专利名称：Nogo受体拮抗剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及神经生物学和分子生物学。本发明更具体涉及免疫原性Nogo受体-1 (NgRl)多肽，Nogo受体-1抗体，其抗原结合片段，可溶性Nogo受体及其融合蛋白以及编码它们的核酸。本发明进一步涉及Nogo受体-1拮抗剂多聚核苷酸。本发明进一步涉及包含该种Nogo受体抗体，其抗原结合片段,免疫原性Nogo受体-1多肽，可溶性Nogo受体及其融合蛋白，编码它们的核酸以及拮抗剂多聚核苷酸的组合物，以及这些成分的制备和使用方法。
背景技术：
神经元的轴突和树突是由神经元向外延伸的长细胞突起。伸展的轴突或神经突的尖端包含了一个专化的区域，该区域被称作生长锥。生长锥感受局部环境并引导轴突向神经元靶细胞生长。生长锥可响应表面粘性，生长因子，神经传递素和电场等多个环境线索。锥的生长引导涉及多类吸附分子，胞间信号以及刺激和抑制生长锥的因素。生长神经突的生长锥可以不同的速率生长，但其速度通常为每天一至两毫米。
生长锥呈手形，具有可差异吸附至胚胎表面的扁平突起(微端丝或丝状伪足)。丝状伪足具有持续的活性，部分丝状伪足可缩回生长锥，而其它的丝状伪足可持续延长透过基质。不同丝状伪足之间的延长形成了片状伪足。
生长锥通过片状伪足和丝状伪足探索其前方和两侧的区域。当延长物接触到不适宜的表面时，它将缩回当延长物接触到适宜的生长表面时，它将继续延伸并将生长锥导向该方向。生长锥可受到基质表面属性的细微变化所引导。生长锥到达合适的靶细胞后将建立突触联系。
神经细胞的功能受神经元与其直接环境中的其它细胞的接触所影响(U.Rutishauser, T.M.Jessell, Physiol.Rev.68:819 (1988))。这些细胞包括中枢神经系统(CNS)中的特殊神经胶质细胞，少突细胞以及以髓磷脂(多层膜的隔离结构)包覆神经元轴突的周围神经系统(PNS)的施万细胞(G.Lemke, in AnIntroduction to MolecularNeurobiology, Z.Hall,Ed.(Sinauer, Sunderland, Mass.), p.281(1992))。
尽管CNS神经元 具有在损伤后再生的能力，该种能力可由于髓磷脂中抑制蛋白的存在，或者也可能由于在其局部环境中常发现的其它类型的分子的存在而受到抑制(Brittis 和 Flanagan, Neuron50:11-14 (2001) ; Jones 等人,J.Neurosc.22:2792-2803 (2002) ; Grimpe 等人，J.Neurosc1.22:3144-3160 (2002))。
在少突细胞上发现的多种髓磷脂抑制蛋白已得到鉴定，例如，NogoA(Chen等人，Nature403:434-439(2000);Grandpre 等人，Nature403:439-444(2000))，髓鞘相关糖蛋白(MAG, McKerracher 等人，Neuronl3:805-811 (1994);Mukhopadhyay 等人，Neuronl3:151-161 (1994))以及少突细胞糖蛋白(OM_gp, Mikol 和 Stefansson, J.Cell.Biol.106:1213-1219(1988)) ο这些蛋白各自显示为神经元Nogo受体-1的配体(Wang 等人，Nature417:941-944 (2002) ; Liu 等人，Sciehce297:1190-93 (2002) ; Grandpre等人,Nature403:439-444 (2000) ; Chen 等人,Nature403:434-439 (2000) ; Domeniconi 等人，Neuron35:283-90 (2002))。
Nogo受体-1是一种包含了含8个富亮氨酸重复序列的GPI锚定的膜蛋白(Foumier 等人,Nature409:341-346 (2001))。在与抑制蛋白(例如，NogoA, MAG 和 OM-gp)相互作用后，该Nogo受体-1复合物转导了可导致生长锥萎缩和神经突生长抑制的信号。
对抑制Nogo受体-1与其配体结合以及减少髓磷脂-介导的生长锥萎缩和神经突生长抑制的分子存在着迫切的需求。
发明概述
本发明涉及Nogo受体-1拮抗剂在促进神经突生长，神经元存活，以及CNS神经元中轴突再生中的应用。本发明的特征在于可用于抑制神经突生长抑制，促进神经元存活，和/或促进CNS神经元中轴突再生的分子和方法。
本发明还涉及可溶性Nogo受体-1多肽及包含其的融合蛋白，以及针对Nogo受体-1特异性免疫原区的抗体及其抗原片段。本发明还涉及与本发明的抗体结合的免疫原性Nogo受体-1多肽。本发明还涉及可与Nogo受体-1结合的单克隆抗体结合的Nogo受体-1多肽。该种多肽可特别用作免疫原或用于筛选抗体以鉴定与本发明的抗体具有类似特异性的抗体。本发明进一步涉及编码本发明多肽的核酸，包含该种核酸的载体和宿主细胞以及制备该种肽的方法。本发明的抗体，可溶性受体和受体融合蛋白对抗或阻断Nogo受体-1并可用于抑制Nogo受体-1与其配体的结合，抑制神经元内生长锥萎缩并减少神经元内神经突生长或抽芽。
在部分实施方式中，本发明提供了选自如下组合的多肽:MAFTGLTLLEQLDLSDNAQLR(SEQ ID NO:26);LDLSDNAQLR(SEQID NO:27);LDLSDDAELR(SEQ IDNO:29);LDLASDNAQLR(SEQ IDNO:30);LDLASDDAELR(SEQ ID NO:31);LDALSDNAQLR(SEQ IDNO:32);LD ALSDDAELR(SEQ ID NO:33);LDLSSDNAQLR(SEQ ID NO:34);LDLSSDEAELR(SEQID NO:35);DNAQLRffDPTT(SEQ ID NO:36);DNAQLR(SEQ ID NO:37);ADLSDNAQLRVVDPTT(SEQID N0:41) ;ALSDNAQLR ffDPTT (SEQ ID NO:42) ;LDLSDNAALRVVDPTT (SEQ IDNO:43) ;LDLSDNAQLHVVDPTT(SEQ ID NO:44);以及 LDLSDNAQLAWDPTT(SEQ ID NO:45)。
在部分实施方式中，本发明提供了编码本发明多肽的核酸。在部分实施方式中，该核酸可操作地连接至表达控制序列。在部分实施方式中，本发明提供了包含本发明核酸的载体。
在部分实施方式中，本发明提供了包含本发明核酸或载体的宿主细胞。在部分实施方式中，本发明提供了生产本发明多肽的方法，其包括培养包含本发明核酸或载体的宿主细胞，然后从该宿主细胞或培养基回收该多肽。
在部分实施方式中，本发明提供了生产抗体的方法，其包括以本发明的多肽或包含本发明的核酸或载体的宿主细胞对宿主免疫接种，然后回收抗体。本发明还提供了由该方法生产的抗体及其抗原结合片段。
在部分实施方式中，本发明提供了特异性结合本发明多肽的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体不是由杂交瘤细胞系HB7E11 (ATCC 编号PTA-4587-HB7E11)生产的单克隆抗体。
在本发明的部分实施方式中，该抗体或其抗原结合片段(a)抑制神经元的生长锥萎缩；(b)减少对神经元神经突生长和抽芽的抑制；以及(C)抑制Nogo受体-1与配体的结合。在部分实施方式中，该神经突生长和抽芽为轴突生长。在部分实施方式中，该神经元为中枢神经系统神经元。
在部分实施方式中，本发明的抗体为单克隆抗体。在部分实施方式中，本发明的抗体为鼠抗体。在部分实施方式中，本发明的抗体选自由人源化抗体，嵌合抗体以及单链抗体构成的组合。
在部分实施方式中，本发明提供了抑制Nogo受体-1与配体结合的方法，其包括将Nogo受体-1与本发明的抗体或其抗原结合片段相接触。在部分实施方式中该配体选自由NogoA, NogoB, NogoC, MAG 和 OM-gp 构成的组合。
在部分实施方式中，本发明提供了抑制神经元中生长锥萎缩的方法，其包括将神经元与本发明的抗体或其抗原结合片段相接触。
在部分实施方式中，本发明提供了减少神经元中神经突生长或抽芽抑制的方法，其包括将神经元与本发明的抗体或其抗原结合片段相接触。在部分实施方式中，该神经突生长或抽芽为轴突生长。在部分实施方式中，该神经元为中枢神经系统神经元。
在部分实施方式中，本发明提供了包含药学可接受载体以及本发明的抗体或其抗原结合片段的组合物。在部分实施方式中，该组合物进一步包括一种或多种附加治疗剂。
在部分实施方式中，本发明提供了促进具有死亡风险的神经元存活的方法，其包括将该神经元与有效量的本发明的抗-Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段相接触。在部分实施方式中，该神经元处于体外。在部分实施方式中，该神经元在哺乳动物体内。在部分实施方式中，该哺乳动物显示了多发性硬化症，ALS,亨廷顿病，阿尔茨海默病，帕金森氏病，糖尿病神经病变，中风，外伤性脑损伤或脊髓损伤的信号或症状。
在部分实施方式中，本发明提供了在哺乳动物中促进具有死亡风险的神经元存活的方法，其包括(a)提供表达本发明抗-Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段的培养后的宿主细胞；以及(b)在该神经元的位点或附近将该宿主细胞导入该哺乳动物。
