专利名称：预防奶牛乳房炎的融合蛋白sip-trap及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种无乳链球菌的SIP蛋白(Surface Immunogenic Protein) ^P^11^W TRAP (Target of RNA III Activating Protein)的融合蛋白SIP-TRAP，以及该蛋白的制备方法和应用。
背景技术：
奶牛乳房炎是奶牛乳腺组织炎症，由多种原因引起，但主要为乳腺组织感染病原微生物所致，是危害奶牛业的最主要疾病之一。引起奶牛乳房炎的病原微生物有细菌、真菌、病毒等，种类繁多，不同地区流行的病原微生物种类也不同。但统计资料显示，金黄色葡萄球菌(S. aureus)和无乳链球菌(S. agalactiae)是引起奶牛乳房炎的两种最主要病原菌。随着这两种病原菌耐药性菌株的不断增加，传统的抗生素治疗效果越来越不尽人意。因此，近年来人们致力于研究和使用疫苗免疫方法来防制奶牛乳房炎。TRAP蛋白是一个由167个氨基酸残基组成的蛋白质，在葡萄球菌中高度保守，它能够被RNAIII激活蛋白(RAP)激活。最近研究证实TRAP在葡萄球菌应激反应中发挥作用， 可保护DNA免受氧化损伤、自然突变和适应性突变的影响(Balaban N, et al. 1998 ；Kiran MD, et al. 2009)。YANG等用TRAP抗体筛选噬菌体展示库，确定了一个TA21肽，并利用表达在大肠杆菌表面的TA21(FTA21)免疫小鼠，在败血症模型中，免疫小鼠100%存活，对照小鼠0 %存活；在蜂窝织炎模型中，对照组全部发生S. aureus皮下损伤，免疫组仅30 %皮下损伤。证明TRAP具有良好的免疫原性。本课题组研究已经证实，原核表达的TRAP融合蛋白免疫小鼠后，可使小鼠获得良好的抗金黄色葡萄球菌感染的能力。SIP蛋白是暴露于无乳链球菌表面的、高度保守的蛋白，各型无乳链球菌菌株均能表达，相对分子量为45.5KDa。进一步研究证实，SIP蛋白能诱导交叉免疫保护作用，即用 SIP重组蛋白免疫小鼠，可有效抵抗无乳链球菌I A/C、I B、II/R、III、V和VI型菌株感染 (Brodeur Br, et al. 2000 ；Martin D, et al. 2002)。表明 SIP 蛋白是预防无乳链球菌感染的良好的疫苗候选抗原。但到目前为止，尚未见到将TRAP蛋白和SIP蛋白进行融合表达后用于预防奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌和无乳链球菌感染的研究报道。为了能够有效地同时防治奶牛(或羊)乳房炎金黄色葡萄球菌和无乳链球菌感染，而且又可以简化未来疫苗制备工艺，本研究将金黄色葡萄球菌TRAP蛋白和无乳链球菌 SIP蛋白融合表达，并研究了其免疫保护作用，证明其具有良好的免疫保护性。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种融合蛋白SIP-TRAP，该融合蛋白为无乳链球菌 SIP蛋白与金黄色葡萄球菌TRAP蛋白的融合蛋白；本发明的第二个目的在于提供上述融合蛋白的制备方法；本发明的第三个目的在于提供融合蛋白SIP-TRAP的用途，以克服现有技术中奶牛(或羊)乳房炎疫苗免疫保护效果差、保护范围窄、免疫程序复杂等问题。本发明所提供的融合蛋白，命名为SIP-TRAP，其氨基酸序列是如下a)或b)a) SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列；或b)SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列经替换、缺失、或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的融合蛋白SIP-TRAP的氨基酸序列(SEQ ID No. 2)，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。