专利名称：蒿属花粉变应原注射用疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明生物技术领域，具体涉及一种蒿属花粉变应原注射用疫苗及其制备方法。
背景技术：
人们对于变态反应疾病的认识始于“花粉热”，1911年科学家noon和freeman首次利用花粉提取液来治疗花粉热，变应原疾病治疗的历史从此开始。我国变应原的发展是 1956年协和医院耳鼻喉科主任张庆松教授从美国引进，并取得了突破性进展，发现了中国最重要的秋季型致敏花粉是蒿属(Artemisia)植物花粉，为发展中国自己的变应原，实现变应原本土化的道路提供依据。上世纪八十年代由叶世泰、乔秉善牵头全国数十家医院完成的中国气传致敏花粉调查显示，很多地区夏秋季空气中花粉含量最多的为蒿属花粉。赵京等在北京地区13 14岁儿童呼吸道过敏性疾病流行病学调查中发现蒿属花粉敏感者为5. 7%。此后，我国各地区对我国蒿属花粉过敏开展大量的临床流行病学调查，见如下。段志坚《呼和浩特市过敏原分布情况及临床分析》中显示呼和浩特市诱导过敏性鼻炎的主要变应原为蒿属花粉。张克生《呼和浩特地区气传与致敏花粉的探讨》结果显示呼和浩特地区的主要致敏花粉为蒿属花粉。孟和宝力高《呼和浩特市区秋季过敏性鼻炎人群过敏原检测分析》呼和浩特地区秋季主要过敏原为蒿属植物，艾蒿花粉，对尘螨、粉尘螨过敏者占一定比例。刘光辉《武汉城区花粉症患者主要致敏花粉的研究》；刘光辉、祝绒飞《武汉地区蒿属花粉分布及对过敏性鼻炎患者气道反应性的影响》蒿属花粉是武汉城区秋季主要致敏花粉之一。杨炯《武昌地区空气中主要致敏花粉调查》蒿属花粉为本地区夏秋季主要致敏花粉。董尚雄《湖北省荆门地区气传花粉与过敏性哮喘相关性》荆门市主要秋季致敏花粉为蒿属花粉。张宏誉《北京市气传蒿属花粉浓度调查》北京地区在蒿属花粉临床季节内，日平均浓度在100g/m3。赵艳《阿罗格点刺试验在变应性鼻炎病原诊断中的应用》蒿属花粉为荆门地区变应性鼻炎常见过敏原。曹绥平《变态反应性疾病201例致敏原分析》陕西省榆林地区主要致敏花粉为蒿属花粉。西安医科大学二附院呼吸内科《西安地区气传花粉动态的初步调查》西安地区秋季主要致敏花粉为蒿属花粉。山西医科大学第二医院魏秀兰《山西省1298例次变应原测定结果分析》蒿属花粉为山西地区儿童哮喘变态反应原主要因素。大同市第三人民医院变态反应科李国琴《大同地区240例花粉症抗原皮试及临床
3分析》大同地区致敏花粉源中蒿属花粉居首。军区兰州总医院变态反应室张兴勇《兰州地区2M例变应性鼻炎皮试结果分析》； 《兰州地区87例花粉症分析》；《空军某部群发性变态反应性鼻炎调查报告》；兰州军区医院胸内科陈琳《兰州地区气传花粉初步调查》兰州地区主要致敏花粉为蒿属花粉。《洛阳市区360例花粉症患者变应原分析》河南科技大学第三附属医院变态反应室，洛阳地区秋季诱导花粉症和哮喘症状的主要致敏花粉为蒿属花粉。十九冶医院贺鸿珍《马鞍山地区100例过敏性鼻炎病人的抗原及脱敏疗效观察》 马鞍山地区过敏性鼻炎致敏原主要吸入物为室内尘土、粉尘螨、蒿属花粉囊与多价霉菌。孙娟《气传致敏花粉区域性调查现状》我国八大地区均有蒿属花粉过敏。李全文《山东省三市空气中气传及致敏花粉调查》山东省济南、潍坊和烟台主要致敏花粉为蒿属花粉。以上蒿属花粉流行病学调查研究显示，蒿属花粉过敏广泛分布我国各个地区，在北方地区蒿属花粉是过敏性鼻炎和哮喘主要致病因素。蒿属(Artemisia)植物为1、2或多年生草本，稀灌木，常具浓烈香气，多有根状颈和营养枝。茎多直立，部分丛生状，有明显纵棱；植物常被绒毛；叶互生，绝大部分羽毛状分裂；头状花序小，基部常有小苞片；花异性，边缘花雌性，中央花两性。蒿属的花粉特征具有高度一致性，主要体现在花粉呈球形或近球形，极面观呈三裂圆形具三孔沟，赤道面观为圆形或椭圆形。