新型小麦变应原的制作方法

专利名称：新型小麦变应原的制作方法
技术领域：
本发明涉及IgE-介导的变态反应的领域，特别是职业性哮喘如面包师哮喘 (baker‘ s asthma) 0本发明更具体地是涉及对新型小麦变应原的鉴定以及其在治疗和诊 断中的用途。本发明也涉及用于在哺乳动物中对IgE-介导的变态反应进行诊断和治疗的 方法。
背景技术：
来自小麦(普通小麦(Triticum aestivum))的变应原可引起三种不同的IgE-介 导的变态反应，由吸入小麦面粉而引起的呼吸道变态反应，由摄食小麦制品而引起的食物 变态反应以及属于禾本花粉(grass pollen)变态反应群组的小麦花粉变态反应。对小麦 面粉成分的变态反应性致敏是引起职业性哮喘的最常见的原因之一，大约1-10%的烤面包 工人受到影响，因此其被称作面包师哮喘。这些烤面包工人产生针对小麦面粉变应原以及 面粉诱导的哮喘和/或鼻炎的IgE抗体。对于面包师哮喘是真正的职业性疾病这一假设的 支持来源于如下发现，对于烤面包相关的变应原的致敏在暴露于面粉的人中的流行程度， 与作为对照的未暴露于面粉的人群相比高十倍。另外，对于已知的可在敏感人群中引起支 气管哮喘的小麦面粉的阈值的建立也是有可能的。最早的对面粉变态反应的系统性的研究 已在1993年由Baggoe所进行。其它早期的报道集中于对面包师哮喘病例的描述以及随后 的机理性研究，所述机理性研究证明了 IgE介导的机制在面包师哮喘中的重要性。其后又 有多次尝试通过免疫化学方法、RAST技术、免疫印迹以及近来通过分子克隆技术来鉴别引 发疾病的面粉变应原。普通小麦是禾本科的重要成员。高达40%的所有的变态反应的个体携有可与禾本 花粉变应原反应的血清IgE抗体。多个研究曾报道了由于小麦面粉和禾本花粉蛋白中共有 的IgE表位而造成的小麦面粉和禾本花粉之间的交叉反应性。禾本花粉变应原与小麦种子 变应原之间的交叉反应性也曾有描述，并且有证据表明，患有面包师哮喘和IgE介导的对 小麦的食物变态反应的患者可以识别不同的变应原，所述变应原可用于面包师哮喘、对小 麦的食物变态反应以及禾本花粉变态反应的差别诊断。然而，绝大多数可溶的小麦面粉变 应原仍未经鉴定。如今，只有少数几个小麦面粉变应原已经过鉴定和鉴别，并且其包括α 淀粉酶抑制剂家族成员、酰基辅酶A氧化酶、过氧化物酶、果糖二磷酸缩醛酶以及最近的硫 氧还蛋白。基于小麦面粉提取物的诊断并不能区分患有对小麦的呼吸道变态反应或者食物 变态反应的患者。因此，对于针对小麦的呼吸道变态反应的情况，精确的诊断仍旧依赖于具 体的吸入激发(challenge)，而对于疑似的食物变态反应，精确的诊断则依赖于双盲的、安 慰剂对照的食物激发(DBPCFC)，并且如下问题还未解决，即是否可能鉴定出变应原，其可用 于选择性的诊断和治疗各种由小麦诱导的变态反应的表现形式，比如面包师哮喘、食物变 态反应以及花粉病。因此有需要鉴定出新型变应原并建立方法和诊断性测试来具体地鉴定 出患有IgE-介导的变态反应的患者，比如呼吸道变态反应如面包师哮喘患者，从而将其与 患有食物变态反应和/或花粉变态反应的患者区分开。此外也需要使用此类小麦变应原来用于治疗IgE-介导的变态反应。本发明通过提供新型的小麦变应原及其在治疗和诊断中 的用途来达成这些需要。此外本发明提供了已知的肽和蛋白在治疗和诊断中的用途。这些 肽中的一些由如下处得知Gennaro S. D. et al, Biological Chemistry, April2005, 386 383-389 ；UNIPR0T 编号 P82977 ；UNIPR0T 编号 Q6W8Q2 ；US7, 214，786 和 US2006/0107345。发明概述如上所述，几个已经被鉴定鉴别出来的小麦面粉变应原包括α淀粉酶抑制剂家 族的成员、酰基辅酶A氧化酶、过氧化物酶、果糖二磷酸缩醛酶以及硫氧还蛋白。迄今为止 还没有已经鉴定出的变应原可用于选择性的诊断和治疗各种由小麦诱导的变态反应的表 现形式，比如面包师哮喘、食物变态反应以及花粉病。这引领本发明人去寻找另外的、仍未 鉴定出来的小麦变应原。本发明通过提供新型的小麦变应原以及用于在哺乳动物中对IgE-介导的变态反 应进行诊断和治疗的方法，至少满足了部分现有技术的需要。在第一个方面，本发明涉及代表新型小麦变应原的分离自小麦或者重组性地产生 的多肽，以及其片段或变体，所述片段或变体共享有抗体所针对的表位。所述分离的多肽包 含克隆#10、#112或#126的氨基酸序列。在第二个方面，本发明涉及编码本发明多肽的核酸，所述核酸具有克隆#10、#112 或#126的核苷酸序列。在另一方面，本发明涉及用于治疗和诊断的具有克隆标识符#10、#38、#112或 #126的多肽，其优选用于IgE-介导的变态反应的治疗和诊断，比如针对小麦面粉的呼吸道 变态反应如面包师哮喘。此外本发明涉及用于治疗和诊断的包含克隆#37氨基酸序列的分 离的多肽，其优选用于IgE-介导的变态反应的治疗和诊断，比如针对小麦面粉的呼吸道变 态反应如面包师哮喘。在又一个方面，本发明提供药物组合物，其包含具有克隆标识符#10、#38、#112、 #126或#37的多肽或其低变应原性的形式，该形式被修饰以便消除或减弱其IgE结合反 应；以及任选地包含药物学上可接受的赋形剂、载体、缓冲液和/或稀释剂。所述具有克隆 标识符#10、#38、#112、#126或#37的低变应原性形式的多肽可通过以下方法修饰该分 子的片段化(fragmentation)、截短(truncation)或串联(tandemerization)，内部区段 (segment)的删除，结构域重排，氨基酸残基的取代，二硫键的断裂。本发明的再一个方面涉及“掺有”多肽的变应原组合物，该多肽具有克隆标识符 #10、#38、#112、#126或#37。此变应原组合物可以是变应原提取物，或者是纯化的或重组 的变应原组分的混合物，所述组分不含或者含有很低含量的本发明所述多肽，在所述组合 物中加入所述多肽用于结合来自患者的IgE，所述患者的IgE不结合所述组合物中的其它 变应原组分或结合很弱。本发明的此方面也涉及生产此组合物的方法，该方法包含在变应 原组合物中加入具有克隆标识符#10、#38、#112、#126或#37的多肽的步骤，比如变应原提 取物(任选地掺有其它组分)或者纯化的天然或重组变应原组分的混合物。本发明的再一个方面涉及可以通过上述方法获得的变应原组合物。本发明进一步涉及用于对IgE-介导的变态反应进行体外诊断的方法，其包含如 下步骤将来自疑似具有IgE-介导的变态反应(比如对小麦面粉的呼吸道变态反应如面 包师哮喘)的哺乳动物的体液样品，如血液、血浆或血清样品，与所述具有克隆标识符#10、#38、#112、#126或#37的多肽接触，以及在所述样品中检测特异性地结合本发明的多肽的 IgE抗体的存在。可特异性地结合具有克隆标识符#10、#38、#112、#126或#37的多肽的此 类抗体的存在表明IgE-介导的变态反应。此方法的一个实施方案包含通过微阵列分析来 实现所述方法。本发明的再一个方面提供了试剂盒，其用于实施对IgE-介导的变态反应(比如对 小麦面粉的呼吸道变态反应如面包师哮喘)进行体外诊断的方法，所述试剂盒包含具有克 隆标识符#10、#38、#112、#126或#37的多肽，以及对IgE与所述多肽的结合进行检测的手 段，比如固体支持物如硝化纤维膜或者结合了具有克隆标识符#10、#38、#112、#126或#37 的多肽的微阵列。在又一个方面，本发明提供用于治疗哺乳动物中的IgE-介导的变态反应(比如对 小麦面粉的呼吸道变态反应如面包师哮喘)的方法。在一个实施方案中，该方法包含对易 受此治疗影响的个体施用具有克隆标识符#10、#38、#112、#126或#37的多肽，或者共享有 抗体所针对的表位的该多肽的片段或变体。在另一个实施方案中，该方法包含对易受此治 疗影响的个体施用依照前述方面的药物组合物。定义表 A克隆的定义 本发明多肽的变体和片段应当被理解为指的是具有至少10个氨基酸长度的蛋白 或肽，较优选的是至少25个，更优选的是至少50个或75个氨基酸残基并且与所述多肽的 序列相同性为至少50%，优选超过60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。在本发明中，经修饰的多肽应被理解为指的是经化学或遗传学修饰的多肽，从而 改变其免疫学特性，例如作为与本发明免疫治疗方面相关的例证。