米邦塔仙人掌多糖在防治慢性神经退行性疾病中的应用的制作方法

专利名称：米邦塔仙人掌多糖在防治慢性神经退行性疾病中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于 医药领域，涉及防治中枢神经系统慢性神经退行性疾病的药物。。
背景技术：
人类多种中枢神经系统慢性疾病如脑缺血、癫痫、帕金森氏症、老年性痴呆等，其主要的病理改变即神经细胞的损伤、丢失、坏死和凋亡。近来越来越多的研究证明，导致神经细胞的损伤最终原因是氧化应激(oxidative stress, OS)，所谓氧化应激是机体在遭受各种有害刺激时，体内产生的大量活性氧(reactive oxygen species, R0S)超出体内抗氧化防御系统对氧自由基的清除能力，最终氧化系统和抗氧化系统失衡导致组织损伤。自由基导致的细胞DNA氧化性损伤引发细胞凋亡。由于神经系统具有代谢率高以及抗氧化防御机制相对缺乏的特点，产生活性氧簇(ROS)多且更容易遭受氧化损伤导致疾病。抗氧化治疗主要是应用抗氧化剂，目前抗氧化剂包括天然抗氧化剂(维生素E、维生素C、β胡萝卜素、谷胱甘肽等)和合成抗氧化药物，如普罗布考等。大量的实验证实，抗氧化剂能通过清除自由基、抑制脂质过氧化而发挥神经保护作用，临床研究已取得一些可喜结果。但是，一些研究结果仍然令人困惑，如同一抗氧化剂动物实验有效，而临床试验往往无效。目前有关此类药物治疗的研究主要集中在两个方面一是开发具有多重作用机制的自由基清除剂； 二是鉴于自由基清除剂与抗炎药联合使用时效果更好，因此寻找具有自由基清除作用同时具有抗炎成为一个热点。在这一领域的认识还有待进一步提高，研发新的抗氧化剂及其在临床上的应用将为神经细胞氧化应激损伤的治疗提供更广阔的前景。具有极其重要的社会意义和经济效益。多糖是生物体内普遍存在的一类大分子物质，作为生命物质的组成成分之一，广泛参与细胞的各种生理活动的调节，特别在细胞识别、细胞间物质运输、免疫调节等生物学功能方面新的认识广泛引起人们的重视。近年来大量研究证实，许多多糖具有抗肿瘤、降血糖、抗凝血、抗炎、抗衰老及抗氧化等重要药理活性，已引起药理学家的极大关注，所以多糖也逐渐成为当今新药开发的重要方向之一。因为多糖来源广泛，而生物活性显著，毒副作用小，所以在医药方面具有广阔的开发和利用前景。有人预言“21世纪将是多糖的世纪”。仙人掌(Opuntia dillenii Haw)作为地球上生命力最强盛的植物之一，已生存了两万多年。其药用价值在几千年前就被人类认识和利用，在我国作为药用首载于清代赵学敏所著的《本草纲目拾遗》。据该书记载，仙人掌味淡性寒，行气活血、清热解毒、消肿止痛、 健脾止泻、安神利尿，可内服外用治疗多种疾病。清代刘善术著的《草木便方》中记载，仙人掌苦涩性寒，五痔泻血治不难，小儿白秃麻油擦，虫疮疥癞洗安然。另有《本草求原》、《陆川本草》、《岭南采药录》、《闽南民间草药》、《闽东本草》、《湖南药物志》、《中@国药植图鉴》、《分类草药性》、《贵州民间方药集》、《广西中草药》等也有论述。从资料记载可以看出，仙人掌除用于痢疾、哮喘、胃痛、肠痔泻血外，还用于肾炎、糖尿病、心悸失眠、动脉硬化、高血压、月巴胖症及肝病的辅助治疗。进入21世纪后，医学界和食品科学研究部门又发现了它具有降血糖、降血脂和抗氧化等功效。随着近年深入研究，发现仙人掌可促进新陈代谢，提高人体免疫力，除对糖尿病、高血脂、高血压等有疗效外，特别是抗氧化作用，已作为一种天然抗氧化剂用于食品科学。米邦塔仙人掌(Opuntia ficus-indica Milpa Alta)，是20世纪40年代墨西哥专家从植物仙桃(Opuntia ficus-indica)中选育出来、可作为果蔬食用的少刺的仙人掌品种，1998年我国农业部从墨西哥引进，现已大面积栽培成功，该仙人掌具有耐旱、耐瘠薄、适应性广、抗逆性强、病虫害较少、栽培管理容易等特点。米邦塔仙人掌含有18种人体必需氨基酸、多种维生素、微量元素和玉芙蓉、果仙纤维素、角蒂仙、多糖、留醇、黄酮、亚油酸、SOD等降血脂、降血糖、免疫增强、抗衰老及防癌等药理活性成分。其中仙人掌多糖 (cactuspolysaccharides,CP)为仙人掌所含主要有效成分之一，其含量高，药理活性强，对生物体毒副作用小，因此受到医药研究者的高度关注。