例如在非活性区段，将第114位的P替换S，将第151位的K替换 Q，将第193位的S替换L，将第296位的D替换N，将第342位的T替换K，将第349位的K 替换E，将第367位的A替换I，不影响其免疫原性。因此，本发明融合蛋白SIP-TRAP还包括 SEQ ID No. 2所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有与SIP-TRAP 同等活性的由SIP-TRAP衍生得到的蛋白质。本发明基因包括编码所述蛋白的核酸序列。本发明提供编码权利上述融合蛋白SIP-TRAP的基因。融合蛋白SIP-TRAP的编码基因是如下a)或b)a)其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 1所示；或b)由SEQ ID No. 1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸，得到编码SIP-TRAP的核苷酸序列。应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。因而，本发明sip-trap基因还包括由SEQ ID No. 1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸，得到编码SIP-TRAP的核苷酸序列。本发明融合蛋白SIP-TRAP的制备方法步骤如下a)克隆无乳链球菌表面蛋白sip基因和金黄色葡萄球菌蛋白trap基因；b)采用重叠引物延伸PCRJf sip和trap基因用连接序列连接起来，获得两种蛋白的融合蛋白编码基因，即sip-trap基因；c) sip-trap基因插入载体，重组载体在大肠杆菌中表达SIP-TRAP融合蛋白。本发明克隆sip基因所用的引物序列为上游引物5，-GCC|GGATCC| CAAGAAACAGATACGACGTGG-3，下游引物5，-ACCACCACTACCACTACCACTACCTTTGTTAAATGATACGTG-3>；克隆trap基因所用的引物序列为上游引物5，-GGTAGTGGTAGTGGTAGTGGTGGTTATTTATATACATCTTATGGG-3，下游引物5，-CG|GTCGAC[AATCTATTCTTTTATTGGGT-3‘；其中下划线部分为 sip
下游引物与trap上游引物的重叠互补引物，方框内碱基为限制性内切酶位点。本发明提供了一种含有融合蛋白SIP-TRAP编码基因的重组表达载体。本发明的重组表达载体为PQE/sip-trap。将纯化后的SIP-TRAP融合蛋白进行免疫效果试验研究。首先将表达的SIP-TRAP 蛋白与弗氏佐剂混合乳化，制备免疫原免疫动物，然后进行抗体水平和细胞因子水平检测， 并用2株无乳链球菌和3株葡萄球菌进行攻毒，检测其免疫保护作用。实验结果表明本发明的SIP-TRAP融合蛋白具有很好的免疫原性和免疫保护作用。本发明的SIP-TRAP蛋白为无乳链球菌Sip蛋白与金黄色葡萄球菌TRAP蛋白的融合蛋白，具有良好的免疫原性，特异性强，能同时抵抗来自无乳链球菌和金黄色葡萄球菌的感染，提高作为疫苗的免疫保护范围，并简化了免疫程序，降低了防治成本。将该融合蛋白制备亚单位疫苗，可为我国防治奶牛(或羊)乳房炎提供有力保障。