与所述多肽共享抗体所针对的表位的多肽的片段和变体应被理解为指的是这样 的片段和变体，即它们对IgE抗体的结合可显著地受所述多肽抑制，所述IgE抗体来自经本 发明多肽致敏化的有代表性的患者血清样品。此抑制试验可以依照例如实施例4中所公开 的方案来进行。经修饰的低变应原性多肽或者多肽的变体或片段应当被理解为指的是这样的经修饰的多肽或者多肽的变体或片段，即它们可通过例如依据实施例1的方案来测定其不能 够结合对所述多肽有活性的IgE抗体，所述IgE抗体来自具代表性的经多肽致敏化的患者 血清样品；或者可通过细胞激活试验如嗜碱性粒细胞组胺释放试验来测定其不显示或者显 示出显著降低的生物学变应原活性。所附图表简述表I显示了患有面包师哮喘的患者的人口统计、临床以及血清学特征。表II显示了患有对小麦的食物变态反应(F1-F4)和禾本花粉变态反应(G1-G4) 的患者的人口统计、临床以及血清学特征。表III显示了克隆10-衍生变应原和同源蛋白之间的氨基酸相同性的百分比， 其中标号1-30的蛋白为如下l.gi |122065237 (普通小麦，(Triticum aestivum))， 2. gi I 66356278 (普通小麦，(Triticum aestivum))，3. gi 1124122 (大麦(Hordeum vuIgare subsp. vulgare)), 4. gi | 48093360 ( 二倍体多年生类玉米(Zea diploperennis)), 5. gi I 48093418 (鸭茅状摩擦禾(Tripsacum dactyloides)) ,6. gi | 75994161 (小颖玉 米(Zea mays subsp. parviglumis)), 7. gi | 58396945 (稻[日本型培养组群](Oryza sativa[japonica cultivar-group])),8. gi1115649132( ^ 海月旦(Strongylocentrotus purpuratus)),9.giI 37904392( ^ || 短 _ 胃(Brachypodium distachyon)), 10. gi |26224744(葡萄柚(Citrus χ paradise))，11. gi | 224447 (蚕豆(Vicia f aba)), 12. gi 1124395862 (第四双小核草履虫(Paramecium tetraurelia))，13. gi | 50262213 (笋 jl (Cucurbita maxima)),14. gi|547743( ^M (Nicotiana sylvestris)), 15. gi I 54610713 (陆正蚓(Lumbricus terrestris))，16. gi 1169491 (马铃薯(Solanum tuberosum))，I7· giI 2I829O(光烟草 X 朗氏烟草(Nicotiana glauca χ Nicotiana langsdorffii)),18. gi1124121 (赤豆(Vigna angularis)),19. gi|603890 (西洋接骨 ^ (Sambucus nigra)),20. gi114718445( 薯(Ipomoea batatas)),21. gi1114950( ^ 瓜(Momordica charantia))，22. gi 1109138554 (普通养麦(Fagopyrum esculentum))， 23. gi 118404883 (拟南芥(Arabidopsis thaiiana))，24. gi | 27734408 (狭刀豆(Canavalia Iineate)) ,25. gi | 37901103 (巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)), 26. gi | 92874842 (蒺 BM^ (Medicago truncatula)),27. gi113959383 ( M (Linumusitatissimum)), 28. gi I 22759723 (百日草(Zinnia elegans))，29. gi | 37359345 (葡萄(Vitis vinifera)) and 30. gi | 6453287 ( ^Ρ ^· (Amaranthus hypochondriacus))。表IV显示了实施例2的面包师哮喘患者的临床数据。表V显示了实施例2的食物和禾本花粉变态反应患者的临床数据。表VI 显示了用于扩增克隆 #10、#38、#112、#123、#126 和 #37 cDNA 的 PCR 引物。表VII.患有面包师哮喘的患者的人口统计、临床以及血清学特征。表VIII.患有禾本花粉变态反应的患者的人口统计、临床以及血清学特征。表IX.患有对小麦的食物变态反应的患者的人口统计、临床以及血清学特征。

图1示出了所述克隆10-衍生变应原的核苷酸以及所推断出的氨基酸序列。编码 和非编码区域分别是大写和小写字母，起始(ATG)和终止密码子用下划线画出。马铃薯抑 制剂家族特征序列的氨基酸以灰色背景打印。左手边的数字是用于核苷酸而右手边的数字 用于氨基酸。该序列已被以编号(EU051824)提交至GenBank。
图2示出了纯化的丝氨酸蛋白酶抑制剂样变应原的鉴别。A，含有纯化的克隆 10-衍生变应原的考马斯亮蓝染色SDS-PAGE。分子量标准参照物(kDa)显示在左边。B，所 述纯化的克隆10-衍生变应原的质谱。质荷比显示在χ-轴上，而将强度作为所研究的质 量范围内获得的最强信号的百分比而展示在y-轴上。C，所述纯化的克隆10-衍生变应原 的远紫外圆二色性(CD)分析，波谱以平均残基椭圆率(θ ) (y-轴)来表示，在给定的波长 (χ-轴)记录于25°C (粗线)、95°C (常规线)以及冷却后的25°C (虚线)。图3示出了患有面包师哮喘、禾本花粉变态反应以及食物变态反应的患者IgE的 反应性。将纯化的克隆10-衍生变应原，HSA、rPhl ρUrPhl p5、rPhl p7、rPhl pl2、小麦 花粉提取物和小麦种子提取物点到硝化纤维膜测试条上，并将其与下述一起温育来自22 个面包师哮喘患者(1-22)的血清、4个禾本花粉变态反应患者(G1-G4)的血清、4个患有对 小麦的食物变态反应的患者(F1-F4)血清、1个非变态反应个体(NC)的血清以及未加入血 清的缓冲液(B)。附着的IgE抗体通过125I-标记的抗-人IgE抗体来检测并通过放射自显 影来显示。图4是IgG亚类对克隆10-衍生变应原的反应性的箱线图(box plot)表示。对 于患有面包师哮喘的患者(η = 22)，IgGp4亚类对克隆10-衍生变应原的反应性通过ELISA 来测定并且展示为箱线图，其中50%的数值在箱体内并且非异常值(non-outliers)位于 条棒(bar)之间。箱体内的线象征中位值(median value)，圆圈是异常值以及星是极端值。图5示出了所述克隆10-衍生变应原的变应原活性。RBL细胞与来自三个面包师 哮喘患者(#2、#4、#12)的血清IgE —起装载，或者与非变态反应患者(NC)的血清一起装 载，接着用重组的克隆10-衍生变应原或者梯牧草花粉变应原rPhl pi来进行激发。平均 氨基己糖苷酶的释放作为扣除了自然释放的百分比后的总释放的百分比而显示在y_轴。图6显示了在种子成熟期间，种子中丝氨酸蛋白酶抑制剂样变应原的表达。对于 来自未成熟(第7、10、15、20、25、30、35天)和成熟(M)的小麦种子的经硝化纤维印迹的小 麦提取物，用特异于克隆10-衍生变应原的兔抗体来进行探测，而为了对照的目的，则用相 应的免疫前血清进行。分子量在左侧以千道尔顿(kDa)示出。图7显示了对小麦花粉和种子提取物中的克隆10-衍生变应原的鉴定。经硝化 纤维印迹的提取物使用特异于克隆10-衍生变应原的兔抗体(20)、特异于小麦抑制蛋白 (profilin)的抗体(1#123)、特异于螨变应原的(NC)，或者使用未加入兔抗体的缓冲液来 进行探测。所述相应的免疫前血清分别被称作P#10和P#123。附着的IgG抗体通过125I-标 记的驴抗-兔抗体来检测，并通过放射自显影来显示。分子量标准参照物(kDa)在左侧示 出ο图8示出了对来自小麦种子、稻米、玉米、豆和马铃薯的提取物中的丝氨酸蛋白酶 抑制剂样变应原的检测。