发明内容
本发明的任务是提供米邦塔仙人掌多糖在防治慢性神经退行性疾病中的应用。本发明对我国栽培的米帮塔仙人掌茎进行提取，将米邦塔仙人掌茎用水浸醇沉法进行多糖的粗提，用乙醇，丙酮，乙醚除杂及除蛋白质后，用苯酚一硫酸法检测多糖的含量，进一步纯化得到米帮塔仙人掌多糖，新鲜植物得糖率约7. 3 %。所得米帮塔仙人掌多糖， 主要含半乳糖、D-木糖、L-鼠李糖以及阿拉伯糖，与国外文献报道一致。药效研究发现 在整体大鼠局灶性脑缺血及缺血复灌实验，米邦塔仙人掌多糖可改善大鼠神经行为障碍， 减少脑梗死体积和皮层及海马神经元丢失。在离体培养脑片及培养PC12细胞以及原代培养大鼠皮层、海马神经细胞，经多种方式氧糖剥夺损伤，米邦塔仙人掌多糖均可减少细胞内 ROS的产生，具有很好的神经保护作用。本发明整体实验结果显示米邦塔仙人掌多糖经消化道给予可以缓解大鼠局灶性脑缺血，及缺血复灌后神经症状，减少脑梗死体积；病理组织切片显示可显著减少脑缺血-再灌注皮层及海马神经元组织形态学损伤。离体脑片实验结果显示米邦塔仙人掌多糖对物理性氧糖剥夺损伤、过氧化物H2O2诱导的大鼠海马及皮层神经元损伤，具有明显的保护作用。离体细胞培养实验结果显示(1)离体培养PC12细胞以过氧化氢诱导的氧化应激损伤，米帮塔仙人掌多糖可明显减少细胞死亡，并对细胞凋亡具有明显抑制作用。(2)原代培养大鼠皮层、海马神经元，用化学物质对细胞进行氧糖剥夺损伤；米帮塔仙人掌多糖可保护细胞免遭其损伤，明显减少细胞死亡。本发明揭示米帮塔仙人掌多糖无论对整体动物，还是离体培养脑片或神经细胞，对物理和化学性所致神经细胞氧化应激损伤均具有良好的保护作用，其作用机制可能与抑制细胞内活性氧及自由基的生成，增强体内抗氧化酶活性，加速活性氧与自由基的清除等作用有关，米帮塔仙人掌多糖可以作为预防和治疗慢性神经退行性疾病如脑缺血_再灌注损伤，老年性痴呆、帕金森氏症等神经退行性变的药物。本发明实施例提供了一种优化的米帮塔仙人掌多糖的提取、分离与纯化方法。本发明提供的优化的米帮塔仙人掌多糖提取工艺，方便简捷、经济适用，得糖率较高，适合火批量提取。本发明实验资料一、整体动物实验米邦塔仙人掌多糖对整体大鼠脑缺血损伤的保护作用研究实验动物雄性Sprague & Dawley大鼠，体重200_250g，华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。实验仪器高速冷冻离心机(HITACHI)Hitachi Koki Co,Ltd. Tokyo JapanDYY-SC型电泳仪(北京市六一仪器厂出产)。大鼠脑缺血模型制备采用Zea Longa方法并予改良的大脑中动脉线栓法 (middle cerebralartery occlusion, MCA0)制备大鼠持续性局灶性脑缺血模型。大鼠水合氯醛麻醉(350mg/kg，IP)，依次分离右侧颈总、颈外、颈内动脉，结扎右侧颈外动脉，在靠近颈外、颈内动脉分叉处由颈总动脉沿颈内动脉缓慢插入预 先被多聚酪氨酸包被的直径 0. 26-0. 28mm的尼龙栓线，深度约为1. 8-2. 2cm。假手术组栓线插入深度为1. Ocm，其余步骤同模型组。动物苏醒后出现对侧肢体运动障碍即为模型成功。持续观察8h。对于缺血-复灌所致的短暂性脑缺血(tMCAO)模型，在MCAO 2h后抽出大鼠颈内细线以进行复灌，并持续观察22h。