在部分实施方式中，本发明提供了促进具有死亡风险的神经元存活的基因治疗方法，其中该神经元处于哺乳动物体内，其包括在该神经元位点或附近施用包含了编码本发明抗-Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列的病毒载体，其中该抗-Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段的表达量足以促进该神经元的存活。
在部分实施方式中，本发明提供了包含除了最多三个氨基酸替换外选自如下组合的氨基酸序列的具有60个残基或少于60个残基的分离多肽:SEQ ID NO:49的氨基酸309-335; SEQ IDNO: 49 的氨基酸 309-336; SEQ ID NO: 49 的氨基酸 309-337; SEQ IDNO: 49的氨基酸 309-338; SEQ ID NO: 49 的氨基酸 309-339; SEQ ID NO: 49 的氨基酸 309-340; SEQID NO:49 的氨基酸 309-341; SEQ IDNO:49 的氨基酸 309-342; SEQ ID N0:49 的氨基酸309-343; SEQ IDNO: 49 的氨基酸 309-344; SEQ ID NO: 49 的氨基酸 309-345; SEQ IDNO: 49的氨基酸 309-346; SEQ ID NO: 49 的氨基酸 309-347; SEQ IDNO: 49 的氨基酸 309-348; SEQID NO:49 的氨基酸 309-349; SEQ IDNO:49 的氨基酸 309-350; SEQ ID NO:49 的氨基酸300-344; SEQ IDNO: 49 的氨基酸 301-344; SEQ ID NO: 49 的氨基酸 302-344; SEQ IDNO: 49的氨基酸 303-344; SEQ ID NO: 49 的氨基酸 304-344; SEQ IDNO: 49 的氨基酸 305-344; SEQID NO:49 的氨基酸 306-344; SEQ IDNO:49 的氨基酸 307-344; SEQ ID NO:49 的氨基酸308-344; SEQ IDNO: 49 的氨基酸 336-344; SEQ ID NO: 49 的氨基酸 335-344; SEQ IDNO: 49的氨基酸 334-344; SEQ ID NO: 49 的氨基酸 333-344; SEQ IDNO: 49 的氨基酸 332-344; SEQID N0:49 的氨基酸 331-344;SEQ IDN0:49 的氨基酸 330-344; SEQ ID N0:49 的氨基酸329-344; SEQ EONO: 49 的氨基酸 328-344; SEQ ID NO: 49 的氨基酸 327-344; SEQ IDNO: 49的氨基酸 326-344; SEQ ID NO: 49 的氨基酸 325-344; SEQ IDNO: 49 的氨基酸 324-344; SEQID NO:49 的氨基酸 323-344; SEQ IDNO:49 的氨基酸 322-344; SEQ ID NO:49 的氨基酸321-344; SEQ IDNO: 49 的氨基酸 320-344; SEQ ID NO: 49 的氨基酸 319-344; SEQ IDNO: 49的氨基酸 318-344; SEQ ID NO: 49 的氨基酸 317-344; SEQ IDNO: 49 的氨基酸 316-344; SEQID N0:49 的氨基酸 315-344;SEQ IDN0:49 的氨基酸 314-344; SEQ ID N0:49 的氨基酸313-344; SEQ IDN0:49 的氨基酸 312-344; SEQ ID N0:49 的氨基酸 311-344; SEQ IDNO:49的氨基酸 310-344; SEQ ID NO: 49 的氨基酸 336-344; SEQ IDNO: 49 的氨基酸 336-345; SEQID NO:49 的氨基酸 336-346; SEQ IDNO:49 的氨基酸 336-347; SEQ ID NO:49 的氨基酸336-348; SEQ IDNO: 49 的氨基酸 336-349; SEQ ID NO: 49 的氨基酸 336-350;任意所述多肽片段的变体或衍生物，以及至少两个任意所述多肽片段的组合。
在部分实施方式中，本发明提供了包含选自如下组合的氨基酸序列的具有60个残基或少于60个残基的分离多肽:SEQ IDNO:49的氨基酸311-344; SEQ ID N0:49的氨基酸310-348; SEQ IDNO: 49 的氨基酸 323-328; SEQ ID NO: 49 的氨基酸 339-348; SEQ IDNO: 49 的氨基酸378-414; SEQ ID NO: 49 的氨基酸27-38; SEQ IDNO:49 的氨基酸39-61; SEQ ID NO:49的氨基酸 257-267; SEQ IDNO: 49 的氨基酸 280-292; SEQ ID NO: 49 的氨基酸 301-323; SEQIDNO: 49 的氨基酸 335-343; SEQ ID NO: 49 的氨基酸 310-335; SEQ IDNO: 49 的氨基酸326-328;任意所述多肽片段的变体或衍生物，以及至少两个任意所述多肽片段的组合。
在部分实施方式中，本发明提供了具有60个残基或少于60个残基的分离多肽片段，其包含除了最多三个单独氨基酸替换外与参考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的参考氨基酸序列选自如下组合:(a) SEQ ID N0:49的氨基酸x-344，(b)SEQ IDNO:49的氨基酸309-y，以及(C)S EQ ID NO:49的氨基酸χ-y，其中x为由305至326的任意整数，而y是由328至350的任意整数；并且其中所述的多肽片段抑制Nogo-受体介导的神经突生长抑制。在部分实施方式中，本发明提供了具有60个残基或少于60个残基的分离多肽片段，其包含除了最多三个单独氨基酸替换外与参考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的参考氨基酸序列选自如下组合:(a) SEQ ID NO:49的氨基酸X’-344，(b) SEQ ID N0:49的氨基酸309-y’，以及(C)SEQ ID NO:49的氨基酸x’-y’，其中X’为由300至326的任意整数，而y’是由328至360的任意整数；并且其中所述的多肽片段抑制Nogo-受体介导的神经突生长抑制。在部分实施方式中，本发明提供了具有60个残基或少于60个残基的分离多肽片段，其包含除了最多三个单独氨基酸替换外与参考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的参考氨基酸序列选自如下组合:SEQ ID NO:49的氨基酸309-335; SEQ ID NO: 49的氨基酸 309-344; SEQ ID NO: 49 的氨基酸 310-335; SEQ ID NO: 49 的氨基酸 310-344; SEQ IDNO: 49的氨基酸309-350; SEQ ID NO: 49的氨基酸300-344;以及SEQ ID NO: 49的氨基酸315-344。在部分实施方式中，本发明提供了具有60个残基或少于60个残基的分离多肽片段，其包含除了最多三个单独氨基酸替换外与参考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的参考氨基酸序列为SEQ ID NO:49的氨基酸309-335。
在部分实施方式中，本发明所提供的多肽为环状。在部分实施方式中，该环状多肽进一步包含连接在N-末端的第一分子和连接在C-末端的第二分子；其中所述的第一分子和所述的第二分子彼此连接形成所述的环状分子。在部分实施方式中，该第一和第二分子选自如下组合:生物素分子，半胱氨酸残基，以及乙酰化半胱氨酸残基。在部分实施方式中，该第一分子为连接至本发明多肽N-末端的生物素分子而该第二分子为连接至本发明多肽C-末端的半胱氨酸残基。在部分实施方式中，该第一分子为连接至本发明多肽N-末端的乙酰化半胱氨酸残基而该第二分子为连接至本发明多肽C-末端的半胱氨酸残基。在部分实施方式中，该第一分子为连接至本发明多肽N-末端的乙酰化半胱氨酸残基而该第二分子为连接至本发明多肽C-末端的半胱氨酸残基。在部分实施方式中，该C-末端半胱氨酸连接了 NH2部分。