A，含有来自小麦(W)、稻米(R)、玉米(M)、扁豆⑶和马铃薯⑵ 的提取物考马斯亮蓝染色的凝胶。B，硝化纤维印迹的提取物暴露于兔免疫前血清，以及C， 特异于克隆10-衍生变应原的兔抗体。分子量(kDa)示于左侧。图9通过透射免疫金电子显微镜显示了小麦种子中克隆10-衍生变应原的定位。 A和B，小麦颗粒横截面的低倍放大(A)和高倍放大(B)。A显示了果实和种子的皮(C)，糊 粉层(AL)以及淀粉胚乳(SE)。A中的长方形指示出了可与B显示的区域相比较的区域，即 糊粉层和淀粉胚乳之间的边界。B中的长方形分别指示出了在C、D和E、F中高倍放大显示的区域。C和D，通过使用兔抗-克隆10衍生的Ig(C)或免疫前Ig(D)来探测的小麦种子 糊粉细胞的细节。E和F，使用兔抗-克隆10衍生的Ig(E)或免疫前Ig(F)对小麦蛋白10 进行免疫金定位后的所述淀粉胚乳的高倍放大显微照片。附着的兔抗体使用金-缀合的山 羊抗-兔Ig抗血清(金粒子=黑点)来进行检测。箭头指向胶体金粒子。条线(bar)代 表=A, 20 μ m ;B，5 μ m ；C-F, 0. 5 μ m0 AG,糊粉颗粒；AL,糊粉层；C,多层的果实和种子的皮； CY细胞质材料；L，脂质小体；M，线粒体；SE，淀粉胚乳；SG，淀粉粒；W，细胞壁。图10.患有面包师哮喘的患者的IgE斑点印迹。图11.患有对小麦变态反应和禾本花粉变态反应的患者的IgE斑点印迹。图12.变应原微阵列。A，经微阵列的蛋白和小麦花粉提取物。重组小麦蛋白被指 定为10、37、38、112、123、126 ；WP 小麦花粉提取物；重组梯牧草花粉变应原Phl ρ UPhl P 5、Phl ρ 7以及Phl ρ 12。底部的方框中的数字指示出位置标记(position marker) 0 B与C，与血清温育后的微阵列图片以及用荧光团缀合的抗-IgE抗体来对IgE-反应性斑点 进行检测。B，在与来自非变态反应个体的血清温育后的图片。C，与来自患有面包师哮喘的 (1 :B4)、小麦诱导的食物变态反应的(2 :F6)、禾本花粉变态反应的(3 :G16)有代表性的患 者的血清温育后图片。在玻片(slide)底部上的点指示了位置标记，其是使用荧光团缀合 的抗-IgE抗体而检测出来的纯化的IgE抗体。图13.针对小麦种子蛋白、小麦花粉提取物以及禾本花粉变应原的IgE反应性的 普及性(prevalence)。具有IgE反应性的患者的百分比在y-轴显示，对于面包师哮喘(A) (η = 23)，对小麦的食物变态反应(B) (η = 38)以及禾本花粉变态反应(C) (η =17)。而 χ-轴显示了经测试的重组小麦蛋白#10、#37、#38、#112、#123和#126，小麦花粉提取物，重 组禾本花粉变应原Phl ρ UPhl p5、Phl ρ 7以及Phl ρ 12，包含所有重组小麦蛋白的“小 麦混合物”，小麦面粉以及用于测量IgE反应性的梯牧草CAP。发明详述下面的实施例通过对本发明所述多肽的分离和使用来说明本发明。所述实施例只 是作为例证而不应当被认为是在对本发明进行限制，本发明是由所附的权利要求的范围来 限定的。所述实施例中提到的克隆#123是抑制蛋白(prof il in)，可从例如US 7，214786处了解。实施例1 新型小麦变应原克隆#10实施例1显示了对新型小麦种子变应原克隆#10的鉴定和鉴别，其属于丝氨酸蛋 白酶抑制剂的马铃薯抑制剂家族，此家族与其他蛋白酶抑制剂一起被称作致病相关蛋白 (PR)，PR6家族。克隆#10是PR6家族经过鉴定和描述的第一个变应原。此外实施例1显 示了重组的克隆10衍生变应原的表达和纯化。克隆#10由来自面包师哮喘患者血清的IgE特异性地识别，但在使用来自对小麦 的变态反应、腹腔疾病或禾本花粉变态反应的患者的血清进行测试时却并未显示出IgE反 应性。因此所述克隆10衍生的变应原与其它小麦变应原一起可以用于建立诊断测试，所述 测试将允许特异性地鉴定出患有IgE-介导的面包师哮喘的患者并且将这些患者与患有食 物或花粉变态反应的患者区别开来。技术生物材料、患者的血清和抗体
来自普通小麦Mi chae 1栽培变种的小麦种子从0sterreichische Agentur fur Gesundheit undErn^hrungssicherheit GmbH获得并且在温室内种植。未成熟的种子在授 粉起始之后的第7、10、15、20、25、30、35天被直接收集入液氮中并在-80°c保存直至使用。 小麦花粉从Allergon(Valingej^W)获得。稻米、玉米、豆和马铃薯在本地市场购得。重 组Phl P UPhl P 5, Phl p7以及Phl ρ 12购自BIOMAY (维也纳，奥地利)而人血清白蛋 白(HSA)购自Behring(Marburg，德国)。血清得自22个患有面包师哮喘的患者。面包师 哮喘是在阳性病例、特异于小麦和黑麦花粉的IgE的基础上通过CAP-FEIA系统(Phadia， Uppsala，瑞典)诊断的，而且包括了特异的吸入激发测试用于对临床相关的致敏进行确认
(1)。这些患者的人口统计、临床以及血清学数据在表I中进行了总结。另外，在所述试验内 也包括来自非变态反应个体的血清，来自未患有面包师哮喘但是血清IgE对小麦和黑麦花 粉有反应性并对小麦变态反应的4个患者以及对禾本花粉变态反应的4个患者的血清(表 II)。将来自禾本花粉变态反应患者的血清通过CPA-FEIA系统(Phadia)对其总的血清IgE 水平以及IgE特异的梯牧草花粉进行了分析，而对小麦的食物变态反应患者按照此前所述
(2)进行鉴别。所述克隆10衍生变应原对面包师哮喘的特异性通过用芯片分析来测试了另 外的来自以下患者的血清而得到了确认，20个腹腔疾病患者、119个食物变态反应患者、23 个禾本花粉变态反应患者和25个面包师哮喘患者(Constantin et al，未发表)。针对所述克隆10衍生变应原的特异性兔抗体是通过对兔每隔一个月用纯化的克 隆10衍生变应原(每次注射200μ g)进行免疫接种来培育的，所述免疫接种使用一次弗氏 完全佐剂和两次IFA(Chades River，Kisslegg，德国)。免疫前血清在免疫接种前从兔获 得。为了对照的目的，使用了特异于房尘螨(house dust mite)变应原的兔免疫血清和特 异于小麦抑制蛋白的兔抗血清。对来自小麦种子的Agtll cDNA文库的构建按照Yeh (3)的方法从小麦种子提取总RNA，在授粉起始25天之后收集，并保存 于-80°C。接着将RNA沉淀粒(pellet)溶于异硫氰酸胍缓冲液(4M异硫氰酸胍，0. 83% ν/ ν 3Μ醋酸钠，ρΗ 6,IlmM β-巯基乙醇)并通过氯化铯密度梯度超速离心进行纯化(4)。通 过寡脱氧胸苷酸纤维素亲和层析(Nucleo Trap mRNA ；Machery-Nagel)来分离聚-A+RNA，以 及用 cDNA 合成试齐[J盒(cDNA synthesis System ；Roche Diagnostics, Mannheim)来合成 双链 cDNA。在用 EcoRI 甲基化酶(New England Biolabs,Beverly,ΜΑ)甲基化之后，EcoRI 连接体(New England Biolabs)被加到所述cDNA。加了连接体的cDNA用EcoRI (Roche Diagnostics)进行消化。经消化的连接物用Nick柱(Pharmacia Biotech，Uppsala，瑞典) 去除并且所述cDNA被连接到Xgtll的臂(Stratagene，La Jolla, CA，美国)上。该连接 作用的产物在体外群集(pack) (Gigapack III Gold Cloning Kit, Stratagene)而导致产 生具有2. 43 X IO6PFU的λ gtll表达cDNA文库。对来自小麦种子cDNA文库的IgE-反应性克隆的分离和鉴别将大肠杆菌(E. coli)Y1090用7X IO5PFU的重组噬菌体感染并且用4个患有面包 师哮喘的患者血清IgE进行免疫筛选，如(5)所述。选出15个IgE-反应性噬菌体克隆用 于进一步的再克隆(re-cloning)并且将其DNA通过Platinum PCR Supermix(Invitrogen, Life Technolgies)使用 λ gtll 引物进行 PCR-扩增并测序(MWG, Ebersberg，德国)。
