专利名称：中药腊肠豆及其提取物的制药用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药的用途，具体而言，本发明涉及中药腊肠豆及其提取物的用途，属于中药领域。
背景技术：
艾滋病(AIDS)是由人免疫缺陷病毒(HIV)引起的慢性传染病。HIV主要侵犯、破坏T4淋巴细胞，导致机体细胞免疫功能受损,最终并发各种机会性感染和肿瘤。艾滋病严重地威胁着人类的生存，已引起世界卫生组织及各国政府的高度重视。艾滋病在世界范围内的传播越来越迅猛，严重威胁着人类的健康和社会的发展，已成为威胁人们健康的第四大杀手。联合国艾滋病规划署2006年5月30日宣布自1981年6月首次确认艾滋病以来，25年间全球累计有6500万人感染艾滋病毒，其中250万人死亡。到2005年底，全球共有3860万名艾滋病病毒感染者，当年新增艾滋病病毒感染者410万人，另有280万人死于艾滋病。据联合国艾滋病规划署《2008艾滋病流行状况报告》指出，2007年，全球防治艾滋病的努力取得了显著进展，艾滋病流行首次呈现缓和局势，新增艾滋病毒感染者的数量以及因艾滋病死亡的人数都出现下降。2007年全球新增艾滋病毒感染者270万，比2001年下降了30万；因艾滋病死亡的人数为200万，比2001年下降20万。人类免疫缺陷病毒(Human Tmmuno deficiency Virus, HIV),顾名思义它会造成人类免疫系统的缺陷。1981年，人类免疫缺陷病毒在美国首次发现。它是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒(Lentivirus)，属反转录病毒的一种。至今无有效疗法的致命性传染病。该病毒破坏人体的免疫能力，导致免疫系统的失去抵抗力，而导致各种疾病及癌症得以在人体内生存，发展到最后，导致艾滋病(获得性免疫缺陷综合征)。目前已发现两种HIV病毒株系，分别为HIV-1和HIV-2。两者具有相似的病毒结构和传播途径。HIV-1广泛分布于世界各地，是引起全世界AIDS流行的病原，目前HIV的研究也是以HIV-1为主。自1981年发现首例艾滋病病例以来，世界各国的科学家们就致力于寻找抗艾滋病药物。随着人们对HIV病毒学和分子生物学等方面研究的深入。近年来随着人们对AIDS更深一步的了解以及对HIV-1感染机制的阐明，抗HIV的药物筛选模型逐步建立并取得很好的应用，是以病毒酶为目的靶标的筛选模型，主要分为以HIV蛋白酶，逆转录酶和整合酶为靶点的筛选模型。1986年,Kramer等首次报导HIV蛋白酶(protease)可作为潜在的艾滋病药物“革巴标，，。(Kramer RA.Sehaber MD, Skalla AM, et al.HTLV-1II gag protein is processed inyeas t cells by the virus pol protease[J].Science,1986,231 (4745): 1580-1584.)HIV蛋白酶是由两条相同的肽链组成的同质二聚体，具有C对称轴，每条肽链由99个氨基酸残基构成。HIV蛋白酶的活性中心位于两条肽链之间，由两个起催化的天冬氨酸(Asp 25和Asp 25’)组成。在这两个天冬氨酸残基的附近有一个水分子，在催化过程中此水分子作为亲核体。两个单体的相同的氨基酸残基构成与底物键合的缝隙，其一边由上述的两个天冬氨酸残基组成，另一边是由此二聚体形成的β_发卡式的结构。HIV蛋白酶在病毒复制过程中的主要作用是将gag和gag-pol基因产物裂解成病毒成熟所需要的结构蛋白(基质、壳、核壳)和酶类(蛋白酶、整合酶、逆转录酶)。虽然在体内抑制这种酶的活性，其子代病毒仍会产生，但却是不成熟和不具传染性的。因此抑制HIV蛋白酶，可阻止病毒进一步感染。目前人们已经制备了大量的肽类和非肽类HIV蛋白酶抑制剂。根据这一思路人们合成了多种HIV-1蛋白酶抑制剂，已有10个HIV-1蛋白酶抑制剂成功应用于临床，如沙奎那韦、利托那韦、印地那韦、奈非那韦、安普那韦、阿扎那韦、地瑞那韦等。由于HIV-1病毒易变异的特点，耐药性的问题也随之出现，而国际上使用的高效的抗逆转录病毒治疗(HAART，或称“鸡尾酒疗法”)并不能根除体内的病毒，而长期的药物治疗也会带来一些副作用，且价格较高(每人每年高达15000美金)。