基于癌症早期检测诊治一体的复合纳米新材料及制备方法

专利名称：基于癌症早期检测诊治一体的复合纳米新材料及制备方法
技术领域：
:本发明主要涉及一种基于癌症早期检测、诊断和治疗一体的复合新材料-金纳米笼/纳米氧化铁，属于纳米科学技术领域。
背景技术：
:生物活性物质如抗体蛋白等，由于自身可检测的信号比较弱，难以定量分析或检测。癌症是一类严重危害人类健康的常见病、多发病。据世界卫生组织报告，每年全球癌症新发病例1000多万，死亡700多万，男性530万，女性470万。占总死亡人数的12%。预期到2020年，全球每年新发病例将达1500万。肿瘤病人总数，在发展中国家将增长73%，而发达国家增长29%。癌症是我国居民死亡的主要原因之一。到2008年年底，我国癌症每年新发病例为220万，因癌症 死亡人数为160万，在近30年间居民恶性肿瘤的发病率男性增长了 37%，女性上升了 44.76%，且处于最佳劳动状态的20至60岁者占到40%。预计2015年全世界将有900万人死于癌症，2030年将有1200万人死于癌症。在所有癌症的死亡病例中，有70%发生在中等收入和低收入国家。因此癌症的控制是世界各国政府的卫生战略重点，癌症的治疗成为世界所关注的研究课题。恶性肿瘤(癌症)的早期发现并及时治疗是治疗肿瘤的关键。目前的常规诊断方法灵敏度和特异性比较低，在肿瘤发生早期很难检测，还有靶向输送效果差、强烈的毒副作用以及肿瘤细胞的耐药性等，难以达到预期的治疗效果。因此，发展灵敏度高、特异性强的早期诊断方法以及开发具有高的肿瘤靶向性、安全、有效、经济的抗肿瘤药物体系已经成为目前癌症研究的热点，对癌症的早期诊断和治疗有着重要的意义。现阶段Au Nanocages纳米颗粒在生物医学中的应用主要集中在暗场成像领域，即以Au Nanocages为光散射探针，对癌细胞进行甄别。而灵敏度是进行肿瘤诊断的一个重要方面，癌症越早被发现和诊断，则越容易治愈，病人康复率就越高。因此，高的灵敏度在肿瘤成像探针研究中是一个很重要的参数。如何同时实现癌症的高灵敏度诊断、给药、治疗，是纳米技术应用于生物医学领域面临的一个主要问题。Au Nanocages具有优良的光学性质，可作为暗场成像探针和荧光探针。磁性纳米颗粒是一类智能型的材料，具有磁响应性、超顺磁性和优异的生物相容性，以生物医学领域为例，已在核磁共振成像(MRI)、磁靶向药物、在肿瘤磁靶向化疗和热疗方面得到广泛关注。磁性纳米颗粒的内在化可作为药物进入细胞的载体。如果将两者的优点结合，实现纳米材料的多功能化。预期达到对肿瘤细胞进行磁共振成像、荧光成像、暗场成像、特异性靶向多功能的诊断，通过磁、光成像可以实现优势互补，从而提高癌细胞检测的灵敏度、准确性和治疗的先进性。人们曾经认为癌症是不治之症，但是如今大多数被诊断为早期癌症的病人都能够和癌症长期共存。这大部分归功于癌症诊断和治疗在近几十年中的发展进步。尤其是纳米科学技术的发展为肿瘤的早期诊断，预防和治疗提供了新的希望
发明内容
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发明目的:本发明提出了一种基于癌症早期检测、诊治一体的复合纳米新材料，其目的是:制备出一种基于癌症早期诊断的可同时实现癌症的高灵敏度、高准确率诊断、靶向给药、光热治疗的新试剂。技术方案:一种基于癌症早期检测诊治一体的复合纳米新材料，其特征在于:所述的复合纳米新材料为金纳米笼/纳米氧化铁，纳米氧化铁填充在中空金纳米笼内，外层用生物分子封装，生物分子表面修饰有生物靶向分子；所述的金纳米颗粒为中空金纳米笼或中空金纳米立方盒；所述的纳米氧化铁为纳米四氧化三铁、三氧化二铁或二者混合物。纳米氧化铁粒径4-1000nm,金纳米笼粒径10_2000nm。