所获得的序列与提交至1J National Center for Biotechnology Information(NCBI)的GenBank数据库的序列进行对比。使用NCBI的所述GenBank数据库进行多重序列 排比。Clustal W多重排比工具被用于氨基酸序列相同性。使用ExPASy蛋白质组学 服务器的PR0SITE工具来进行继续搜寻，ExPASy的ProtParam工具被用于氨基酸的组 成。溶剂可接近性(solvent accessibility)与二级结构预测通过使用来自Columbia University Bioinformatics Center 的 PROT 软件进行计算。使用由 Max Planck Institute for Molecular Genetics |白勺“Multipl e Alignment and Phylogenetic Tree
Reconstruction”软件，在所述克隆10衍生的变应原的氨基酸序列以及同源蛋白的基础上 重建了进化系统树。所述克隆10衍生的变应原的表达和纯化克隆10 cDNA的编码区通过使用下列引物对的PCR进行扩增正向5，-CATATGAGCC CTGTGGTGAAGMGCCGGAGGGA-3，以及反向，5，-GAATTCTTAGTGATGGTGATGGTGATGGCCGACCCTGGGG AC-3’ (MWG)。PCR产物含有NdeI (斜体)，EcoRI (下划线)限制酶切位点以及六聚组氨酸标签 (hexahistidine tag)-编码序列(粗体)。将PCR产物亚克隆至Acc印Tor载体(Novagen, Madison, WI)并再次测序(MWG)。然后用 NdeI 和 EcoRI (Roche Diagnostics)将插入片段 从所述Acc印Tor载体中切下来，凝胶-纯化(Promega，Madison，WI，美国)并亚克隆至表达 质粒pET 17b (Novagen)。该DNA序列通过对两条链都测序来确认(Microsynth，Balgach， CH)。将所述pET 17b-克隆10构建物转化到大肠杆菌BL21 (DE3) (Stratagene)中并在含 有100mg/l氨苄青霉素的Luria Broth(17)培养基中于37°C培养至0. 8-1的OD(600nm)。 蛋白表达通过加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至0. 5mM的终浓度来诱导并将细 菌进行另外3h的培养。细菌通过离心来进行收集并且在25mM咪唑，pH7.5，0. (ν/ν) Triton X-100 中用 Ultraturrax(IKA，Stauffen，德国)进行勻浆(homogenize)。通过加 入DNase I来消化掉DNA，在20°C另外搅拌lOmin，用200 μ 1 5Μ的NaCl将该反应终止并在 4°C离心(6000Xg，20min)。所述克隆10衍生的变应原的大部分在细菌提取物的不可溶的 级分(fraction)中发现。在变性的条件下按照QlAexpressionist手册(QIAGEN，Hilden， 德国)使用M-NTA树脂亲和柱来将克隆10衍生的变应原从含有内含体的沉淀粒中纯化出 来。将含有所述重组变应原的级分集中(pool)起来并以IOmM NaH2PO4 pH 7. 5进行透析。 使用 Micro BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL)来测定蛋白浓度。ELISA将克隆10衍生的变应原以5 μ g/ml的浓度溶于PBS中并包被(coat)在ELISA平 板(Nunc Maxisorb, Roskilde, Denkmark)上。在用 PBS 中 (w/v)的 BSA、0.05% (ν/ ν) Tween 20 (PBST)封闭(block)后，将平板与在 PBST，0. 5 % (w/v)BSA 中经 1 50 稀释 的血清一起温育，用于如(6)所述那样测量IgGp IgG2, IgG3以及IgG4。附着的抗体通过如 前(2)所述的下述方法来检测，首先与在PBST，0.5% (w/v)BSA中经1 1000稀释的单克 隆小鼠抗-人IgG亚类抗体(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) 一起温育，然后与在 PBST，0.5% (w/v)BSA中经1 2000稀释的辣根过氧化物酶偶联的绵羊抗-小鼠抗血清 (GE Healthcare, Little Chalfont，英国)一起温育。所有测定均进行重复，并将结果以平 均值表示。蛋白提取，SDS-PAGE和免疫印迹来自成熟和未成熟的小麦种子、稻米(Oryza sativa)、玉米(Zea mays)、扁豆(菜豆Phaseolus vulgaris)以及马铃薯(Solanum tuberosum)的SDS-蛋白提取物通过将3g 组织在32ml的样品缓冲液(6)中勻浆并继而煮沸10分钟来进行制备。为了去除不可溶的 颗粒，将所述提取物在10，OOOXg于4°C离心lOmin，并将上清液以整分试样保存在-20°C。 另外将来自小麦种子的PBS-蛋白提取物按前述方法⑵制备。普通小麦花粉(500mg) 在5ml PBS,2mMEDTA, ImM PMSF中于4°C过夜提取。在13，OOOXg于4°C离心Ih后，使用 Micro BCA Protein Assay试剂盒(Pierce)测定上清液中的蛋白浓度并将整分试样保存 在-20°C直至使用。将等量的SDS-蛋白提取物用14%制备型SDS-聚丙烯酰胺凝胶来进行 分离。使用分子量标准参照物(Rainbow Marker,GE Healthcare ；Precision Plus Protein Standard, BioRad, Herkules, CA ；Page Ruler Pre—stained Protein Ladder, Fermentas, Burlington, Ontario)作为标准。在电泳分离之后，将蛋白或者用考马斯亮蓝染色，或者将 其印迹到硝化纤维膜(Schleich & Schuell，Dassel，德国)上(8)。将膜在缓冲液A(50mM 磷酸钠缓冲液，pH 7. 4,0. 5% w/v BSA,0. 5% v/v Tween-20,0. 05% w/v NaN3)中封闭两 次IOmin及一次30min，并在4°C与特异于所述克隆10衍生变应原的兔抗血清、相对应的 免疫前血清、以及作为对照目的的特异于不相关抗原的兔抗血清或者只是缓冲液一起温育 过夜。将兔血清在缓冲液A中稀释至1 50，000。附着的抗体使用在缓冲液A中稀释至 1 2000的来自驴的125I-标记抗-兔抗体(GE Healthcare)在室温下检测2h并在-70°C 通过增效荧光屏(Kodak，Heidelberg，德国)显示到Kodak XOMAT胶卷上。对于IgE斑点印迹实验，将IOOng的重组克隆10衍生变应原和重组禾本花粉变应 原Phl P UPhl P 5,Phl P 7和Phl ρ 12，以及3 μ g的小麦花粉提取物和2 μ g的成熟小 麦种子PBS-提取物点到硝化纤维膜上。将该硝化纤维测试条用缓冲液A封闭并在4°C过夜 暴露于在缓冲液A中稀释至1 10的患者血清。附着的IgE抗体使用在缓冲液A中稀释 至 1 20 的 125I-标记的抗-人 IgE 抗体(RAST RIA,Demeditec Diagnostics，德国)在室 温下检测过夜，并在-70°C通过放射自显影显示，所述放射自显影通过增效荧光屏(Kodak) 使用Kodak XOMAT胶卷。重组克隆10的MS以及⑶分析用 TOF Compact MALDI II 仪器(Kratos，Manchester，英国；piCHEM，Research and Development, Graz，奥地利)来以线性模式(linear mode)获取激光解吸质谱。将样品溶 于10%乙腈(0. 三氟乙酸)，将α-氰-对羟基桂皮酸(溶于60%乙腈，0. 三氟乙 酸)用作基质。对于样品制备，将蛋白和基质溶液1/1的混合物沉积(deposit)到目标上 并风干。⑶测量使用蛋白浓度为0. lmg/ml的纯化的克隆10衍生变应原(在H2O中)，在 Jasco J-810分光偏振仪(东京，日本)上使用0. 2cm程长的矩形比色皿来进行。从190nm 到260nm使用0. 5nm的分辨率以50nm/min的扫描速度记录远紫外⑶波谱并取三次扫描的 平均作为结果。结果以在给定波长的平均残基椭圆率(Θ)来表示。温度扫描按照步进扫 描(st印-scan)的程序进行，其中将样品以2°C/min的速率从25°C加热至95°C并以相同 的速率冷却回25°C。用指定的参数记录每5°C连续波长的波谱。另外，使用0.5°C的步进 分辨率在215nm记录温度扫描。结果以在给定波长的摩尔平均残基椭圆率(θ 来表示。 最终的波谱通过扣除相应的在等同条件下获得的基线波谱而得到校正。使用二级结构评估 程序⑶SSTR (9)来计算克隆10衍生的变应原的二级结构的含量(content)。
