抗b7h4单克隆抗体-药物缀合物和使用方法

专利名称：抗b7h4单克隆抗体-药物缀合物和使用方法
技术领域：
本发明提供了抗B7-H4抗体、抗体片段、以及与配偶体分子缀合的抗体模拟物，所 述配偶体分子诸如是药物、放射性同位素和毒素。
背景技术：
乳腺癌和卵巢癌分别是美国女性癌症死亡的第二和第四大主要原因(美国癌症 学会(2005)Cancer facts and figures)。美国癌症学会估计2005年美国约40，000位妇女 将死于乳腺癌以及约16，000位将死于卵巢癌。表面上皮肿瘤占所有卵巢肿瘤的80 %以上， 所述卵巢肿瘤包括浆液瘤、粘液性瘤、内膜样瘤和透明细胞癌(Seidman等“Blaustein’ s Pathology of theFemale Genital Tract，，791-4 (Kurman 编辑，第五版，New York, Springer-Verlag,2002)。卵巢癌通常以晚期存在，其中转移性疾病已扩散至局部和远处部 位(Pettersson, (1994) Int. Fed. of Gyn. and Obstetrics，第 22 卷；以及 Heintz 等(2001) J. Epidermiol. Biostat. 6 107-38)。因此，尽管一生发生乳腺癌的概率显著高于卵巢癌，但 是乳腺癌患者的5年生存率比卵巢癌患者好得多。B7样分子属于免疫球蛋白(Ig)超家族。B7样分子的细胞外部分含有单IgV和IgC 结构域，并且共享 20% -40%的氨基酸同一性。B7样分子在控制和精细调整抗原特异性 免疫反应中起着重要的作用。B7-H4也称为08E、B7x和B7S1，其为B7家族的成员并且认为 其在刺激和抑制性调节T细胞反应中起着作用(Carreno等，(2002) Ann. Rev. Immunol. 20 29-53 和 Khoury 等，(2004) Immunity 20 :529_538)。已将人 B7-H4 定位在 1 号染色体上， 并且其包含6个外显子和5个内含子，共66kb，其中外显子6用于备选地剪接以产生两种不 同的转录物(Choi 等(2003) J. Immunol. 171 4650-4654)。B7-H4通过与T细胞上的受体结合发挥其生理功能，其进而诱导细胞周期停 滞并抑制CD4+和CD8+T细胞的细胞因子分泌、细胞毒性的发展以及细胞因子的产生 (Prasad 等(2003)Immunity 18 :863_873 ；Sica 等(2003)Immunity 18 :849_861 ；Wang 等 (2004)Microbes Infect. 6 :759_66 ；和 Zang 等(2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 100 10388-10392)。已提示Β7-Η4可能是炎症反应的弱化子以及可能在下调抗原特异性免疫 和抗肿瘤应答中起着作用(zang 等(2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 100 10388-10392 ； Prasad 等(2003)Immunity 18 :863_873 ;Sica 等(2003)Immunityl8 849-861 ；Choi 等 (2003) J. Immunol. 171 4650-4654 以及 Carreno 等(2003) Trends Immunol. 24 :524_7)。在大范围正常躯体组织，包括肝、骨骼肌、肾、胰和小肠中检测到了 B7_H4mRNA的 表达，但未检测到蛋白质表达(Sica等，(2003)Immunityl8 :849-61和Choi等(2003) J. Immunol. 171 :4650_4)。B7-H4是在刺激T细胞、B细胞、单核细胞及树突状细胞后可诱导 的，然而免疫组织化学分析揭示除了在一些卵巢和肺癌(Id.)中有阳性染色之外，其在若 干外周组织中几乎不表达。此外，B7-H4在原发和转移的乳腺癌中一致地过量表达，独立于 肿瘤分级或阶段，这提示这一蛋白质在乳腺癌生物学中起着重要作用(Tringler等(2005) Clinical Cancer Res. U 1842-48)。也参见美国专利号6，962，980,6, 699，664,6, 468，546、 6，488，931,6, 670，463和6，528，253，其每一个均在此引入作为参考。
可利用许多治疗模式用于治疗晚期乳腺癌和卵巢癌，包括放疗、使用细胞毒抗肿 瘤剂的常规化疗、激素疗法(芳香酶抑制剂、黄体化激素释放激素类似物)、二膦酸盐和信 号转导抑制剂(Smith (2002) Lancet，360 :790_2)。然而，不幸的是，许多患者对这些治疗模 式的任一个要么反应很差，要么完全没反应。因此，需要鉴定乳腺癌和卵巢癌的新分子标记 和抗乳腺癌和卵巢癌的治疗剂。因此，B7-H4代表了治疗包括卵巢癌和乳腺癌在内的肿瘤 以及各种其它由B7-H4的表达所表征的疾病的重要靶标。发明概述本发明提供了抗体-配偶体分子缀合物，其包含单克隆抗体，尤其是人序列单克 隆抗体，其与B7-H4(a/k/a 08E、B7S1和B7x)结合并且展示出许多期望的性质。这些性质 包括与人B7-H4高亲和性结合、被表达B7-H4的细胞内化、介导抗体依赖性细胞毒性的能 力、和/或当缀合至细胞毒素时在体内抑制表达B7-H4的细胞生长的能力。还提供了应用 本发明的抗体_配偶体分子缀合物治疗各种B7-H4介导的疾病的方法。在一个方面，本发明涉及抗体-配偶体分子缀合物，所述缀合物包含单克隆抗体 或其抗原结合部分，其中所述抗体(a)以Ix 10_8M或更小的亲和性结合人B7-H4 ；(b)被表达B7-H4的细胞内化；(c)对表达B7-H4的细胞显示出抗体依赖性细胞毒性(ADCC)；和(d)当缀合至细胞毒素时在体内抑制表达B7-H4的细胞的生长。优选地，该抗体显示性质(a)、(b)、(c)和(d)的至少两种。更优选地，该抗体显示 性质(a)、(b)、(c)和(d)的至少三种。更优选地，该抗体显示所有四种性质(a)、(b)、(c) 和(d)。在另一个优选的实施方案中，该抗体以5xlO_9M或更小的亲和性结合B7-H4。在又 一个优选的实施方案中，当该抗体缀合至细胞毒素时其在体内抑制表达B7-H4的肿瘤细胞 的生长。在一些实施方案中，该抗体与乳腺细胞癌肿瘤细胞系，诸如细胞系SKBR3(ATCC登 录号HTB-30)结合。一般地，该抗体是人抗体，尽管在备选的实施方案中，该抗体可以是鼠抗体、嵌合 抗体或人源化抗体。在另一实施方案中，该抗体在与SKBR3乳腺细胞癌肿瘤细胞上表达的B7-H4结合 后被这些细胞内化。在另一实施方案中，本发明提供了抗体-配偶体分子缀合物，所述缀合物包含单 克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体与参照抗体交叉竞争结合人B7-H4，其中所述参 照抗体(a)包含SEQ ID NO=I的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ IDNO 6的氨基酸 序列的轻链可变区；(b)包含SEQ ID NO 2的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ IDNO 7的氨基酸 序列的轻链可变区；(c)包含SEQ ID NO 3的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ IDNO 8的氨基酸 序列的轻链可变区；(d)包含SEQ ID NO 4的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ IDNO 9的氨基酸序列的轻链可变区；或(e)包含SEQ ID NO 5的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ IDNO 10的氨基酸 序列的轻链可变区；在一个方面中，本发明涉及抗体-配偶体分子缀合物，所述缀合物包含单克隆抗 体或其抗原结合部分，所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区是人Vh 4-34基因的产物 或衍生自人Vh 4-34基因(其蛋白质产物在本文中描述为SEQ ID NO :51)，其中所述抗体特 异性结合B7-H4。本发明还提供了抗体-配偶体分子缀合物，所述缀合物包含单克隆抗体或 其抗原结合部分，所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区是人Vh 3-53基因的产物或衍 生自人Vh 3-53基因(其蛋白质产物在本文中描述为SEQ ID NO :52)，其中所述抗体特异性 结合B7-H4。本发明还提供了抗体-配偶体分子缀合物，所述缀合物包含单克隆抗体或其抗 原结合部分，所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区是人Vh 3-9/D3-10/JH6b基因的产 物或衍生自人VH3-9/D3-10/JH6b基因(其蛋白质产物在本文中描述为SEQ ID N0:53)，其 中所述抗体特异性结合B7-H4。本发明还提供了抗体_配偶体分子缀合物，所述缀合物包含单克隆抗体或其抗 原结合部分，所述抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区是人VKA27基因的产物或衍生自