生物分子包括:二氧化硅、2，3-二巯基丁二酸(DMSA)、PEDOT/PSS [poly (3，4-ethylenedioxythiophene)poly (styrenesulfonate)]> PDADMAC (poly dialIyIdimethy lammonium chioride)、聚乙二醇(PEG)、己二酸、聚乙二醇单甲醚(mPEG)、聚乙烯醇、葡聚糖、氨基酸、肽分子、DNA分子、生物素-亲和素、抗体-抗原。生物靶向分子包括:壳聚糖、叶酸、氨基酸、肽分子、DNA分子、生物素-亲和素、抗体-抗原。一种如上所述的基于癌症早期检测诊治一体的复合纳米新材料的制备方法，其特征在于:具体步骤如下:(I)、以银纳米立方体为模板，加入AuCV和AuCly制备出中空金纳米立方盒状颗粒(nanoboxes)和中空多孔金纳米笼状颗粒(nanocages),将中空金纳米立方盒状颗粒用H2O2腐蚀，得到消角的中空金纳米立方盒状颗粒；(2)、在步骤(I)得到的中空金纳米立方盒状颗粒和中空多孔金纳米笼状颗粒溶液中加入0.02molFeCl2.6H20溶于200mL去离子水和FeCl3.4H20, Fe3+与Fe2+的摩尔比是
1.75，快速搅拌反应前驱物溶液，超声振荡，确保Fe2+和Fe3+溶液能进入中空的金纳米笼或中空金纳米立方盒粒子空腔内，然后再快速加入30ml氨水或氢氧化钠，纳米氧化铁在金纳米立方盒或多孔金纳米笼内部成核，生长；(3)、在步骤(2)反应液中加入分散剂葡聚糖、壳聚糖、淀粉、明胶、聚乙二醇、油酸、白蛋白或乳胶表面活性剂，调控纳米氧化铁的粒径，使得纳米氧化铁的粒径大于金纳米笼或金纳米立方盒孔径，得到在金纳米笼或金纳米立方盒内生长的纳米氧化铁就被装载在金纳米笼的空心笼芯或金纳米立方盒内，将金纳米笼外面的纳米氧化铁经多次洗涤后去掉，干燥后得到复合纳米颗粒；(4)、将步骤(3)得到的复合纳米颗粒用生物分子封装，得到金纳米笼/纳米氧化铁颗粒；(5)、将步骤(4)得到的金纳米笼/纳米氧化铁颗粒与生物靶向分子反应，得到用于基于癌症早期检测、诊治一体的复合纳米新材料。纳米氧化铁被包覆在中空金纳米笼内部。生物探针分子被包覆在中空金纳米笼或中空金纳米立方盒内部；生物探针分子为荧光染料Cy5或卟啉。

优点及效果:
本发明提出了一种基于癌症早期检测、诊治一体的复合纳米新材料，具有如下优
占-
^ \\\.
I)中空多孔金纳米笼状颗粒(Au Nanocages)的LSPR光谱可以从可见光区连续地调控到近红外光区，并且该红移现象表现的尤其明显，但同时金纳米笼的形状和大小基本保持不变，这是其他结构金纳米颗粒(金纳米棒和金纳米壳结构)不具备的，Au Nanocages的LSPR光谱调控是通过控制内部空腔大小，表面壁厚以及表面孔径来实现的，可以进行精确调控，因此性能更加稳定；2)金纳米笼/纳米氧化铁的热稳定性、靶向性高于金纳米笼；3)金纳米笼/纳米氧化铁可实现早期肿瘤磁光的联合诊断，可实现的早期肿瘤高灵敏度的检测；4)金纳米笼/纳米氧化铁可实现早期肿瘤诊断的多元化，可同时实现磁共振成像、荧光成像、暗场成像，提高肿瘤诊断的准确性。本发明主要创新点在于:(I)相对于普通的肿瘤光-磁诊断试剂相比,Au Nanocages/Fe304复合纳米新材料更具有磁光联和性能，其灵敏度和准确率更高；(2)和普通的材料合成方法不同，本发明提出一种创新性的材料设计方法-材料的组装是由外到内的组装方法，可以避免表面复杂的修饰对材料性能的影响，材料的合成易于控制，使得复合纳米新材料的性能稳定；(3)可同时实现肿瘤的高灵敏度多元化联合诊断、光热治疗以及靶向药物的，为肿瘤的早期诊断，早期治疗提供依据。


:图1 为 Au Nanocages/Fe304 制备不意图；图2暗场的荧光成像照片；图3 \加权成像图；图4为每个细胞吞噬铁离子质量的对比图；图5是未受到近红外激光照射的荧光显微镜照片；图6受到近红外激光照射后荧光显微镜照片。
具体实施方式
