专利名称：肠道病毒71型感染c57/bl6乳鼠模型的建立方法
技术领域：
本发明涉及一种肠道病毒71型感染C57/BL6乳鼠模型的建立方法。
背景技术：
肠道病毒71型(EV71)属于小RNA病毒科肠道病毒属，是引起婴幼儿手足口病 (Hand Foot and Mouth Disease, HFMD)的主要病原之一。EV71感染的主要症状是手、足、 口等部位皮疹或疱疹，部分患儿可并发无菌性脑膜炎、脑干脑炎、神经源性肺水肿、脊髓灰质炎样麻痹等神经系统并发症，呼吸道感染和心肌炎等，可致残、致死。自2008年安徽阜阳爆发手足口病以来，EV71的感染呈加剧的趋势，已经成为备受关注的公共卫生问题，但目前 EV71的感染途径、致病机制及流行规律仍不明确，并且缺乏有效的治疗药物及疫苗。缺乏成熟稳定的动物模型是造成上述情况的最重要的原因之一。目前，国内外对 EV71致病机理、临床治疗及疫苗研发均受困于缺乏动物模型。因此，建立成熟稳定的动物模型对EV71基础和临床研究显得尤为重要。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种肠道病毒71型感染C57/BL6乳鼠模型的建立方法，动物模型的建立可加深对肠道病毒71型病原学的了解，促进肠道病毒71型致病机制的研究，用于高效抗病毒药物的筛选和疫苗的研制，为EV71病原学研究、临床基础研究以及疫苗学研究提供了有力的工具。本发明是通过以下技术方案实现的一种肠道病毒71型肌肉注射感染C57/BL6乳鼠模型的建立方法，包括以下步骤 取C57/BL6乳鼠，后肢肌肉注射病毒液，即得肠道病毒71型感染的小鼠模型。所述病毒液注射量为20 μ L，是通过以下方法制得的将EV71毒种，以 200 μ L/100mL细胞培养瓶的接种量接种MA104细胞，37°C,5% CO2培养，每天观察细胞病变情况，至MA104细胞约70%出现凝集、皱缩时，将整瓶细胞冻融，离心取上清，即得到EV71的病毒液。所述EV71毒种，为现有技术中已有的，常规取得即可，本发明对此无限制，不再赘述。所述建立方法，还包括以下小鼠模型的鉴定步骤饲养上述接种肠道病毒71型的乳鼠，3天后，后肢出现反应迟缓、后肢瘫痪，5天后死亡的，即为感染成功的小鼠模型。本发明成功地建立了稳定的肠道病毒71型感染的乳鼠模型，其后肢瘫痪率一般为70% 100%，死亡率为30 100%。本发明为科研人员研究肠道病毒71型病原学、肠道病毒71型致病机制以及高效抗病毒药物的筛选和疫苗的研制提供了基础，具有广阔的应用前景。
图1为临床分离毒株的RT-PCR鉴定的电泳图，其中，M = Maker (D2000)，N=阴性细胞对照，B =空白试剂对照，1 =分离毒株。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例1建立感染肠道病毒71型的乳鼠模型步骤如下1、EV71的分离鉴定本发明所采用的EV71毒株是从临床的重症手足口病人的大便标本中分离的，同时采用人横纹肌肉瘤细胞株(RD)、恒河猴肾细胞株(MA104)和非洲绿猴肾细胞株(Vero)三种细胞对标本中的病毒进行分离，结果三种细胞上菌出现了细胞病变，传代后冻存毒种。然后提取分离到的EV71的基因组RNA，逆转录成cDNA，采用EV71国家标准引物对分离毒株进行鉴定，结果表明分离毒株在226bp处出现了很亮的条带(如图1所示)，可证实从临床手足口重症病人大便标本中分离的毒株为EV71。2、EV71感染动物模型的建立2.1小鼠的准备购买SPF级别的C57/BL6孕鼠2只，每只产乳鼠6只，25°C、湿度50 %，分格饲养在 ABSL-2实验室的净化动物饲养柜内，每天观察动物生长情况，C57/BL6乳鼠生长状态良好。2.2毒种的准备将分离的EV71毒种，以200yL/100mL细胞培养瓶的接种量接种MA104细胞， 37°C、5% CO2培养，每天观察细胞病变情况。接种EV71后第2天，MA104细胞约70%出现了凝集、皱缩，将整瓶细胞冻融后，离心取上清，即得到EV71的病毒液。2. 3 EV71感染动物模型的建立2. 3. 1动物分组将两组动物分别设为病毒组和正常对照组，病毒组肌注接种EV71病毒，正常对照组肌注接种含2%胎牛血清的1640培养液。2.3.2 接种 EV71采用无菌的微量进样器，病毒组每只C57/BL6乳鼠左后肢肌肉注射病毒液20 μ L， 正常对照组每只C57/BL6乳鼠左后肢肌肉注射含2%胎牛血清的1640培养液20 μ L。然后将动物按相同的条件饲养在净化动物饲养柜内，每天观察动物。2. 3. 3接毒后的观察接种0天及1天病毒组和正常对照组均无异常；接种3天后病毒组动物后肢全部出现明显反应迟缓、后肢瘫痪，正常对照组无异常，取两组动物各3只分别进行解剖固定； 至接种5天病毒组剩余乳鼠均死亡，正常对照组无异常，动物模型建立成功。
权利要求
1.一种肠道病毒71型感染C57/BL6乳鼠模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤 取C57/BL6乳鼠，后肢肌肉注射病毒液，即得肠道病毒71型感染的小鼠模型。
2.根据权利要求1所述的肠道病毒71型肌肉注射感染C57/BL6乳鼠模型的建立方法，其特征在于所述病毒液注射量为20 μ L，是通过以下方法制得的将EV71毒种，以 200 μ L/100mL细胞培养瓶的接种量接种MA104细胞，37°C,5% CO2培养，每天观察细胞病变情况，至MA104细胞70%出现凝集、皱缩时，将整瓶细胞冻融，离心取上清，即得到EV71的病毒液。
3.根据权利要求1所述的肠道病毒71型肌肉注射感染C57/BL6乳鼠模型的建立方法， 其特征在于还包括以下小鼠模型的鉴定步骤饲养上述接种肠道病毒71型的乳鼠，3天后，后肢出现反应迟缓、后肢瘫痪，5天后死亡的，即为感染成功的乳鼠模型。
全文摘要
本发明公开了一种肠道病毒71型感染C57/BL6乳鼠模型的建立方法取C57/BL6乳鼠，后肢肌肉注射病毒液，即得肠道病毒71型感染的小鼠模型。所述病毒液注射量为20μL，是通过以下方法制得的将EV71毒种，以200μL/100mL细胞培养瓶的接种量接种MA104细胞，37℃、5％CO2培养，每天观察细胞病变情况，至MA104细胞有70％出现凝集、皱缩时，将整瓶细胞冻融，离心取上清，即得到EV71的病毒液。本发明成功地建立了稳定的肠道病毒71型感染C57/BL6乳鼠模型，为研究肠道病毒71型病原学、致病机制以及高效抗病毒药物的筛选和疫苗的研制提供了基础，具有良好的应用前景。
文档编号A61K35/76GK102379903SQ20111034412
公开日2012年3月21日 申请日期2011年11月3日 优先权日2011年11月3日
发明者张颖, 盖中涛 申请人:济南市传染病医院