图 1.为 sip、trap 基因 PCR 扩增结果，其中 M :DNA marker DL2000 ； 1 :sip 基因; 2 :trap 基因；图 2.为 sip-trap 基因 PCR扩增结果，其中 M :DNA marker DL2000 ；1 sip-trap S 因；图3.为sip-trap基因T/A克隆鉴定结果，M =DNA marker DL2000,1 酶切鉴定结果，2 :PCR鉴定结果；图4为表达载体重组质粒pQE/sip-trap的鉴定结果，M =DNA marker DL2000,1 酶切鉴定结果，2 :PCR鉴定结果；图5为重组蛋白SIP-TRAP的表达结果，M 蛋白marker ；1 IPTG诱导3h的重组菌； 2 未诱导的重组菌；图6为Western blot检测结果，M 蛋白marker ； 1 :TRAP蛋白印迹结果；2，3 SIP-TRAP蛋白印迹结果；4 =SIP蛋白印迹结果；图7 为重组蛋白 TRAP、SIP、SIP-TRAP 纯化结果，M 蛋白 marker ；1 =TRAP 蛋白；2 SIP 蛋白；3 =SIP-TRAP 蛋白；图8为图8a小鼠免疫血清TRAP IgG抗体效价变化，图8b小鼠免疫血清SIP IgG 抗体效价变化；图9为图9aIFN_ γ浓度标准曲线，图9b IL_2浓度标准曲线，图9c IL_4浓度标准曲线；图10重组蛋白免疫组及对照组小鼠血清细胞因子含量对比(M士SD)；图11各菌株攻毒实验动物后实验动物的存活数，其中图Ila为S. aureus Wood46 株攻毒后存活数；图lib为S. aureus HLJ23-1株攻毒后存活数；图Ilc实验动物S. aureus Newman株攻毒后保护率；图Ild实验动物S. agalactiae B03020株攻毒后存活数；图lie 实验动物S. agalactiae 8511-10株攻毒后存活数。
具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1 SIP-TRAP蛋白的制备1 材料1. 1菌株金黄色葡萄球菌参考株Newman (荷兰乌特勒支大学)、Wood46 (本实验室保存菌株)和HLJ855-23-1株(本实验室分离菌株)；无乳链球菌B03020株、8511-10 株(本实验室分离菌株)。本实施例中所用的金黄色葡萄球菌Newman株、Wood46株已在文献(金黄色葡萄球菌凝集因子A的免疫原性.冯昊，朱战波，崔玉东等.生物工程学报， 2009,25(8) :1180-1186)中公开；金黄色葡萄球菌HLJ855-23-1株、无乳链球菌B03020株、 8511-10株已在文献(奶牛乳房炎多联灭活疫苗的免疫研究，朱战波，硕士论文，2004. 5)中公开。1. 2载体与宿主菌克隆载体pMD18-T vector购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司、表达载体PQE30及其受体菌大肠杆菌M15(pREP4)由本实验室保存。1. 3工具酶及其主要生化试剂LA Taq DNA聚合酶、限制性内切酶BamH I.Sal I为 TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司的产品；蛋白质Marker和DNA Marker为北京全式金生物技术有限公司产品；封闭用脱脂奶粉为北京普利来基因技术有限公司产品；Tryptone 及Yerst Extract为Oxoid公司产品，BHI培养基为Becton Dickinson公司产品；IPTG、氨苄青霉素、DMS0、TEMED、TMB、Tween-20、弗氏完全及不完全佐剂均为Sigma-Aldrich公司产
P
BFI ο1.4 试剂盒及其他=Plasmid minipr印 kit 购自 Axygen 公司；Gel DNA purification Kit购自上海化舜生物有限公司；MagneHis 蛋白纯化试剂盒为Promega公司广品。2 方法2. 1引物的设计与合成参照已发表的无乳链球菌sip基因和黄色葡萄球菌trap 基因序列，经反复筛选，最终设计两对引物，其中下划线部分为sip下游引物与trap上游引物的重叠互补引物，并在sip上游引物5’末端加入BamH I限制性酶切位点，trap下游引物3’末端加入Ml I限制性酶切位点，见方框内碱基部分。经计算机DNAMar软件分析， 具有较好的特异性。