:一种基于癌症早期检测诊治一体的复合纳米新材料，其特征在于:所述的复合纳米新材料为金纳米笼/纳米氧化铁，纳米氧化铁填充在中空金纳米笼内，外层用生物分子封装，生物分子表面修饰有生物靶向分子；所述的金纳米颗粒为中空金纳米笼或中空金纳米立方盒；所述的纳米氧化铁为纳米四氧化三铁、三氧化二铁或二者混合物。纳米氧化铁粒径4-1000nm,金纳米笼粒径10_2000nm。生物分子包括:二氧化硅、2，3-二巯基丁二酸(DMSA)、PEDOT/PSS [poly (3，4-ethylenedioxythiophene)poly(styrenesulfonate)]> PDADMAC (poly dialIyIdimethy lammonium chioride)、聚乙二醇(PEG)、己二酸、聚乙二醇单甲醚(mPEG)、聚乙烯醇、葡聚糖、氨基酸、肽分子、DNA分子、生物素-亲和素、抗体-抗原。
生物靶向分子包括:壳聚糖、叶酸、氨基酸、肽分子、DNA分子、生物素-亲和素、抗体-抗原。一种如上所述的基于癌症早期检测诊治一体的复合纳米新材料的制备方法，其特征在于:具体步骤如下:(I)、以银纳米立方体为模板，加入AuCV和AuCly制备出中空金纳米立方盒状颗粒(nanoboxes)和中空多孔金纳米笼状颗粒(nanocages),将中空金纳米立方盒状颗粒用H2O2腐蚀，得到消角的中空金纳米立方盒状颗粒，如图1中所不；(2)、在步骤(I)得到的中空金纳米立方盒状颗粒和中空多孔金纳米笼状颗粒溶液中加入0.02molFeCl2.6H20溶于200mL去离子水和FeCl3.4H20, Fe3+与Fe2+的摩尔比是1.75，快速搅拌反应前驱物溶液，超声振荡，确保Fe2+和Fe3+溶液能进入中空的金纳米笼或金纳米立方盒粒子空腔内，然后再快速加入30ml氨水或氢氧化钠，纳米氧化铁在金纳米立方盒或多孔金纳米笼内部成核，生长；(3)、在步骤(2)反应液中加入分散剂葡聚糖、壳聚糖、淀粉、明胶、聚乙二醇、油酸、白蛋白或乳胶表面活性剂，调控纳米氧化铁的粒径，使得纳米氧化铁的粒径大于金纳米笼或金纳米立方盒孔径，得到在金纳米笼或金纳米立方盒内生长的纳米氧化铁就被装载在金纳米笼的空心笼芯或金纳米立方盒内，将金纳米笼外面的纳米氧化铁经多次洗涤后去掉，干燥后得到复合纳米颗粒；(4)、将步骤(3)得到的复合纳米颗粒用生物分子封装，得到金纳米笼/纳米氧化铁颗粒，如图1中所示；(5)、将步骤(4)得到的金纳米笼/纳米氧化铁颗粒与生物靶向分子反应，得到用于基于癌症早期检测、诊治一体的复合纳米新材料。纳米氧化铁被包覆在中空金纳米笼内部。生物探针分子被包覆在金纳米笼或金纳米立方盒内部；生物探针分子为荧光染料Cy5或卟啉。与以往的金纳米粒子进行肿瘤的诊断和光热治疗的研究不同，本发明是利用金纳米笼(金纳米立方盒)与纳米氧化铁纳米进行组装，合成金纳米笼(盒)/纳米氧化铁复合粒子，并且采用由外到内的组装方法，首先制备金纳米笼(盒)，其次氧化铁在金纳米笼(盒)内成核长大，通过表面活性剂(如葡聚糖等)得到单分散的纳米氧化铁，用生物分子封装，得到金纳米笼(盒)/纳米氧化铁复合粒子，最后用生物靶向分子进行表面修饰，用于肿瘤的磁共振成像、荧光成像、暗场成像、特异性靶向多功能的诊断，光热治疗和作为靶向药物载体。制备过程如图1所示，具体步骤如下:1)金纳米笼(盒)状颗粒制备以银纳米立方体(nanocubes)为模板，分别采用AuC12_或者AuC14_为反应前驱物，通过简单的置换反应(I和II式)可分别制备出中空金纳米立方盒状颗粒(nanoboxes)和中空多孔金纳米笼状颗粒(nanocages)。3Ag(s)+AuCl4^(aq) — Au(s)+3AgCl(s)+Cr(aq), IAg(s)+AuCl2^(aq) ^ Au(s)+AgCl(s)+Cr(aq).1I2)不同壁厚的Au Nanocages的制备