在部分实施方式中，本发明提供了包含第一多肽片段和第二多肽片段的分离多肽，其中所述的第一多肽片段包含了除了最多二十个单独氨基酸替换外与第一参考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的第一参考氨基酸序列选自如下组合:(a)SEQ IDN0:49的氨基酸a-445，(b)SEQ ID NO: 49的氨基酸27_b，以及(c) SEQ ID NO: 49的氨基酸a_b，其中a为由25至35的任意整数，而b是由300至450的任意整数；其中所述的第二多肽片段包含了除了最多二十个单独氨基酸替换外与第二参考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的第二参考氨基酸序列选自如下组合:(a) SEQ IDN0:49的氨基酸c-445，(b) SEQ IDNO: 49的氨基酸27-d，以及(c)SEQID NO: 49的氨基酸c_d，其中c为由25至35的任意整数，而d是由300至450的任意整数；并且其中所述的多肽抑制Nogo-受体介导的神经突生长抑制。在部分实施方式中，本发明进一步提供了包含第一多肽片段和第二多肽片段的分离多肽，其中该第一多肽片段包含了除了最多二十个单独氨基酸替换外与第一参考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中该第一参考氨基酸序列选自如下组合:(a) SEQ ID N0:49的氨基酸27-310，以及(b)SEQ ID NO:49的氨基酸27-344。在部分实施方式中，本发明进一步提供了包含第一多肽片段和第二多肽片段的分离多肽，其中该第二多肽片段包含了除了最多二十个单独氨基酸替换外与第二参考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中该第二参考氨基酸序列选自如下组合:(a ) SEQ ID NO:49的氨基酸27-310，以及(b) SEQ ID NO: 49的氨基酸27-344。在部分实施方式中，本发明进一步提供了包含第一多肽片段和第二多肽片段的分离多肽，其中该第二多肽片段包含了除了最多二十个单独氨基酸替换外与第一参考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中该第一参考氨基酸序列包含SEQ ID N0:49的氨基酸27-310而该第二参考氨基酸序列包含SEQ ID N0:49的氨基酸27-310，或其中其中该第一参考氨基酸序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸27-344而该第二参考氨基酸序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸27-310，或其中该第一参考氨基酸序列包含SEQ ID NO: 49的氨基酸27-344而该第二参考氨基酸序列包含SEQ ID NO: 49的氨基酸27-344。在部分实施方式中，本发明进一步提供了该第一多肽片段位于该第二多肽片段的上游。在部分实施方式中，本发明进一步提供了在第一多肽片段和第二多肽片段之间的肽接头。在部分实施方式中，本发明进一步提供了该肽接头包含SEQ ID N0:65(G4S)3o在部分实施方式中，本发明进一步提供了该肽接头包含 SEQ ID N0:66(G4S)2。在部分实施方式中，本发明提供了本发明的多肽，其中至少一个半胱氨酸残基被外源氨基酸替换。在部分实施方式中，该至少一个半胱氨酸残基为C266。在部分实施方式中，该至少一个半胱氨酸残基为C309。在部分实施方式中，该至少一个半胱氨酸残基为C335。在部分实施方式中，该至少一个半胱氨酸残基位于C336。在部分实施方式中，该至少一个半胱氨酸残基被选自丙氨酸，丝氨酸和苏氨酸的氨基酸替换。在部分实施方式中，该替换氨基酸为丙氨酸。在部分实施方式中，本发明提供了分离多肽，其包含:(a)除了参考氨基酸序列中至少一个半胱氨酸残基被不同氨基酸替换外，与所述参考序列一致的氨基酸序列，其中所述的参考氨基酸序列选自如下组合:(i) SEQ ID N0:49的氨基酸a-445，(ii)SEQ IDNO:49的氨基酸27-b，以及(iii)SEQ ID NO:49的氨基酸a-b，其中a为由25至35的任意整数，而b是由300至450的任意整数；以及(b)外源多肽；其中所述的多肽抑制Nogo-受体介导的神经突生长抑制。在部分实施方式中，本发明进一步提供了所述的参考氨基酸序列的C266被不同氨基酸替换。在部分实施方式中，本发明进一步提供了所述的参考氨基酸序列的C309被不同氨基酸替换。在部分实施方式中，本发明进一步提供了所述的参考氨基酸序列的C335被不同氨基酸替换。在部分实施方式中，本发明进一步提供了所述的参考氨基酸序列的C266和C309被不同氨基酸替换。在部分实施方式中，本发明进一步提供了所述的参考氨基酸序列的C309和C335被不同氨基酸替换。在部分实施方式中，本发明进一步提供了该不同的氨基酸为丙氨酸。在部分实施方式中，本发明提供了分离多肽，其包含:(a)除了最多二十个单独氨基酸替换外与参考序列一致的氨基酸序列，其中所述的参考氨基酸序列选自如下组合:(i)SEQ ID NO: 49 的氨基酸 a-445，(ii) SEQ ID NO: 49 的氨基酸 27_b，以及(iii) SEQID NO: 49的氨基酸a-b，其中a为由25至35的任意整数，而b是由300至450的任意整数；以及(b)外源多肽；其中所述的多 肽抑制Nogo-受体介导的神经突生长抑制。在部分实施方式中，本发明提供了包含第一多肽片段和第二多肽片段的分离多肽，其中所述的第一多肽片段包含除了最多二十个单独氨基酸替换外与第一参考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的第一参考氨基酸序列选自如下组合:(a) SEQ IDNO:60的氨基酸a-305，(b)SEQ ID NO: 60的氨基酸l_b，以及(c) SEQID NO: 60的氨基酸a_b，其中a为由I至27的任意整数，而b是由264至309的任意整数；并且其中所述的第二多肽片段包含了除了最多二十个单独氨基酸替换外与第二参考氨基酸序列一致的氨基酸序列，其中所述的第二参考氨基酸序列选自如下组合:(a) SEQID N0:49的氨基酸c-332，(b) SEQ IDN0:49的氨基酸275-d，以及(c)SEQ ID NO:49的氨基酸c_d，其中c为由265至306的任意整数，而d是由308至340的任意整数；并且其中所述的多肽抑制Nogo-受体介导的神经突生长抑制。在特定的实施方式中，该第一参考氨基酸序列选自如下组合:(a) SEQ ID NO: 49的氨基酸1-274;以及(b)SEQ ID NO:49的氨基酸1-305。在特定的实施方式中，该第二参考氨基酸序列选自如下组合:(a) SEQ ID NO:60的氨基酸275-311 ;(b) SEQ ID N0:60的氨基酸 275-332 ; (c) SEQ ID NO: 60 的氨基酸 306-311 ; (d) SEQ ID NO: 60 的氨基酸 306-308 ;以及(e)SEQID NO:60的氨基酸306-309。在一种实施方式中，该第一多肽片段序列包含SEQID NO:49的氨基酸1-274而该第二多肽片段包含SEQ ID N0:60的氨基酸275-311。在部分实施方式中，该第一多肽片段序列包含SEQ ID NO: 49的氨基酸1-274而该第二多肽片段包含SEQID NO: 60的氨基酸275-332。在部分实施方式中，该第一多肽片段序列包含SEQ IDNO:49的氨基酸1-305而该第二多肽片段包含SEQID NO:60的氨基酸306-308。在部分实施方式中，该第一多肽片段序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸1-305而该第二多肽片段包含SEQID NO:60的氨基酸306-309。在部分实施方式中，至少一个附加氨基酸被添加至第二多肽片段的C-末端。在一种实施方式中，该至少一个附加氨基酸为色氨酸。在部分实施方式中，该第一多肽片段的A269被不同的氨基酸替换。在一种实施方式中，该不同的氨基酸为色氨酸。在部分实施方式中本发明提供了包含第一多肽片段和第二多肽片段的分离多肽，其中所述的第一多肽片段除了不超过二十个单独氨基酸替换外由SEQ ID N0:49的氨基酸1-310组成；且其中所述的第二多肽片段除了不超过五个单独氨基酸替换外由SEQIDNO:60的氨基酸311-318组成；并且其中所述的多肽抑制nogo-受体-介导的神经突生长抑制。在部分实施方式中本发明进一步提供了该外源多肽选自以下组合:(a)血清白蛋白，(b)Fc区，(C)信号肽，(d)多肽标记，以及(e)两种或多种所述外源多肽的组合。在部分实施方式中，本发明进一步提供了该Fe区选自如下组合:IgA Fe区；IgD Fe区；IgG Fe区；IgE Fe区以及IgM Fe区。在一种实施方式中，该Fe区为IgG Fe区。在部分实施方式中，本发明进一步提供了介于该氨基酸序列和IgG Fe区之间的肽接头。在部分实施方式中，该肽接头包含了 SEQ ID N0:66(G4S)2。在部分实施方式中，本发明进一步提供了该多肽标记选自如下组合=FLAG标记；Str印标记 ’聚组氨酸标记；VSV_G标记；流感病毒血凝素(HA)标记；以及c-Myc标记。在部分实施方式中，本发明提供了与一种或多种聚烷撑二醇部分连接的本发明多肽。在部分实施方式中，本发明进一步提供了该一种或多种聚烷撑二醇部分为聚乙二醇(PEG)部分。在部分实施方式中，本发明进一步提供了与1-5PEG部分连接的本发明多肽。在部分实施方 式中，本发明提供了编码本发明多肽的分离多聚核苷酸。在部分实施方式中，本发明进一步提供了该核苷酸序列被可操作地连接至表达控制元件(例如，可诱导启动子，组成型启动子，或分泌信号)。