专利名称：黄花苜蓿温度诱导的脂质转运体MfTIL及其编码基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，涉及一种黄花苜蓿温度诱导的脂质转运体MfTIL及其编码基因和应用。
背景技术：
环境中的非生物胁迫，例如干旱、盐碱、冷害和热害等影响植物的生长和发育，造成农作物的减产，也影响林木、果树、花卉、园艺观赏植物的正常生长和品质，培育耐逆的植物品种是种植业的主要目标之一。然而，植物耐逆性是一个数量性状，涉及至少几百个基因的作用，因此从耐逆性强的植物中分离耐性基因是十分必要的。脂质转运体(Iipocalins)是一个广泛分布于生物界蛋白家族(Akerstromet al. 2000),但这个蛋白家族成员的氨基酸序列同源性低，其功能是运输疏水性化合物(Flower et al. 2000)。植物脂质运载蛋白可分为两大类温度诱导的脂质转运体(temperature induced lipocalins, TIL)和叶绿体脂质转运体(chloroplasticlipocalins, CHLs)(Charron et al. 2005)。植株中的脂质转运体 的研究并不多。主要在模式植物拟南芥有过研究，TIL基因受低温和高温诱导(Charron et al. 2002),具有抗温度胁迫的功能(Charron et al. 2008 ；Chi et al. 2009)。黄花苜猜(Medicago sativa subsp. falcata)是一种非常耐寒的豆科牧草种质，在寒冷的西伯利亚也有分布，从中克隆抗寒基因，能为转基因育种提供更为优良的目的基因，而且对于农林植物抗逆分子育种尤为重要和迫切。
发明内容
为克服现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的是提供一种黄花苜蓿温度诱导的脂质转运体MfTIL。本发明的另一目的在于提供编码所述的黄花苜蓿温度诱导的脂质转运体MfTIL的基因。本发明的再一目的在于提供所述的黄花苜蓿温度诱导的脂质转运体MfTIL的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现一种黄花苜蓿温度诱导的脂质转运体MfTIL，其氨基酸序列如下所示MGNTVGKDKEVVKGVDLERYMGRWYEIASFPSFFQPKNGENTRATYTLNSDGTVHVLNETWNGGKRTSIEGSAYKADPKSDEAKLKVKFYVPPFLPIIPAVGDYfflLYLDQDYQYALlGGPTNKYLffILCRQPHLDEAIYNQLVEKAKEEGYDVSKLHKTPQSDPPPE ；编码所述的黄花苜蓿温度诱导的脂质转运体MfTIL的核苷酸序列如下所示 ATGGGAAACACCGTAGGGAAGGACAAGGAGGTTGTGAAGGGTGTAGACTTGGAGAGGTACATGGGTAGGTGGTATGAGATAGCTTCTTTCCCTTCATTCTTCCAGCCCAAAAATGGAGAGAACACAAGAGCCACATACACTCTCAACAGTGATGGGACTGTTCATGTTCTCAACGAGACTTGGAATGGTGGTAAAAGAACCTCCATAGAAGGAAGTGCTTATAAAGCTGACCCCAAAAGTGATGAAGCCAAGCTCAAGGTTAAATTCTATGTTCCTCCATTCTTGCCAATTATTCCTGCTGTTGGAGATTACTGGATTTTGTACCTTGATCAAGATTATCAATATGCTCTCATTGGTGGGCCTACCAATAAATATCTATGGATACTATGCAGGCAACCCCATTTGGATGAAGCAATCTACAACCAGCTTGTTGAGAAAGCTAAGGAAGAAGGCTATGATGTGAGTAAATTGCACAAGACTCCACAGAGTGATCCTCCACCTGAGTAA ；上述黄花苜蓿温度诱导的脂质转运体MfTIL在提高植物抗寒性中的应用该应用包括用本发明的MfTIL基因构建植物表达载体；用构建的表达载体转化植物组织；将转化的植物组织培育成转基因植株。