多数种的染色体数目为2n = 18，少数种的染色体数目为2n = 36。其产于亚洲、欧洲及北美洲的温带、寒温带及亚热带地区。在北美洲和欧洲主要过敏的蒿属花粉为艾蒿花粉，我国蒿属花粉有186种44变种，遍布全国，西北，华北，东北及西南省区最多，华东， 华中，华南略少，多生于荒坡、旷野及路旁。协和医院变应原制备中心制备的大籽蒿花粉变应原注射液、黄花蒿花粉变应原注射液在国内各地数百家医院使用了几十年，有效的抑制了我国蒿属花粉过敏性鼻炎向过敏性哮喘的转变，有效的减轻了我国蒿属花粉过敏性病人哮喘的症状。现在变应原特异免疫治疗的方法主要分为皮下注射给药免疫治疗和舌下给药免疫治疗。皮下注射给药免疫治疗已有100年的历史，其安全性和有效性已经被得到证明。上世纪90年代初，变应原舌下滴剂疫苗诞生，1998年，WHO宣布了变应原舌下滴剂疫苗安全和有效。但是舌下给药免疫脱敏的方式相比皮下注射免疫给药，治疗周期长，短时间内疗效不显著，平均脱敏周期3 5年。在一个治疗周期中，舌下给药方式免疫脱敏给药的剂量是皮下注射给药量的100倍。所以皮下注射给药免疫脱敏的方式相比舌下给药，虽然病人依从性差，但治疗周期短，见效快，治疗费用低。所以两种给药方式是相辅相成。Al(OH)3K 剂广泛用于生物制品中，已被证明安全有效。Al (OH)3K剂是最早用于变应原疫苗中，也是目前在变应原疫苗使用最广泛的佐剂。其跟变应原吸附，使变应原在体内缓释，减少了病人注射次数，提高了治疗的有效性。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种治疗蒿属花粉过敏性疾病的疫
田ο
本发明的另一目的在于提供上述疫苗的制备方法。为了实现本发明目的，本发明提供了一种蒿属花粉变应原注射用疫苗，其含有蒿属花粉变应原和铝佐剂，其中蒿属花粉变应原为大籽蒿花粉、黄花蒿花粉和艾蒿花粉变应原。所述三种花粉变应原的总有效剂量浓度为lAU/ml 1000AU/ml，蛋白浓度
0.01 μ g/ml 50 μ g/ml。(Bradford法测蛋白浓度)。其中，大籽蒿花粉变应原活性范围为lAU/ml 1000AU/ml，蛋白浓度0. 01 μ g/ml 50 μ g/ml ；黄花蒿花粉变应原活性范围为lAU/ml 1000AU/ml，蛋白浓度0. 01 μ g/ml 50 μ g/ml ；艾蒿花粉变应原活性范围为 lAU/ml 1000AU/ml，蛋白浓度 0. 01 μ g/ml 50 μ g/ml。优选地，所述大籽蒿花粉变应原、黄花蒿花粉变应原和艾蒿花粉变应原按照活性等比例混合。所述铝佐剂含量为0. 0001 1. 25mg/ml。所述疫苗还包括氯化钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲盐和苯酚。优选地，该疫苗各成分配比如下三种花粉变应原的有效浓度为lAU/ml 1000AU/ml,0. 5% 1 %的NaCl，2mM 200mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲盐，0. 0001
1.25mg/ml 的 Al (OH)3,0. 2% 0. 5%的苯酚。本发明同时提供了一种治疗蒿属花粉过敏性疾病的药物，其包括大籽蒿花粉变应原、黄花蒿花粉变应原和艾蒿花粉变应原。所述药物还包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。本发明还提供了上述疫苗在制备治疗过敏性疾病的药物中的应用。所述的过敏性疾病选自过敏性哮喘、变应性鼻炎、过敏性皮炎和慢性荨麻疹。本发明还提供了制备上述疫苗的方法，其步骤如下(1)分别从大籽蒿花粉、黄花蒿花粉和艾蒿花粉中分离大籽蒿花粉变应原、黄花蒿花粉变应原和艾蒿花粉变应原。