大鼠随机分为假手术组、缺血组、生理盐水组、仙人掌多糖治疗组(200mg/kg/d)。 生理盐水组给与等体积生理盐水。仙人掌多糖治疗组在手术前每天静脉注射仙人掌多糖 200mg/kg，连续3天，术后15min再给予一次。神经行为学评分参考Zea Longa的6级评分法在术后3h、6h、8h进行评分0分， 无神经损伤症状；1分，不能完全伸展对侧前爪；2分，向栓塞对侧转圈3分，向对侧倾倒4 分，不能自发行走，昏迷5分，死亡。脑梗死体积测定所有动物在栓塞后8h断头取脑。大鼠用10%水合氯醛1. 5mL深度麻醉后处死，迅速取脑，-20°C冻lOmin，从视交叉处取冠状面均勻切成1-1. 5mm厚脑片， 放入2%TTC溶液(37°C)中染色30min，然后用4%多聚甲醛固定。24h后拍照并输入计算机，采用AUTOCAD图像处理软件计算梗死面积(粉红色区为正常脑组织，白色区为梗死区)， 各脑片梗死面积之和乘以厚度(1.5mm)为总的梗死体积，以梗死体积/全脑体积比作为统计参数。形态学检测缺血2h再复灌注22h深度麻醉大鼠，透心灌注取脑(冰冷的生理盐水及4%多聚甲醛)，4%多聚甲醛4°C固定过夜，脱水后石蜡包埋，选择前囟后3和4. 5mm处作等距离的冠状切片，片厚5 μ m，HE染色后于光镜下观察。免疫组织化学分析将如上所述切好的脑片用0. IM PBS清洗，脱蜡，酒精梯度洗脱，室温于10% H2O2中浸泡IOmin去除内源性过氧化物酶；PBS漂洗三遍后，10%正常山羊血清37°C孵育30min，加入一抗兔抗小鼠iNOS单克隆抗体(1 100) 37°C孵育2h ；PBS清洗后加入生物素化羊抗兔IgG(l 100) 二抗37°C孵育lh;PBS清洗后加入SABC 37°C孵育 Ih ；0. 5g/LDAB显色5-lOmin。阴性对照实验用PBS代替一抗，其余步骤相同。蛋白质印迹分析暂时性脑缺血复灌注22h后，分别取每组大鼠各4只断头取脑，迅速于冰上分离右侧海马和皮层。将脑组织用0.4ml冰冷勻浆缓冲液(Tris-HCl 50mmol/L, PH7. 4, NaCl 150mmol/L,0.5 % Triton X-100，二胺四乙酸 lmmol/L， phenylmethylsulfony fluoride lmol/L,抑肽酶 5mg/L)，在冰浴下制成勻菜，14，OOOXg 4°C离心30min。收集上清用作总蛋白测定。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离胶浓度为8%， PH 8. 8，浓缩胶浓度为4%，pH 6.8。每泳道上样量皮层7 μ 1，海马10 μ 1。电泳结束后将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶转膜到硝酸纤维素膜。将NC膜置于含5%牛奶的TBS缓冲液中4°C 过夜，加入iNOS单克隆兔抗鼠抗体(1 500)。TBS洗膜后，将膜用羊抗兔二抗室温下孵育 Ih.胶片上电泳蛋白条带扫描并用软件(Gel-ProAnalyzer 4.0)定量分析。统计学分析采用SPSS11. 5统计软件，数值用(S)表示，神经行为学评分用非参数统计(Marm-Whitney)方法做秩禾检验，其他组间比较采用单因素方差分析 (ONEffAY-ANOVA)和PLSD法进行显著性检验， ρ < 0. 05有显著意义。实验结果(1).米邦塔仙人掌多糖对大鼠神经行为学评分及脑梗死体积的影响 神经行为学评分显示，局灶性脑缺血3h后，仙人掌多糖治疗组、生理盐水组及假手术组动物均有不同程度的神经功能缺损，但各组间损伤程度比较未见显著性差异。缺血6h及8h 后给药组与生理盐水组行为学评分比较有显著差异(P < 0. 05)。缺血组及生理盐水组的损伤程度相当，没有明显差异(ρ >0.05)。脑梗死8h后大鼠脑片经TTC染色，梗死区域呈苍白色，非梗死区呈红色。缺血组及米邦塔仙人掌多糖治疗组大鼠缺血侧部分皮质及纹状体出现梗死，非缺血侧无梗死，与MCA支配的脑区一致，说明模型成功。假手术组未见梗死灶； 缺血组及生理盐水组出现大面积的白色梗死区域，米邦塔仙人掌多糖治疗组脑梗死体积较缺血模型组及生理盐水组明显减少，经统计学差异有显著性(P < 0. 05)。与神经行为学评分的结果一致，见