所述的用本发明的MfTIL基因构建植物表达载体，可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体；所述植物表达载体包括但不限于双元农杆菌载体以及用于单子叶基因枪转化的载体；所述的双元农杆菌载体包括pBI121，pCAMBIA系列载体；所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它效应mRNA加工或基因表达的DNA片段；使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可使用任何一种强启动子或诱导型启动子；这些启动子包括但不限于花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子和泛素(Ubiqutin)启动子，它可单独使用或与其他的植物启动子结合使用；此外使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，这些增强子区域包括但不限于ATG起始密码子和邻接区域。起始密码子必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的翻译。翻译控制信号和起始密码子可以使多种不同的来源，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或来自结构基因。
为了便于对转基因植株进行鉴定及筛选，可对所使用的植物表达载体进行加工，包括加入或替换植物可选择性标记。可使用的选择性标记包括编码抗除草剂的酶的基因或具有抗性的抗生素标记物；所述的除草剂包括草丁膦、草甘膦等，所述的抗生素包括卡那霉素、潮霉素、庆大霉素等。从转基因植物的安全性考虑，可以不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。含有MfTIL基因的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。本发明的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接的DNA转化，显微注射、电穿孔等各种常规或特异的遗传转化方法导入植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主可以是双子叶植物或单子叶植物。所述的MfTIL基因片段的获得和植物表达载体的制备方法，包括以下步骤(I)引物设计① MfTIL 扩增上游引物 RTl 13 TGAAATAGAGGAAGCAATAACATC ；②MFTIL 扩增下游引物 RTl 14 CAGGCATTTGT GTCTTGAGG ；③引入Xba I 酶切位点的上游引物 RT31 : TCCATCTAGATGAAATAGAGGAAGCAATAACATC；④引入BamH I 酶切位点的下游引物 RT32 TAGAGGATCCAGGCATTTGTGTCTTGAGG ；(2) MfTIL基因片段的获得以黄花苜蓿(Medicago falcata)的cDNA为模板，使用引物①和引物②扩增MfTIL基因片段，并连接进入PGEM-T easy载体中，构建获得pGEM_MfTIL载体；(3)植物表达载体pB1-MfTIL的构建以pGEM-MfTIL载体为模板，使用引物③和引物④使MfTIL基因片段引入Xba I和BamH I两个酶切位点，进而构建获得植物表达载体pBI_MfTIL ；所述的转基因植物优选为转基因烟草；所述的转基因烟草的获得，包括以下的步骤(I)用电转的方法将pB1-MfTIL导入根瘤农杆菌EHA105中，获得含表达载体pB1-MfTIL农杆菌阳性菌落；(2)将活化的含有表达载体pB1-MfTIL的农杆菌EHA105浸染烟草无菌苗，经共培养和抗生素筛选，获得转基因烟草。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果发明人已从黄花苜蓿中克隆了脂质转运体基因的cDNA序列MfTIL。MfTIL基因的表达受低温和ABA诱导，构建了适合于双子叶植物的表达载体，转化双子叶模式植物烟草，转基因植株明显提高了抗冻和抗冷性。