A27基因(其蛋白质产物在本文中描述为SEQ ID NO :54)，其中所述抗体特异性结合 B7-H4。本发明还提供了抗体-配偶体分子缀合物，所述缀合物包含单克隆抗体或其抗原结 合部分，所述抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区是AVk L6/JK1基因的产物或衍生自人 Vk L6/JK1基因(其蛋白质产物在本文中描述为SEQ ID NO :55)，其中所述抗体特异性结合 B7-H4。在其它方面，本发明提供了抗体-配偶体分子缀合物，所述缀合物包含单克隆抗 体或其抗原结合部分，所述抗体包含(a)人Vh 4-34、3-53或3_9基因的重链可变区；以及(b)人Vk A27或VK L6的轻链可变区；其中所述的抗体特异性结合B7-H4。在相关的实施方案中，所述抗体包含人Vh 4-34基因的重链可变区和AVk A27基 因的轻链可变区。在另一相关的实施方案中，所述抗体包含人Vh 3-53基因的重链可变区和
A27基因的轻链可变区。在另一相关的实施方案中，所述抗体包含AVh 3-9基因的重 链可变区和人Vk L6基因的轻链可变区。在另一方面，本发明提供了分离的单克隆抗体或其 抗原结合片段，所述抗体包含包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区；以及包含CDR1、 ⑶R2和⑶R3序列的轻链可变区；其中(a)重链可变区CDR3序列包含选自SEQ ID NO :21、22、23、24和25的氨基酸序列 和其保守修饰的氨基酸序列；(b)轻链可变区CDR3序列包含选自SEQ ID NO 36、37、38、39和40的氨基酸序列 和其保守修饰的氨基酸序列；(c)该抗体以ΙχΚΤΜ或更小的KD与人B7-H4结合；(d)与用B7-H4转染的人CHO细胞结合。优选地，重链可变区CDR2序列包含选自SEQ ID NO 16、17、18、19和20的氨基酸 序列和其保守修饰的氨基酸序列；以及轻链可变区⑶R2序列包含选自SEQ ID N0:31、32、 33,34和35的氨基酸序列和其保守修饰的氨基酸序列。
优选地，重链可变区⑶Rl序列包含选自SEQ ID NO 11、12、13、14和15的氨基酸 序列和其保守修饰的氨基酸序列；以及轻链可变区⑶Rl序列包含选自SEQ ID NO =26,27,
28、29 和30的氨基酸序列和其保守修饰的氨基丨酸序列。特别的组合含有
(a)包含 SEQ ID NO11的!■链可变区CDRl
(b)包含 SEQ ID NO16的!■链可变区CDR2
(C)包含 SEQ ID NO21的!■链可变区CDR3
(d)包含 SEQ ID NO26的轻链可变区CDRl
(e)包含 SEQ ID NO31的轻链可变区CDR2禾口
(f)包含 SEQ ID NO36的轻链可变区CDR3。
另--特别的组合含有
(a)包含 SEQ ID NO12的!■链可变区CDRl
(b)包含 SEQ ID NO17的!■链可变区CDR2
(C)包含 SEQ ID NO22的!■链可变区CDR3
(d)包含 SEQ ID NO27的轻链可变区CDRl
(e)包含 SEQ ID NO32的轻链可变区CDR2禾口
(f)包含 SEQ ID NO37的轻链可变区CDR3。
另--特别的组合含有
(a)包含 SEQ ID NO13的!■链可变区CDRl
(b)包含 SEQ ID NO18的!■链可变区CDR2
(C)包含 SEQ ID NO23的!■链可变区CDR3
(d)包含 SEQ ID NO28的轻链可变区CDRl
(e)包含 SEQ ID NO33的轻链可变区CDR2禾口
(f)包含 SEQ ID NO38的轻链可变区CDR3。
另--特别的组合含有
(a)包含 SEQ ID NO14的!■链可变区CDRl
(b)包含 SEQ ID NO19的!■链可变区CDR2
(C)包含 SEQ ID NO24的!■链可变区CDR3
(d)包含 SEQ ID NO29的轻链可变区CDRl
(e)包含 SEQ ID NO34的轻链可变区CDR2禾口
(f)包含 SEQ ID NO39的轻链可变区CDR3。
另--特别的组合含有
(a)包含 SEQ ID NO15的!■链可变区CDRl
(b)包含 SEQ ID NO20的!■链可变区CDR2
(C)包含 SEQ ID NO25的!■链可变区CDR3
(d)包含 SEQ ID NO30的轻链可变区CDRl
(e)包含 SEQ ID NO35的轻链可变区CDR2禾口
(f)包含 SEQ ID NO40的轻链可变区CDR3。
本发明的其它特定的抗体或其抗原结合片段含有
(a)包含 SEQ ID NO1的氨基酸序列的重链可变区；和
(b)包含SEQ ID NO 6的氨基酸序列的轻链可变区。另一特定的组合含有(a)包含SEQ ID NO 2的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO 7的氨基酸序列的轻链可变区。另一特定的组合含有(a)包含SEQ ID NO 3的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO 8的氨基酸序列的轻链可变区。另一特定的组合含有(a)包含SEQ ID NO 4的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO 9的氨基酸序列的轻链可变区。另一特定的组合含有(a)包含SEQ ID NO 5的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO 10的氨基酸序列的轻链可变区。在本发明的另一方面，提供了包含抗体或其抗原结合部分的抗体-配偶体分子缀 合物，所述抗体与任一前述抗体竞争结合B7-H4。本公开的抗体可以例如是全长抗体，例如IgGl、IgG2或IgG4同种型的全长抗体。 备选地，该抗体可以是抗体片段，诸如Fab、Fab’或Fab’ 2片段，或者是单链抗体(例如， scFv)ο本发明还提供了抗体-配偶体分子缀合物，所述缀合物包含与治疗剂连接的本发 明的抗体或其抗原结合部分，所述治疗剂诸如细胞毒素或放射性同位素。在特别优选的实 施方案中，本发明提供了抗体_配偶体分子缀合物，所述缀合物包含与化合物“毒素A”连接 (例如通过巯基连接)的本发明的抗体或其抗原结合部分。例如，在多个实施方案中，本发 明提供了以下优选的抗体_配偶体分子缀合物(i)包含抗体或其抗原结合部分的抗体_配偶体分子缀合物，所述抗体含有(a)包含SEQ ID NO 1的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ IDNO 6的氨基酸 序列的轻链可变区；(b)包含SEQ ID NO 2的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ IDNO 7的氨基酸 序列的轻链可变区；(c)包含SEQ ID NO 3的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ IDNO 8的氨基酸 序列的轻链可变区；(d)包含SEQ ID NO 4的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ IDNO 9的氨基酸 序列的轻链可变区；或(e)包含SEQ ID NO 5的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ IDNO 10的氨基酸 序列的轻链可变区；其中所述抗体或其抗原结合部分与诸如毒素A的毒素连接，如在美国专利申请号 60/882,461中详细讨论的那样，其在此全文引入作为参考。(ii)抗体-配偶体分子缀合物，所述缀合物包含以下抗体或其抗原结合部分，所 述抗体含有(a)包含SEQ ID NO 11的重链可变区CDRl ；