利用I)中制备的金纳米笼(盒)状颗粒，采用腐蚀剂H2O2 (或者过硫酸盐、CN-和O2)制备不同壁厚的Au Nanocages的实验分为两步；第一电流置换反应制备出LSPR谱峰在不同位置的金银合金纳米立方盒(Au-AgAlloy Nanoboxe),采用的是用过量的H2O2氧化溶解Au-AgAlloy Nanoboxes中的银原子。而在制Alloy Nanoboxes的反应过程中，一个三价的金离子置换三个零价的银，银原子在内部被氧化成了而还原得到金原子则大多沉积在AgNanocubes的表面，从而形成了内部为空腔的的纳米立方盒结构。反应初始阶段加入少量的HAuNanocubes的表面会形成一个小坑,银原子正是从这个小坑中不断地解出来,随着加入的HAuCl4量的增多,Ag Nanocubes的坑逐渐演变成内部的空腔,最后形成Au Nanocages2Ag+H202 — 2Ag++20H_H2O2会和Au-AgAlloy Nanoboxes中的银原子反应,依据的反应是:残留在Au-AgAlloy Nanoboxes中的银原子包括合金层中的银原子会被过量的H2O2溶解,而不会引入其他新的元素，因此反应得到的Au Nanocages的壁厚和表面孔径都可以得到很好的控制。3)金纳米笼状颗粒与磁性纳米材料的组装Au Nanocages与磁性纳米材料的组装,我们提出一种创新性的材料设计方法-材料组装的顺序是由外到内的材料组装方 法。首先利用步骤2),在精确调控Au Nanocages粒径(大于40nm)和孔径(大于4nm)的基础上，然后在溶液中加入FeCl2 MH2C^PFeCl3.6Η20，快速搅拌反应前驱物溶液，超声振荡，确保Fe2+和Fe3+溶液能进入中空的Au Nanocages粒子空腔内，快速加入氨水(或氢氧化钠)，Fe3O4成核，生长，在反应机理如下:Fe2++2Fe3++80!T — Fe304+4H20(I)FeCl2+2FeCl3+8NaOH — Fe304+8NaCl+4H20(2)组装过程中，在上述反应液中加入分散剂葡聚糖(或壳聚糖、淀粉、明胶、聚乙二醇、油酸、白蛋白、乳胶等)，使纳米Fe3O4在Au Nanocages溶液中(金纳米笼内和笼外)成核、分散、生长，精确调控Fe3O4的粒径，最后得到粒径为10 IOOOnm Fe3O4,因为纳米Fe3O4的粒径小于金纳米笼的孔径)，这样在金纳米笼内生长的Fe3O4就被装载在Au Nanocages的空心笼芯内，将Au Nanocages外面的Fe3O4经多次洗漆后去掉,得到Au Nanocages/Fe304组装体。4)在步骤3)制备Au Nanocages/Fe304组装体基础上,利用生物分子封装,生物分子包括氨基酸、肽分子、DNA分子、生物素-亲和素、抗体-抗原、二氧化硅、荧光染料、近红外染料Cy5,制备出Au Nanocages/Fe304复合纳米粒子。实施例1以Au Nanocages/Fe304为例制备生物探针(I)参照文献[Chinese Sci Bull, 2010, 55]制备纳米 Fe3O4 颗粒，参照文献[AdvMater, 2008, 20]制备金纳米笼或金纳米立方盒。(2)取(I)Au Nanocages 颗粒 2g IOmmol,加入 0.02mol FeCl3.6H20 溶于 200mL去离子水配成0.lmol/L的溶液中，Fe3+与Fe2+的摩尔比是1.75，反应起始60°C时，先加入氨水30mL，升温到80°C时再加入表面活性剂0.5mL,陈化时间是40 130min ;搅拌速度接近300r/min,得到复合纳米粒子。(3)室温下，将20%浓度的TODAC水溶液1.5mL加入5mL去离子水中快速搅拌，随后缓慢加入(2)中制备的7nM的纳米Au Nanocages/Fe304溶液5mL，继续搅拌两小时后，15000rpm离心30分钟，去除上层多余的I3DDAC溶液，即得到生物分子I3DDAC封装的Au