图1是植物表达载体pB1-MfTIL的表达框示意图。图2是本发明所述MfTIL基因开放阅读框序列的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图，其中，M是标准DNA分子；1是M fTIL基因的扩增片段。图3是MfTIL基因的植物表达载体的PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图，其中，M是标准DNA分子；1是阳性重组子；P是阳性对照。图4是低温和脱落酸(ABA)诱导MfTIL基因表达的特征柱状图，其中，图(a)是低温对MfTIL基因转录的影响，图(b)是ABA对MfTIL基因转录的影响；柱上方的字母a、b、c、d和e表示不同处理之间的差异显著(P ( 0. 05)，即数据柱上方字母相同时表示没有显著差异，数据柱上方字母不同时表示存在显著差异。图5是导入MfTIL基因的转基因烟草的PCR鉴定结果琼脂糖凝胶电泳图，其中，W表示野生型；P表示pB1-MfTIL载体，为阳性对照；编号I 8表示不同的转MfTIL基因烟草。图6是3个导入MfTIL基因的转基因烟草的Southern杂交、实时定量PCR和Western杂交鉴定，其中，W表示野生型；编号Tl、T2和T29表示不同的转基因烟草；图(a)是Southern杂交，图(b)是实时定量PCR检测，图(c)是Western杂交；柱上方的字母a和b表示不同材料之间的差异显著(P ( 0. 05)。图7是导入MfTIL基因的转基因烟草抗冻性存活率检测，其中图(a)是冻处理后的存活率，图(b)是冻处理后各个植株的照片；柱上方的字母a、b和c表示不同材料之间的差异显著(P ( 0. 05)。图8是表达MfTIL基因的转基因烟草抗冷性的相对电导率检测。其中，W表示野生型；编号Tl、T2和T29表示不同的转基因烟草；柱上方的字母a和b表示不同材料之间的差异显著(P ( 0. 05)。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。黄花苜蓿种子品种为海拉尔，中国农科院北京畜牧兽医研究所牧草种质资源库。根癌农杆菌(Aggobacterium tumefaciens) EHA105 :购自北京天恩泽基因科技有限公司。烟草或烟草(Nicotiana tabacum L.)种子品种为中烟90,广东省农科院作物研究所。pBI121表达载体购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。大肠杆菌DHlOB :购自上海超研生物科技有限公司。实施例1MfTIL的克隆一、黄花苜蓿cDNA模板制备 将黄花苜蓿(Medicago falcata)种子用60°C热水浸泡5分钟，于28°C黑暗条件下催芽，当种子露白时，点播于盛有泥土的塑料盆(直径15cm)中，于温室内培养，自然光照，温度25-28°C。将苗龄8-10周的黄花苜蓿植株放入温度为5°C的人工气候箱(光照强度为200 u mo I HT2s-1)内，光/暗周期为12小时光照，进行5°C低温处理，连续处理2天。取黄化苜猜的成熟叶片，用Trizol方法提取总RNA,用M-MLV逆转录酶试剂盒(Promega公司)反转录获得cDNA模板，_20°C保存备用。二、设计扩增MfTIL基因引物根据本实验室构建的黄花苜蓿冷诱导基因cDNA缩减文库中发现的MfTIL基因cDNA片段的序列，在NCBI上进行BLASTn比对EST序列，并下载相应核苷酸序列一致性最高的序列，利用DNAStar软件的Seqman工具进行序列拼接，如此反复直到拼接得到该基因的全长序列。通过DNAstar软件分析以上全长序列的开放阅读框，根据开放阅读框两端的序列设计引物MfTIL 扩增上游引物 RT113 : TGAAATAGAGGAAGCAATAACATC ；MfTIL 扩增下游引物 RTl 14 CAGGCATTTGT GTCTTGAGG ；三、扩增获得MfTIL基因并构建载体用上述步骤一制备的模板和步骤二设计的引物进行PCR扩增。PCR 反应体系(50ii L) :K0D-Plus_DNA 聚合酶(T0Y0B0 公司，IU u L-1) I U I,10Xbuffer5ii 1，dNTPs (IOmmol L-1) 1，MgSO4 (25mmol L-1) 1，上游弓丨物(10 u mo I L-1)1. 5 u 1，下游引物(10 u mo I L-1)1. 5 U I,反转录第一链 cDNA2 u I, ddH20 补足至50u I0PCR 反应程序=PCR 反应程序94°C 3 分钟；94°C 0. 5 分钟，55°C 0. 5 分钟，72°C 0. 5分钟，35个循环；72°C 10分钟。扩增产物以0. 