人鼠嗜碱性粒细胞白血病(Human rat basophil leukemia, huRBL)化验为量化IgE Ab-介导的速发型(immediate-type)反应，进行了 huRBL细胞介质释 放化验。将转染了人Fc ε RI(IO)的RBL细胞(克隆RBL-703/21)在补充了 5 % FCS，4mM L-谷氨酰胺，和lmg/ml G418硫酸盐的RPMI 1640中培养。在用胰蛋白酶/EDTA诱导后收 集细胞，洗涤，于培养基中再悬浮，并且将细胞浓度调节至2X IO6细胞/ml。将50 μ 1整分 试样的所述细胞溶液加至96孔平底微量培养板(96-well flat-bottom microplate)的孔 中(细胞密度/孔为IXlO5细胞)。将人血清在培养基中稀释至1 10，加入到所述细胞 中并在37°C，7% C02，95%的相对湿度中温育过夜。去除培养基并将平板用200μ 1/孔的 Tyrode，s缓冲液+0. 1% BSA洗涤3次。对于IgE交联，将在含50% D2O和0. 1% (w/v)BSA 的Tyrode' s缓冲液中稀释的100 μ 1克隆10衍生变应原或者rPhl ρ 1，(0. 3 μ g/ml)，加 入孔中。对于自发释放，将没有蛋白的Tyrode's缓冲液加入到孔中。总释放通过加入含有 10% Triton X-100的Tyrode' s缓冲液来测定。在37V, 7% C02，95%的相对湿度中温育 1小时后，通过离心收集细胞并将50 μ 1上清液转移至新的平板，以及加入50 μ 1每孔的化 验溶液(O. IM柠檬酸或柠檬酸钠，PH 4. 5以及160 μ M 4-甲基伞形酮-N-乙酰- β -D-氨 基葡糖苷)。在另外一小时的温育之后通过在每个孔加入100 μ 1甘氨酸缓冲液(0. 2Μ甘 氨酸，0.2%NaCl，pH 10. 7)来将该反应终止。在荧光微量培养板读数器(reader)中，于 λεχ:360/λΜ:465测量荧光。自发释放在未经Triton X-100胞溶的对照孔中测定。具体 的释放使用公式(样品-自发/总量-自发)X 100来计算。免疫金电子显微镜将小麦的干燥颗粒用锋利的剃刀刀片切成小碎片(大约0. 5mm大小的立方体)。 为了保持细胞的干燥状态，将所述立方体于室温下在丙烯醛蒸汽中无水固定5天。将其在 室温下转移至二甲氧基丙烷(DMP)I天用于去除任何残留的水并使用上升序列的DMP:乙醇 和乙醇单体Lowicryl K4 M作为中间阶段而将其包埋入Lowicryl K4M树脂。聚合作用 在-35 °C进行。从外周和中央的颗粒组织均切出超薄切片并将其置于银网格(silver grids)上 用于免疫标记程序。对克隆10衍生变应原的标记在保湿室内(PBS缓冲液+1 % (w/v)BSA, pH 7. 4， Tris缓冲液+1% (w/v)BSA,pH 8.2)于室温按照如下所述进行1. PBS缓冲液中5% (w/v) BSA，15分钟；2.兔抗-小麦蛋白10抗体和免疫前抗体，在PBS缓冲液中稀释至1 35，2 小时；3. PBS缓冲液，5分钟，Tris缓冲液，2X5分钟；4.与IOnm大小的胶体金粒子偶联的 山羊抗-兔IgG抗体(BioCell，Plano，Wetzlar，德国)，在Tris缓冲液中稀释至1 20; 5. Tris缓冲液，1 X5分钟，蒸馏水，2X5分钟。切片用乙酸铀酰(5分钟)和柠檬酸铅(10秒)染色。样品在透射电子显微镜EM 410 (FEI，Eindhoven，荷兰)中分析。MM对编码丝氨酸蛋白酶抑制剂样变应原的小麦cDNA的分离和鉴别用来自4个患有面包师哮喘的患者的IgE抗体筛选小麦种子cDNA表达文库。所述 IgE-反应性克隆10的cDNA的开放阅读框含有262个核苷酸编码84个氨基酸的多肽(图 1)。根据推断出的所述克隆10衍生变应原的氨基酸序列计算出9. 4kDa的分子量和6. 08的等电点(Pl)。对氨基酸组成的分析显示了很高的缬氨酸残基含量(15.5%)以及半胱氨 酸残基的缺失。根据计算机辅助的二级结构分析，所述克隆10衍生变应原主要由无规卷曲 和片层及一个α-螺旋结构域组成。根据溶剂可接近性的计算几乎有80%的氨基酸是 对溶剂暴露的。对序列基序的搜索显示出一个潜在的酪蛋白激酶II的磷酸化位点(氨基 酸32)，两个N-末端豆蔻酰化位点(氨基酸11，15)以及马铃薯抑制剂I家族特征序列(图 1 氨基酸25-26被框选出(boxed))的存在。所述克隆10衍生氨基酸序列与存放在NCBI数据库的序列的对比显示，所 述变应原最相同于普通小麦的枯草蛋白酶-胰凝乳蛋白酶抑制剂WSCI前体(编号 gi 1122065237)，以及相同于普通小麦的WSCI蛋白酶抑制剂(编号gi | 66356278)，并展示出 与一组在植物和动物中出现的丝氨酸蛋白酶抑制剂显著的同源性。这些丝氨酸蛋白酶抑制 剂构成了一个被命名为马铃薯抑制剂I的家族并且以在每一个该蛋白中都保守的共有序 列模式作为特征。所述属于马铃薯抑制剂I家族的丝氨酸蛋白酶抑制剂是60-90个氨基酸 的小蛋白缺乏二硫键并且只含有单一的抑制位点。小麦丝氨酸蛋白酶抑制剂的序列显示出 对于来自下述来源的蛋白酶抑制剂显著程度的序列保守性，即来自其它单子叶植物如大麦 (Hordeum vulgare)、玉米(Zea mays, Zea diploperennis)、摩擦禾(gamma grass)(甲鸟茅 状摩擦禾Tripsacum dactyloides)和稻米(Oryza sativa)，双子叶植物和蠕虫(表III)。 表III列出了每个所述丝氨酸蛋白酶抑制剂之间的序列相同性的百分比。所述丝氨酸蛋白酶抑制剂样变应原的表达、纯化和物理化学鉴别所述克隆10衍生的变应原在大肠杆菌BL21 (DE3)中带有C-末端六聚组氨酸标签 进行表达。大约25mg/L液体培养基的丝氨酸蛋白酶抑制剂样变应原可由镍层析纯化(图 2A)。对纯化的重组蛋白10的MALDI-T0F分析导致了 9970. 8Da的质量峰(图2B)。纯化的 重组克隆10衍生变应原的远紫外⑶波谱(图2C)表明该蛋白是折叠的并含有可观的量的 β-片层以及很低的α-螺旋含量。该波谱以最低值在204nm和最高值在190nm为特征。 通过使用参考数据集合7的程序CDSSTR进行的二级结构分析得出了 8%的α-螺旋含量， 23%的β-片层含量，14%的β-转角含量以及53%的无规卷曲。0.033的NRMSD值证明 了计算的和源自实验的波谱之间很好的契合(fit)。在加热到95°C时，观察到CD波谱最小 值的轻微移位(shift)(由204nm到201nm)，表明该蛋白的部分变性。在冷却到25°C时该 蛋白重折叠(图2C)。然而在204nm的最小值低于加热前，这暗示着β-片层的重排。总的 来说，在温度扫描期间观察到的波谱指向了所述克隆10衍生变应原的热稳定性。重组克隆10衍生变应原是新的来自小麦的丝氨酸蛋白酶抑制剂样变应原使用来自患有面包师哮喘、禾本花粉变态反应和对小麦的食物变态反应的患者的 血清，通过斑点印迹分析来测试纯化的克隆10衍生变应原对IgE的反应性(图3)。所述重 组克隆10衍生变应原与来自22个患有面包师哮喘的患者中的3个(#1、#2、#12)的IgE-抗 体反应(13.6%)。只有很低的特异于主要小麦变应原，α淀粉酶的IgE水平的患者#1，显 示出很强的对所述丝氨酸蛋白酶抑制剂样变应原的IgE反应性。有趣的是，所述克隆10衍 生变应原由来自患有面包师哮喘的患者IgE抗体专有地识别而不是来自患有IgE-介导的 对小麦的食物变态反应的患者或者患有禾本花粉变态反应的患者。