Nanocages/Fe304 溶液。4)将 3) 50nM 包覆了 I3DDAC 的 Au Nanocages/Fe304 溶液与 0.2mM 的生物素或牛血清蛋白-生物素一比一混合，加入羟乙基哌嗪乙硫磺酸HEPES缓冲液调节反应液pH值为酸碱中性，震荡三分钟后静置半个小时。最后将反应液以80的rmp的速度离心10分钟以去除剩余的生物分子。5)抗体与F1DDAC封装的Au Nanocages/Fe304溶液的连接同牛血清蛋白。6)取ImL的PSS溶液加入到IOmL去离子水溶液中快速搅拌，随后缓慢加入50nM在步骤3)中溶液lmL，搅拌2小时后，IOOOOrpm离心两次，以去除溶液中多余的PSS，得到包覆PSS的复合纳米颗粒。包覆了一层PSS后，复合纳米颗粒的表面电性变为负电。实施例2合成2，3- 二巯基丁二酸(DMSA)修饰的纳米复合材料(I)参考文献[J Colloid Interface Sc1.1997,194:427-433]方法，将 ImLDMSA溶液(3mM)加入到1.5mL的纳米复合材料胶体溶液中(7.0 X 1012particles/mL)，轻微搅拌2小时，得DMSA修饰的 复合纳米材料。(2)将⑴使用Mill1-Q水离心洗涤除去未反应的DMSA(3000rpm)。再将纳米材料重新分散于3mL水溶液中备用。实施例3DNA修饰的复合纳米颗粒(I)将巯基 DNA (5' -SH-CCC CCC CCC CTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTTTTT TTT T-3')根据文献[Nat.protoc.2006，1,324]进行活化。(2)将在实施例1中制备的复合纳米颗粒经HOOOrpm离心lOmin，然后与活化后的DNA在25°C下孵育24h，复合纳米颗粒的终浓度为2nM，DNA的终浓度是1.32X 1(Γ6Μ。(3)将⑵中过量的DNA通过HOOOrpm离心IOmin除去，下层复合纳米颗粒重悬在等量的超纯水中，得到DNA修饰的复合纳米颗粒。实施例4组氨酸对复合纳米颗粒的修饰(I)利用实施例1中制得的复合纳米粒子10μ g以8000转/分，离心30分钟，最后分散在高纯水中，最终制得的复合纳米粒子溶胶的浓度为290 μ Μ,将pH值用NaOH调到
9.6。(2)将(I)中加入100 μ M的组氨酸溶液，反应一个小时，得到的组氨酸修饰的复合纳米粒子溶胶的浓度为0.25mM。实施例5合成mPEG修饰的复合纳米颗粒(I)参考文献[Nucleic Acids Res.2007.35:3668]合成 LA-NHS，在干燥的三颈烧瓶中加入2.06g(0.0lmol) LA和1.28g(0.011mol)NHS，再加入20mL无水四氢吠喃(简称THF)，搅拌溶解，冷却至O °C。(2)将 2.06g(0.0lmol) 二环己基碳二亚胺(DCC)溶于 IOmL 无水 THF，0°C下，向
(I)反应瓶中缓慢滴加含有DCC的四氢峡喃溶液后，搅拌2小时，升温至20°C 25°C，反应4 6h后，过滤，蒸馏，用乙酸乙酷重结晶得产物黄色硫辛-N-琥珀酰亚胺基酯(LA-NHS)针状晶体，真空干燥。(3) LA-mPE 的合成参考文献[Bioconjug Chem.2006，17:603]，取mPEGlIOO-NH2(0.275g,0.25mmol)和步骤(2)LA-NHS(143mg，0.5mmol)置于二颈烧瓶中，溶于IOmL的无水二氯甲烷中，搅拌，逐滴加入无水三乙胺0.5mL ;常温反应12小时，用预冷的冰乙醚重沉淀，真空干燥，得LA-mPEG粗产品。 (4)将(3) LA-mPEG (0.5mM)水溶液加入到ImL的复合纳米颗粒水溶液中(1.68 X IO11个/mL)，常温搅拌3小时；在3700rpm下洗涤3次，将mPEG@复合纳米颗粒重新分散在ImL水溶液中，储藏在4°C冰箱中备用。