引物的核苷酸序列为sip 上游引物5，-GCC|ggatcc| CAAGAAACAGATACGACGTGG-3，下游引物5，-ACCACCACTACCACTACCACTACCTTTGTTAAATGATACGTG-3，trap 上游引物5，-GGTAGTGGTAGTGGTAGTGGTGGTTATTTATATACATCTTATGGG-3，下游引物5，-coIgtcgac丨 aatctattcttttattgggt-3，2. 2PCR模板DNA的获取以无乳链球菌临床分离株8511-10株菌和金黄色葡萄球菌的Newman株为模板采用蛋白酶K法提取基因组DNA。2. 3目的基因的扩增分别以制备的基因组DNA为模板扩增sip基因与trap基因。扩增sip PCR程序94V预变性5分钟，再以94°C变性50秒，55°C退火45秒，72°C 延伸60秒进行30个循环，最后以72°C延伸10分钟。取5yL PCR扩增产物于1 %琼脂糖凝胶中进行电泳分析。扩增trap PCR程序94°C预变性5分钟，再以94°C变性50秒，55 °C退火45秒， 72°C延伸50秒进行30个循环，最后以72°C延伸10分钟。取5μ LPCR扩增产物于琼脂糖凝胶中进行电泳分析。
扩增sip-trapPCR程序各取上述PCR纯化产物1 μ L为模板，并且以sip上游和 trap下游为引物。94°C预变性5分钟后，再以94°C变性50秒，55°C退火45秒，72°C延伸90 秒进行30个循环，最后以72°C延伸10分钟。取5μ LPCR扩增产物于琼脂糖凝胶中进行电泳分析。2. 4 sip-trap重组克隆载体的构建及鉴定将sip-trap PCR产物经电泳回收纯化后，克隆到PMD18-T载体中，经PCR、双酶切鉴定正确后，送测序正确后送上海生工测序。2. 5重组表达载体pQE/sip-trap的构建将上述酶切的重组质粒进行琼脂糖凝胶电泳分离之后，使用Axygen公司Gel DNA purification试剂盒进行回收SIP-TRAP片段。 同时对表达载体PQE30进行相应位点的双酶切。各酶切体系均在37°C恒温水浴锅内反应3 小时。将回收片段与酶切后表达载体连接，转化至M15(pREP4)中，挑取单菌落用试剂盒提取质粒，分别进行PCR和双酶切鉴定。2. 6重组菌的诱导表达将重组菌接种于5mL含有氨苄青霉素的LB培养基中，37°C 摇床培养至OD值约为0. 6左右，加入IPTG至终浓度为lmmol/L，继续在37°C振荡培养3小时，取适量菌液离心后进行SDS-PAGE分析表达情况。表达的蛋白在破碎上清中，这就使蛋白纯化较为简便，进行大量培养，准备纯化。2. 7 SDS-PAGE蛋白电泳取培养好菌液lmL，12000r/min离心lmin，弃上清，在沉淀中加入90 μ L IX上样缓冲液和10 μ L IM DTT,吹打混勻，煮沸5min，置冰水中冷却后，取 10 μ L进行SDS-PAGE。电泳完毕后，取出凝胶，置于考马斯亮蓝R-250染色液中，在脱色摇床上染色lh，弃去染色液，用蒸馏水淋洗凝胶后，加入脱色液，在摇床上脱色lh，待蓝色背景消失、目的条带清晰时，用清水冲洗，照相分析。2. 8重组融合蛋白的Western blot检测采用湿转印法。具体步骤按《分子克隆》 进行(J.萨姆布鲁克，D. W.拉塞尔著，黄培堂等译。2002年第三版，1474页)。2. 9镍颗粒纯化蛋白质SIP-TRAP重组蛋白含有6个连续His残基，可利用其能与 Ni2+结合的特性，应用MagneHisTM蛋白纯化系统进行纯化(按照产品说明书进行)，具体步骤如下取经IPTG诱导后的重组菌12000r/min离心2min，完全弃上清，细胞沉淀置_20°C 冰箱中15min;然后是重组菌重新悬浮于细胞裂解液中，室温摇床培养10 20min。按 30 μ L/A600的量将Ni颗粒加入到裂解菌液管中，混勻后室温摇床孵育aiiin;然后加入 Binding/Wash Buffer，吸管混勻，用磁力平台将Ni颗粒沉于管底，吸管小心移出上清；重复3此后，加入100 μ L Elution Buffer，吸管混勻，室温摇床培养1 ^iin ；重新使Ni颗粒沉于管底，吸管移出上清到另一个离心管中，于-20°C保存备用。