附加的实施方式包括包含本发明分离多聚核苷酸的载体以及包含所述载体的宿主细胞。在部分实施方式中，本发明提供了选自如下组合的分离多聚核苷酸:(i)反义多聚核苷酸；(ii)核酶；(iii)小干扰RNA(siRNA);以及(iv)小发夹RNA (shRNA)。在部分实施方式中，多聚核苷酸为包含了与NgRl mRNA编码部分互补的至少10个碱基的反义多聚核苷酸。在部分实施方式中，该多聚核苷酸为核酶。在更进一步的实施方式中，该多聚核苷酸为SiRNA或shRNA。在部分实施方式中，本发明提供了该siRNA或shRNA抑制NgRl表达。在部分实施方式中，本发明进一步提供了该 siRNA 或 shRNA 与包含了 CUACUUCUCCCGCAGGCG 或 CCCGGACCGACGUCUUCAA或CUGACCACUGAGUCUUCCG的核苷酸序列至少有90 %的一致性。在另一实施方式中，该 siRNA 或 shRNA 核苷酸序列为 CUACUUCUCCCGCAGGCG 或 CCCGGACCGACGUCUUCAA 或CUGACCACUGAGUCUUCCG。在部分实施方式中，本发明进一步提供了该siRNA或shRNA核苷酸序列与多聚核苷酸序列 GATGAAGAGGGCGTCCGCT 或 GGGCCTGGCTGCAGAAGTT 或 GACTGGTGACTCAGAG AAGGC 生成的mRNA互补。本发明的附加实施方式包括药物组合物，其包括本发明的多肽，多聚核苷酸，载体或宿主细胞并在特定的实施方式中包括药学可接受的载体。在特定的实施方式中，该组合物包含SEQ IDNO: 7的氨基酸27-310以及抗炎剂。在另一实施方式中，该组合物包含SEQID N0:9的氨基酸27-310以及抗炎剂。在部分实施方式中，本发明进一步提供了该抗炎剂选自由留体抗炎剂和非留体抗炎剂构成的组合。在特定的实施方式中，该留体抗炎剂选自如下组合:氢化可的松，21-醋酸基娠烯醇酮，阿氯米松，阿尔孕酮，安西奈德，丙酸倍氯米松，倍他米松，倍他米松戊酸，布地奈德，氯泼尼松，丙酸氯倍他索，丙酸氯倍他索，氯倍他松，氯倍他松丁酸盐，氯可托龙，氯泼尼醇，皮质酮，可的松，可的伐唑，deflazacon,地奈德，去羟米松，地塞米松，二氟拉松，二氟可龙，二氟泼尼酯，甘草次酸，氟扎可特，氟氯奈德，氟美松，新戊酸氟米松，氟尼缩松，氟轻松曲安缩松，醋酸氟轻松，氟氢松醋酸酯曲安缩松，氟可丁丁酯，氟考龙，氟考龙己酸盐，二氟可龙戊酸盐，氟米龙，氟培龙醋酸盐，醋酸氟泼尼定，氟泼尼龙，氟氢缩松，氟甲酰龙，哈西奈德，齒美他松，齒泼尼松醋酸盐，氢可他酯，氢化可的松，醋酸氢化可的松，丁酸氢化可的松，氢化可的松磷酸盐，氢化可的松，21-琥珀酸钠，氢化可的松叔丁乙酸盐，马泼尼酮，甲羟松，甲基强的松，甲泼尼龙，糠酸莫米松，帕拉米松，泼尼卡酯，强的松，强的松龙21-diedryaminoacetate,泼尼松龙磷酸钠,醋酸泼尼松龙琥拍酸钠，强的松龙钠21-m-苯磺酸，强的松龙钠21-硬脂酸乙醇酸酯，叔丁乙酸盐强的松，强的松龙21-三甲基乙酸盐，泼尼松，泼尼松龙戊酸酯，泼尼立定，泼尼立定21- 二乙氨基醋酸盐，替可的松，曲安西龙，曲安西龙曲安缩松，苯曲安奈德和己曲安奈德。在特定的实施方式中，该甾体抗炎剂为甲泼尼龙。在另一实施方式中，该非留体抗炎剂选自如下组合:阿明洛芬，苯恶洛芬，布氯酸，卡布洛芬，芬布芬，非诺洛芬，氟洛芬，氟比洛芬，布洛芬，吲哚洛芬，酮洛芬，咪洛芬，萘普生，奥沙普秦，吡洛芬，普拉洛芬，舒洛芬，噻洛芬酸，硫恶洛芬，吲哚美辛，阿西美辛，阿氯芬酸，环氯茚酸，双氯芬酸，芬氯酸，芬克洛酸，芬替酸，呋罗芬酸，异丁芬酸，伊索克酸，oxpinac,舒林酸，硫平酸，托美汀，齐多美辛，佐美酸，氟芬那酸，甲氯芬那酸酸，甲芬那酸，尼氟灭酸，托芬那酸，二氟尼柳，氟苯沙酸，伊索昔康，吡罗昔康，舒多昔康，替诺昔康，乙酰水杨酸，柳氮磺胺批唳，阿扎丙宗，bezpiperylon,非普拉宗,莫非布宗,轻基保泰松和苯乙丁氮酮。附加的实施方式包括组合物，其中SEQ ID NO: 7或9的氨基酸27-310被融合至外源多肽。在部分实施方式中，该外源多肽为Fe。本发明的实施方式还包括促进神经突生长的方法，其包括将神经元与包含本发明的多肽，多聚核苷酸或组合物的药剂相接触，其中所述的药剂抑制Nogo受体I介导的神经突生长抑制。附加实施方式包括抑制NgRl信号转导复合物的信号转导的方法，其包括将神经元与有效量的包含本发明的多肽，多聚核苷酸或组合物的药剂相接触，其中所述的药剂抑制NgRl信号转导复合物的信号转导。其它实施方式包括在哺乳动物中治疗中枢神经系统(CNS)疾病，素乱或损伤的方法，其包括向需要该种治疗的哺乳动物施用有效量的包含本发明的多肽，多聚核苷酸或组合物的药剂相接触， 其中所述的药剂抑制Nogo受体I介导的神经突生长抑制。在特定的实施方式中，该疾病，紊乱或损伤选自如下组合:多发性硬化症，ALS，亨廷顿病，阿尔茨海默病，帕金森氏病，糖尿病神经病变，中风，外伤性脑损伤，脊髓损伤，视神经炎，青光眼，听力丧失以及肾上腺脑白质营养不良。在部分实施方式中本发明进一步提供了该多肽被融合至外源多肽。在部分实施方式中，该外源多肽为血清白蛋白。在部分实施方式中，该外源多肽为Fe区。在部分实施方式中，该外源多肽为信号肽。在部分实施方式中，该外源多肽为多肽标记。在部分实施方式中，本发明进一步提供了该Fe区选自如下组合:IgA Fe区；IgD Fe区；IgG Fe区；IgE Fe区以及IgM Fe区。在部分实施方式中，本发明进一步提供了该多肽标记选自如下组合:Flag标记；Str印标记；聚组氨酸标记；VSV-G标记；流感病毒血凝素(HA)标记；以及c-Myc标记。
图1为Nogo受体-1的结构示意图。人sNogoR310包含SEQ ID NO: 7的残基26-310而 sNogoR344 包含 SEQ ID NO:6 的残基 26-344。大鼠 sNogoR310 包含 SEQ ID N0:9 的残基27-310 而 sNogoR344 包含 SEQ ID NO:8 的残基 27-344。图2显示了通过Vector Nti软件获得的Nogo受体-1蛋白的抗原性图。大鼠P-617为 SEQ ID N0:10 而大鼠 P-618 为 SEQID NO: 11。人 P-617 为 SEQ ID NO:47 而人 P-618 为SEQ ID NO:48。图3A显示了抗-Nogo受体-1抗体7E11的结合活性。该图显示了 7E11浓度对Nogo66与Nogo受体-1结合的影响。图3B显示了抗-Nogo受体-1抗体1H2的结合活性。该图显示了 1H2浓度对Nogo66与sNogoR344-Fc (在此处和美国专利申请60/402，866中也称为Fc_sNogoR344或Ig_sNogoR344)结合的影响。Fc-MAG不与Nogo66竞争结合sNogoR344-Fco图4显示了抗No go-R-1抗体1H2，3G5和2F7的ELISA结果。抗体在固定化抗原存在下对OD45tl的作用得到了检测。该固定化抗原为sNogoR310-FC (在此处和美国专利申请 60/402，866 中也称为 Fc_sNogoR310 或 Ig_sNogoR310)，sNogoR344_Fc，p-617, p-618,P-4, p-5和卵白蛋白以及BSA。图5显示了单克隆抗体7E11在不同数量的髓磷脂存在下对大鼠DRG神经突生长的作用。图6A显示了在如下竞争者存在下sNogoR310与125I_Nogo66或125I_Nogo40的结合作用:Nogo66, Nogo40以及抗-Nogo受体-1单克隆抗体上清液。图6B显不了 125I_Nogo66与sNogoR310的结合活性。图7 显不了 sNogoR310_Fc 对 125I_Nogo40 与 sNogoR310 结合的作用。图8 显示了 sNogoR310_Fc 与 125I_Nogo40 的结合活性。图9A显示了 sNogoR310在髓磷脂存在或缺失的情况下对神经突生长/细胞的作用。图9B显示了 sNogoR310在髓磷脂存在或缺失的情况下对神经突生长的作用。图1OA显示了 sNogoR310_Fc在持续增多的髓磷脂的存在或缺失下对大鼠DRG神经突生长的作用。图1OB显示了在以PBS，PBS+sNogoR310-Fc，20ng髓磷脂和髓磷脂+sNogoR3IO-Fc处理后的神经突/细胞数。
图11显示了单克隆抗体5B10在持续增多的髓磷脂存在下对DRG神经突生长/细胞的作用。图12显示了在大鼠脊髓横切模型中直至诱导损伤后30日内sNOgOR310-Fc对BBB评分的作用。图13A和13B报导了 WT或转基因小鼠品系08或品系01进行脊髓半切后运动BBB评分随时间的变化。图13C显示了 WT和转基因小鼠损伤后最大容忍倾斜角度随时间的变化。图13D显示了倾斜网格爬升过程中后肢错误随损伤后时间的变化。在所有的图中均报导了每组7-9只小鼠的平均土s.e.m.。转基因组的值与WT小鼠的值具有统计学差异(双星号，P〈0.01 ;学生t检验)。图14A显示了在溶媒或sNOgOR310-Fc处理动物进行脊髓半切后运动BBB评分随时间的变化。图14B显示了网格行走过程中后肢错误随损伤后时间的变化。图14C显示的足迹分析揭示了对照小鼠比未损伤或损伤+sNOgOR310-Fc大鼠具有更短的步长和更大的步幅。在所有的图中均报导了每组7-9只大鼠的平均土 s.e.m.。sNogoR310-Fc组的值与对照的值具有统计学差异(图14A-B)。在图14C中的对照值和无SCI或SCI+sNogoR310-Fc大鼠的值具有统计学差异。(星号，P〈0.05 ;双星号，p〈0.01 ;学生t检验)。图15显示了抗-rNgRl抗体1D9与大鼠NgRl的可溶性片段(srNgR310)的结合模型。图16A显示了人Nogo受体cDNA的核苷酸序列。在起始和终止密码子下添加了下划线。选定的RNAi靶区以斜体表示。RNA1-1和RNA1-3特异性靶向人NgR基因，所设计的RNA1-2靶向人，小鼠和大鼠NgR基因。图16B显示了用于将NgR RNAi构建进入表达载体PU6的DNA寡聚核苷酸的核苷酸序列。图17显示了在小鼠L细胞中RNAi阻抑的瞬时转染测试的结果。