(2)将大籽蒿花粉变应原、黄花蒿花粉变应原和艾蒿花粉变应原冻干复溶后的原液按比例混合，添加Al (OH) 3佐剂4°C过夜吸附至终浓度为0. 0001-1. 25mg/ml，得治疗蒿属花粉过敏性疾病的注射用疫苗。所述大籽蒿花粉变应原、黄花蒿花粉变应原和艾蒿花粉变应原分离方法如下1)通过机械(吸尘器)采集或水培法分别收集大籽蒿花粉或黄花蒿花粉或艾蒿花粉，然后使用200 300目网筛除去灰尘等杂质，并对所收集花粉进行纯度检测，形态学与分子生物学鉴定。2)将1)所得到的花粉连续3 证用丙酮浸泡搅拌脱脂，每间隔30min搅拌 IOmin,更换新的丙酮连续脱脂3 5次，直到上清液为无色为止，将脱脂后的固体物自然干
O3)将脱脂后的大籽蒿花粉或黄花蒿花粉或艾蒿花粉以投料比1 10 1 50 (W V)加入50mM 500mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，4°C搅拌4 Mh。4)将提取后的提取液，6000rpm，4°C，离心15min。取上清8000rpm，4 °C，离心 30min后取上清。5)将离心分离后的离心液用8 μ m滤膜澄清过滤，再将粗提液经0. 45 μ m、 0. 22 μ m滤膜依次过滤。
6)将5)过滤后的提取液，用5KD超滤膜衡滤，直到滤出液上清为无色或滤出液的电导与超滤用缓冲液一致。用RSAT竞争免疫抑制法测定原液活性，其活性不低于 2000AU/ml。7)将超滤浓缩后原液加入终浓度为-10%甘露醇溶液后，按照冻干工艺条件，_45°C冻结，在lOPa-151^真空压力下，_30°C干燥，控制水分含量彡3%。。本发明制备蒿属花粉变应原注射用疫苗具有以下有益效果1、所选用的三种蒿属花粉变应原大籽蒿花粉变应原、黄花蒿花粉变应原和艾蒿花粉变应原是我国主要致敏的三种蒿属花粉变应原，其有效性高于单一的蒿属花粉变应原。三种蒿属花粉变应原联合的疫苗囊括了我国致敏蒿属花粉的主要变应原。2、吸附到Al(OH)3I，在体内起到了缓释的作用，提高了用药的有效性和安全性。3、变态反应疾病皮下注射免疫脱敏给药方式，相比舌下含服滴剂给药方式，见效快，治疗周期短。整个治疗周期给药剂量远小于舌下滴剂给药剂量(约100倍)，其治疗费用远远小于舌下滴剂给药免疫脱敏，减轻患者的医疗负担。4、本发明能够显著治疗过敏性皮炎、慢性荨麻疹、变应性鼻炎和过敏性哮喘等过敏性疾病。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1大籽蒿花粉变应原原液的制备1)通过机械(吸尘器)采集或水培法收集大籽蒿花粉，然后使用300目网筛除去灰尘等杂质，并对所收集花粉进行纯度检测，形态学与分子生物学鉴定。2)将1)所得到的花粉以体积比1 5加入丙酮，在室温间断搅拌下脱脂，每次池， 脱脂后丙酮无色，将脱脂后的固体物自然干燥至无丙酮味。3)将脱脂后的大籽蒿花粉IOOOg以投料比1 25(W V)加入25000ml 200mM
PH8. 0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，4°C搅拌Mh。4)将提取后的提取液，6000rpm, 4°C，离心15min。取上清8000rpm，4°C，离心30min