3 结果3. 1 sip、trap基因的扩增用设计的引物分别对无乳链球菌sip基因和金黄色葡萄球菌trap基因进行PCR扩增，PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳，均可见特异性DAN条带， 与预期值大小(sip :1227bp、trap :495bp)相符，见图1。3.2 sip-trap基因的扩增sip-trap基因使用重叠引物，通过重叠延伸PCR方法进行扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，可见一条特异性DNA条带，与预期值大小(1746bp) 相符，见图2。3. 3 sip-trap基因T/A克隆结果将纯化的PCR产物酶切后分别连接到pMD18_T载体上，并转化到感受态细胞E. coli DH5a中，经培养后分别以疑似阳性克隆为模板，对重组克隆pMD18T-IsdB3进行PCR鉴定，得到约67^p的目的基因片段。将PCR鉴定为阳性的质粒用BamH I和Ml I双酶鉴定，分别获得预期大小的两个目的基因片段，见图3。3. 4测序所得的sip-trap基因的核苷酸序列翻译成氨基酸序列，比对结果具体如下QETDTTWTARTVSEVKADLVKQDNKSSYTVKYGDTLSVISEAMSIDMNVLAKINNIADIN LIYPETTLTVTYDQKSHTATSMKIETPATNAAGQTTATVDLKTNQVFVADQKV 回 LNTISEGMTPEAA
TTIVSPMKTYSSAPALKSKEVLA ■ EQAVSQVAANEQVSPAPVKSITSEVPAAKEEVKPTQTSVSQ § TTVSPASVAAETPAPVAKVAPVRTVAAPRVASAKVVTPKVETGASPEHVSAPAVPVTTTSPATDSKL QATEVKSVPVAQKAPTATPVAQPASTTNAVAAHPE ■ AGLQPHVAAYKEKVASTYGVNEFSTYRAGD PGDHGKGLAVDFIVG ■ NQALGN ■ VAQYSTQNMAANNISYV Q WQQKFYSNTNSIYGPANTffNA MPDRGGVTANHYDHVHVSFNKGSGSGSGG YLYTSYGTYGFLHQIKINNPTHQLFQ FSASDTSVIFEETDGETVLKSPSIYEVIKEIGEFSEHHFYCAIFIPSTE DHAYQLEKKLISVDDNFRNFGGFKSYRLLRPAKGTTYKIYFGFAD
RHAYEDFKQSDAFNDHFSKDALSHYFGSSGQHSSYFERYLYPIKE突变分别位于114位S突变为P ；151位Q突变为K ；193位L突变为S ；296位 N突变为D ；342位K突变为T ；349位Ε突变为K ；367位1突变为Α。氨基酸同源性高达 98. 7%以上。黑色大写英文字母为Sip的氨基酸序列；灰色背景的序列为TRAP的氨基酸序列；下划线的GSGSGSGG是Sip蛋白和TRAP蛋白的连接序列。本研究的Sip蛋白与已报道的未突变的Sip蛋白均具有良好的免疫原性。3. 5表达载体重组质粒pQE/SIP-TRAP的鉴定结果将酶切目的片段与酶切后的 PQE-30相连，表达重组质粒命名pQE/SIP-TRAP，并对其进行PCR鉴定及酶切鉴定，见图4。 结果，重组质粒经BamH I和Ml I双酶切的DNA片段与实际大小C3461bp及1746bp)相符。3. 6重组蛋白SIP-TRAP的表达结果重组质粒转化到M15 (pREP4)大肠杆菌后，经 ImM IPTG诱导后，经SDS-PAGE电泳检测，结果有重组质粒的M15(pREP4)的大肠杆菌可表达 67kDa的融合蛋白，与理论值相符，表明该基因在M15(pREP4)中获得了表达；对诱导表达不同时间的细菌进行SDS-PAGE电泳检测，如图5。