8%的琼脂糖凝胶电泳检测(图2)。获得与预期片段长度(571bp) —致的PCR片段(图2)。将获得的PCR产物用DNA凝胶回收试剂盒(Qiagen公司)回收后进一步通过Taq酶催化的反应进行末端加A,反应体系如下2ii llOXbuffer，I ii 14mM dATP，11 ii gPCR回收片段，0.1 ii I Taq DNA聚合酶，加入无菌的去离子水总体积为20 yl，70°C反应20分钟。用PCR产物回收试剂盒回收上述获得的PCR片段。用T4DNA连接酶(TaKaRa公司)将PCR回收片段与pGEM-T easy载体(Promega公司)进行连接，反应体系如下liillOXT4连接酶缓冲液，回收目的片段60ng，I ill T4连接酶，2 ill pGEM-T easy载体(10ng)，加无菌水至总体积为10iU，16°C连接过夜。大肠杆菌感受态细胞的制备用接种环取保存于_80°C超低温冰箱的大肠杆菌DHlOB菌液，在SOB固体培养基上划板，于37°C培养箱内培养过夜；挑取大肠杆菌DHlOB单菌落接种于Iml的SOB液体培养基中，在37°C恒温摇床上以200rpm振荡培养约6h，接种于200ml SOB液体培养基中，于37°C恒温摇床上以200rpm振荡培养至OD550 = 0. 6-0. 8。以2500rpm离心10分钟收集菌体，加入预冷的10%甘油洗涤，离心收集细菌。重复用10%甘油洗涤，离心收集细菌。最后将细菌分装，于_70°C保存备用。连接产物电激转化大肠杆菌将上述的末端加A的PCR片段和pGEMT-vector连接产物在 1/3 的 TE (1M NaCl, IOmM Tris-HCl pH8. 0, ImM EDTA)中透析 30 分钟。取20 Ul大肠杆菌感受态细胞至电极杯(孔径1_)，加入I Ul经过透析的连接产物，用电激仪(MicroPulser，Bio-RAD公司)电激转化。电激参数为电阻200 Q，1800V, 25 U F。电激后的菌体转入Iml SOC液体中，于37°C恒温摇床上以200rpm振荡培养I小时。取100 yl菌液涂布于含IPTG和X-gal的LB固体(含100 u g/mL Amp)培养基上，于37°C培养箱内倒置培养过夜。重组质粒pGEM-MfTIL的筛选、纯化及测序呈蓝斑的菌落不含插入片段，仅挑取呈白斑的菌落，做菌落PCR检测。挑取PCR阳性菌落，接种于2ml含100 u g/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37°C恒温摇床上以200rpm振荡培养过夜。吸取2ml菌液，用质粒DNA纯化试剂盒(Qiagen公司)提质粒，4°C保存备用。对获得的质粒用Xba I /BamH I双酶切，电泳检测插入片段的大小 ，进一步确定阳性克隆。纯化的重组质粒命名为pGEM-MfTIL，送交上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，测序结果如下
权利要求
1.一种黄花苜蓿温度诱导的脂质转运体MfTIL，其特征在于其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.编码权利要求1所述的黄花苜蓿温度诱导的脂质转运体MfTIL的核苷酸序列如SEQID NO. 2 所示。
3.权利要求1所述的黄花苜蓿温度诱导的脂质转运体MfTIL在提高植物抗寒性中的应用。
4.根据权利要求3所述的黄花苜蓿温度诱导的脂质转运体MfTIL的应用，其特征在于该应用包括用本发明获得的MfTIL基因构建植物表达载体；用构建的表达载体转化植物组织；将转化的植物组织培育成转基因植物。
全文摘要
本发明公开了一种黄花苜蓿温度诱导的脂质转运体MfTIL及其编码基因及应用，属于植物基因工程领域。本发明通过获得MfTIL基因，并将获得的MfTIL基因构建植物表达载体，用构建的表达载体转化植物组织，然后培育成转基因植株。MfTIL基因受低温和脱落酸刺激的诱导；本发明提供了利用MfTI基因培育耐寒植物的方法，将该基因在植物过量表达后，提高了转基因植物的耐冻性和耐冷性。
文档编号C12N15/29GK103059114SQ20121059394
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日
发明者郭振飞, 涂庆华, 何雪英 申请人:华南农业大学