(b)包含SEQ ID NO 16的重链可变区CDR2 ；(c)包含SEQ ID NO 21的重链可变区CDR3 ；(d)包含SEQ ID NO 26的轻链可变区CDRl ；(e)包含SEQ ID NO 31的轻链可变区CDR2 ；禾口(f)包含SEQ ID NO 36的轻链可变区CDR3 ；或所述缀合物包含以下抗体或其抗原结合部分，所述抗体含有(a)包含SEQ ID NO 12的重链可变区CDRl ；(b)包含SEQ ID NO 17的重链可变区CDR2 ；(c)包含SEQ ID NO 22的重链可变区CDR3 ；(d)包含SEQ ID NO 27的轻链可变区CDRl ；(e)包含SEQ ID NO 32的轻链可变区CDR2 ；禾口(f)包含SEQ ID NO 37的轻链可变区CDR3。或所述缀合物包含以下抗体或其抗原结合部分，所述抗体含有(a)包含SEQ ID NO 13的重链可变区CDRl ；(b)包含SEQ ID NO 18的重链可变区CDR2 ；(c)包含SEQ ID NO 23的重链可变区CDR3 ；(d)包含SEQ ID NO 28的轻链可变区CDRl ；(e)包含SEQ ID NO 33的轻链可变区CDR2 ；禾口(f)包含SEQ ID NO 38的轻链可变区CDR3。或所述缀合物包含以下抗体或其抗原结合部分，所述抗体含有(a)包含SEQ ID NO 14的重链可变区CDRl ；(b)包含SEQ ID NO 19的重链可变区CDR2 ；(c)包含SEQ ID NO 24的重链可变区CDR3 ；(d)包含SEQ ID NO 29的轻链可变区CDRl ；(e)包含SEQ ID NO 34的轻链可变区CDR2 ；和(f)包含SEQ ID NO 39的轻链可变区CDR3。或所述缀合物包含以下抗体或其抗原结合部分，所述抗体含有(a)包含SEQ ID NO 15的重链可变区CDRl ；(b)包含SEQ ID NO 20的重链可变区CDR2 ；(c)包含SEQ ID NO 25的重链可变区CDR3 ；(d)包含SEQ ID NO 30的轻链可变区CDRl ；(e)包含SEQ ID NO 35的轻链可变区CDR2 ；禾口(f)包含SEQ ID NO 40的轻链可变区CDR3 ；其中所述抗体或其抗原结合片段与诸如毒素A的毒素连接；以及(iii)包含抗体或其抗原结合部分的抗体-配偶体分子缀合物，所述抗体与被包 含以下重链可变区的抗体识别的相同表位结合(例如，与后者交叉竞争结合人B7-H4)，其 中所述的重链可变区含有以下氨基酸序列(a)包含SEQ ID NO=I的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ IDNO 6的氨基酸序列的轻链可变区；(b)包含SEQ ID NO 2的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ IDNO 7的氨基酸 序列的轻链可变区；(c)包含SEQ ID NO 3的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ IDNO 8的氨基酸 序列的轻链可变区；(d)包含SEQ ID NO 4的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ IDNO 9的氨基酸 序列的轻链可变区；或(e)包含SEQ ID NO 5的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ IDNO 10的氨基酸 序列的轻链可变区；其中所述抗体或其抗原结合片段与诸如毒素A的毒素连接。本发明还提供双特异性分子，所述双特异性分子包含本发明的抗体或其抗原结合 部分，所述抗体或其抗原结合部分连接到具有不同于所述抗体或其抗原结合部分的结合特 异性的第二功能部分。还提供组合物，所述组合物包含本发明的抗体或其抗原结合部分或抗体_配偶体 分子缀合物或者双特异性分子以及可药用载体。本发明还包括编码本发明抗体或其抗原结合部分的核酸分子，以及包含此类核酸 的表达载体、包含此类表达载体的宿主细胞以及应用此类宿主细胞制备抗B7-H4抗体的方 法。此外，本发明提供了包含人免疫球蛋白重链和轻链转基因的转基因小鼠，其中所述小鼠 表达本发明的抗体，以及提供了从此类小鼠制备的杂交瘤，其中所述的杂交瘤产生本发明 的抗体。本公开也提供了分离的抗B7-H4抗体-配偶体分子缀合物，其以高亲和性与B7-H4 特异性结合，尤其是包含人单克隆抗体的那些。一些此类抗体_配偶体分子缀合物能够被 表达B7-H4的细胞内化，以及能够介导抗体依赖性细胞毒性。本发明还提供了应用本文公 开的抗B7-H4抗体-配偶体分子缀合物治疗诸如乳腺癌和卵巢癌的癌症的方法。还提供了包含本发明的与配偶体分子缀合的抗体、或其抗原结合部分的组合物。 可有利地与本文公开的抗体配偶体分子缀合物中的抗体缀合的配偶体分子包括但不限于 作为药物的分子、毒素、标记分子(例如放射性同位素)、蛋白质和治疗剂。本文还公开了包 含抗体_配偶体分子缀合物和可药用载体的组合物。在一个方面，此类抗体-配偶体分子缀合物经由化学接头缀合。在一些实施方案 中，接头是肽基接头并且在本文中描述为(L4)p-F-(L1)mt5其它接头包括胼和二硫化物接头， 并且在在本文中分别描述为(L4)p-H-⑴^或(L4)p-J-(L1)mt5除了连接到所述配偶体的接头 之外，本发明还提供了可切割的接头臂，其适于连接到基本上任何分子种类。在另一方面，本发明提供了治疗或预防由表达B7-H4的肿瘤细胞生长所表征的疾 病的方法，其包括给受试者施与治疗或预防所述疾病有效量的包含本发明的抗B7-H4人抗 体的抗体_配偶体分子缀合物。所述疾病可以是癌症，诸如乳腺细胞癌或卵巢癌。在另一方面，本发明提供了治疗自身免疫疾病的方法，其包括给受试者施与治疗 自身免疫疾病有效量的包含本发明的抗B7-H4人抗体的抗体_配偶体分子缀合物。本发明的其它特征和优点从以下发明详述和实施例中将是显而易见的，其中所述 实施例不应当认为是限制性的。本申请全文引用的所有参考文献、Genbank登录号、专利和公开的专利申请均在此明确地引入作为参考。附图简述图IA显示IGll人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO 41)和氨基 酸序歹Ij (SEQ ID NO :1)。描述了 CDRl 区(SEQ ID NO 11)、CDR2 区(SEQ ID NO 16)和 CDR3 区(SEQ ID NO 21)，并标出了 V和J种系衍生物。图IB显示IGll人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO 46)和氨基 酸序歹Ij (SEQ ID NO 6)。描述了 CDRl 区(SEQ ID NO 26)、CDR2 区(SEQ ID NO 31)和 CDR3 区(SEQ ID NO 36)，并标出了 V和J种系衍生物。图2A显示2A7人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO 42)和氨基酸 序歹丨J (SEQ ID NO :2)。描述了 CDRl 区(SEQ ID NO :12)、CDR2 区(SEQ ID NO 17)和 CDR3 区(SEQ ID NO 22)，并标出了 V、D和J种系衍生物。图2B显示2A7人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO 47)和氨基酸 序歹丨J (SEQ ID NO :7)。描述了 CDRl 区(SEQ ID NO 27)、CDR2 区(SEQ ID NO 32)和 CDR3 区(SEQ ID NO 37)，并标出了 V和J种系衍生物。图3A显示2F9人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO 43)和氨基酸 序歹丨J (SEQ ID NO 3)。描述了 CDRl 区(SEQ ID NO 13)、CDR2 区(SEQ ID NO 18)和 CDR3 区(SEQ ID NO 23)，并标出了 V、D和J种系衍生物。图3B显示2F9人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO 48)和氨基酸 序歹丨J (SEQ ID NO :8)。描述了 CDRl 区(SEQ ID NO 28)、CDR2 区(SEQ ID NO 33)和 CDR3 区(SEQ ID NO 38)，并标出了 V和J种系衍生物。