图1。(2)米邦塔仙人掌多糖对大鼠缺血-再灌注损伤皮层和海马神经细胞形态学变化的影响大鼠脑缺血_再灌注后，脑组织病理切片HE染色后于光镜下观察发现。脑缺血模型组大鼠皮层及海马神经细胞均可见明显的形态学变化神经细胞丢失、核固缩、核深染等。米邦塔仙人掌多糖(200mg/kg)治疗组大鼠皮层及海马神经细胞的形态学变化得到显著改善，神经细胞丢失减少，核固缩、核深染减轻，表明其对脑缺血-再灌注损伤具有保护作用，见图2。(3).米邦塔仙人掌多糖对缺血-再灌注损伤大鼠脑组织中iNOS表达及活性的影响免疫组织化学染色后光镜下iNOS在皮层及海马神经元表达的结果显示， 缺血侧脑组织DAB染色后iNOS阳性反应产物呈深棕色，假手术组中，未见胞浆内iNOS明显表达，细胞形态完整。与假手术组相比，缺血模型组阳性反应细胞明显增加，米邦塔仙人掌多糖(200mg/kg)治疗组胞浆iNOS阳性细胞，与缺血组相比，表达明显减少，结果见图3。二、离体脑片实验米邦塔仙人掌多糖对离体脑片氧化应激损伤的保护作用实验一对离体脑片氧糖剥夺损伤的保护作用实验动物雄性SD大鼠，体重为200 300g，华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。试剂2，3，5-三苯基氯化四氮唑，同第一部分，人工脑脊液组成(mmol·!/1: NaCl 126，KC13. 5，NaH2PO4 1. 2，MgCl2 1. 3，CaCl2 2. 0，葡萄糖 11，NaHCO3 25，pH 7. 4)， 避光保存；碘化丙啶(propidium iodide, PI)，Sigma公司产品；乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，乳酸脱氢酶)、一氧化氮合酶(N0S，分型)、一氧化氮(N0)、考马氏亮蓝检测试剂盒(南京建成生物制品有限公司)，其余试剂均为分析纯。实验仪器脑片切片机(美国生产)，酶标仪TECANA-5082 (奥地利生产)。激光共聚焦显微镜=Leica, TCS-SP (德国生产)。皮层和海马脑片的制备成年SD大鼠快速断头，迅速将全脑取出，立即浸入冰冷的预先饱和混合氧气(95% 02+5% C02)的人工脑脊液中，将小脑和脑干弃去，分离海马与皮质，.分别用切片机沿纵轴切成400 μ m厚脑片.用人工脑脊液漂洗两次后放置培养瓶内 (瓶内盛3ml人工脑脊液，(35士0. 5) °C，持续通入95% O2和5% CO2混合气，进行孵育。脑片损伤模型的建立脑片在35 °C ACSF中孵育30min后，实施氧糖剥夺 (oxygen-glucose deprivation, 0GD)损伤，用预先饱和混合氮气(95 % N2 禾口 5 % CO2) 的无糖脑脊液(以IOmmol ^L-1的蔗糖代替ACSF中的葡萄糖)置换瓶内培养液，分别持续通95% N2+5% 02各5、10、15、20、25、30min，再恢复含氧、含糖孵育条件正常孵育2h (reoxygenation, REO)，孵育结束后，所有脑片进行TTC染色，用酶标仪测定490nm处光密度(OD)值。计算不同时间氧糖剥夺损伤后的脑组织与对照组的损伤百分率(％ )，以确定损伤模型所需的最佳时间。