3. 7 Western blot检测结果分别以二免17d的TRAP、Sip抗血清为一抗，1 100 倍稀释；Goat anti-mouse IgG-Peroxidase 为二抗，按 1 MOO 倍稀释，分别对 TRAP、Sip、 SIP-TRAP蛋白进行Wfestern blot检测，如图3_6所示，结果表明融合表达产物能与TRAP、 Sip抗血清特异性结合，如图6。3. 8 重组蛋白 TRAP、Sip、SIP-TRAP 纯化结果重组菌 pQE-trap、pET-sip、pQE/ SIP-TRAP经IPTG诱导3小时后，通过MagneHis 蛋白纯化试剂盒纯化，分别获得纯化的 TRAP、Sip、SIP-TRAP 融合蛋白，如图 7。实施例2 SIP-TRAP蛋白免疫保护效果研究1 材料1. 1菌株与实验动物菌株同实施例1。免疫实验用小鼠为购自长春生物制品所的清洁级昆明系小白鼠。1. 2试剂表达纯化过的SIP-TRAP、Sip、TRAP蛋白；弗氏完全和不完全佐剂、DMS0、 TEMED, TMB、Tween_20、均为Sigma-Aldrich公司产品；羊抗鼠IgG-HRP为北京中山金桥生物技术公司产品；DAB底物显色液购自武汉博士德生物工程有限公司。2实验方法2. 1免疫原制备分别吸取等体积的纯化蛋白和弗氏佐剂于两个注射器中，在两个注射器之间连一小段输液管(长度适宜即可)，连接处要捆紧扎牢，然后互推混勻至乳化完全。取一滴滴于水中，若不扩散则认为乳化成功，置于4°C保存。2. 2动物免疫将200只健康小鼠随机分成20组，每组10只。其中对照5组，免疫 15组，免疫组分别为TRAP蛋白3组、SIP蛋白2组、TRAP与SIP混合蛋白(TRAP+SIP) 5组、 SIP与TRAP嵌合蛋白(SIP-TRAP) 5组。首次免疫后3周进行二次免疫，二次免疫后17d用所测定的小鼠绝对致死量进行攻毒，每日观察记录小鼠的死亡情况，共一周。在免疫前、一免后21d及二免后17d进行采血，每次采血3只，分离血清，-20°C保存，用于抗体水平及细胞因子检测。2. 3抗体水平检测用间接ELISA检测初免后21d及二免后17d分离的血清样本中 IgG含量。具体步骤如下Sip和TRAP抗原均以10 μ g/mL浓度，每孔100 μ L包被96孔酶标板，37°C两小时，然后用PBST洗涤。每孔加10(^1^5%脱脂乳的？8511封闭液，371封闭 lh，洗涤；每孔加入PBS稀释的待检免疫血清，37°C孵育lh，洗涤；每孔加入PBS稀释的Goat anti-Mouse IgG-Peroxidase 二抗，37°C孵育 lh，洗涤；每孔加入 100 μ L TMB 显色液，室温显色IOmin后每孔加入50 μ L 2Μ的硫酸终止反应，测0D45(1nm吸光值。分析结果。当样品 OD45tl值彡(阴性血清的OD45tl值+3倍标准方差)时即为阳性。2. 4细胞因子检测对加强免疫17d的蛋白免疫组血清样本中的IL-2、IL_4和 IFN-Y浓度进行检测。按细胞因子ELISA定量检测试剂盒的操作步骤进行。2. 5动物保护实验(1)细菌最小致死量的确定I.细菌计数取复苏后的金黄色葡萄球菌Newman株、Wood46株、HLJ23-1株和无乳链球菌B03020株、8511-10株菌分别接种于TSB和BHI液体培养基中，37°C培养12h，测定菌悬液OD值，做10倍系列稀释，每个稀释度取100 μ L菌液涂板计数。II.细菌接种将每种菌株按菌数进行不同倍数稀释，每个稀释度接种5只小鼠，每只小鼠腹腔接种菌液100 μ L。接种后观察记录1周，根据小鼠的死亡情况计算绝对致死量。(2)小鼠攻毒试验取对数生长期金黄色葡萄球菌Newman株、Wood46株、HLJ23-1 株、无乳链球菌B03020株、8511-10株菌液，根据平板计数结果，用PBS离心洗涤并稀释。