因此，寻找新型HIV-1蛋白酶抑制剂和找到能有效抑制病毒、修复人体免疫力、低毒、廉价的抗HIV药物仍然是现阶段研究人员急需解决的问题。天然产物及其衍生物被用于治疗各种疾病由来已久。与合成药物相比而言，天然产物具有结构多样性，功能多样性，副作用低等优点，其中传统中药更是历经几千年医疗验证，因此从中筛选结构新颖，作用方式独特的HIV蛋白酶抑制剂具有很大意义。天然产物 又称次级代谢产物(Secondary Metabolites),具有结构的多样性和生物活性的多样性。天然产物及其衍生物在以往的疾病治疗中发挥了无可限量的作用，也是当今药物研发过程中最具潜力的资源之一(Newman DJ, Gragg GM, Snader KM.Nat ProdR印，2000，17(3):215-234 ；Lee K-H.J Nat Prod.2004,67(2):273-283)。现在对中药等传统药物、海洋生物以及微生物代谢过程中的天然产物研究方兴未艾，每年都会有大量结构新颖的化合物被发现提供出来，这些新颖化合物是合成方法所无法实现的药物和药物先导化合物的重要源泉，在新药和先导化合物的发现中起着重要作用。对于天然产物尤其是来源于中药等的天然产物的研究是很有必要的，因为中药在我国已有数千年应用的历史，是一个伟大的药物小分子化合物的宝库，因此从中药等天然产物中进行重要病毒或重要疾病相关靶蛋白抑制剂的筛选是很有必要的。腊肠豆为豆科植物腊肠豆(Cassia fistula L.)的果实。性味苦凉，清热解毒，理气润肠。治胃痛，疟疾，感冒，麻疹，水痘，便秘。已有不少专利公开中药可以作为潜在的抗艾滋病病毒药物，刘光明等在CN101982187A中公开核桃壳提取物、周英在CN101507778A中公开了茶叶提取物、戴好富等在CN101411796A中公开了槟榔提取物、陈光英等在CN101254224中公开了青梅提取物、吴南屏等在CN1850144中公开了金银花提取物、张兰珍在CN1255355中公开了叶下珠提取物均具有抗艾滋病病毒作用。除此之外，没有有关腊肠豆(Cassia fistula L.)在抗艾滋病药物中的应用，而且，以上的提取物也没有能最终确定其抗艾滋病病毒的活性成分。
发明内容
本发明选取Hiv-1蛋白酶作为靶标蛋白，通过体外酶活高通量筛选(HTS)作为初步筛选的活性评价方法筛选腊肠豆提取物，找出具备发展为具有全新抗艾滋病潜力的药物。根据本发明的一个方面，提供了中药腊肠豆在制备治疗艾滋病的药物中的用途，特别是提供了中药腊肠豆在制备抑制HIV-1蛋白酶的药物中的用途。
本文中的中药腊肠豆是豆科植物腊肠豆(Cassia fistula L.)的果实。本文中的腊肠豆为腊肠豆原生药材。本文中的中药腊肠豆提取物是水提取物或有机溶剂提取物，优选有机溶剂提取物，其中有机溶剂提取物优选为乙醇、乙酸乙酯、正丁醇或石油醚分别提取得到的提取物或者上述溶剂的两种以上先后提取得到的提取物。其中，乙醇优选95 %的乙醇。其中，腊肠豆的乙醇提取物由以下方法制备得到:取一定量的腊肠豆药材用95%乙醇进行回流提取，料药比例为2:1 20:1 (L/Kg)，每次提取I 8小时，共计提取三次。将提取液经过滤后减压蒸干得浸膏。本发明以HIV-1蛋白酶为靶点，从腊肠豆提取物中分离提纯出HIV-1蛋白酶抑制齐U。本发明提供的HIV-1蛋白酶抑制剂为自皮杉醇，其中自皮杉醇来自腊肠豆的95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物。本发明还提供了一种用于制备HIV-1蛋白酶抑制剂的药物组合物，该药物组合物是由所述的腊肠豆原生药材或其有机溶剂提取物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。以上述中药腊肠豆或其提取物为活性成分，与药学上可接受的辅助添加剂成分混合后，按相应的常规药物制剂方法，可以制备抑制HIV-1蛋白酶活性、预防和/或治疗艾滋病的药物。例如，与在口服制剂中可以被接受的崩解剂、赋形剂、润滑剂、粘合剂、填充剂等常用辅助添加成分混合后，按常规的操作方法和过程，可以制成为片剂、丸剂、胶囊剂或多种相应的缓释剂、控释剂等固体口服制剂形式的药物；与常规的增溶剂、乳化剂、润饰剂、起泡或消泡剂等表面活性剂、稀释剂、防腐剂、稳定剂、矫味剂、增稠剂等混合后，按相应的常规方法，可以制备成为合剂、糖浆、口服液等液体制剂形式的口服药物；与常规的悬浮剂、稳定剂、分散剂或调节溶液渗透压剂混合，按相应的常规方法，配置成注射液。