若干来自每个所述三个 病人的组的血清由于对禾本花粉的共致敏而显示出对重组梯牧草花粉变应原的IgE反应 性。所述克隆10衍生的变应原对面包师哮喘患者特异的IgE反应性在芯片分析中得到确认，该芯片分析使用另外20个来自腹腔疾病患者的血清，119个食物变态反应患者，23个来 自禾本花粉变态反应患者的血清以及25个面包师哮喘患者(Constantin et al，未发表)。在面包师哮喘患者的组里进行的IgG亚类对所述克隆10衍生变应原的反应性的 分析显示出变应原_特异的IgG1的存在以及较低程度的变应原_特异的IgG4水平二者均 表明了 Th2反应然而却没有检测到特异于所述克隆10衍生变应原的相关IgG1和IgG1的反 应性(图4)。为研究特异于所述丝氨酸蛋白酶抑制剂样变应原的IgE抗体的变态反应活性，将 表达所述人Fc ε RI的RBL细胞与来自具有和不具有特异的IgE抗体的患者血清IgE —起 装载并继而暴露于所述变应原(图5)。与来自患者#1的血清IgE —起装载的RBL细胞在 变应原暴露时显示出最强的脱颗粒(degranulation) (51%的总β-氨基己糖苷酶释放)。 与来自患者#4和#12的血清IgE —起装载的RBL细胞获得了较低的脱颗粒(分别是22% 和19% )这与斑点印迹中IgE识别的强度相对应(图3)。当RBL细胞与来自非变态反应 的人的血清一起装载的时候，几乎观察不到脱颗粒(图5 =NC)。主要的梯牧草花粉变应原 rPhl ρ 1在与来自患者#12的血清IgE—起装载的RBL细胞中诱导很强的脱颗粒，而当RBL 细胞与来自患者#1与#4的血清一起装载时则是温和的脱颗粒(图5)。事实上，患者#1、 #4和#12也患有禾本花粉变态反应(表I)。所述丝氨酸蛋白酶抑制剂样变应原在成熟期间于小麦种子中累积
将特异于克隆10衍生变应原的兔抗体用于研究该蛋白在小麦种子成熟期间的表 达(图6)。将含有在种子成熟的不同时间点收集的小麦种子提取物的硝化纤维薄片用特异 的兔抗体和免疫前Ig来探测。该克隆10特异的抗体与40kDa的蛋白反应，呈现出所述丝 氨酸蛋白酶抑制剂样变应原的四聚体(图6)。在将斑点与来自相同兔的免疫前Ig温育时 未发现免疫反应性(图6)。所述丝氨酸蛋白酶抑制剂样变应原优先在小麦种子中检测到当我们比较花粉和种子的时候，我们发现所述丝氨酸蛋白酶抑制剂样变应原优先 在种子中表达(图7)而在花粉提取物中只是在大约65kDa获得了微弱的信号。使用兔 抗-小麦种子抑制蛋白抗体在小麦种子和花粉中检测到泛变应原(panallergen)抑制蛋白 (图7 #123)。对于免疫前Ig未发现反应性(图7)。然后我们使用丝氨酸蛋白酶抑制剂样变应原-特异抗体在稻米、玉米、扁豆和马 铃薯中搜寻交叉反应的结构，其中的同源蛋白已经被描述为具有50% (豆)、49% (玉米、 稻米)和33% (马铃薯)的序列一致性(表III)。所述丝氨酸蛋白酶抑制剂样变应原在小麦种子中作为四聚体再次检测到，在稻米 中检测到大约23kDa的条带但是在玉米、扁豆或马铃薯中未发现反应性(图8C)尽管可比 较的量的每种提取物被用于SDS-PAGE (图8A)。在将斑点与免疫前Ig温育时未观测到反应 性(图8B)。通过免疫金电子显微镜对丝氨酸蛋白酶抑制剂样变应原在小麦颗粒的糊粉层以 及淀粉粒之间的定位图9A显示了通过小麦颗粒的超薄切片在透射电子显微镜中的低倍放大。该颗粒 的三个主要的形态组件是可见的表面的多层果实和种子的皮(C)，糊粉层(AL)和大容量
14(voluminous)的该颗粒的内部的起始，淀粉胚乳(SE)。长方形标记出了可与B图9B显示 的区域相比较的区域以高倍放大展示了糊粉细胞和毗邻的淀粉胚乳之间的边界。所述糊粉 细胞充满了被小的脂质小泡(L)所包围的糊粉颗粒(AG)(蛋白液泡)。两个组件均包埋入 细胞的细胞质基质。所述淀粉胚乳由具有可变大小的淀粉粒组成，其紧密地群集只留下无 定形细胞质材料的很小空间。长方形表明了分别在C、D和E、F中高倍放大显示的区域。图 9C显示了使用针对小麦蛋白10培育的Abs在糊粉细胞中对克隆10衍生变应原的定位。金 粒子(箭头)表明小麦蛋白10主要存在于细胞的细胞器之间的细胞质基质中但也存在于 脂质小泡(L)的周围部分。在淀粉区，小麦蛋白10与淀粉粒(SG)之间的所述无定形细胞 质材料(CY)相关联(图9E)。使用免疫前Abs的对照试验显示了非常低程度的非特异标记 (图9D和F)。实施例2 重组变应原的表汰与纯化实施例2显示了命名为克隆#10、#37、#38、#112、#123和#126的6个IgE反应性
小麦种子变应原的鉴定和鉴别。另外实施例2显示了用于所述克隆重组变应原表达与纯化 的方法。生物材料，患者血清来自普通小麦Mi chae 1栽培变种的小麦种子从0sterreichische Agentur fur Gesundheit undEmShrungssicherheit GmbH获得并且在温室内种植。在直到授粉开始的 25天的时间段之后直接将未成熟的种子收集入液氮中并在-80°C保存直至使用。血清得自 24个患有面包师哮喘的患者(表IV)。面包师哮喘是在病例、总血清IgE水平、特异于小麦 和黑麦的IgE的基础上通过CAP-FEIA系统(Phadia，Uppsala，瑞典)进行诊断的并是在特 异的吸入激发测试之后的(1)(图10)。将来自禾本花粉变态反应患者的血清通过CPA-FEIA 系统(Phadia)对其总的血清IgE水平以及IgE特异的梯牧草花粉进行了分析，而对小麦的 食物变态反应患者按照此前所述(2)进行鉴别(图11)。这些患者的临床数据在表IV中进 行了总结。为了对照的目的，将来自非变态反应个体的血清包括在所述试验中。对来自小麦种子的Agtll cDNA文库的构建按照Yeh[3]从保存在-80°C的小麦种子中提取总RNA。接着将该RNA沉淀粒溶 于异硫氰酸胍缓冲液(4M异硫氰酸胍，0.83% ν/ν 3Μ醋酸钠，ρΗ 6,0. IlM β-巯基乙醇) 并通过氯化铯密度梯度超速离心进行纯化。通过寡脱氧胸苷酸纤维素亲和层析(Nucleo Trap mRNA ；Machery-Nagel)来分离聚-A+RNA，以及用 cDNA 合成试剂盒(cDNA synthesis System ；Roche Diagnostics，Mannheim，德国)来合成双链 cDNA。在用 EcoRI 甲基化酶(New England Biolabs, Beverly, ΜΑ)甲基化之后，EcoRI 连接体(New England Biolabs)被力口 到所述cDNA。加了连接体的cDNA用EcoRI (Roche Diagnostics)进行消化。经消化的连 接物用Nick柱(Pharmacia Biotech，Uppsala，瑞典)去除并且所述cDNA被连接到Agtll 的臂(Stratagene，La Jolla，CA，美国)上。该连接作用的产物在体外群集(Gigapack III Gold Cloning Kit, Stratagene)而导致产生具有 2. 43X IO6PFU(蚀斑形成单位)的 Xgtll 表达cDNA文库。对来自小麦种子cDNA文库的IgE-反应性克隆的分离和鉴别将大肠杆菌(E. coli)Y1090用7X105PFU的重组噬菌体感染并且用4个(#1、 #2、#5、#13)患有面包师哮喘的患者的血清IgE进行免疫筛选，如(5)所述。选出6个IgE-反应性噬菌体克隆用于进一步的再克隆(re-cloning)并且将其DNA通过Platinum PCR Supermix(Invitrogen，Life Technolgies)使用 λ gtll 引物进行 PCR-扩增并测序 (MWG，Ebersberg，德国)。Mf 所获得的序列与提交至Ij National Center for Biotechnology Information (NCBI)的GenBank数据库的序列进行对比。所述克隆的编码区通过使用表IV所列引物的PCR进行扩增。将PCR产物亚 克隆至Acc印Tor载体(Novagen，Madison, WI)并再次测序(MWG)。然后用NdeI和 EcoRI (Roche Diagnostics)消化含有插入片段的所述Acc印Tor载体，将该插入片段凝 胶-纯化(Promega，Madison, WI，美国)并亚克隆至表达质粒pET 17b (Novagen)。该DNA 序列通过对两条DNA链都测序来确认(Microsynth, Balgach, CH)。