAACGTGGGCACGTTTTTGAAGAAATGCAGAGGCCCGGTACCCCACTTTACAACATCAAAGCATACCTCCCTGTCATTGAGTCCTTTGGATTTTCTAGTCAGTTGAGAGCTGCAACATCTGGGCAGGCTTTCCCCCAGTGTGTCTTTGATCATTGGGACACCATGACCTCAGATCCTTTGGAGGCTGGATCACAAGCTGCACAGCTTGTTATGGACATCCGCAAGAGGAAGGGACTCAAGGAACAAATGACTCCCCTTTCTGAGTTTGAAGACAAGCTTTAA
上述黄花苜蓿延伸因子2MfEF2在提高植物抗寒性中的应用:该应用包括用本发明的MfEF2基因构建植物表达载体；用构建的表达载体转化植物组织；将转化的植物组织培育成转基因植株。所述的用本发明的MfEF2基因构建植物表达载体，可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体；所述植物表达载体包括但不限于双元农杆菌载体以及用于单子叶基因枪转化的载体；所述的双元农杆菌载体包括pBI121，pCAMBIA系列载体；所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它效应mRNA加工或基因表达的DNA片段；使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可使用任何一种强启动子或诱导型启动子；这些启动子包括但不限于花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子和泛素(Ubiqutin)启动子，它可单独使用或与其他的植物启动子结合使用；此外使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，这些增强子区域包括但不限于ATG起始密码子和邻接区域。起始密码子必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的翻译。翻译控制信号和起始密码子可以使多种不同的来源，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或来自结构基因。为了便于对转基因植株进行鉴定及筛选，可对所使用的植物表达载体进行加工，包括加入或替换植物可选择性标记。可使用的选择性标记包括编码抗除草剂的酶的基因或具有抗性的抗生素标记物；所述的除草剂包括草丁膦、草甘膦等，所述的抗生素包括卡那霉素、潮霉素、庆大霉素等。从转基因植物的安全性考虑，可以不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。含有MfEF2基因的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。本发明的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接的DNA转化，显微注射、电穿孔等各种常规或特异`的遗传转化方法导入植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主可以是双子叶植物或单子叶植物。所述的MfEF2基因片段的获得和植物表达载体的制备方法，包括以下步骤:(I)引物设计① MfEF2 扩增上游引物 RT77:CTAGTCAAGATGGTGAAGTTCACAG ；②MfEF2 扩增下游引物 RT78: CAGTTTTCATAACAGCCAAGTACAT ；(2) MfEF2基因片段的获得:以黄花苜蓿(Medicago falcata)的cDNA为模板，使用引物①和引物②扩增MfEF2基因片段，并连接进入PGEM-T easy载体中，构建获得pGEM_MfEF2载体；(3)植物表达载体pBI_MfEF2的构建对重组质粒pGEM_MfEF2和pB 1-121表达质粒分别用Xba I和BamH I进行双酶切，回收MfEF2基因片段和线性化的pB1-121载体，进行连接构建获得植物表达载体pB1-MfEF2。所述的转基因植物为转基因烟草；所述的转基因烟草的获得，包括以下的步骤:(I)用电转的方法将pBI_MfEF2导入根瘤农杆菌EHA105中，获得含表达载体pB1-MfEF2农杆菌阳性菌落；(2)将活化的含有表达载体pBI_MfEF2的农杆菌EHA105浸染烟草无菌苗，经共培养和抗生素筛选，获得转基因烟草。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:发明人已从黄花苜蓿中克隆了 EF2基因的cDNA序列MfEF2。MfEF2基因的表达受低温胁迫诱导，构建了适合于双子叶植物的表达载体，转化双子叶模式植物烟草，转基因植株明显提高了抗冻性和抗冷性。