图18显示了人NgR表达载体对SKN和293细胞的转染。图19显示了人SKN细胞中RNAi阻抑的瞬时转染测试。图20显示了 RNAi慢病毒载体的示意图。该RNAi表达盒可插入PacI位点或EcoRI位点。LTR-长末端重复；RRE-Rev应答元件；cPPT_中央聚嘌呤通道；CBA_鸡β肌动蛋白；WPRE-旱獭肝炎转录后调节元件；SIN LTR-自我失活型LTR。图21显示了以7E11抗体验证克隆Neuroscreen细胞中NgRl阻抑的western印迹分析。图22显示了以LV(克隆#3G9,1E51E91E10)，LV-NgRRNAi或原态细胞转导的克隆NeuroScreen细胞中NgR表达的概括。Western印迹中的NgR和GAPDH信号通过光密度扫
描进行定量。图23显示了通过不同的NgR阻抑水平构建的四种NeuroScreen细胞克隆。NgR表达表示为原态NeuroScreen细胞中NgR:GAPDH信号比例的百分比。图24A-B 显示了融合至大鼠 IgG[NgR(310) ecto-Fc]的大鼠 NgRl (27-310)胞外区结构域和甲泼尼龙(MP)在体外对髓磷脂诱导的鸡背根神经节(DRGs)中神经突生长抑制的作用。(A)将分离胚胎13天的鸡背根神经节神经元在NgR(310) ecto-Fc或NgR(310)ecto-Fc存在下置于磷酸盐缓冲液(PBS)或髓磷脂(400ng/微孔)中。(B)以PBS对照土 SEM (η-3)百分比表示的每个细胞(Π-3)神经突生长的定量。比例尺，200 μ m。与PBS对照比较P〈0.05。图25A-E 显示了融合至大鼠 IgG[NgR(310) ecto-Fc]的大鼠 NgRl (27-310)胞外区结构域和甲泼尼龙(MP)对脊髓损伤(SCI)后功能性恢复的作用。㈧在4周内每周记录BBB评分。(B) SCI后两天MP-处理大鼠中的BBB评分。(C)对单独动物的BBB评分归一化至第二日。(D) —致性脚掌行走频率和后肢-前肢协调性，显示了 SCI后3和4周获得14或更高评分的各组中的大鼠比例。(E) NgR(310) ecto-Fc-和MP+NgR(310) ecto-Fc-处理组的平均步长与对照的比较。图26A-B 显示了融合至大鼠 IgG[NgR(310) ecto-Fc]的大鼠 NgRl (27-310)胞外区结构域和甲泼尼龙(MP)处理对尾部至脊髓损伤后轴突数量的作用。图27显示了融合至大鼠IgG[NgR(310) ecto-Fc]的大鼠NgRl (27-310)胞外区结构域和甲泼尼龙(MP)处理对接触腹角运动神经元的生物素葡聚糖胺(BDA)-标记的轴突数量的作用。
发明详述 定义及通用技术除非另行说明，此处所用的技术和科学术语的含义等同于本发明所属领域普通技术人员的普遍理解。在产生冲突的情况下，将受本申请包括定义所支配。此外，除非上下文另行指明，单数形式的术语可包括复数形式，而复数形式的术语可包括单数形式。此处涉及的所有出版物，专利及其它参考文献均以全部目的在此全文引用作为参考。尽管其它与此处所述类似或等同的方法和材料也可用于对本发明的实施或测试，下文描述了适用的方法和材料。该材料，方法和实施例仅作阐释目的，并非意在限制。从具体描述和权利要求中可显而易见地得到本发明的其它特征和优势。在整个说明书和权 利要求中，术语“包含”及其变体应理解为包括了任何所列举的整体或整体组合，但排除了任何其它整体或整体组合。为进一步明确本发明，此处提供了下列术语和定义。应当注意术语“一个”或“一种”实体指一个或多个该种实体；例如，“一种免疫球蛋白分子”应理解为代表一个或多个免疫球蛋白分子。因此，术语“一个”(或“一种”)，“一个或多个”以及“至少一个”在此处可进行互换。在整个说明书和权利要求中，术语“由…组成”及其变体指包括了任何所列举的整体或整体组合，但该特定的方法，结构或组合物中不可加入其它的整体或整体组合。在整个说明书和权利要求中，术语“基本由…组成”及其变体指包括了任何所列举的整体或整体组合，且选择性地包含了不会实质改变特定的方法，结构或组合物的基础或新颖性能的整体或整体组合。”此处所用的“抗体”指完整的免疫球蛋白，或其抗原结合片段。本发明的抗体可属于任何同型或类别(例如，M，D，G，E和A)或任何亚类(例如，Gl-4，A1-2)，并可具有kappa (K)或 lambda ( λ )轻链。此处所用的“Fe”指包含一种或多种重链恒定区CHl，CH2和CH3的免疫球蛋白重链部分。例如，抗体的重链恒定区的一部分可通过木瓜蛋白酶获得。此处所述的“NogoR融合蛋白”指包含融合至外源多肽的可溶性Nogo受体-1部分的蛋白。
此处所用的“人源化抗体”指至少部分非人源序列被人源序列替换的抗体。如何制备人源化抗体的范例可参见美国专利6，054, 297，5，886，152以及5，877，293。此处所用的“嵌合抗体”指包含了一个或多个来自第一抗体的区域并包含了一个或多个来自另一抗体的区域的抗体。该第一抗体和附加抗体可来自相同或不同物种。如此处和美国专利申请60/402，866所用，“Nogo受体”，“NogoR”，“NogoR-1 ”，“NgR”，“NgR-1 ”，“NgRl ” 以及 “NGR1 ” 均指 Nogo 受体-1。此处所用的术语“多肽”同时包括了单数和复数的“多肽”，并指由酰胺键(也称作肽键)线性连接的单体(氨基酸)所组成的一种分子。术语“多肽”指任何两个或多个氨基酸的链，且不指定产物的具体长度。因此，肽，二肽，三肽，寡肽，“蛋白”，“氨基酸链”或任何其它指代两个或多个氨基酸链的术语都包含在“多肽”的定义之内，且术语“多肽”可取代任何上述术语或与之互换。术语“多肽”还指多肽表达后修饰的产物，该种修饰包括但不限于糖基化，乙酰化，磷酸化，酰胺化，通过已知的保护/阻断基团进行衍生化，蛋白水解裂解，或通过非天然存在的氨基酸进行修饰。多肽可衍生自天然的生物来源或通过重组技术生产，但不一定需要翻译自指定的核酸序列。它可通过任何方式生成，包括化学合成。本发明的多肽的大小约为3个或更多，5个或更多，10个或更多，20个或更多，25个或更多，50个或更多，75个或更多，100个或更多，200个或更多，500个或更多，1000个或更多，或者2000个或更多的氨基酸。多肽可具有一种指定的三维结构，但并非必须具有该种结构。具有指定三维结构的多肽被称为折叠结构，而不具有指定三维结构，但可采用多种构型的多肽被称为未折叠结构。此处所用的术语糖蛋白指一种至少与一个糖部分连接的蛋白，该糖部分通过一种氨基酸残基(例如丝氨酸残基或天冬氨酸残基)的含氧或含氮侧链与蛋白连接。“分离的”多肽或其片段，变体或衍生物指一种不存在于其天然环境中的多肽。不要求达到特定的纯化水平。例如，一种分离的多肽可取自其自然的或天然的环境中。在宿主细胞中表达的重组生产的多肽和蛋白被认为对于本发明的目的而言是分离的，因为它们是通过任何合适的技术分离，分割，或者部分或充分纯化的天然或重组多肽。在本发明中，“多肽片段”指更大多肽的短氨基酸序列。蛋白片段可以是“独立式的”或是包含在更大的多肽中(该片段作为其部分)。本发明的多肽片段的代表性范例包括，例如，包含约5个氨基酸，约10个氨基酸，约15个氨基酸，约20个氨基酸，约30个氨基酸，约40个氨基酸，约50个氨基酸，约60个氨基酸，约70个氨基酸，约80个氨基酸，约90个氨基酸，以及约100个氨基酸或长度更长的片段。术语“片段”，“变体”，“衍生物”及“类似物”在指本发明的多肽时包括任何至少保留了部分生物活性的任意多肽。只要该多肽仍然能发挥功能，此处所述的多肽可不受限制地包括其片段，变体或衍生物。本发明的可溶性NgRl多肽可包括水解片段，删除片段并特别包括传递至动物时更容易到达作用位点的片段。多肽片段进一步包括包含了天然多肽抗原性或免疫原性表位(包括线性和三维表位)的任意多肽部分。本发明的可溶性NgRl多肽和多肽片段包括变体区，包括如上所述的片段，以及具有由氨基酸替换，缺失或插入所得的变更氨基酸序列的多肽。变体可天然产生，例如等位基因变体。“等位基因”指占据了有机体的染色体上给定位点的基因的副本。Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, NewYork(1985). 非天然存在的变体可通过本领域已知的突变技术制备。本发明的NgRl多肽和多肽片段可包含保守或非保守氨基酸替换，缺失或添加。本发明的NgRl多肽和多肽片段还可包含衍生分子。变体多肽在此也可称为“多肽类似物”。此处所用的多肽或多肽片段“衍生物”指具有一个或多个经过功能性侧基团反应化学衍生得到的残基的主体多肽。