将所述pET 17b_插 入片段构建物转化到大肠杆菌BL21(DE3) (Stratagene)中并在含有100mg/l氨苄青霉素 的Luria Broth(LB)培养基中于37°C培养至0.8-1的OD(600nm)。蛋白表达通过加入异 丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至0. 5mM的终浓度来诱导并将细菌进行另外3h的培 养。细菌通过离心来进行收集并且在25mM咪唑，pH7. 5，0. (v/v)Triton X-IOO中用 Ultraturrax (IKA，Stauffen，德国)进行勻浆。通过加入DNase I来消化掉DNA，在20°C另 外搅拌IOmin,用200 μ 1 5Μ的NaCl来终止并在4°C离心(6000g, 20min)。在变性的条件 下按照QlAexpressionist手册，方案17(QIAGEN, Hilden，德国)使用Ni-NTA树脂亲和柱 来将克隆10衍生变应原从含有内含体的沉淀粒中纯化出来。将含有所述重组变应原的级 分集中起来并以IOmM NaH2PO4 pH 7. 5进行透析。在天然的条件下按照QlAexpressionist 手册，方案12 (QIAGEN)使用Ni-NTA树脂亲和柱来将重组蛋白#37、#38、#112、#123和#126 从细菌细胞溶胞产物的沉淀粒中纯化出来。将含有所述重组蛋白的级分集中起来并以IOmM NaH2PO4 pH 7. 5进行透析。在14% SDS-PAGE凝胶上分析蛋白样品的纯度并通过考马斯亮 蓝染色来将其显示。使用 Micro BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL)来测定蛋 白浓度。实施例3 变应原阵列实施例3显示了变应原微阵列，其显示出如实施例2中所制备的重组小麦种子变 应原由来自面包师哮喘患者的血清IgE特异性地识别，而不是来自对小麦的食物变态反应 或禾本花粉变态反应患者的血清IgE。因此所述重组变应原特异于对小麦面粉的呼吸道变 态反应。另外实施例3显示了在所述阵列中对梯牧草花粉标记phi ρ 1和Phl ρ 5以及小 麦花粉的使用来提高呼吸道变态反应的体外诊断。患者和血清血清得自患有面包师哮喘的西班牙患者(B1-B23)，患有小麦诱导的食物变态 反应的奥地利(F1-F26)和德国患者(G1-G17)以及患有禾本花粉变态反应的奥地利患 者(G1-G17)。依据阳性病例来选择患者，特异的吸入激发测试用于在面包师哮喘的情况 下对临床相关的致敏进行确认(1)以及在具有对小麦的食物变态反应的婴儿患者中进行 双盲安慰剂对照的食物激发(DBPCFC)。将来自所有患者的血清通过所述CAP-FEIA系统 (Phadia, Uppsala，瑞典)来分析总血清IgE水平和特异于小麦花粉及梯牧草花粉的IgE。 这些患者的人口统计、临床以及血清学数据在表VII、VIII和IX中进行了总结。为了对照 的目的，来自健康个体的血清也包括在所有试验里。
生物材料将重组小麦蛋白#10、#37、#38、#112、#123和#126在大肠杆菌中表达并按照(12) 纯化，所述重组蛋白通过用来自面包师哮喘患者血清进行的筛选而源自cDNA文库。小麦 花粉购自 Allergon( Vallinge，瑞典)而重组 Phl pl，Phl ρ 5，Phl ρ 7，Phl ρ 12 来自 BIOMAY (维也纳，奥地利)。蛋白提取物普通小麦花粉(500mg)在5ml PBS,2mM EDTA, ImM PMSF中于4°C过夜提取。在 13，OOOXg于4°C离心Ih后，使用Micro BCA Protein Assay试剂盒(Pierce)测定上清液 中的蛋白浓度并将整分试样保存在-20°C直至使用。变应原微阵列分析将小麦花粉提取物，1-1. 5ng/斑点(spot)，重组和纯化的小麦蛋白以及重 组禾本花粉变应原，0. 1-0. 15ng/ 斑点，用 Nano Plotter NP2 (Gesellschaft fur Silizium-Mikrosysteme mbH, Gro β erkmannsdorf，德国)点样在如(13)所述附着于显微 镜玻片的硝化纤维膜上。纯化的人IgE被用作位置标记(14)。所述经点样的微阵列用30 μ 1 化验缓冲液(弱磷酸盐缓冲液，PH 7. 5)预洗涤并与30 μ 1来自变态反应患者未稀释的血 清或对照一起温育。在用30 μ 1化验缓冲液洗涤后，用20 μ 1荧光团-缀合抗-IgE抗体检 测附着的IgE抗体并在635nm的波长测量荧光强度(FI) (GenePix 4000B fran Axon)。基 于由人血清白蛋白所得的数值，将截止水平设置为FI = 300。MM患者的描述我们分析了患有面包师哮喘、小麦诱导的食物变态反应或者禾本花粉变态反应的 患者。面包师哮喘患者的组由23个职业性暴露于小麦面粉的患者组成(4个女性，19个男 性平均年龄39岁，范围22-60岁)。91%的所述面包师哮喘患者由于小麦面粉的吸入而 患有哮喘，以及94%报有鼻结膜炎(rhinoconjunctivitis)的症状。对于其它变应原来源 (例如，猫、蟑螂、狗、禾本花粉、马、房尘螨、霉菌和/或橄榄花粉)的致敏在70%所述面包 师哮喘患者和48%患有禾本花粉变态反应的所述患者中有发现(表VII)。有趣的是，没有 面所述包师哮喘患者呈现出对食物的变态反应并且症状局限在呼吸的表现形式上。患有小麦诱导的食物变态反应的患者组包含38个个体(25个女性，13个男性平 均年龄13岁，范围0. 5-65岁)(表VIII)。我们再次发现71 %对其它呼吸变应原来源(例 如，桦树花粉、草本花粉、房尘螨和艾属(mugwort)花粉)致敏并且58%也对食物变应原 (例如，胡萝卜、牛奶、榛子、鸡蛋、麦芽、坚果、桔子、李子、稻米、黄豆、芹菜、海鲜、虾和/或 香料)致敏(表VIII)。在55%的这些患者中发现IgE-介导的对禾本花粉的变态反应。这 些患者的症状变化不同，从呼吸症状(例如，哮喘、支气管炎、咳嗽、结膜炎、呼吸困难、鼻充 血、鼻溢(rhinorrhoea)、鼻结膜炎)到胃肠症状(例如，腹痛、腹泻、肠胃气胀、喉咙痛和呕 吐)以及皮肤症状(例如，湿疹、瘙痒和风疹)(表VIII)。禾本花粉变态反应患者的组由17个患者组成(5个女性，12个男性平均年龄13 岁，范围0. 5-65岁)。71%的这些病人也患有对其它呼吸变应原来源(例如，桦树花粉、猫、 狗、房尘螨、兔和艾属花粉)的变态反应(表IX)。根据血清学65%呈现对小麦面粉的IgE 反应性以及23%含有针对其它食物变应原的IgE。然而，对于这些患者只记录到一个患有
17风疹且无食物变态反应症状的患者。呼吸症状如哮喘、结膜炎、呼吸困难、鼻结膜炎以及鼻 炎在所述禾本花粉变态反应患者中占优势。所述变应原阵列的组成将指定为#10、#37、#38、#112、#123和#126的6个重组小麦种子变应原点样到 硝化纤维包被的玻片上(图12，A)。所述重组小麦蛋白基于cDNA在大肠杆菌中表达，所述 cDNA是用来自面包师患者的血清如(15)所述那样从小麦种子cDNA文库中分离出来的。根 据与存放在NCBI数据库的序列的同源性，可将所述小麦变应原描述为如下#10与普通小 麦的枯草蛋白酶-胰凝乳蛋白酶抑制剂WSCI前体(编号gi 1122065237)有96%的同源性， #37是普通小麦硫氧还蛋白H (编号gi I 27461140),#38是普通小麦谷胱甘肽转移酶(编号 gi I 20067419) ,#112与普通小麦I-Cys-过氧化物氧还蛋白(编号gi | 34539782)有99 %的 同源性，#123与普通小麦抑制蛋白(编号gi 11346803)有96%的同源性以及#126与大麦 脱水蛋白11 (编号gi I 4105101)有69%的同源性。在所述重组小麦变应原之外，也将小麦花粉提取物、重组梯牧草花粉变应原(rPhl pUrPhl p5、rPhl p7和rPhl pl2) (16-19)以及IgE点样到所述玻片上(图12，A)。与血清 温育之后微阵列有代表性的图像显示在图12，B-C中。用对任何变应原均未显示反应性 的非变态反应的人血清探测的芯片上，可进行检测并且只有经点样的IgE标记可用抗-IgE 缀合物检测到(图12，B)。