图1是植物表达载体pBI_MfEF2的表达框示意图。图2本发明所述MfEF2基因开放阅读框序列的PCR扩增琼脂糖电泳图，其中，M是标准DNA分子；I是MfEF2基因的扩增片段。图3是MfEF2基因的植物表达载体的PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图，其中，M是标准DNA分子；1-3是3组构建的植物表达质粒的MfEF2基因的扩增片段。图4是低温诱导MfEF2基因表达的实时定量PCR检测柱状图。柱上方的字母a和b表示不同材料之间的差异显著(P ( 0.05)，即数据柱上方字母相同时表示没有显著差异，数据柱上方字母不同时表示存在显著差异。图5是导入MfEF2基因的转基因烟草的PCR鉴定结果琼脂糖凝胶电泳图，其中，W表示野生型；P表示pB1-MfEF2载体，为阳性对照；编号I 11表示不同的转基因烟草。图6是3个导入MfEF2基因的转基因烟草的Southern杂交和Northern杂交鉴定，其中，W表示野生型；数字1-3表示不同的转基因烟草；图(a)是Southern杂交，图(b)是Northern 杂交。图7是导入MfEF2杂交基因的转基因烟草抗冻性检测，其中图(a)是冻处理后的存活率，图(b)是冻处理前后各的植株照片。柱上方的字母a和b表示不同材料之间的差异显著(P ( 0.05)，即数据柱上方字母相同时表示没有显著差异，数据柱上方字母不同时表不存在显著差异。图8是表达MfEF2基因的转基因烟草抗冷性的相对电导率检测。其中，W表示野生型；编号I 3表示不同的转基因烟草。柱上方的字母a和b表示不同材料之间的差异显著(P ( 0.05)，即数据柱上方字母相同时表示没有显著差异，数据柱上方字母不同时表示存在显著差异。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。黄花苜蓿种子:品种为海拉尔，中国农科院北京畜牧兽医研究所牧草种质资源库。根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105:购自北京天恩泽基因科技有限公司。烟草或烟草(Nicotiana tabacum L.)种子:品种为中烟90,广东省农科院作物研究所。
pBI121表达载体:购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。大肠杆菌DHlOB:购自上海超研生物科技有限公司。实施例1MfEF2的克隆一、黄花苜蓿cDNA模板制备将苗龄8 10周的黄花苜蓿植株放入温度为5°C的人工气候箱(光照强度为200 μ mo I HT2iT1)内，光/暗周期为12小时，进行低温处理，连续处理2天。提取总的RNA:剪取成熟叶片，加入液氮快速研磨成粉末，转移至2ml离心管中，力口入1.5ml TRE-Trizol(广州博理生物科技公司)试剂，剧烈振荡15秒，冰浴5分钟。IOOOOrpm离心5min,吸取上清至2ml离心管,加入0.3ml氯仿,剧烈振荡15秒,冰浴10分钟。12000rpm离心15分钟，吸取上层水相(彡0.7ml)至1.5ml离心管，依次加入0.4ml异丙醇和0.4mlBuffer A (1.2M NaCl，80mM柠檬酸钠，用DEPC处理水配制)，立即混匀，室温下放置10分钟。12000rpm离心10分钟，弃上清，用75%乙醇(DEPC处理水配制)洗涤沉淀。7500rpm离心5分钟，弃上清，再短暂离心3秒，用枪头吸尽上清。室温下风干沉淀5分钟，加入30 35 μ I DEPC处理水，60°C温浴5分钟，溶解沉淀，获得黄花苜蓿总RNA。取I 3 μ I总RNA进行甲醛变性胶电泳，检查RNA的完整性，并用紫外分光光度计测260nm与280nm的光吸收值，确定总RNA的浓度与纯度。逆转录制得黄花苜蓿的cDNA模板:以上述得到的黄花苜蓿总RNA为模板，以Oligo (dT) 18为反转录引物,用M-MLV逆转录酶试剂盒(Promega公司),参照说明书的方法合成cDNA第一链。逆转录反应体系为:24 8总1 嫩，14 11.(^1 Oligo (dT) 18，加入无菌的无离子水，使反应液总体积达到1 0μ 1，混勻，70°C保温5min后，迅速放入碎冰浴5分钟；继续向反应液依次加入以下成分:5μ I M-MLV5 X Reaction Buffer, 1.25 μ 12.5mM dNTPs,0.5 μ I RNase抑制剂(25U)，I μ I M-MLV逆转录酶(200U)，加无菌的无离子水至终体积为25 μ I。轻弹管壁，混匀，短暂离心。于42°C保温，反应60分钟，再在70°C下保温10分钟，使酶失活。反应结束后，制备获得黄花苜蓿的cDNA模板，于-20°C保存备用。二、设计扩增MfEF2基因引物根据本实验室构建的黄花苜蓿冷诱导基因cDNA消减文库中发现的MfEF2基因cDNA片段的序列，在NCBI上进行BLASTn比对EST序列，并下载相应核苷酸序列一致性最高的序列，利用DNAStar软件的Seqman工具进行序列拼接，如此反复直到拼接得到该基因的全长序列。通过DNAstar软件分析以上全长序列的开放阅读框，根据开放阅读框两端的序列设计引物:MfEF2 扩增上游引物 RT77:CTAGTCAAGATGGTGAAGTTCACAGMfEF2 扩增下游引物 RT78: CAGTTTTCATAACAGCCAAGTACAT三、扩增获得MfEF2基因并构建载体PCR扩增:以步骤一得到的cDNA第一链为模板和步骤二设计的引物RT77和RT78进行PCR扩增。