实施例6复合纳米粒子表面修饰SiO2纳米粒子(I)参考文献[J.Colloid Interface Sci，1986，26，62]制备 SiO2，用 3.0mL 的25%氨水作为催化剂加入到50mL乙醇溶液中，放入45mL的水溶液密封的玻璃瓶中20°C下搅拌I小时，接着将0.2mL的TEOS加入到反应瓶中，550rpm下搅拌12小时得SiO2纳米粒子。(2)将150μ L和300μ L的APTES分别加入至Ij (I)制备的50 ml SiO2胶体溶液中，常温下搅拌2小时，在70°C加热回流I小时，在2000rpm下，得到APTES@Si02纳米粒子，并用150mL无水乙醇分3次洗漆,最后分散到IOmL无水乙醇溶液中。(3)取(2)得到的3.0mL APTESiSiO2纳米粒子加入到30mL的复合纳米颗粒溶液中，常温搅拌I 2小时后，2500rpm下，洗涤3次，得到表面修饰SiO2纳米粒子的复合纳米粒子。 实施例7利用金纳米笼制备的复合材料用于光学成像和磁共振成像(I)将HeLa (人体宫颈癌)和MCF_7(人体乳腺癌)各50mL放入含10%胎牛血清(FCS)、100U/mL青霉素、100 μ g/mL链霉素及I %谷氨酰胺的DMEM培养基，培养条件是:37°C>5% CO2、饱和湿度，每48小时传代一次，取对数生长期细胞用于实验。(2)分别在HeLa和MCF-7细胞系中加入不同浓度复合纳米粒子的PBS溶液配成含有0、1、10、30、5(^8/1^样品的细胞培养基，在371:孵育3h，然后将孵育过的两组细胞用PBS缓冲液洗三次，再将其悬浮于PBS缓冲液中(I X 106cells/mL)，准备测试磁共振成像。(3)将(2)吞噬了复合纳米粒子的细胞在浓硝酸和高氯酸的混合酸(摩尔比为4: I)中加热到90°C，蒸干，瓶底出现白色结晶后，用水溶解，定容，测试铁离子的浓度，计算出每个细胞吞噬铁离子的质量。(4)将不同浓度的复合纳米粒子样品置分别0.5T和3.0T磁共振成像两个中磁场下按下列参数扫描T1加权成像。结果显示:复合纳米材料具有较高的纵向弛豫率:在3.0T磁场下，Γι为
1.47mM_1s_1 ;在0.5T磁场下,!T1为2.1mlT1S'可以进行良好的T1磁共振成像(见图3 \加权成像图)和荧光成像(见图2暗场的荧光成像照片)，图4为每个细胞吞噬铁离子质量的对比图。两种功能的成像优势的结合提高了检测肿瘤细胞的灵敏度和准确度。实施例8
以合成多肽(A54)修饰的纳米复合材料进行肝癌的光热治疗(I)使用参考文献[Journal of Nanoparticle Research.2009,11:1321]方法制备A54合成多肽，向ImL的复合纳米离子水溶液中(1.68 X IO11个/mL)加入100 μ L的多肽水溶液(100 μ Μ)。合液在常温下轻微搅拌3小时，然后使用截留分子量(MWCO) 3000的超滤离心管离心除去未反应的多肽Α54，最后将修饰好的GNs分散于ImL去离子水中，储藏在4 °C冰箱中备用。(2)肝癌细胞BEL-7404在37°C下含有5%0)2潮湿的环境中培养，使用RPMI 1640培养基，培养基中含有10%胎牛血清(FBS)和1%双抗。当细胞在培养皿中覆盖到80%的面积以后，移去培养基，PBS洗净残存的血清后，加入ImL的0.1 %胰酶消化溶液，培养箱中消化1-3分钟。(3)将⑵接种于覆有盖玻片的12孔培养板中，每孔接种2.5X IO5个细胞，在37°C下含有5%浓度CO2潮湿空气环境中培养24小时后，弃去原培养基，加入lmLA54@纳米复合粒子(3.0X 101°个/mL)的培养基，在37°C下含有5%浓度CO2潮湿空气环境中继续培养3小时后弃去培养液，用PBS (pH = 7.4)对盖玻片冲洗3次后备用。(4)将(3)用近红外激光器(1.07W、807nm)在距盖玻片Icm中心处垂直照射7分钟，取出盖玻片后，用PBS (pH = 7.4)小心冲洗以后，用95%乙醇来固化30分钟，用1%冰醋酸浸泡30秒,备用。