后取上清。5)将离心分离后的离心液用8 μ m滤膜澄清过滤，再将粗提液经0. 45 μ m、0. 22 μ m 滤膜依次过滤。6)将幻过滤后的提取液，用5KD超滤膜衡滤，直到滤出液上清为无色或滤出液的电导与超滤用缓冲液一致。将提取液超滤浓缩到原体积1/5，用RSAT竞争免疫抑制法测定原液活性，其活性不低于2000AU/ml。7)将超滤浓缩后原液加入终浓度为-10%甘露醇溶液后，按照冻干工艺条件，_45°C冻结，在lOPa-151^真空压力下，_30°C干燥，控制水分含量彡3%。实施例2黄花蒿花粉变应原原液的制备1)通过机械(吸尘器)采集或水培法收集黄花蒿花粉，然后使用300目网筛除去灰尘等杂质，并对所收集花粉进行纯度检测，形态学与分子生物学鉴定。2)将1)所得到的花粉以体积比1 5加入丙酮，在室温间断搅拌下脱脂，每次池， 脱脂后丙酮无色，将脱脂后的固体物自然干燥至无丙酮味。3)将脱脂后的黄花蒿花粉IOOOg以投料比1 25(W V)加入25000ml 200mM
PH8. 0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，4°C搅拌Mh。4)将提取后的提取液，6000rpm, 4°C，离心15min。取上清8000rpm，4°C，离心30min
后取上清。5)将离心分离后的离心液用8 μ m滤膜澄清过滤，再将粗提液经0. 45 μ m、0. 22 μ m 滤膜依次过滤。6)将幻过滤后的提取液，用5KD超滤膜衡滤，直到滤出液上清为无色或滤出液的电导与超滤用缓冲液一致。将提取液超滤浓缩到原来体积的1/5，用RSAT竞争免疫抑制法测定原液活性，其活性不低于2000AU/ml。7)将超滤浓缩后原液加入终浓度为-10%甘露醇溶液后，按照冻干工艺条件，_45°C冻结，在lOPa-151^真空压力下，_30°C干燥，控制水分含量彡3%。实施例3 艾蒿花粉变应原原液的制备1)通过机械(吸尘器)采集或水培法收集艾蒿花粉，然后使用300目网筛除去灰尘等杂质，并对所收集花粉进行纯度检测，形态学与分子生物学鉴定。2)将1)所得到的花粉以体积比1 5加入丙酮，在室温间断搅拌脱脂，每次3h， 直至脱脂后上清丙酮为无色，将脱脂后的固体物自然干燥至无丙酮味后称重。3)将脱脂后的艾蒿花粉IOOOg以投料比1 25(W V)加入25000ml200mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，4°C搅拌Mh。4)将提取后的提取液，6000rpm, 4°C，离心15min。取上清8000rpm，4°C，离心30min
后取上清。5)将离心分离后的离心液用8 μ m滤膜澄清过滤，再降粗提液经0. 45 μ m、0. 22 μ m 滤膜依次过滤。6)将幻过滤后的提取液，用5KD超滤膜衡滤，直到滤出液上清为无色或滤出液的电导与超滤用缓冲液一致。将提取液超滤浓缩到原来体积的1/5，用RSAT竞争免疫抑制法测定原液活性，其活性不低于2000AU/ml。7)将超滤浓缩后原液加入终浓度为-10%甘露醇溶液后，按照冻干工艺条件，_45°C冻结，在lOPa-151^真空压力下，_30°C干燥，控制水分含量彡3%。实施例4蒿属花粉变应原注射用疫苗的制备1)半成品的配制将大籽蒿花粉变应原冻干品、黄花蒿花粉变应原冻干品、艾蒿花粉变应原冻干品分别用50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液溶解配制为不低于2000AU/ml后混合，配制为不低于2000AU/ml蒿属花粉变应原原液，添加等体积2. 5mg/mlAl (OH) 34°C过夜搅拌吸附， 用50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液依次稀释为100AU/ml、10AU/ml、lAU/ml，添加终浓度为0. 4%的苯酚、终浓度为0. 5%的氯化钠，最终配制成1000AU/ml、100AU/ml、10AU/ml、 lAU/ml四个浓度的半成品。2)半成品分装