实验分组随机分为①正常空白对照组脑片在孵育过程中不作任何处理②损伤模型组脑片在ACSF中孵育30min后，氧糖剥夺15min，随后恢复正常ACSF孵育2h。③米帮塔仙人掌多糖处理组分为3个浓度组，在损伤前30min分别加入0. 2mg · Γ1 Umg · L—1、 2mg · Γ1米帮塔仙人掌多糖。TTC染色脑 片与2 % TTC (用ACSF稀释)35 V条件下避光孵育30min，随后取出， 生理盐水漂洗，吸去表面水分，称湿重，以Ig脑片20ml比例加入抽提液(乙醇二甲亚砜=1 1)，避光24h，按皮层脑片200μ 1/孔，海马脑片100μ 1/孔的量加至96孔板， 酶标仪测定各孔在490nm处吸光度值(A490)。组织损伤百分率=(1-A490损伤/A490对照)X100%o激光共聚焦检测大鼠脑片细胞内PI荧光强度以二甲基亚砜为溶剂，将PI配制成 lmmol/L浓度，以2 μ 1/ml加入脑片孵育杯中，混勻，将各组孵育后的脑片移至含有2 μ 1/ml PI的人工脑脊液中，35°C下避光负载30min，持续通氧，人工脑脊液漂洗3次，随后进行激光共聚焦检测，观察并记录脑片组织的损伤情况即平均荧光强度。激光共聚焦工作条件为 Power 200mM ；Zoom2，光切厚度10 μ m,中速扫描，激发波长490nm，发射波长650nm，10倍光学显微镜头进行观察。因PI可以透过损伤的细胞膜进入细胞内，和DNA结合后发出荧光， 荧光愈强，表明损伤愈严重。脑片孵育液生化指标检测分别收集氧糖剥夺15min及复氧复糖2h后的脑片孵育上清液，按照试剂盒检测说明书检测孵育液中乳酸脱氢酶含量；实验结束后将各组脑片组织进行勻浆，检测组织中NO含量和iNOS活性变化。并进行组织蛋白含量测定。统计学分析采用SPSS11. 5统计软件，数值用(S)表示，组间比较采用单因素方差分析(0NEWAY-AN0VA)和PLSD法进行显著性检验，ρ < 0. 05有显著意义。实验结果(1)米邦塔仙人掌多糖对氧糖剥夺损伤脑片活性的影响米邦塔仙人掌多糖对脑片TTC染色的影响将0. 2mg · L-1Umg · Γ1及2mg · Γ1的仙人掌多糖与大鼠皮层和海马脑片在正常条件共同孵育3h，对脑片TTC染色无影响。各组A490值之间差异无显著意义。氧糖剥夺损伤后大鼠皮层和海马脑片TTC染色A490值较正常对照组显降低，P < 0. 01 (组织损伤百分率皮层36. 36% ’海马52. 38% )0损伤前给与不同剂量仙人掌多糖均能明显逆转脑片TTC染色A490值的降低，与损伤组相比，P<0.05。且其保护作用与剂量呈正相关，具有明显剂量依耐性。结果见图4。(2)米邦塔仙人掌多糖对脑片PI染色的影响大鼠皮层、海马脑片负载PI后均能在激光共聚焦下显示出清晰的荧光图像，损伤区坏死细胞呈现红色。结果表明，氧糖剥夺损伤后，其PI平均荧光强度明显增加，分别为 323. 89士35. 69和189. 76士20. 06与对照组相比，P < 0. 01。米邦塔仙人掌多糖lmg/L及 2mg/L处理后能显著减弱氧糖剥夺损伤后脑片PI荧光强度，表明坏死细胞减少，进一步证明对脑组织氧化应激损伤具有保护作用。结果见图5。(3)米邦塔仙人掌多糖对乳酸脱氢酶释放的影响氧糖剥夺损伤15min，乳酸脱氢酶的释放轻度增加，与正常对照组比较，无统计学意义，(P >0.05)。如脑片氧糖剥夺损伤15min再复氧复糖孵育2h后，皮层、海马脑片孵育液中乳酸脱氢酶量显著增加，与正常对照组比较(P < 0.01)，米帮塔仙人掌多糖0. 2mg/L、lmg/L和2mg/L处理后能显著减弱复氧复糖孵育2h后海马、皮层乳酸脱氢酶的释放，与损伤模型组比较差异有显著意义(P <0.01)。结果见图6。(4)米邦塔仙人掌多糖对脑片NO/iNOS释放的影响氧糖剥夺伤孵育15min后，皮层、海马脑片组织中NO含量明显增加，iNOS活性均显著增加，与对照组比较，P <0.01 ；米帮塔仙人掌多糖0. 2mg/L、lmg/L、 2mg/L处理后均能不同程度降低海马、皮层脑片的NO的含量和减弱iNOS活性，与模型损伤组比较，P < 0. 05，结果见图7。