图4A显示12E1人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO 44)和氨基酸 序歹丨J (SEQ ID NO 4)。描述了 CDRl 区(SEQ ID NO 14)、CDR2 区(SEQ ID NO 19)和 CDR3 区(SEQ ID NO 24)，并标出了 V、D和J种系衍生物。图4B显示12E1人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO 49)和氨基 酸序歹Ij (SEQ ID NO :9)。描述了 CDRl 区(SEQ ID NO 29)、CDR2 区(SEQ ID NO 34)和 CDR3 区(SEQ ID NO 39)，并标出了 V和J种系衍生物。图5A显示13D12人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO 45)和氨基 酸序歹Ij (SEQ ID NO :5)。描述了 CDRl 区(SEQ ID NO 15)、CDR2 区(SEQ ID NO 20)和 CDR3 区(SEQ ID NO 25)，并标出了 V、D和J种系衍生物。图5B显示13D12人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO 50)和氨 基酸序列(SEQ ID NO 10)。描述了 CDRl 区(SEQ ID NO :30)、CDR2 区(SEQ ID NO 35)和 CDR3区(SEQ ID NO 40)，并标出了 V和J种系衍生物。图6显示IGll和13D12的重链可变区氨基酸序列与人种系Vh 4-34氨基酸序列 (SEQ ID NO 51)的比对。图7显示2A7和2F9的重链可变区氨基酸序列与人种系Vh 3-53氨基酸序列(SEQ ID NO 52)的比对。图8显示12E1的重链可变区氨基酸序列与组合的人种系VH3-9/D3_10/JH6b氨基 酸序列(SEQ ID NO 53)的比对。图9显示1G11、2A7、2F9和13D12的轻链可变区氨基酸序列与人种系Vk A27氨基酸序列(SEQ ID NO 54)的比对。

图10显示12E1的轻链可变区氨基酸序列与组合的人种系Vk L6/JK1氨基酸序列 (SEQ ID NO 55)的比对。图IlA和IlB显示ELISA实验结果，其证实了针对人08E的人单克隆抗体与08E 特异性结合。图IlA显示了来自如下的结果用人抗08E抗体包被ELISA板并随后添加纯 化的08E蛋白质并用兔抗08E抗血清检测。图IlB显示了来自如下的结果用抗小鼠Fe、随 后用单克隆抗C9(0.6yg/ml)包被ELISA板，然后如所标出的那样用五-08E蛋白质滴定， 并且随后用1 μ g/ml的人抗08E抗体滴定。图12显示了流式细胞术实验的结果，其证实抗08E人单克隆抗体2A7与08E转染 的CHO细胞结合。图13显示了流式细胞术实验的结果，其证实在SKBR3乳腺癌细胞中以及在08E转 染的SK0V3和HEK细胞中表达08E。图14显示了 Hum-Zap内化实验结果，其证实针对人08E的人单克隆抗体可内化至 08E+CH0细胞中。图15显示了 Hum-Zap内化实验结果，其证实针对人08E的人单克隆抗体可内化至 08E+SKBR3 细胞中。图16显示了用包括1G11、2A7、2F9和13D12在内的各种人抗08E单克隆抗体的表
位作图研究的结果。图17显示了抗体依赖性细胞毒性(ADCC)测定法的结果，其证实了人单克隆抗08E 抗体以ADCC依赖性方式杀死人乳腺癌细胞系SKBR3。图18显示了抗体依赖性细胞毒性(ADCC)测定法的结果，其证实了人单克隆抗08E 抗体以ADCC依赖性方式杀死08E转染的SK0V3细胞。图19显示了抗体依赖性细胞毒性(ADCC)测定法的结果，其证实了人单克隆抗08E 抗体以浓度和ADCC依赖性方式杀死人乳腺癌细胞系SKBR3。图20显示了在SCID小鼠上的体内研究结果，其显示通过抗08E抗体抑制了 HEK-B7H4肿瘤的肿瘤生长。图21呈现了曲线图，其显示了 HEK293-B7H4异种移植的小鼠模型的体内结果，展 现了用各种浓度的单独的运载体、裸抗体、或抗体-配偶体分子缀合物治疗的小鼠中的肿 瘤体积中位数。图22呈现了曲线图，其显示了 HEK293-B7H4异种移植的小鼠模型的体内结果，展 现了用各种浓度的单独的运载体、裸抗体、或抗体-配偶体分子缀合物治疗的小鼠中的体 重改变中位数。发明详述本发明涉及抗体-配偶体分子缀合物，所述缀合物包含以高亲和性与B7_H4(a/k/ a 08E、B7S1和B7x)特异性结合的单克隆抗体，尤其是人序列单克隆抗体。在某些实施方案 中，本发明的抗体衍生自特定的重链和轻链种系序列和/或包含特定的结构特征，诸如含 有特定氨基酸序列的CDR区。本发明提供分离的抗体、制备此类抗体的方法、抗体_配偶体 分子缀合物和包含此类抗体的双特异性分子以及含有所述抗体、抗体_配偶体分子缀合物 或双特异性分子的药物组合物。本发明还涉及使用所述抗体_配偶体分子缀合物的方法，诸如用于检测B7-H4，以及用于治疗与B7-H4的表达相关的疾病，诸如癌症。因此，本发明还 提供使用本发明的抗B7-H4抗体-配偶体分子缀合物治疗各种癌症的方法，例如，治疗乳腺 细胞癌、转移的乳腺癌、卵巢细胞癌、转移的卵巢癌和肾细胞癌。为更容易理解本发明，首先定义某些术语。另外的定义在整个详述中阐明。术语“B7-H4”、“08E”、“B7X”、和“B7SΓ，在本文中可互换使用，并且包括人B7-H4的 变体、同种型、同源物、直向同源物和旁系同源物。例如在某些情况下，对B7-H4特异性的抗 体可以与来自非人物种的B7-H4交叉反应。在其它实施方案中，对B7-H4特异性的抗体可 以是对人B7-H4完全特异的并且可不显示物种或其它类型的交叉反应性。术语“人B7-H4” 是指人序列B7-H4，诸如具有Genbank登录号NP_078902 (SEQ ID NO 56)的人B7-H4的完 全氨基酸序列。B7-H4在本领域还称为，例如BL-CAM、B3、Leu-14和Lyb-8。人B7-H4可以 由于具有例如保守突变或在非保守区中的突变而不同于SEQ ID N0:56的人B7-H4，并且该 B7-H4具有与SEQ ID NO :56的人B7-H4基本上相同的生物功能。例如，人B7-H4的生物功能 是在B7-H4的细胞外结构域上具有表位，所述表位被本发明的抗体特异性结合，或人B7-H4 的生物功能包括例如，抑制T-细胞增殖、抑制细胞因子产生、抑制细胞周期产生、或与T细 胞受体结合。特定的人B7-H4序列在氨基酸序列上通常至少90%同一于SEQ IDNO 56的人 B7-H4并且含有当与其它物种(例如，鼠)的B7-H4氨基酸序列比较时将氨基酸序列鉴定 为人源的氨基酸残基。在某些情况下，人B7-H4在氨基酸序列上可以至少95%或甚至至少 96%、97%、98%或99%同一于SEQ ID N0:56的B7-H4。在某些实施方案中，人B7-H4序列 将显示不超过10个不同于SEQ ID N0:56的B7-H4的氨基酸。在某些实施方案中，人B7-H4 可显示不超过5个或甚至不超过4个、3个、2个或1个不同于SEQ ID NO 56的B7-H4的氨 基酸。同一性百分数可以如本文所述进行测定。术语“免疫应答”是指例如，淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞、以及由上 述细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子、以及补体)的作用，这些作用导 致对侵入性病原体、被病原体感染的细胞或组织、癌细胞，或者，在自身免疫或病理炎症情 况下，对正常的人类细胞或组织的选择性损害、破坏或将它们从人体清除。“信号转导途径”是指在多种信号转导分子之间的生物化学关系，这些分子在将信 号从细胞的一部分传递到细胞的另一部分中发挥作用。如本文所使用的短语“细胞表面受 体”包括例如能够接受信号并将这种信号跨细胞原生质膜传递的分子及分子的复合体。本 发明的“细胞表面受体”的实例是B7-H4受体。本文所称的术语“抗体”包括完整抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部 分”)或其单链。“抗体”指包括通过二硫键互相连接的至少两条重链(H链)及两条轻链 (L链)的糖蛋白，或其抗原结合部分。每一条重链都包含重链可变区(在此缩写为Vh)以 及重链恒定区。该重链恒定区包含三个结构域，ChI、CH2以及Ch3。每一条轻链都包含轻链 可变区(在此缩写为VJ及轻链恒定区。该轻链恒定区包含一个结构域Q。