“衍生物”还包括包含了二十个标准氨基酸的一个或多个天然存在的氨基酸衍生物的肽。例如，4-羟基脯氨酸可取代脯氨酸；5_羟基赖氨酸可取代赖氨酸；3_甲基组氨酸可取代组氨酸；高丝氨酸可取代丝氨酸；以及鸟氨酸可取代赖氨酸。此处所用的术语“二硫键”包括了两个硫分子间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含了能与另一硫醇基团形成二硫键或桥的硫醇基团。此处所用的“融合蛋白”指包含了通过肽键可操作地连接至第二多肽的第一多肽的蛋白。该第一多肽和第二多肽可相同或不同，且它们可直接连接或通过肽接头进行连接(见下文)。术语“多聚核苷酸”包括了单数或复数的核酸，并指分离的核酸分子或构建体，例如，信使RNA (mRNA)或质粒DNA (pDNA)。多聚核苷酸和包含全长cDNA序列的核苷酸序列，包括未翻译的5’和3’序列，编码序列。多聚核苷酸可包括常规的磷酸二酯键或非常规的键(例如，于肽核酸(PNA)等发现的酰胺键)。多聚核苷酸可由可以是未修饰RNA或DNA或是修饰后的RNA或DNA的任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核苷酸组成。例如，多聚核苷酸可由单链和双链DNA，由单链和双链区混合得到的DNA，单链和双链RNA，以及由单链和双链区混合得到的RNA，包含了可能是单链，或者更典型为双链或单链和双链区混合物的DNA和RNA的杂交分子所组成。此外，该多聚核苷酸可由包含RNA或DNA或者同时包含RNA和DNA的三链区所组成。多聚核苷酸还可包含为稳定或为其它目的进行修饰的一个或多个修饰碱基或者DNA或RNA骨架。“修饰的”碱基包括，例如，三苯甲基化碱基和异常碱基如肌苷。DNA和RNA可进行多种修饰；因此，“多聚核苷酸”包括了化学，酶或代谢修饰的形式。术语“核酸”指在多聚核苷酸中存在的任何一个或多个核酸片段，例如DNA或RNA片段。“分离的”核酸或多聚核苷酸指从其天然环境中分离的核酸分子，DNA或RNA。例如，包含在载体中的一种编 码NgR多肽或多肽片段的重组多聚核苷酸被认为对于本发明的目的而言是分离的。分离多聚核苷酸的进一步范例包括存在于外源宿主细胞中的重组多聚核苷酸或在溶液中(部分或完全)纯化的多聚核苷酸。分离的RNA分子包括对本发明多聚核苷酸的体内或体外RNA转录物。如本发明所述的分离的多聚核苷酸或核酸进一步包括合成制备的该种分子。此外，多聚核苷酸或核酸可以是启动子，核糖体结合位点或转录终止子等调节元件或是包含该种调节元件。此处所用的“编码区”指由翻译氨基酸的密码子组成的一部分核酸。尽管“终止密码子”(TAG，TGA，或TAA)不翻译成氨基酸，它仍可被认为是编码区的一部分，但如启动子，核糖体结合位点，转录终止子等侧翼序列不是编码区的一部分。本发明的两个或多个编码序列可存在于一个单独的多聚核苷酸构建体(例如，单独的载体)中或分离的多聚核苷酸构建体(例如，分离的(不同)载体)中。此外，任何载体可包含一个单独的编码区，或包含两个或多个编码区，例如，一种单独载体可分别编码一种免疫球蛋白的重链可变区和一种免疫球蛋白的轻链可变区。此外，本发明的载体，多聚核苷酸或核酸可编码与编码本发明NgR多肽或多肽片段的核酸融和或未融合的外源编码区。外源编码区包括但不限于专门的元件或基序，例如分泌信号肽或外源功能性区域。
在特定的实施例中，该多聚核苷酸或核酸为DNA。当为DNA时，一种包含了编码多肽的核酸的多聚核苷酸通常包括与一个或多个编码区域可操作连接的一个启动子和/或其它转录或翻译控制元件。可操作的连接指当某种基因产物(例如，多肽)的编码区域与一个或多个调节序列以一种特定方式连接时，基因产物的表达受到调节序列的影响或控制。如启动子功能的诱导可使mRNA的转录编码目标基因产物，并且如果两个DNA片段之间的接头的性质不干扰表达调节序列引导基因产物表达的能力或干扰DNA模板被转录的能力，则两个DNA片段(例如一个多肽编码区域和与之连接的启动子)被“可操作地连接”。因此，如果一个启动子能够影响一种编码多肽的核酸的转录，则该启动子区域将被可操作地连接至该核酸。该启动子可以是一种仅能在预定细胞中引导DNA的充分转录的细胞特异性启动子。除启动子外的其它转录控制元件，如增强子，操作子，阻遏子以及转录终止信号可与多聚核苷酸进行可操作连接以引导细胞特异性转录。此处披露了合适的启动子和其它转录控制区。各种转录控制区域已为本领域技术人员所熟知。其包括，但不限于，在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区域，例如，但不限于，来自细胞巨化病毒的启动子和增强子片段(立即早期启动子，与内含子-A相连接)，猿病毒40 (早期启动子)以及逆转录酶病毒(例如禽劳斯肉瘤病毒)。其它的转录控制区域包括衍生自肌动蛋白，热休克蛋白，牛生长激素和兔球蛋白的脊椎动物基因的区域以及其它能够在真核细胞中控制基因表达的序列。其它合适的转录控制区域包括组织特异性启动子和增强子以及淋巴因子-诱导型启动子(例如，受干扰素或白介素诱导的启动子)。类似地，各种翻译控制元件已为本领域的普通技术人员所熟知。其包括，但不限于核糖体结合位点，翻译启动和终止密码子以及衍生自小核糖核酸病毒的元件(特别是内部核糖体进入位点，或是IRES，也被称为CITE序列)。在其它的实施方式中，本发明的多聚核苷酸为RNA，例如，以信使RNA(mRNA)的形式存在。本发明的多聚核苷酸和核酸编码区可与编码分泌或信号肽的附加编码区(引导本发明的多聚核苷酸编码的多肽的分泌)相连接。根据信号假设，由哺乳动物细胞分泌的蛋白具有一种信号肽或分泌型前导序列，后者在生长蛋白链向粗面内质网的输出被启动时从成熟蛋白上被裂解。本领域的普通技术人员均了解由脊椎动物分泌的多肽通常具有融合到多肽N末端的信号肽，它从完整或“全长”多肽序列裂解以生产分泌或“成熟”型多肽。在特定实施例中采用了如免疫球蛋白重链或轻链信号肽等天然信号肽，或保留了引导与之可操作连接的多肽分泌能力的该序列的功能性衍生物。此外还可以使用外源哺乳动物信号肽或其功能性衍生物。例如，野生型前导序列可被人组织型纤溶酶原激活剂(TPA)或小鼠β-葡萄糖醛酸酶的前导序列替换。此处所用的术语“工程改造的”包括通过人工方法(例如，通过重组技术，体外肽合成，肽的酶催化或化学偶合或是这些技术的组合)处理核酸或多肽分子。此处所用的术语“连接的”，“融合的”或“融合”可相互替换。这些术语指通过化学连接或重组技术等任何方法连接两个或多个元件或成分。“框内融合”指以能够维持原始开放阅读框架(ORFs)的正确翻译阅读框的方式连接两个或多个多聚核苷酸ORFs以形成一个更长的连续0RF。因此， 重组融合蛋白是一种含有两个或更多与原始ORFs所编码的多肽相应的片段的单独蛋白(该片段一般在天然状态下不进行该种连接)。尽管该阅读框架在融合片段中彼此连续，该片段可被框内接头序列等序列物理或空间分隔。“接头”序列指在融合蛋白中分割两个多肽编码区的一种或多种氨基酸的系列。典型的接头至少包含5个氨基酸。其它的接头包含至少10个或至少15个氨基酸。在特定的实施方式中，可对肽接头的氨基酸进行选择以使该接头具有亲水性。接头(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3(G4S)3(SEQ ID NO:65)为一种优选接头，它由于可提供足够的灵活性而广泛应用于多种抗体。其它接头包括(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2(G4S)2(SEQ ID NO:66),Glu Ser GlyArgSer Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO:67), Glu Gly Lys SerSer Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr (SEQID NO:68), Glu Gly Lys Ser Ser GlySer Gly Ser Glu Ser LysSer Thr Gln(SEQ ID NO:69), Glu Gly Lys Ser Ser Gly SerGlySer Glu Ser Lys Va I Asp (SEQ ID NO: 70), Gly Ser Thr Ser GlySer Gly Lys SerSer Glu Gly Lys Gly(SEQ ID NO:71), Lys GluSer Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln LeuAla Gln Phe Arg Ser LeuAsp (SEQ ID NO: 72)以及 Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser GluGlu LeuAla Phe Arg Ser Leu Asp (SEQ ID N0:73)。更短接头的范例包括上述接头的片段，而更长接头的范例包括上述接头的组合，上述接头片段的组合，以及上述接头与上述接头片段的组合。在有关多肽的上下文中，“线性序列”或“序列”指多肽中的由氨基向羧基末端方向排列的氨基酸，其中序列内彼此相邻的残基在多肽的一级结构内邻近。