实验二 米 邦塔仙人掌多糖对H2O2所致大鼠离体脑片损伤保护作用实验动物雄性SD大鼠，体重为200 300g，华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。试剂2，3，5_ 三苯基氯化四氮唑(2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride, TTC)，仙人掌多糖，同第二部分；乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,乳酸脱氢酶)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutashSOD)、谷胱甘肽(glutathion，谷胱甘肽还原酶)、总抗氧化能力(total antioxidationcapability)检测试剂盒购自南京建成生物制品有限公司。其余试剂均为分析纯。3.实验仪器切片机和酶标仪同前；4.皮层和海马脑片的制备 同前。H2O2致脑片氧化应激损伤模型的建立脑片在35°C人工脑脊液中孵育30min后，分别用1，2和4mmol/L H2O2继续孵育30min，随后恢复正常人工脑脊液孵育2h。对照组实验步骤同损伤组，但孵育液中不含H202。TTC染色，计算不同浓度H2O2的脑组织损伤百分率，以确定损伤模型所需H2O2的最佳浓度。实验分组脑片在35°C人工脑脊液中孵育30min，随机分为对照组继续正常孵育；模型组用含2mmol/L H2O2人工脑脊液孵育30min，随后恢复正常人工脑脊液孵育2h ； 米帮塔仙人掌多糖处理组在损伤前30min，分别用0. 333和1. 67mg/L米帮塔仙人掌多糖预孵育，用含2mmol/L H2O2人工脑脊液孵育30min，恢复正常孵育2h后，将脑片进行TTC染色。7.TTC染色同前。8.脑片孵育液生化指标检测孵育结束，取出培养脑片，滤纸吸干表面水分后称取湿重。将收集的人工脑脊液分别按照试剂盒说明书进行乳酸脱氢酶、SOD活性，谷胱甘肽还原酶含量和总抗氧化能力检测，将检测结果除以相应培养脑片组织湿重，以每克组织的检测量为单位。亚硝酸法测定SOD活性，SOD活性表示为试剂盒对照管与样品管间亚硝酸盐量的差值(Δ)。亚硝酸盐量根据亚硝酸盐标准品的标准曲线(Y = a+bX)计算得出，Y代表吸光度值，X代表亚硝酸盐浓度。9.统计采用SPSSl 1.5统计软件，数值用 (x± s)表示，组间比较采用单因素方差分析(0NEWAY-AN0VA)和PLSD法进行差异显著性检验，p<0. 05有显著意义。实验结果1.米邦塔仙人掌多糖对H2O2损伤脑片活性的影响用含1，2和 4mmol · L4H2O2的人工脑脊液孵育脑片30min均可降低大脑皮层和海马脑片TTC染色A49tlnm 值，表明H2O2对大鼠脑片可造成不同程度损伤(见图1)。其中2mmol/L H2O2损伤强度适中， 组织损伤百分率皮层(42士3)%，海马(53士3)%，可以确定为本实验比较理想的造模浓度。损伤前或损伤同时给予米帮塔仙人掌多糖能逆转脑片A49tlnm值降低，表明其对H2O2所致脑片损伤具有一定的保护作用。实验发现不同时间给药所表现的效应不同，损伤前给药的脑组织保护作用优于损伤同时给药，如在损伤30min后给予则无明显保护作用(P>0. 05)。 另外，其保护作用还与浓度相关，1. 67mg .L-1的保护作用强于0. 333mg ·Ι^(Ρ < 0. 01)。结果见表1.