进一步的，本发明 提供了该药物组合物的制备方法，包括以下步骤:(a)取一定量的腊肠豆，用1-3倍量的95%乙醇回流提取3次，合并提取液，浓缩得浸膏。(b)称取一定量步骤(a)中的浸膏，用蒸馏水分散，分别经过石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取得到石油醚层、乙酸乙酯层、正丁醇层和水层4部分，浓缩以后得相应的粗组分。(c)取步骤(b)所得的粗组分，进行HIV-1蛋白酶的抑制率测定。(d)利用硅胶柱层析、sephadex LH-20凝胶柱层析色谱法对步骤(C)测得的具有高活性的粗组分，做进一步分离。分离过程中遵循活性跟踪的原则只对有活性的部分进行分离纯化。(e)将纯化的单一组分进行核磁共振分析确认结构。(f)对步骤(e)确认的单一组分进行HIV-1蛋白酶抑制活性测定，确定IC5tl值。通过本发明的HIV-1蛋白酶抑制剂的筛选方案从腊肠豆中提取分离出了 HIV-1蛋白酶抑制剂，其中乙酸乙酯萃取层对HIV-1蛋白酶有明显的抑制活性，从中分离的二苯乙烯类化合物自皮杉醇对HIV-1蛋白酶的抑制活性IC5tl达59 μ M。按照本发明，可以将上述含有中药腊肠豆或其提取物，或中药腊肠豆及其提取物与其它具有预防和/或治疗艾滋病作用的西药或中药活性成分配伍组成的复方制剂，按照常规的制剂技术，制备成口服制剂或注射剂。
图1示出HIV-1蛋白酶抑制剂筛选模型的示意图。图2示出腊肠豆的95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物的分离纯化流程图。图3示出腊肠豆的95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物经过分离纯化后得到的八个部分的活性筛选结果。图4示出自皮杉醇抑制HIV-1蛋白酶的IC5tl曲线图。
具体实施例方式下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例1腊肠豆原生药药品与浸膏制备取中药腊肠豆为原生药，按常规方法粉碎，过筛，制成粒度为60 80目的腊肠豆细粉，灭菌，分装即成。称取2公斤腊肠豆细粉，用8升95%乙醇提取三次，每次回流3小时，合并有机相，浓缩后的浸膏165克。备用。实施例2HIV-1蛋白酶的表达、纯化、蛋白活性检测以及IC5tl值的测定
DHIV-1蛋白酶的表达、纯化:a)HIV-1蛋白酶片段的扩增及表达载体的构建设计引物PCR将HIV-1蛋白酶编码片段扩增，回收PCR产物及pET_l Ia载体用NdeI和BamH I酶切，回收目的片段，将酶切后的片段与线性化载体进行连接后转化E.col1.DH5a感受态细胞。挑取转化的克隆进行PCR鉴定，阳性克隆进行DNA测序。HIV-1蛋白酶的基因序列:
权利要求
1.中药腊肠豆在制备治疗艾滋病的药物中的用途。
2.中药腊肠豆在制备抑制HIV-1蛋白酶的药物中的用途。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的用途，其中所述腊肠豆为豆科植物腊肠豆(Cassia fistula L.)的果实。
4.根据权利要求1或2中任一项所述的用途，其中所述腊肠豆为腊肠豆的原生药材。
5.根据权利要求1或2中任一项所述的用途，其中所述腊肠豆经有机溶剂提取。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯、正丁醇或石油醚中的一种或多种。
7.根据权 利要求6所述的用途，其中乙醇浓度为95%。
全文摘要
本发明提供中药腊肠豆在制备治疗艾滋病的药物中的用途，特别是在制备抑制HIV-1蛋白酶的药物中的用途。本发明提供的腊肠豆乙酸乙酯萃取物对HIV-1蛋白酶活性的抑制率为83.4％，从腊肠豆中分离出来的白皮杉醇对HIV-1蛋白酶抑制活性的IC50值为59μM。
文档编号A61P31/18GK103156907SQ201110410429
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月9日 优先权日2011年12月9日
发明者陈卫强, 杨诚, 冯金磊, 张坛杰, 李金楠, 唐延婷, 郭宇 申请人:天津市国际生物医药联合研究院