此处所用的术语“表达”指通过基因生产RNA或多肽等生化物质的过程。该过程包括任何该基因的功能存在的显现，包括但不限于，基因阻抑以及瞬时表达和稳定表达。它包括但不限于将基因转录为信使RNA (mRNA)，转移RNA(tRNA)，小发夹RNA (shRNA)，小干扰RNA (siRNA)或任何其它RNA产物，和将mRNA翻译为多肽，以及调节转录或翻译的任何过程。如果该最终产物是一种生化产物，则表达包括了该种生化产物和任何前体的生成。基因的表达产生了“基因产物”。此处所用的基因产物既可以是核酸(例如，由基因转录生成的信使RNA)，也可以是通过转录物翻译得到的多肽。此处所述的基因产物进一步包括经过转录后修饰(例如，多聚腺苷酸化) 的核酸，或是经翻译后修饰(例如，甲基化，糖基化，以及脂质的添加，与其它蛋白亚基的结合，蛋白水解裂解等)的多肽。术语“RNA干扰”或“RNAi”指通过siRNAs来沉默或减少基因表达。双相区对沉默基因序列具有同源性的siRNA启动了动物和植物的序列特异性，转录后基因沉默过程。该基因可以是该有机体的内源或外源基因，整合于染色体或存在于未整合入基因组的转染载体。该基因的表达被完全或部分抑制。也有人认为RNAi可抑制靶RNA的功能；该靶RNA的功能可以是完全或部分的。此处所用的术语“治疗”指治疗性或预防性措施，其目的为预防或延缓(减轻)有害的生理变化或紊乱，例如多发性硬化症的发展。有益或目标临床结果包括，但不限于，可测或不可测的症状的缓和，疾病程度的减轻，疾病状态的稳定(即，不恶化)，疾病进展的延迟或减缓，疾病状态的改善或减轻，以及(部分或完全)消除。“治疗”还指与未接受治疗的预计存活相比更长的存活时间。需要接受治疗的对象包括已经患有疾病或紊乱以及容易患该疾病或紊乱的对象或是需要预防该疾病或紊乱的对象。“对象”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”指需要进行诊断，预后或治疗的任何对象，特别是哺乳动物对象。哺乳动物对象包括，但不限于，人类，驯养动物，畜牧动物以及动物园，运动，宠物动物，例如狗，猫，豚鼠，兔子，大鼠，小鼠，马，家畜，牛等；灵长类动物，例如猴，猿，以及黑猩猩；犬科动物，如狗和狼；猫科动物，如猫，狮以及虎；马科动物，如马，驴以及斑马；食用动物，如牛，猪以及羊；有蹄动物，如鹿和长颈鹿；啮齿动物，如小鼠，大鼠，仓鼠以及豚鼠等。在特定的实施方式中，该哺乳动物为人类对象。此处所用的“治疗有效量”指在必要的剂量和时间周期下其效果足以达到所需的治疗结果的数量。治疗结果可以是，例如，症状的减轻，延长存活时间，改善活动性等等。治疗结果不必要“治愈”。此处所用的“预防有效量”指在必要的剂量和时间周期下其效果足以达到所需的预防结果的数量。由于预防剂量通常在疾病发生前或疾病早期施用，预防有效量将小于治疗有效量。本发明涉及促进CNS神经元等神经元存活，神经元的神经突生长和轴突再生的特定NgRl拮抗剂。例如，本发明提供了在通常轴突生长被抑制的条件下刺激轴突生长的NgRl多肽和多肽片段，抗体及其片段，以及多聚核苷酸。因此，本发明的NgRl拮抗剂可用于治疗能够通过促进神经元存活，或通过刺激CNS中轴突生长或再生得到缓和的损伤，疾病或紊舌L。示范性的CNS疾病，紊乱或损伤包括，但不限于，多发性硬化症(MS)，进行性多灶性脑白质病(PML)，脑脊髓炎(EPL)，桥脑中央髓鞘溶解症(CPM)，脑白质营养不良，亚历山大病以及佩-梅病(PMZ)，球形细胞脑白质营养不良(克拉伯病)以及华勒氏变性，视神经炎，横贯性脊髓炎，肌萎缩性侧索硬化症(ALS)，亨廷顿舞蹈病，阿尔茨海默病，帕金森氏病，脊髓损伤，颅脑损伤，辐射后损伤，化疗后的神经系统并发症，中风，急性缺血性视神经病变，维生素E缺乏症,单独的维生素E缺乏综合症,AR,巴康氏综合症,Marchiafava-Bignami综合症，异染性脑白质营养不良症，三叉神经痛和贝尔麻痹症。MS是这些疾病中传播最广的一种，在全世界约有250 万患者。
Nogo受体-1多肽一方面，本发明涉及具有免疫原性的Nogo受体-1多肽。在本发明的部分实施方式中，该免疫原性多肽主要由选自以下组合的氨基酸序列组成:LDLSDNAQLRVVDPTT (大鼠)(SEQ ID NO:1) ;LDLSDNAQLRSVDPAT (人)(SEQ ID NO: 2) ；AVASGPFRPFQTNQLTDEELLGLPKCCQPDAADKA(大鼠)(SEQ ID NO:3) ;AVATGPYHPIWTGRATDEEPLGLPKCCQPDAADKA(人)(SEQ IDNO:4);以及 CRLGQAGSGA(小鼠)(SEQ ID NO: 5)。在部分实施方式中，本发明涉及被结合Nogo受体-1的单克隆抗体结合的Nogo受体-1多肽。在部分实施方式中，该多肽被单克隆7E11抗体识别。在部分实施方式中，该多肽选自如下组合:LDLSDNAQLR(SEQ ID NO:27) ；LDLSDDAELR(SEQ ID NO:29)；LDLASDNAQLR(SEQ ID NO:30) ；LDLASDDAELR(SEQ ID NO:31) ；LDALSDNAQLR(SEQ IDNO:32) ；LDALSDDAELR(SEQ ID NO:33) ；LDLSSDNAQLR(SEQ ID NO:34) ；LDLSSDEAELR(SEQ IDNO:35) ；DNAQLRVVDPTT(SEQ ID NO:36) ；DNAQLR(SEQ ID NO:37) ；ADLSDNAQLRVVDPTT(SEQID N0:41) ；LALSDNAQLRVVDPTT(SEQ IDNO:42) ；LDLSDNAALRVVDPTT(SEQ ID NO:43)；LDLSDNAQLHVVDPTT (SEQ ID NO:44);以及 LDLSDNAQLAWDPTT (SEQ ID NO: 46)。在部分实施方式中，本发明涉及编码SEQ ID NOs: 1-5，26-27，29-37和41-45的多肽的核酸。在本发明的部分实施方式中，该核酸分子被连接至表达控制序列(例如，pCDNA ⑴)。本发明还涉及了包含编码本发明多肽的核酸的载体。在本发明的部分实施方式中，该载体为克隆载体。在本发明的部分实施方式中，该载体为表达载体。在本发明的部分实施方式中，该载体包含至少一个选择性标记。本发明还涉及包含上述核酸或载体的宿主细胞。本发明还涉及包含培养宿主细胞步骤的生产本发明免疫原性多肽的方法。在部分实施方式中，该宿主细胞为原核细胞。在部分实施方式中，该宿主细胞为真核细胞。在部分实施方式中，该宿主细胞为酵母。本发明还涉及可用于，例如，促进神经突生长，促进神经元存活，促进轴突存活，或抑制NgRl信号转导复合物的信号转导的特定Nogo受体-1多肽和多肽片段。本发明的多肽和多肽片段通常通过阻断NgRl-介导的神经元存活，中枢神经系统(CNS)神经元的神经突生长或轴突再生的抑制来产生作用。人NgRl多肽显示为下文的SEQ ID N0:49。全长人NgRl (SEQ ID NO:49): MKRASAGGSRLLAWVLWLQAWQVAAPCPGACVCYNEPKVTTSCPQQGLQAVPVGIPAASQRIFLHGNRISH
VPAASFRACRNLTILffLHSNVLARIDAAAFTGLALLEQLDLSDNAQLRSVDPATFHGLGRLHTLHLDRCGLQELGPGLFRGLAALQYLYLQDNALQALPDDTFRDLGNLTHLFLHGNRIDSVPERAFRGLHSLDRLLLHQNRVAHVHPHAFRDLGRLMTLYLFANNLSALPTEALAPLRALQYLRLNDNPWVCDCRARPLWAWLQKFRGSSSEVPCSLPQRLAGRDLKRLAANDLQGCAVATGPYHPIWTGRATDEEPLGLPKCCQPDAADKASVLEPGRPASAGNALKGRVPP⑶SPPGNGSGPRHINDSPFGTLPGSAEPPLTAVRPEGSEPPGFPTSGPRRRPGCSRKNRTRSHCRLGQAGSGGGGIODSEGSGALPSLTCSLTPLGLALVLWTVLGPC
大鼠NgRl多肽显示为下文的SEQ ID NO:50。全长大鼠NgRl (SEQ ID NO: 50):MKRASSGGSRLLAWVLWLQAWRVATPCPGACVCYNEPKVTTScPQQGLQAVPTGIPASSQRIFLHGNRISHVPAASFQSCRNLTILffLHSNALARIDAAAFTGLTLLEQLDLSDNAQLHVVDPTTFHGLGHLHTLHLDRCGLRELGPGLFRGLAALQYLYLQDNNLQALPDNTFRDLGNLTHLFLHGNRIPSVPEHAFRGLHSLDRLLLEQNHVARVHPHAFRDLGRLMTLYLFANNLSMLPAEVLMPLRSLQYLRLNDNPWVCDCRARPLWAWLQKFRGSSSEVPcNLPQRLADRDLKRLAASDLEGCAVAsGPFRPIQTSQLTDEELLSLPKCCQPDAADKASVLEPGRPASAGNALKGRVPPGDTPPGNGSGPRHINDSPFGTLPSSAEPPLTALRPGGSEPPGLPTTGPRRRPGCSRKNRTRSHCRLGQAGSGASGTGDAEGSGALPALACSLAPLGLALVLWTVLGPC