V1^nt可以 进一步被细分为多个高变区，被称为互补决定区(CDR)，其间散布有较保守的被称为构架区 (FR)的区域。每个Vh以及\均由3个CDR及4个FR组成，从氨基端至羧基端按照以下顺 序排布FR1、⑶Rl、FR2、⑶R2、FR3、⑶R3、FR4。重链及轻链的可变区包含与抗原相互作用的 结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主的组织或因子的结合，这些宿主的组织或因子包括免疫系统的多种细胞(例如效应细胞)及经典补体系统的第一成分(Clq)。本文所使用的术语抗体的“抗原结合部分”(或“抗体部分”)是指保留特异性结合 抗原(例如B7-H4)的能力的抗体的一个或多个片段。已经显示抗体的抗原结合功能可以 由全长抗体的片段来实现。术语抗体的“抗原结合部分”中所涵盖的结合片段的实例包括 (i)Fab片段，其为由\、VH、(^结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，为包括在铰 链区由二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fab’片段，它实质上是带有铰链区部 分的 Fab (参见，FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul 编著，第 3 版 1993) ； (iv)由 Vh 及 ChI 结构 域组成的Fd片段；(ν)由抗体的单臂的\及Vh结构域组成的Fv片段；(vi) dAb片段(Ward 等，(1989) Nature 341 :544_546)，它由Vh结构域组成；(vii)分离的互补决定区(CDR)；以 及(viii)纳米抗体(nanobody)，其为含有单可变结构域及两个恒定结构域的重链可变区。 此外，虽然Fv片段的两个结构域即\与Vh是由分开的基因编码的，但是可以使用重组方 法由合成接头将它们连接起来，使得它们作为单一蛋白链得以制备，其中\及\区域配对 形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等(1988) Science 242 :423_426 ；及 Huston 等(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879_5883)。术语抗体的“抗原结合部分” 也旨在涵盖此类单链抗体。这些抗体片段可通过本领域技术人员已知的常规方法获得，并 且对于这些片段进行的有用性的筛选与筛选完整抗体的方式相同。本文所使用的“分离的抗体”指这样的抗体，即其基本上没有具有不同抗原特异性 的其它抗体(例如，特异性结合B7-H4的分离的抗体基本上没有特异性结合非B7-H4的其 它抗原的抗体)。然而，特异性结合B7-H4的分离的抗体可对其它抗原，诸如来自其它物种 的B7-H4分子具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上没有其它细胞材料和/或化 学物质。本文所所使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单一分子组分的 抗体分子制备物。单克隆抗体组合物显示了针对特定表位的单一结合特异性及亲和力。本 文所使用的术语“人抗体”或“人序列抗体”意指包括具有这样的可变区的抗体，即在这些 可变区中构架区及CDR区均衍生自人类种系免疫球蛋白序列。此外，如果该抗体含有恒定 区，则该恒定区也衍生自人类种系免疫球蛋白序列。人抗体可包括后期修饰，所述修饰包括 天然或人为修饰。本发明的人抗体可以包括不是由人类种系免疫球蛋白序列所编码的氨基 酸残基(例如，在体外由随机诱变或位点特异性诱变引入的突变或在体内由体细胞突变引 入的突变)。然而，本文所使用的术语“人抗体”并非意指包括以下抗体其中衍生自另一个 哺乳动物物种(诸如小鼠)的种系的CDR序列被移植到人类构架区序列上。术语“人单克隆抗体”，其在“人”后面可包括术语“序列”，是指显示出单一结合特 异性的抗体，这些抗体具有这样的可变区，即其中构架区和⑶R区均衍生自人类种系免疫 球蛋白序列。在一个实施方案中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，该杂交瘤包括从转基因非人 类的动物(例如转基因小鼠)获得的B细胞，所述动物具有包含融合至永生化细胞的人类 重链转基因及轻链转基因的基因组。本文使用的术语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有 人抗体，诸如(a)从动物(例如小鼠)中分离的抗体，该动物对于人类免疫球蛋白基因是转 基因的或转染色体的，或从由其制备出的杂交瘤分离的抗体(以下将进一步说明)；(b)从 经转化以表达人抗体的宿主细胞(例如转染瘤)中分离的抗体，(c)从重组的组合人抗体文库中分离的抗体，以及(d)通过任何其它方法来制备、表达、产生或分离的抗体，其中所 述方法包括将人类免疫球蛋白基因序列剪接到其它DNA序列中。此类重组人抗体具有这样 的可变区，即其中构架区及CDR区均衍生自于人类种系免疫球蛋白序列。然而，在某些实施 方案中，此类重组人抗体可经受体外诱变(或者，在使用人类Ig序列转基因的动物时，经受 体内体细胞诱变)，并且因此重组抗体的Vh和\区域的氨基酸序列为这样的序列其尽管 衍生自人类种系Vh和\序列并与之相关，但是并不天然存在于体内人抗体种系所有组成成 分之中。术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体种类(例如IgM或IgGl)。短语 “识别抗原的抗体”与“对抗原特异的抗体”在本文中可与术语“特异性结合抗原的抗体”互
换使用。术语“人抗体衍生物”是指人抗体的任何经修饰的形式，例如，该抗体与另一种试 剂或抗体的缀合物。术语“人源化抗体”意指以下抗体，即其中衍生自另一个哺乳动物物种 (诸如小鼠)的种系的CDR序列被移植到人类构架序列上。可以在人类构架序列中进行额 外的构架区修饰。术语“嵌合抗体”意指以下抗体，其中可变区序列衍生自一个物种而恒定区序列 衍生自另一个物种，诸如其中可变区序列衍生自小鼠抗体而恒定区序列衍生自人抗体的抗 体。术语“抗体模拟物”意指能够模拟抗体结合抗原之能力的分子，但是它们不局限于 天然抗体结构。此类抗体模拟物的实例包括但不限于亲和体(AfTibody)、经设计的锚蛋白 重复蛋白(DARPin)、抗运载蛋白(Anticalin)、Avimer、以及万能抗体(Versabody)，所有这 些应用这样的结合结构，即当它们模拟传统抗体结合时，所述结构产自不同的机制并且通 过不同的机制作用。如本文所使用的术语“配偶体分子”指在抗体_配偶体分子缀合物中与抗体缀合 的实体。配偶体分子的实例包括药物、毒素、标记分子(包括但不限于肽和小分子标记，诸 如荧光染料标记，以及单原子标记，诸如放射性同位素)、蛋白质以及治疗剂。如本文所用，“特异性结合人B7-H4”的抗体意图指这样的抗体，其以Ix 10_7M或更 小，更优选5χ10_8Μ或更小，更优选3χ 10、或更小，更优选Ix 10、或更小，甚至更一般地 5x ICT9M或更小的Kd结合人Β7-Η4。本文使用的术语“基本上不结合”蛋白质或细胞是指不结合或不以高亲和力结合 蛋白质或细胞，即，以1Χ10_6Μ或更大，更优选为1Χ10_5Μ或更大，更优选为1Χ10_4Μ或更 大，更优选为1Χ10_3Μ或更大，甚至更优选为1Χ10_2Μ或更大的Kd结合蛋白质或细胞。本文使用的术语"Kass。。”或“Ka”旨在表示特定的抗体-抗原相互作用的结合速率， 而本文使用的术语"Kdis”或“K/’旨在表示特定的抗体-抗原相互作用的解离速率。本文使 用的术语“KD”旨在表示解离常数，它是由&与1之比(即Kd/Ka)得到，并被表示为摩尔浓 度(M)。抗体的Kd值可以使用本领域成熟的方法得以确定。确定抗体的Kd的优选方法是 通过使用表面等离子共振，优选使用诸如Biaeore 系统的生物传感器系统。如本文所使用的那样，术语IgG抗体的“高亲和性”指抗体对于靶抗原具有Ix 10_7M或更小、更优选5x IO-8M或更小、甚至更优选IxlO-8M或更小、甚至更优选5x 10_9M或 更小并且甚至更优选Ix IO-9M或更小的KD。然而，“高亲和性”结合对于其它抗体同种型可以不同。例如，IgM同种型的“高亲和性”结合指抗体具有ICT6M或更小、更优选ICT7M或更 小、甚至更优选10_8M或更小的KD。如本文所使用的那样，术语“受试者，，包括任何人类或非人类动物。