(5)将(4)置于 100 μ g/mL浓度的AO溶液中染色15分钟，用PBS (pH = 4.8)小心冲洗，浸入0.1M氯化钙 溶液45秒，再用PBS (pH = 7.4)洗涤后，铺盖于载玻片上。结果显示:图5是未受到近红外激光照射的荧光显微镜照片，图6受到近红外激光照射后荧光显微镜照片。细胞在激光照射后，细胞上富集大量的纳米复合粒子，使周围的环境升温(> 50°C )，造成大部分的细胞坏死。纳米复合材料进行肝癌的光热治疗。实施例9阿霉素修饰的纳米复合材料进行肝癌的靶向药物治疗(I)参考文献[Biomacromolecules.2010，11:2094]的方法合成 Cys-PEG-Dox，将PEG2000 (10.0g，IOmmol)和新蒸吡啶(3.955g,50mmol)加入 70mL 的二氯甲烷(DCM)溶液中，氮气保护，冰浴下将溶解在IOmL DCM中p_NPC(8.07g,40mmol)逐滴加入，常温反应24小时，用预冷的冰乙醚重沉淀，真空干燥后备用。(2)将胱胺盐酸盐(0.612g，2.72mmol)和 ΤΕΑ(0.568g，5.61mmol)溶解于 5mL 的DMF中，在常温氮气保护，将(1)PEG-NPC(2.787g，0.540mmol)的DMF溶液(IOmL)逐滴加入到烧瓶中，反应12小时，使用预冷的冰乙醚重沉淀两次后真空干燥得Cys-PEG-NPC粗产品。(3)将(2) Cys-PEG-NPC (0.2g, 0.08mmol)溶解在 IOmL DMSO 中，再加入 50mg 的盐酸阿霉素(0.08mmol)和57 μ L TEA，氮气保护，常温反应48小时后，加入30mL水溶液，使用截留分子量1000的透析袋透析3天，冷冻干燥得到Cys-PEG-Dox干粉。(4)将(3)水溶液ImM加入IOmM DTT，生成SH-PEG-Dox，用截留分子量1000的透析袋透析,加入到ImL复合纳米颗粒(1.68X IO11个/mL)水溶液中，常温搅拌3小时，离心分离，将修饰好的DoxO复合纳米材料分散于ImL去离子水中，储藏在4°C冰箱中备用。(5)阿霉素体外释放测定参照文献[J Mater Chem.2009，19:7879]方法进行体外药物释放测定，取二份20mg的Cys-PEG-Dox样品，加IOOml水，装入截留分子量1000的透析袋中，分别置于盛有50mL醋酸盐缓冲溶液(pH 5.3)和磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)离心管中。然后将其置于恒温振动箱中，37°C,40°C,43°C, IOOrpm转速条件下,定时取ImL释放液,并立即补加等量的缓冲溶液。结果显示:复合材料具有很好的药物温控释放性。实施例10阿霉素修饰的纳米复合材料进行肝癌体外的热疗-化疗(1)将实施例3中(4)与碘化丙陡(PI)直接在37°C培养6小时后。(2)将(1)与DoxOGNs共培养的BEL-7402在43°C培养30分钟后，再在37°C培养
5.5小时备用。(3)将(2)使用PBS洗涤3次，洗去未粘附到细胞上的DoxO复合纳米材料，用4%的多聚甲醛溶液固15分钟，最后使用封片剂封片，置于荧光显微镜下观察拍照。(4)将⑵使用PBS洗涤3次，PI染色，封片剂封片，置于荧光显微镜下观察拍照。结果显示:光学照片可见细胞明显出现出芽起泡的现象，少许细胞由梭形变园。PI染色的荧光照片可见只有少量细胞显红色荧光。流式细胞检测结果表明:相比未经热处理的对照组，热疗组凋亡 的和死亡细胞量增加了 16%左右。证明了热处理可以有效增强阿霉素化疗的疗效，同时由于纳米核壳复合材料的简便的和可控制的加热作用(肿瘤部位)，既可以降低对正常细胞的伤害，又增加对肿瘤细胞的伤害，是极具潜力的肿瘤治疗新方法。
权利要求
1.一种基于癌症早期检测诊治一体的复合纳米新材料，其特征在于:所述的复合纳米新材料为金纳米笼/纳米氧化铁，纳米氧化铁填充在中空金纳米笼内，外层用生物分子封装，生物分子表面修饰有生物靶向分子；所述的金纳米颗粒为中空金纳米笼或中空金纳米立方盒；所述的纳米氧化铁为纳米四氧化三铁、三氧化二铁或二者混合物。