PCR反应体系为:KOD-Plus DNA聚合酶(Τ0Υ0Β0公司，IU/μ I) I μ 1、10Xbuffer5y 1,2.5mM dNTPs5 μ UMgSO4 (2 5mmo I.Ι^)2μ 1、10 μ M 上游引物 RT771.5 μ 1、1(^|/[下游引物1^781.5 μ 1、第一链cDNA2y 1、无菌的无离子水32 μ I。混匀后按下列程序进行PCR反应:94°C 3分钟，94°C变性0.5分钟，55°C退火I分钟，68°C延伸1.5分钟，35个循环后，68°C延伸1.5-2分钟。以0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
PCR产物回收与末端加A:用PCR产物回收试剂盒回收上述获得的PCR产物，进一步通过Taq酶催化的反应进行末端加A,反应体系如下:2 μ IlOXbuffer, I μ 14mM dATP,Ilyg PCR回收片段，0.1μ I Taq DNA聚合酶，加入无菌的去离子水至总体积为20 μ 1，70°C反应20分钟，即对MfEF2基因片段进行了末端加A。末端加A的MfEF2基因片段与T载体的连接:用PCR产物回收试剂盒回收上述获得末端加了 A的MfEF2基因片段。用T4DNA连接酶(TaKaRa公司)将PCR回收片段与pMD20T-vector (TaKaRa公司)进行连接，反应体系如下:1 μ 110XT4连接酶缓冲液，回收的目的片段 60ng，ly I T4 连接酶(350υ/μ I)，2μ lpMD20T_vector 载体(10ng)，加无菌水至总体积为10μ 1，16°C连接过夜。大肠杆菌感受态细胞的制备:用接种环取保存于_80°C超低温冰箱的大肠杆菌DHlOB菌液，在SOB固体培养基上划板，于37°C培养箱内培养过夜；挑取大肠杆菌DHlOB单菌落接种于Iml的SOB液体培养基中，在37°C恒温摇床上以200rpm振荡培养约6h，接种于200ml SOB液体培养基中，于37°C恒温摇床上以200rpm振荡培养至OD55tl = 0.6 0.8。以2500rpm离心10分钟收集菌体，加入预冷的10%甘油洗涤，离心收集细菌。重复用10%甘油洗涤，离心收集细菌。最后将细菌分装，于一 70°C保存备用。连接产物电激转化大肠杆菌:将上述MfEF2基因片段与T载体的连接产物在1/3的 TE (IM NaCl, IOmM Tris-HCl pH8.0, ImM EDTA)中透析 30 分钟。取 20 μ I 大肠杆菌感受态细胞至电极杯(孔径1mm)，加入1μ I经过透析的连接产物，用电激仪(MicroPulser,Bio-RAD公司)电激转化。电激参数为:电阻20(^，180(^，25 4 。电激后的菌体转入ImlSOC液体中，于37°C恒温摇床上以200rpm振荡培养I小时。取100 μ I菌液涂布于含IPTG和X-gal的LB固体(含100 μ g/mL Amp)培养基上，于37°C培养箱内倒置培养过夜。
重组质粒的筛选、纯化及测序:呈蓝斑的菌落不含插入片段，仅挑取呈白斑的菌落，做菌落PCR检测。挑取PCR阳性菌落，接种于2ml含100 μ g/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37°C恒温摇床上以200rpm振荡培养过夜。吸取2ml菌液，用质粒DNA纯化试剂盒(Qiagen公司)提质粒，4°C保存备用。对获得的质粒用Xba I /BamH I双酶切，电泳检测插入片段的大小，进一步确定阳性克隆。将纯化的重组质粒(命名为pGM-MfEF2)，测序。用0miga2.0软件对测序结果进行分析，除去两端的T载体序列，从而得到PCR扩增产物的序列如下:
权利要求
1.一种黄花苜蓿延伸因子2MfEF2，其特征在于其氨基酸序列如SEQ IDN0.1所示。
2.编码权利要求1所述的黄花苜蓿延伸因子2MfEF2的核苷酸序列如SEQIDN0.2所示。
3.权利要求1所述的黄花苜蓿延伸因子2MfEF2在提高植物抗寒性中的应用。
4.根据权利要求3所述的黄花苜蓿延伸因子2MfEF2的应用，其特征在于:该应用包括用本发明获得的MfEF2基因构建植物表达载体；用构建的表达载体转化植物组织；将转化的植物组织培育成 转基因植物。
全文摘要
本发明公开了一种黄花苜蓿延伸因子2MfEF2及其编码基因和应用，属于植物基因工程领域。本发明通过获得MfEF2基因，并将获得的MfEF2基因构建植物表达载体，用构建的表达载体转化植物组织，然后培育成转基因植株。MfEF2基因受低温的诱导；本发明提供了利用MfEF2基因培育耐寒植物的方法，将该基因在植物过量表达后，提高了转基因植物的耐冻性和耐冷性。
文档编号C12N9/12GK103173425SQ20121059391
公开日2013年6月26日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日
发明者郭振飞, 何思健, 何雪英 申请人:华南农业大学