术语“非人类 动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物及非哺乳动物，诸如非人灵长类动物、绵羊、犬、猫、 马、奶牛、鸡、两栖动物、爬行动物等等。符号“_”不管用作键还是与键正交显示，均表明这样的点，其中所显示的部分在该 点与分子的剩余部分、固相支持物等连接。除非另作说明，术语“烷基”，就其本身或作为另一个取代基的部分，是指直链或支 链的或环状烃基、或它们的组合，其可以是完全饱和的、单不饱和的、或多不饱和的，并且可 包括二价以及多价基团，具有所指定的碳原子数目(即C1-Cltl是指1至10个碳原子)。饱 和烃基的实例包括但不限于以下基团，诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异 丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基、以及(例如)正戊基、正己基、正庚基、 正辛基的同系物或异构体，等等。不饱和烷基基团是具有一个或多个双键或三键的基团。 不饱和烷基基团的实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、丁烯基、2-异戊烯基、2-( 丁二烯 基)、2，4_戊二烯基、3-(1，4_戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基以及3-丙炔基、3- 丁炔基，以 及更高级同系物以及异构体。除非另有说明，术语“烷基”还意在包括那些以下详细说明的 烷基衍生物，诸如“杂烷基”。限于烃基基团的烷基基团被称为“同烷基(homoalkyl) ”。术语“亚烷基”其本身或作为另一个取代基的部分是指衍生自链烷的二价基团，例 如但不限于-CH2CH2CH2CH2-,并且进一步包括那些如下说明为“杂亚烷基”的基团。一般地， 烷基(或亚烷基)基团将具有1到24个碳原子，其中具有10个或更少碳原子的那些基团 在本发明中是优选的。“低级烷基”或“低级亚烷基”是较短链的烷基或亚烷基基团，通常具 有八个或更少的碳原子。除非另作说明，术语“杂烷基”就其本身或与另一个术语组合，是指稳定的直链或 支链、或环状烃基、或它们的组合，其由所说明的数目的碳原子以及至少一个杂原子组成， 其中所述杂原子选自0、N、Si和S，并且其中氮、碳、以及硫原子可任选地被氧化，并且氮 杂原子可任选地被季铵化。一个或多个杂原子0、N、S、及Si可位于杂烷基基团的任何内 部位置，或可位于该烷基基团附着于该分子的其余部分的位置。实例包括但不限于-CH2 -CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N (CH3) -CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S (0) -CH3、-CH 2-CH2-S (O)2-CH3、-CH = CH-O-CH3、-Si (CH3) 3、-CH2-CH = N-OCH3 和-CH = CH-N(CH3)-CH3。 多达两个杂原子可以是连续的，例如诸如-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si (CH3) 3。类似地，术语 “杂亚烷基”就其本身或作为另一个取代基的部分是指衍生自杂烷基的二价基，例如但不 限于-CH2-CH2-S-CH2-CH2-以及-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于杂亚烷基基团，杂原子也可 占据链末端的任一端或两端(例如，亚烷氧基、亚烷二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基等 等)。术语“杂烷基”与“杂亚烷基”包括聚(乙二醇)及其衍生物(参见例如，Shearwater Polymers Catalog，2001)。此外，对于亚烷基以及杂亚烷基连接基团，书写连接基团的分子 式的方向并不表示连接基团的方向。例如，式-C(O)2R'-代表-C(O)2R'-以及-R’ C(O)2-0与术语“烷基”或“杂烷基”组合使用的术语“低级”是指具有1到6个碳原子的部 分。术语“烷氧基”、“烷氨基”、“烷基磺酰基”、以及“烷硫基”(或硫代烷氧基)都是以它们的常规意义使用，并分别指通过氧原子、氨基基团、SO2基团、或硫原子附着于该分子的 其余部分的那些烷基基团。术语“芳基磺酰基”是指通过SO2基团附着于该分子其余部分的 芳基基团，且术语“巯基”是指SH基团。一般而言，“酰基取代基”也选自以上所给出的组。在本文中使用的术语“酰基取 代基”指附着于羰基碳并满足其化合价的基团，该羰基碳直接或间接地附着于本发明的化 合物的多环核上。除非另作说明，术语“环烷基”与“杂环烷基”，就它们本身或与其它术语组合，分别 表示环型的取代或未取代的“烷基”以及取代或未取代的“杂烷基”。另外，对于杂环烷基， 杂原子可占据这样的位置，即杂环在该位置上附着于分子的其余部分。环烷基的实例包括 但不限于环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等等。杂环烷基的实例包括但 不限于1-(1，2，5，6-四氢吡啶基)、1_哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、 四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基 等等。环结构的杂原子以及碳原子可任选地被氧化。除非另作说明，术语“卤”或“卤素”，就它们自身或作为另一个取代基的部分，是指 氟、氯、溴、或碘原子。此外，诸如“卤烷基”的术语是指包括单卤烷基以及多卤烷基。例如， 术语“卤(C1-C4)烷基”旨在包括但不限于三氟甲基、2，2，2_三氟乙基、4-氯代丁基、3-溴丙
其绝绝寸寸。除非另作说明，术语“芳基”是指取代或未取代的多不饱和的芳香烃取代基，它可 以是单一的环或多环(优选地1至3个环)，这些环稠合在一起或以共价键相连接。术语 “杂芳基”指这样的芳基基团(或环)，即所述芳基基团(或环)含有一至四个选自N、0、以 及S的杂原子，其中氮、碳以及硫原子任选地被氧化，并且氮原子任选地被季铵化的。杂芳 基可以通过杂原子附着于该分子的其余部分。芳基以及杂芳基基团的非限制性实例包括 苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、 4-咪唑基、吡嗪基、2- P恶唑基、4-喷唑基、2-苯基-4- 唑基、5- 唑基、3-异嘴唑基、 4-异唑基、5-异巧悉唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻 吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌 呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹 啉基、以及6-喹啉基。以上提到的每一个芳基以及杂芳基环体系的取代基选自以下描述的 可接受的取代基。“芳基”以及“杂芳基”还包括这样的环体系，即其中一个或多个非芳香环 体系被稠合、或者以其它方式结合至芳基或杂芳基体系上。简言之，术语“芳基”当与其它术语(例如芳氧基、芳硫基、芳烷基)组合使用时， 包括以上定义的芳基环以及杂芳基环。因此，术语“芳烷基”意在包括其中芳基基团附着于 烷基基团的那些基团(例如，苯甲基、苯乙基、吡啶基甲基等等)，其中所述的烷基基团包括 其中碳原子(例如，亚甲基基团)已被例如氧原子取代的那些烷基基团(例如苯氧基甲基、 2_吡啶基氧基甲基、3-(1_萘氧基)丙基等等)。以上术语(例如“烷基”、“杂烷基”、“芳基”、以及“杂芳基”)各自均包括指定基团 的取代以及未取代的形式。以下提供每个类型基团的优选取代基。烷基以及杂烷基(包括那些经常提到的如亚烷基、链烯基、杂亚烷基、杂烯 基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基、以及杂环烯基)的取代基一般分别称为“烷基取代基”以及“杂烷基取代基”，并且它们可以是一个或多个基团，这些基团选自但不限 于-OR，、= 0、= NR，、= N-OR，、-NR，R”、-SR，、-卤素、-SiR' R”R”，、-OC (0)R，、-C(O) R，、-CO2R'、-CONR' R”、-OC (0) NR，R”、-NR” C (0) R，、-NR，-C (0) NR” R”，、-NR” C (0) 2R，、-NR-C(NR，R”R”，) = NR””、-NR-C(NR，R”)= NR””、_S (0) R，、_S (0) 2R，、_S (0) 2NR，R",-NRSO2R' 、-CN和-NO2，数量在从0到(2m’ +1)的范围内，其中m’是此类基团的碳原子的总数。