表1米帮塔仙人掌多糖对H2O2诱导的大鼠皮层及海马脑片损伤的保护作用
权利要求
1. 一种制备米帮塔仙人掌多糖的方法，包括以下步骤a .米帮塔仙人掌粗多糖的制备将新鲜购置的米邦塔仙人掌茎清水洗净去皮后切成碎片，干燥，取干燥米邦塔仙人掌茎碎片投入双蒸水中，米邦塔仙人掌茎碎片与双蒸水的重量/体积比为0. 1 :1，于95°C搅拌3h过滤，去滤液，在残渣中再次加入2倍的双蒸水95°C 搅拌2h，再次去滤液，将2次提取的滤液充分搅拌后抽滤，然后将抽滤后的滤液放入旋转蒸发仪中，旋转蒸发至原体积的10%，再加入适量的氯仿萃取4-5次，然后将上层液体移至另一容器中，按体积比1 :4加入无水乙醇至终浓度为80%，4°C过夜，常温抽滤，留沉淀物，依次用无水乙醇，丙酮，乙醚分别将沉淀清洗3次，去杂质后进行真空干燥得米邦塔仙人掌粗糖粉末；b .米邦塔仙人掌粗糖分离纯化用纤维素DEAE-52分离柱进行分离纯化首先用如下方法将上柱预处理(1)将干粉的纤维素浸泡在蒸馏水中，约3小时左右，去除杂质，抽干；(2)用0. 5mol/L的HCl溶液浸泡2小时，用去离子水洗净至PH中性，并抽干；(3)将抽干的纤维素再浸泡在0. 5mol/L的NaOH溶液中2小时，用去离子水洗至中性，抽干，将粗糖粉末与45°C双蒸水按重量与体积之比为1 :4的比例溶解，将此溶解液分别用双蒸水及0. 5M的NaOH溶液缓冲液，用上述处理后的分离柱进行洗脱，流速3ml/5min，然后将洗脱液用苯酚-硫酸法检测糖的出现，最后收集含糖洗脱液放入旋转蒸发仪中蒸发，转速为 50-80/3min，温度60°C，蒸发至稠状液体，进行真空干燥得纯化米邦塔仙人掌多糖粉末。
全文摘要
本发明揭示了米邦塔仙人掌多糖可改善大鼠神经行为障碍，减少脑梗死体积和皮层及海马神经元丢失，可减少细胞内ROS的产生，具有很好的神经保护作用，可作为预防和治疗中枢神经系统慢性神经退行性疾病的药物，用于预防和治疗中枢神经系统慢性神经退行性疾病。本发明还提供了优化的米帮塔仙人掌多糖提取工艺，该提取工艺具有方便简捷、经济适用，得糖率较高和适合大批量提取等特点。
文档编号A61P9/10GK102432690SQ20111033497
公开日2012年5月2日 申请日期2010年6月13日 优先权日2010年6月13日
发明者吕青, 徐旭林, 湛进进, 赵博, 郭莲军, 陈建国, 陈扬, 黄先菊 申请人:华中科技大学