小鼠NgRl多肽显示为下文的SEQ ID N0:51o全长小鼠NgRl (SEQ ID NO: 51):MKRASSGGSRLLAWVLWLQAWRVATPCPGACVCYNEPKVTTSCPQQGLQAVPTGIPASSQRIFLHGNRISHVPAASFQSCRNLTTLWLHSNALARIDAAAFTGLTLLEQLDLSDNAQLHVVDPTTFHGLGHLHTLHLDRCGLRELGPGLFRGLAALQYLYLQDNNLQALPDNTFRDLGNLTELFLHGNRIPSVPEHAFRGLHSLDRLLLHQNHVARVHPHAFRDLGRLMTLYLFANNLSMLPAEVLMPLRSLQYLRLNDNPWVCDCRARPLWAWLQKFRGSSSEVPCNLPQRLADRDLKRLAASDLEGCAVASGPFRPIQTSQLTDEELLSLPKCCQPDAADKASVLEPGRPASAGNALKGRVPP⑶TPPGNGSGPRHINDSPFGTLPSSAEPPLTALRPGGSEPPGLPTTGPRRRPGCSRKNRTRSHCRLGQAGSGASGTGDAEGSGALPALACSLAPLGLALVLWTVLGPC抗体本发明进一步涉及特异性结合本发明的Nogo受体-1多肽的抗体或其抗原结合片段。在部分实施方式中该抗原或抗原结合片段与主要由选自SEQ ID NOs:1-5, 26-27, 29-37和41-45的氨基酸序列组成多肽相结合。本发明的抗体或抗原结合片段可在体内或体外生产。下文讨论了抗体或抗原结合片段的生产。本发明的抗体或其抗原结合片段抑制Nogo受体-1与配体(例如，NogoA, NogoB,NogoC,MAG,OM-gp)的结合并减少髓磷脂介导的对神经突生长和抽芽，特别是轴突生长的抑制，还可减少髓磷脂介导的生长锥萎缩。在部分实施方式中，该抗-Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段来自鼠科动物。在部分实施方式中，该Nogo受体-1来自大鼠。在其它实施方式中，该Nogo受体-1来自人。在部分实施方式中，该抗-Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段为重组，工程改造，人源化和
/或嵌合。在部分实施方式中，该抗体选自组合:单克隆7E11 (ATCCk编号PTA-4587-HB7E11);单克隆 1H2 (ATCCk 编号 PTA-4584-HB1H2);单克隆 2F7 (ATCCr 编号PTA-4585-HB2F7);单克隆 3G5 (ATCCr 编号 PTA-4586-HB3G5);以及单克隆 5B10 (ATCX8
编号PTA-4588-HB5B10)。在部分实施方式中，该抗体为多克隆抗体46。示范性的抗原结合片段为？&13，？&13’，？(&13’)2，？^ (1，(^13，以及包含决定簇互补区(CDR)片段的片段，单链抗体(scFv)，嵌合抗体，双价抗体以及至少包含免疫球蛋白部分的多肽，其中该部分足以使该多肽进行特异性抗原结合(例如，免疫粘附素)。此处所用 的Fd指由Vh和Cm区组成的片段；Fv指由抗体单臂的\和Vh区组成的片段；而dAb指由Vh区组成的片段(Ward等人,Nature341:544-546 (1989))。此处所用的单链抗体(scFv)指'区和Vh区通过可使其形成单蛋白链的合成接头配对形成单价分子的抗体(Bird 等人,Science242:423-426 (1988) and Huston 等人,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA55: 5879-5883 (1988))。此处所用的双价抗体指双特异性抗体，其中Vh和\区表达在单个多肽链上，但所采用的接头太短以至于不能使同一链上的两个区域配对，因而迫使该区域与另一条链上的互补区配对并产生两个抗原结合位点(例如，参见Holliger, P.，等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:6444-6448 (1993)以及 Poljak, R.J.,等人,Structure2:1121-1123(1994)。)此处所用的特异性结合目标抗原的免疫粘附素指一种共价或非共价整合了一个或多个⑶Rs的分子。在部分实施方式中，本发明提供了本发明Nogo受体-1抗体的亚基多肽，其中该亚基多肽选自如下组合:(a)重链或其可变区；以及(b)轻链或其可变区。在部分实施方式中，本发明提供了本发明的Nogo受体-1抗体的亚基多肽的编码重链或其可变区，或是轻链和其可变区的核酸。在部分实施方式中，本发明提供了本发明的Nogo受体-1抗体的高变区(CDR)或编码⑶R的核酸。
免疫本发明的抗体可通过免疫接种适当的宿主(例如，包括人，小鼠，大鼠，绵羊，山羊，猪，牛，马，爬行动物，鱼，两栖动物等脊椎动物，以及在鸟，爬行动物和鱼的卵中)生成。该种抗体可以是多克隆或单克隆抗体。在部分实施方式中，该宿主通过本发明的免疫原性Nogo受体-1多肽进行免疫接种。在其它实施方式中，该宿主以与完整或破碎细胞的细胞膜相关的Nogo受体-1进行免疫接种且本发明的抗体通过与本发明的Nogo受体-1多肽进行鉴定。在部分实施方式中，该Nogo受体-1抗原与佐剂施用以刺激免疫应答。通常需要伴随抗原施用佐剂以引发该抗原的免疫应答。该种佐剂通常为可促进非特异性发炎，并在免疫位点募集单核噬菌细胞的不溶或不可降解物质。佐剂的范例包括，但不限于，弗氏试齐U，RIBI (胞壁酰二肽)，ISCOM(免疫刺激复合物)或其片段。对抗体制备方法的综述可参见，例如，Harlow和Lane, Antibodies, A LaboratoryManual (1988) ; Yelton, D.Ε.等人，Ann.Rev.0f Biochem.50:657-80.(1981);以及 Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology (New York: John ffiley& Sons) (1989)。以本发明的免疫原性Nogo受体-1多肽对免疫反应性的测定可通过本领域公知的多种方法中的任意一种进行，包括，例如，免疫印迹测定和ELISA。
抗体生产及生产抗体的细胞系本发明的单克隆抗体可通过上文例如Harlow和Lane, Antibodies, A LaboratoryManual (1988)中描述的标准方法进行制备。简言之，在适当的时间处死动物，并采用例如EBV或与永生化细胞系(例如骨髓瘤细胞)的融合产物通过本领域公知的多种方法(包括但不限于转化)中的任意一种永生化淋巴结和/或B-细胞。然后，将细胞克隆分离并测试各克隆的上清液中对本发明的免疫原性Nogo受体-1多肽具有特异性的抗体的生成。选择，克隆和扩增杂交瘤的方法已为本领公知。类似地，鉴定免疫球蛋白基因的核苷酸和氨基酸序列的方法已为本领域所知。生产本发明抗体的其它适用技术包括在体外将淋巴细胞暴露至本发明的Nogo受体-1或免疫原性多肽， 或替代性地，在噬菌体或类似的载体中选择抗体库。参见Huse等人，Science，246:1275-81(1989)。可用于本发明的抗体可修饰或未修饰状态下使用。抗原(此处为本发明的Nog O受体-1或免疫原性多肽)和抗体可通过共价或非共价连接能提供可测信号的物质进行标记。各种标记和结合技术已为本领域所知，并可用于实施本发明。适用的标记包括，但不限于，核素，酶，底物，辅因子，抑制剂，荧光剂，化学发光剂，磁性颗粒等。揭示该种标记使用的专利包括美国专利3，817，837; 3, 850，752; 3, 939，35O; 3，996，345; 4，277，437; 4，275，149和4，366，241。此外还可生产重组免疫球蛋白(参见美国专利 4，816，567)。在本发明的部分实施方式中，抗体具有多重结合特异性，例如通过本领域技术人员已知的一系列技术中的任意一种制备的双功能抗体，该种技术包括生产杂交杂交瘤，二硫键取代，化学交联，在两个单克隆抗体间添加肽接头，向特定细胞系导入两组免疫球蛋白重和轻链等等(参见下文更具体的讨论)。本发明的抗体还可以是人单克隆抗体，例如，通过永生化人细胞，通过SCID-hu小鼠或其它能生成“人”抗体的非人动物生产的抗体。
噬菌体展示库本发明的抗-Nogo受体-1抗体可通过筛选重组组合抗体库分离得到。示范性组合可结合本发明的免疫原性Nogo受体-1多肽，例如通过本发明的免疫原性Nogo受体-1多肽免疫化的动物的mRNA制备的\和VhCDNAs制备的scFv噬菌体展示库。制备和筛选该种库的方法已为本领域所知。可通过商业的方法和材料生成噬菌体展示库(例如，Pharmacia重组卩遼菌体抗体系统，目录编号27-9400-01 ；Stratagene SurfZAP卩遼菌体展示试剂盒，目录编号240612 ;以及MorphoSys的其它产品)。还存在其它可用于生成和筛选抗体展示库的方法和试剂(例如，参见Ladner等人.美国专利号5，223，409;Kang等人.PCT
发明者丹尼尔·H·S·李, 文丁一, R·布莱克·佩平斯凯, K·简·雷尔顿, 王辛中, 阿列克谢·卢戈夫斯科伊, 沃纳·迈尔, 埃伦·A·加伯, 劳拉·西尔维安, 保罗·H·魏因雷布 申请人:比奥根艾迪克Ma公司