R’、 R”、R”’以及R””各自均优选地独立地指氢、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基， 例如取代有1至3个卤素的芳基、取代或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基基团、或芳烷 基基团。当本发明的化合物包括超过一个R基团时，例如，当存在超过一个这些基团时，这 些R基团各自均独立地选为R’、R”、R”’以及R””基团。当R’和R”附着于相同的氮原子 时，它们可与氮原子组合成5、6、或7元环。例如，-NR’ R”旨在包括，但不局限于，1-吡咯烷 基以及4-吗啉基。从以上取代基的讨论中，本领域技术人员会明白术语“烷基”旨在包括 这样的基团，即所述基团包括结合到非氢基团的基团上的碳原子，诸如卤烷基(例如，-CF3 和-CH2CF3)以及酰基(例如，-C (0) CH3、-C (0) CF3、-C (0) CH2OCH3 等)。类似于对烷基基团所说明的取代基，芳基取代基以及杂芳基取代基通常 分别被称为“芳基取代基”以及“杂芳基取代基”，并且是不同的并选自，例如卤 素、-OR，、 =0、 = NR，、 = N-OR，、-NR，R”、-SR，、-卤素、-SiR，R” R”，、-OC (0) R，、-C (0) R，、-CO2R，、-CONR，R，，、-OC (0) NR，R，，、-NR，，C (0) R，、-NR，-C (0) NR” R”，、-NR” C (0) 2R，、-NR-C (NR，R” ) = NR”，、-S (0) R，、-S (0) 2R，、-S (0) 2NR，R”、-NRSO2R' 、-CN和-NO2, -R’，-N3, -CH(Ph)2、氟代(C1-C4)烷氧基和氟代(C1-C4)烷基，并且其数目从0 到芳香环体系上开放化合价的总数的范围内；并且其中R’、R”、R”’以及R””优选独立地选 自氢、(C1-C8)烷基以及杂烷基、未取代的芳基和杂芳基、(未取代的芳基P(C1-C4)烷基、以 及(未取代的芳基)氧基-(C1-C4)烷基。当本发明的化合物包括超过一个R基团时，例如， 当存在超过一个这些基团时所述R基团各自均被独立地选为R’、R”、R”’以及R””基团。任选地，在芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个芳基取代基可被 式-T-C(O)-(CRR' )q-u-的取代基取代，其中，T和U独立为-NR-、_0_、-CRR，-或单键； 且q是从0到3的整数。备选地，在芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可任选被 式-A- (CH2) r-B-的取代基取代，其中，A 和 B 独立地为-CRR，-、-0-、-NR-、-S-、-S (0) -、-S (0) 2 -、-S(0)2NR’_或单键；且r是从1到4的整数。如此形成的新环的单键之一可任选被双键代 替。备选地，在芳基或杂芳基环的相邻原子的取代基上的两个取代基可任选地被式-(CRR’) S-X- (CR”R”’) d-的取代基取代，其中s和d独立地是从0至3的整数，并且X是-0-、-NR’ -、-5-、-5(0)-、-5(0)2-或-5(0)2殿，。优选地，取代基R、R，、R”以及R”，独立地选自氢或取代 或未取代的(C1-C6)烷基。本文所使用的术语“二磷酸酯”包括但不限于含有两个磷酸酯基团的磷酸的酯。术 语“三磷酸酯”包括但不限于含有三个磷酸酯基团的磷酸的酯。例如，具有二磷酸酯或三磷 酸酯的特定药物包括三磷酸酯本文使用的术语“杂原子”包括氧(0)、氮(N)、硫(S)和硅(Si)。除非上下文另有说明，符号“R”是一个通用缩写，其代表选自以下的取代基取代 或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、 以及取代或未取代的杂环基基团。在以下各分部中进一步详细地说明了本发明的不同方面。具有特定功能件质的抗B7-H4抗体本发明的抗体由该抗体的特定功能特征或性质所表征。例如，该抗体特异性结合 人B7-H4，诸如在细胞表面上表达的人B7-H4。优选地，本发明的抗体以高亲和性结合人 B7-H4，例如以Ix 10_7M或更小的KD，更优选以5x 10_8M或更小的Kd,以及甚至更优选以Ix IO-8M或更小的Kd结合。本发明的抗B7-H4抗体结合人B7-H4并且优选显示下列性质中的 一种或更多种(a)以Ix 10_8M或更小的亲和性结合人B7-H4 ；(b)被表达B7-H4的细胞内化；(c)对表达B7-H4的细胞显示出抗体依赖性细胞毒性(ADCC)；和(d)当缀合至细胞毒素时在体内抑制表达B7-H4的细胞的生长。在一个优选的实施方案中，该抗体显示性质(a)、(b)、(C)和(d)的至少两种。在 一个更优选的实施方案中，该抗体显示性质(a)、(b)、(c)和(d)的至少三种。在甚至一个 更优选的实施方案中，该抗体显示所有四种性质(a)、(b)、(c)和(d)。在另一个优选的实 施方案中，该抗体以5x IO-9M或更小的亲和性结合B7-H4。在又一个优选的实施方案中，当 该抗体缀合至细胞毒素时其在体内抑制表达B7-H4的肿瘤细胞的生长。优选地，本发明的抗体以5x 10、或更小的Kd结合B7-H4蛋白，以3x 10、或更 小的Kd结合B7-H4蛋白，以Ix IO-8M或更小的Kd结合B7-H4蛋白，以7x ICT9M或更小的Kd 结合B7-H4蛋白，以6x 10_9M或更小的Kd结合B7-H4蛋白或以5x 10_9M或更小的Kd结合 B7-H4蛋白。抗体对B7-H4的结合亲和性可以通过例如标准的BIAC0RE分析进行评价。评估抗体对B7-H4的结合能力的标准测定法是本领域公知的，例如包括ELISA、蛋 白质印迹、RIA和流式细胞分析。抗体的结合动力学(例如，结合亲和力)也可通过本领域 公知的标准测定法进行评估，诸如通过elisa、斯卡查德和Biacore 系统分析。作为另一 个实例，本发明的抗体可与乳腺癌肿瘤细胞系例如SKBR3细胞系结合。单克隆抗体1G11、2A7、2F9、12E1 和 13D12本发明的示例性抗体包括如在PCT申请PCT/US2006/061816中分离并结构表征的 人单克隆抗体1G11、2A7、2F9、12E1和13D12，所述PCT申请在此全文引入作为参考。IGlU 2A7、2F9、12E1和13D12的乂11氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO :1、2、3、4和5中。IGlU 2A7、2F9、12E1和13D12的&氨基酸序列分别显示在SEQ ID N0:6、7、8、9和10中。
考虑到这些抗体中每一种均可以结合B7-H4，这些V1^nt序列可以“混合并匹配”， 从而产生本发明的其它的抗B7-H4结合分子。B7-H4与此类“混合并匹配的”抗体的结合可 以用上文所述的结合测定法(例如FACS或ELISA)来检测。优选地，当Vh和\链混合并匹 配时，来自特定VH/VL配对的Vh序列被替换为结构上相似的Vh序列。同样，一般地，来自特 定VH/\配对的\序列被替换为结构上相似的\序列。因此，在一个方面，本发明提供分离 的单克隆抗体或其抗原结合部分，其含有(a)包含选自SEQ ID NO :1、2、3、4和5的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含选自SEQ ID NO :6、7、8、9和10的氨基酸序列的轻链可变区；其中该抗体 与B7-H4、优选人B7-H4特异性结合。优选的重链和轻链组合包括(a)包含SEQ ID NO=I的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO 6的氨基酸序列的轻链可变区；或(c)包含SEQ ID NO 2的氨基酸序列的重链可变区；和(d)包含SEQ ID NO 7的氨基酸序列的轻链可变区；或(e)包含SEQ ID NO 3的氨基酸序列的重链可变区；和(f)包含SEQ ID NO 8的氨基酸序列的轻链可变区；或(g)包含SEQ ID NO 4的氨基酸序列的重链可变区；和(h)包含SEQ ID NO 9的氨基酸序列的轻链可变区；或(i)包含SEQ ID NO 5的氨基酸序列的重链可变区；和(j)包含SEQ ID NO 10的氨基酸序列的轻链可变区。在另一方面，本发明提供包含1G11、2A7、2F9、12E1和13D12的重链和轻链CDR1、 CDR2和CDR3或其组合的抗体。