按测定的小鼠绝对致死量进行腹腔注射攻毒。7天后将攻毒小鼠全解剖检查其病变情况，同时无菌采取每只小鼠的肝、脾和淋巴结，进行细菌分离鉴定。3 结果3. 1血清IgG水平及变化将一免21d和二免17d的每份待检血清按1 100倍稀释后，以辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠为二抗，进行间接ELISA检测，测定OD45tl吸光值。每组检测3只小鼠血清，以阴性血清OD45tl平均值加3倍标准差为阳性，结果见表1、2，TRAP 抗体水平是嵌合蛋白SIP-TRAP组> TRAP组> Sip+TRAP组；而Sip抗体水平是Sip组>SIP-TRAP 组> Sip+TRAP 组。
表ITRAP IgG抗体水平
权利要求
1.一种融合蛋白SIP-TRAP，其是由无乳链球菌SIP蛋白和金黄色葡萄球菌TRAP蛋白融合而成。
2.如权利要求1所述的融合蛋白SIP-TRAP，其氨基酸序列为a)SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列；或b)SEQID No. 2所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。
3.编码权利要求1或2所述融合蛋白SIP-TRAP的基因。
4.如权利要求3所述的编码融合蛋白SIP-TRAP的基因是如下a)或b):a)其核苷酸序列如序列表中SEQID No. 1所示；或b)由SEQID No. 1所示核苷酸序列经取代一个或几个核苷酸，得到编码SIP-TRAP的核苷酸序列。
5.一种制备权利要求1、2所述融合蛋白SIP-TRAP的方法，其特征在于包括如下步骤a)克隆无乳链球菌表面蛋白sip基因和金黄色葡萄球菌蛋白trap基因；b)采用重叠引物延伸PCRJfsip和trap基因用连接序列连接起来，获得两种蛋白的融合蛋白编码基因，即sip-trap基因；c)sip-trap基因插入载体，重组载体在大肠杆菌中表达SIP-TRAP融合蛋白。
6.如权利要求5所述的制备方法，其中步骤a)克隆sip基因所用的引物序列为 上游引物5，-GCC |GGATCC| CAAGAAACAGATACGACGTGG-3'下游引物5，-ACCACCACTACCACTACCACTACCTTTGTTAAATGATACGTG-3> ； 克隆trap基因所用的引物序列为上游引物5，-GGTAGTGGTAGTGGTAGTGGTGGTTATTTATATACATCTTATGGG-3> 下游引物5，-CG lGTCGACl AATCTATTCTTTTATTGGGT-3‘；其中下划线部分为sip下游引物与trap上游引物的重叠互补引物，方框内碱基为限制性内切酶位点。
7.含有权利要求3或4所述基因的重组载体。
8.如权利要求7所述的重组载体，其为PQE/sip-trap。
9.权利要求1或2所述的融合蛋白SIP-TRAP、权利要求3或4所述基因在制备奶牛或羊乳房炎疫苗中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，所述的奶牛或羊乳房炎疫苗为无乳链球菌和/或金黄色葡萄球菌疫苗。
全文摘要
本发明提供了一种融合蛋白SIP-TRAP及其制备方法和用途，该蛋白是将无乳链球菌的Sip基因和金黄色葡萄球菌的Trap基因连接后的融合基因插入载体进行表达纯化获得的，实验表明该蛋白具有良好的免疫原性，其免疫效果优于SIP、TRAP单独免疫以及SIP和TRAP混合免疫的效果。本发明提供的SIP-TRAP蛋白可作为免疫原提高奶牛或羊对无乳链球菌和金黄色葡萄球菌感染的抵抗力，简化了免疫操作程序，且免疫效果好。
文档编号A61P15/14GK102304185SQ20111025874
公开日2012年1月4日 申请日期2011年9月2日 优先权日2011年9月2日
发明者宋佰芬, 崔玉东, 朱战波, 迟佳琦 申请人:黑龙江八一农垦大学