12，C中的图显示了与来自面包师哮喘患者(1)、小麦诱导的变态 反应患者(2)以及禾本花粉变态反应患者(3)的血清温育的微阵列芯片有代表性的图像。 所述面包师哮喘患者(1 表I :B4)显示了对重组小麦变应原#10很强的IgE反应性以及对 #126和#112很弱的反应性。对于食物变态反应患者(2 表VIII :F26)，观察到了 IgE对重 组小麦变应原#123和梯牧草花粉rPhl ρ 12很强的结合以及对小麦花粉提取物和rPhl ρ 1很弱的结合。来自禾本花粉变态反应患者的芯片的图像(3 :G16)显示了对rPhl ρ 5和 rPhl ρ 12很强的信号以及与小麦抑制蛋白#123、小麦花粉提取物和rPhl ρ 1很弱的信 号。由来自面包师哮喘患者的IgE抗体特异性识别的小麦种子变应原的鉴定91%的面包师哮喘患者在小麦面粉CAP中呈阳性(表VII)。使用经点样的 小麦变应原可对62%的面包师哮喘患者建立起IgE反应性的概况(profile)。变应原 #126(30% #10(26% #123(22% )和 #122(17% )是最经常检测到的组分而 #37 和 #38 只与4%的血清反应(图13，A)。有趣的是，在所述小麦CAP中呈阴性的两个患者(B5，B18 表VIII)与变应原#126反应。48%的面包师哮喘患者显示对梯牧草花粉提取物的IgE反 应性并且这些患者的每一个也都用经点样的rPhl ρ 1和rPhl ρ 5组合来进行诊断。重组 rPhl pl2(35% )总是比小麦抑制蛋白#123(22% )更强也更经常被识别。交叉反应性花粉 变应原rPhl ρ 7与13%的血清反应。由面包师哮喘患者识别的重组小麦种子变应原不是患有小麦诱导的食物变态反 应患者的IgE抗体的靶标所有具有对小麦食物变态反应的患者在小麦面粉CAP中呈阳性但是所述重组小 麦蛋白几乎不被识别(5% )(图13，B)。对交叉反应性梯牧草花粉抑制蛋白呈阳性的两个 所述患者也在微阵列中对小麦抑制蛋白#123具有阳性信号。55%的小麦诱导的食物变态 反应患者在Phleum CAP中显示出IgE反应性但是对小麦花粉提取物仅有18%在所述芯片
18上呈阳性以及26%在经点样的rPhl ρ 1和rPhl ρ 5组合中。经点样的rPhl ρ 1和rPhl P 5单独分别被18 %和16 %的所述血清识别，交叉反应性变应原rPhl ρ 7和rPhl ρ 12与 13%和26%的所述血清反应。rPhl ρ 1和rPhl ρ 5是用于禾本花粉变态反应的诊断标记变应原而抑制蛋白由 面包师哮喘和小麦食物变态反应患者识别65%的禾本花粉变态反应患者在所述小麦CAP中呈阳性。在微阵列中经测试的 所述重组小麦蛋白中，只有重组小麦蛋白#123由23. 5%的所述患者识别(图13，C)。这 些患者的每一个也都对交叉反应性梯牧草花粉抑制蛋白rPhl ρ 12呈阳性。但是rPhl ρ 12(35%)总是比#123更强也更经常被识别出。所有患有禾本花粉变态反应的患者在所述 梯牧草花粉CAP和所述经点样的rPhl ρ 1和rPhl ρ 5组合中呈阳性。重组Phl ρ 1(94%) 单独比Phl ρ 5(88%)更经常地由具有禾本花粉变态反应的患者识别。小麦花粉提取物与 82%的所述血清和29%的交叉反应性rPhl p7反应。所有禾本花粉变态反应患者和具有禾本花粉变态反应的面包师哮喘患者在所述 微阵列以及所述Phleum CAP中的rPhl ρ 1和rPhl ρ 5组合中呈阳性(图13，A ；C)。这 些发现与此前发表的数据相一致，该数据显示禾本花粉变态反应可以由对rPhl ρ 1和rPhl P 5的IgE反应性来诊断(20，21)。然而，在具有小麦诱导的变态反应的患者中，只有26% 在所述微阵列中与rPhlp 1和rPhl ρ 5反应，但超过两倍(55% )在所述Phleum CAP中呈 阳性(图13，B)。另外，那些在所述CAP系统中与禾本花粉提取物反应以及在所述微阵列 中与梯牧草花粉抑制蛋白(rPhl ρ 12)反应的患者也由于植物抑制蛋白的交叉反应性而对 小麦抑制蛋白呈阳性(22)。不过，IgE识别的频率和强度对于rPhl ρ 12总是比对于小麦 抑制蛋白更强(22)。实施例4将所述分析物固定于固体支持物，如ImmunoCAP (Phadia，Uppsala，瑞典)。来自对 所述变应原致敏以及对该变应原显示IgE反应性的至少三个具代表性患者的血清样品在 室温与所述变应原以最终浓度100 μ 1/mL温育3小时，并且作为并行的阴性对照，与单独的 缓冲液以及大肠杆菌非变态反应麦芽糖结合蛋白(MBP)温育。继而分析所述样品中IgE对 携带有固定分析物的ImmunoCAP (Phadia，Uppsala，瑞典)测试的结合，以研究与变应原的 预温育是否特应性的抑制或者显著地降低IgE结合。
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表VIII 患有禾本花粉变态反应的患者的人口统计、临床以及血清学特征
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权利要求
一种分离的多肽，其包含SEQ ID NO2、8或10的氨基酸序列。
2.权利要求1的多肽，特征为其分离自小麦或者是重组产生的。
3.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1或2中所述多肽。
4.权利要求3的核酸，其具有SEQID NO :1、7或9的核苷酸序列。
5.权利要求1或2的多肽或者与所述多肽共享有抗体所针对的表位的该多肽的片段或 变体，用于治疗或诊断。
6.权利要求1或2的多肽或者与所述多肽共享有抗体所针对的表位的该多肽的片段或 变体，用于治疗或诊断IgE-介导的变态反应。
7.一种分离的、包含SEQ ID NO :4或6的氨基酸序列的多肽，或者与所述多肽共享有 抗体所针对的表位的该多肽的片段或变体，用于治疗或诊断。
8.一种分离的、包含SEQ ID NO :4或6的氨基酸序列的多肽，或者与所述多肽共享有 抗体所针对的表位的该多肽的片段或变体，用于治疗或诊断IgE-介导的变态反应。
9.药物组合物，其包含具有SEQID NO :2、4、6、8或10的氨基酸序列的多肽，或者经修 饰以消除或减弱其IgE结合反应的所述多肽的低变应原性形式，以及任选地包含药物学可 接受的赋形剂、载体、缓冲液和/或稀释剂。
10.权利要求9的药物组合物，其中所述多肽的所述低变应原性形式通过以下方法修 饰该分子的片段化、截短或串联；内部区段的缺失；结构域重排；氨基酸残基的取代；二硫 键的断裂。
11.产生变应原组合物的方法，其包含以下步骤将具有SEQID N0:2、4、6、8或10的 氨基酸序列的多肽或者与所述多肽共享有抗体所针对的表位的该多肽的片段或变体，加入 到包含变应原提取物和/或至少一种纯化的变应原组分的组合物中。
12.通过权利要求11的方法可以获得的变应原组合物。
13.用于IgE-介导的变态反应的体外诊断的方法，其包含下列步骤-将来自疑似具有IgE-介导的变态反应的哺乳动物的体液样品，与至少一种具有SEQ ID NO :2、4、6、8或10的氨基酸序列的多肽或者与所述多肽共享有抗体所针对的表位的该 多肽的片段或变体，进行接触；以及-检测该样品中特异地结合一或多种所述多肽的IgE抗体的存在；其中此特异地结合一或多种所述多肽的抗体的存在表明IgE-介导的变态反应。
14.权利要求13的方法，其中所述IgE-介导的变态反应是对小麦面粉的呼吸道变态反应。
15.用于实施权利要求13或14的方法的诊断试剂盒，其包含具有SEQID N0:2、4、6、8 或10的氨基酸序列的多肽或者与所述多肽共享有抗体所针对的表位的该多肽的片段或变 体，或者包含权利要求9或10的组合物。
全文摘要
本发明涉及IgE-介导的变态反应的领域，特别是职业性哮喘如面包师哮喘。本发明更具体地是涉及对新型小麦变应原的鉴定以及其在IgE-介导的变态反应的治疗和诊断中的用途。另外本发明提供了已知蛋白在治疗和诊断中的用途。本发明也涉及用于在哺乳动物中对IgE-介导的变态反应进行诊断和治疗的方法。
文档编号A61K39/35GK101932597SQ200880125943
公开日2010年12月29日 申请日期2008年11月28日 优先权日2007年11月30日
发明者C·康斯坦丁, R·瓦伦塔, S·基尔塞 申请人:法蒂亚公司