将检验合格的四个浓度的半成品，在无菌条件下分装到IOml西林瓶中，每瓶5ml。实施例5蒿属花粉变应原注射用疫苗制备过程的分步检测如表1所示，三种蒿属花粉变应原原液、混合后的原液、均为无异物、无沉淀的澄清液体，半成品为无异物的乳白色混悬液，无菌检查应均为阴性，无异常毒素，PH值为 7. 2-8. O0表1三种蒿属花粉变应原原液、混合后原液、半成品的检测结果
权利要求
1.一种蒿属花粉变应原注射用疫苗，其含有蒿属花粉变应原和铝佐剂，其中蒿属花粉变应原为大籽蒿花粉、黄花蒿花粉和艾蒿花粉变应原。
2.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述三种花粉变应原的总有效剂量浓度为 lAU/ml 1000AU/ml，蛋白浓度0. 01 μ g/ml 50 μ g/ml ；其中，大籽蒿花粉变应原活性范围lAU/ml 1000AU/ml，蛋白浓度0. 01 μ g/ml 50 μ g/ml ；黄花蒿花粉变应原活性范围为lAU/ml 1000AU/ml，蛋白浓度0. 01 μ g/ml 50 μ g/ml ；艾蒿花粉变应原活性范围为 lAU/ml 1000AU/ml，蛋白浓度 0. 01 μ g/ml 50 μ g/ml。
3.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述大籽蒿花粉变应原、黄花蒿花粉变应原和艾蒿花粉变应原按照活性等比例混合。
4.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述铝佐剂含量为0.0001 1. 25mg/ml。
5.如权利要求1 4任意一项所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗还包括氯化钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲盐和苯酚。
6.如权利要求5所述的疫苗，其特征在于，其中NaCl的浓度为0.5% 1%，磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲盐浓度为2mM 200mM，苯酚的浓度为0. 2% 0. 5%。
7.一种治疗蒿属花粉过敏性疾病的药物，其特征在于，包括大籽蒿花粉变应原、黄花蒿花粉变应原和艾蒿花粉变应原。
8.如权利要求7所述的药物，其特征在于，还包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。
9.一种制备权利要求1 6任意一项所述疫苗的方法，其步骤如下(1)分别从大籽蒿花粉、黄花蒿花粉和艾蒿花粉中分离大籽蒿花粉变应原、黄花蒿花粉变应原和艾蒿花粉变应原。(2)将大籽蒿花粉变应原、黄花蒿花粉变应原和艾蒿花粉变应原冻干复溶后的原液按比例混合，添加疫苗佐剂，得治疗蒿属花粉过敏性疾病的注射用疫苗。
10.权利要求1 6任一项所述的疫苗在制备治疗过敏性疾病的药物中的应用，其特征在于，所述的过敏性疾病选自过敏性哮喘、变应性鼻炎、过敏性皮炎和慢性荨麻疹。
全文摘要
本发明涉及一种蒿属花粉变应原注射用疫苗，其含有蒿属花粉变应原和铝佐剂，其中蒿属花粉变应原为大籽蒿花粉、黄花蒿花粉和艾蒿花粉变应原。本发明能够显著治疗过敏性皮炎、慢性荨麻疹、变应性鼻炎和过敏性哮喘等过敏性疾病。
文档编号A61P11/02GK102512673SQ201110433658
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月21日 优先权日2011年12月21日
发明者乔秉善, 何立峰, 姜敏, 汤承祁, 牛占坡, 白彩明, 裴潇竹 申请人:北京新华联协和药业有限责任公司