2.根据权利要求1所述的基于癌症早期检测诊治一体的复合纳米新材料，其特征在于:纳米氧化铁粒径4-1000nm,金纳米笼粒径10-2000nm。
3.根据权利要求1所述的基于癌症早期检测诊治一体的复合纳米新材料，其特征在于:生物分子包括:二氧化硅、2，3- 二巯基丁二酸(DMSA)、PEDOT/PSS [poly (3，4-ethylenedioxythiophene)poly(styrenesulfonate)]> PDADMAC (poly dialIyIdimethylammonium chioride)、聚乙二醇(PEG)、己二酸、聚乙二醇单甲醚(mPEG)、聚乙烯醇、葡聚糖、氨基酸、肽分子、DNA分子、生物素-亲和素、抗体-抗原。
4.根据权利要求1所述的基于癌症早期检测诊治一体的复合纳米新材料，其特征在于:生物靶向分子包括:壳聚糖、叶酸、氨基酸、肽分子、DNA分子、生物素-亲和素、抗体-抗原。
5.一种如权利要求1所述的基于癌症早期检测诊治一体的复合纳米新材料的制备方法，其特征在于:具体步骤如下: (1)、以银纳米立方体为模板,加入AuCV和AuCV，制备出中空金纳米立方盒状颗粒(nanoboxes)和中空多孔金纳米笼状颗粒(nanocages),将中空金纳米立方盒状颗粒用H2O2腐蚀，得到消角的中空金纳米立方盒状颗粒； (2)、在步骤(I)得到的中空金纳米立方盒状颗粒和中空多孔金纳米笼状颗粒溶液中加入 0.02molFeCl2.6Η20 溶于 200mL 去离子水和 FeCl3.4Η20，Fe3+ 与 Fe2+ 的摩尔比是 1.75，快速搅拌反应前驱物溶液，超声振荡，确保Fe2+和Fe3+溶液能进入中空的金纳米笼或金纳米立方盒粒子空腔内，然后再快速加入30ml氨水或氢氧化钠，纳米氧化铁在金纳米立方盒或多孔金纳米笼内部成核,生长； (3)、在步骤(2)反应液中加入分散剂葡聚糖、壳聚糖、淀粉、明胶、聚乙二醇、油酸、白蛋白或乳胶表面活性剂，调控纳米氧化铁的粒径，使得纳米氧化铁的粒径大于金纳米笼或金纳米立方盒孔径，得到在金纳米笼或金纳米立方盒内生长的纳米氧化铁就被装载在金纳米笼的空心笼芯或金纳米立方盒内，将金纳米笼外面的纳米氧化铁经多次洗涤后去掉，干燥后得到复合纳米颗粒； (4)、将步骤(3)得到的复合纳米颗粒用生物分子封装，得到金纳米笼/纳米氧化铁颗粒; (5)、将步骤(4)得到的金纳米笼/纳米氧化铁颗粒与生物靶向分子反应，得到用于基于癌症早期检测、诊治一体的复合纳米新材料。
6.根据权利要求5所述的基于癌症早期检测诊治一体的复合纳米新材料的制备方法，其特征在于:纳米氧化铁被包覆在中空金纳米笼内部。
7.根据权利要求5所述的基于癌症早期检测诊治一体的复合纳米新材料的制备方法，其特征在于:生物探针分子被包覆在中空金纳米笼或中空金纳米立方盒内部；生物探针分子为荧光染料Cy5或卟啉。
全文摘要
本发明提出了一种基于癌症早期检测诊治一体的复合纳米新材料及制备方法，利用金纳米笼(金纳米盒)与纳米氧化铁纳米进行组装，合成金纳米笼(盒)/纳米氧化铁复合粒子，并且采用由外到内的组装方法，首先制备金纳米笼(盒)，其次氧化铁在金纳米笼(盒)内成核长大，通过表面活性剂(如葡聚糖等)得到单分散的纳米氧化铁，用生物分子封装，得到金纳米笼(盒)/纳米氧化铁复合粒子，最后用生物靶向分子(抗体或DNA分子)进行表面修饰，用于肿瘤的磁共振成像、荧光成像、暗场成像、特异性靶向多功能的诊断，光热治疗和作为靶向药物载体。
文档编号A61K47/02GK103157118SQ20111041044
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月9日 优先权日2011年12月9日
发明者杨玉东 申请人:沈阳工业大学