1G11、2A7、2F9、12E1和13D 12的Vh CDRl的氨基酸序列分别 示于 SEQ ID NO :11、12、13、14 和 15 中。1G11、2A7、2F9、12E1 和 13D12 的 Vh CDR2 的氨基酸 序列分别示于 SEQ ID NO :16、17、18、19 和 20 中。1G11、2A7、2F9、12E1 和 13D12 的 Vh CDR3 的氨基酸序列分别示于 SEQ ID NO :21、22、23、24 和 25 中。1G11、2A7、2F9、12E1 和 13D12 的 Vk CDRl 的氨基酸序列分别示于 SEQ ID NO :26、27、28、29 和 30 中。1G11、2A7、2F9、12E1 和 13D12&VK CDR2 的氨基酸序列分别示于 SEQ ID NO :31、32、33、34和 35 中。1G11、2A7、2F9、 12E1和13D12的Vk CDR3的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO :36、37、38、39和40中。CDR区 用 Kabat 系统(Kabat, Ε· A.等(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版，U. S. D印artment of Health and Human Services，NIH 出版号 91-3242)描述。考虑到称为1G11、2A7、2F9、12E1和13D12的人抗体的每一个均能与B7-H4结合， 并且抗原结合特异性主要是由⑶R1、⑶R2和⑶R3区提供的，因此Vh⑶R1、⑶R 2和⑶R 3 序列与Vk⑶RlWDR 2和⑶R 3序列可以“混合并匹配”(即来自不同抗体的⑶R可以混合 并匹配，尽管每个抗体必须含有Vh⑶Rl、⑶R 2和⑶R 3 ^P Vk CDR 1、⑶R 2和⑶R 3)，从 而产生本发明的其它的抗B7-H4结合分子。B7-H4与此类“混合并匹配的”抗体的结合可以 用上文所述的结合测定法(例如FACS、ELiSA、Biacore 系统分析)测试。优选地，当Vh ⑶R序列混合并匹配时，来自特定Vh序列的⑶Rl、⑶R2和/或⑶R3序列被替换为结构上相 似的⑶R序列。同样，当\⑶R序列混合并匹配时，来自特定￥￡序列的⑶R1、⑶1 2和/或 CDR3序列一般被替换为结构上相似的CDR序列。对于本领域技术人员而言显而易见的是，通过将一个或多个Vh和/或\⑶R区序列替换为来自本文公开的单克隆抗体1G11、2A7、 2F9、12E1和13D12的⑶R序列的结构上相似的序列，可以产生新的Vh和Vl序列。因此，在 另一个方面，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其含有(a)包含选自SEQ ID NO 11、12、13、14和15的氨基酸序列的重链可变区CDRl ；(b)包含选自SEQ ID NO 16、17、18、19和20的氨基酸序列的重链可变区CDR2 ；(c)包含选自SEQ ID NO :21、22、23、24和25的氨基酸序列的重链可变区CDR3 ；(d)包含选自SEQ ID NO 26、27、28、29和30的氨基酸序列的轻链可变区CDRl ；(e)包含选自SEQ ID NO :31、32、33、34和35的氨基酸序列的轻链可变区CDR2 ；和(f)包含选自SEQ ID NO :36、37、38、39和40的氨基酸序列的轻链可变区CDR3 ；其 中该抗体与B7-H4、优选与人B7-H4特异性结合。在优选实施方案中，该抗体含有(a)包含SEQ ID NO 11的重链可变区CDRl ；(b)包含SEQ ID NO 16的重链可变区CDR2 ；(c)包含SEQ ID NO 21的重链可变区CDR3 ；(d)包含SEQ ID NO 26的轻链可变区CDRl ；(e)包含SEQ ID NO 31的轻链可变区CDR2 ；和(f)包含SEQ ID NO 36的轻链可变区CDR3。在另一优选实施方案中，该抗体含有(a)包含SEQ ID NO 12的重链可变区CDRl ；(b)包含SEQ ID NO 17的重链可变区CDR2 ；(c)包含SEQ ID NO 22的重链可变区CDR3 ；(d)包含SEQ ID NO 27的轻链可变区CDRl ；(e)包含SEQ ID NO 32的轻链可变区CDR2 ；禾口(f)包含SEQ ID NO 37的轻链可变区CDR3。在另一优选实施方案中，该抗体含有(a)包含SEQ ID NO 13的重链可变区CDRl ；(b)包含SEQ ID NO 18的重链可变区CDR2 ；(c)包含SEQ ID NO 23的重链可变区CDR3 ；(d)包含SEQ ID NO 28的轻链可变区CDRl ；(e)包含SEQ ID NO 33的轻链可变区CDR2 ；禾口(f)包含SEQ ID NO 38的轻链可变区CDR3。在另一优选实施方案中，该抗体含有(a)包含SEQ ID NO 14的重链可变区CDRl ；(b)包含SEQ ID NO 19的重链可变区CDR2 ；(c)包含SEQ ID NO 24的重链可变区CDR3 ；(d)包含SEQ ID NO 29的轻链可变区CDRl ；(e)包含SEQ ID NO 34的轻链可变区CDR2 ；禾口(f)包含SEQ ID NO 39的轻链可变区CDR3。在另一优选实施方案中，该抗体包括
(a)包含SEQ ID NO 15的重链可变区CDRl ；(b)包含SEQ ID NO 20的重链可变区CDR2 ；(c)包含SEQ ID NO 25的重链可变区CDR3 ；(d)包含SEQ ID NO 30的轻链可变区CDRl ；(e)包含SEQ ID NO 35的轻链可变区CDR2 ；禾口(f)包含SEQ ID NO 40的轻链可变区CDR3。本领域公知，不依赖于⑶Rl和/或⑶R2结构域，单独的⑶R3结构域就能够决定抗 体对于相关抗原的结合特异性，并且基于共同的CDR3序列可以预测性地产生具有相同结 合特异性的多种抗体。参见，例如，Klimka等，British J. of Cancer 83(2) =252-260(2000) (描述了仅使用鼠抗⑶30抗体Ki-4的重链可变结构域⑶R3产生人源化抗⑶30抗体)； Beiboer 等，J. Mol Biol. 296 :833_849 (2000)(描述了仅使用亲本鼠 M0C-31 抗 EGP-2 抗体 的重链CDR3序列产生重组上皮糖蛋白-2 (EGP-2)抗体)；Rader等，Proc. Natl. Acad. Sci U. S. Α. 95 :8910-8915(1998)(描述了使用鼠抗整联蛋白α ν β 3抗体LM609的重链和轻链可 变CDR3结构域的一组人源化抗整联蛋白α νβ 3抗体，其中每个成员抗体在CDR3结构域之 外含有不同的序列，并且能够与亲本鼠抗体结合相同的表位，其亲和力与亲本鼠抗体一样 高或更高)；Barbas 等，J.Am· Chem. Soc. 116 :2161_2162 (1994)(公开了 CDR3 结构域对抗原 结合提供了最重要的贡献)；Barbas 等，Proc，Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 92 :2529_2533 (1995) (描述了抗人胎盘DNA的三种Fab (SI-1，SI-40和SI-32)的重链CDR3序列移植入抗破伤 风类毒素Fab的重链上，由此替换了存在的重链⑶R3，并且证明单独的⑶R3提供结合特 异性)；和Ditzel等，J. Immunol. 157 :739_749 (1996)(描述了移植研究，其中仅向单特异 性IgG破伤风类毒素结合Fab p313抗体转移亲本多特异性Fab LNA3的重链⑶R3足以保 留亲本 Fab 的结合特异性)；Berezov 等，BIAjournal 8 =Scientific Review 8(2001)(描 述了基于抗HER2单克隆抗体CDR3的肽模拟物)；Igarashi等，J. Biochem(Tokyo) 117 452-7(1995)(描述了相应于抗磷脂酰丝氨酸抗体CDR3结构域的12个氨基酸的合成多 肽)；Bourgeois等，J.Virol互807_10 (1998)(显示了衍生自抗呼吸道合胞病毒(RSV) 抗体重链CDR3结构域的单肽能够在体外中和该病毒)；Levi等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.巡4374-8 (1993)(描述了基于鼠抗HIV抗体重链CDR3结构域的肽)；Polymenis和 Stoller, J. Immunol. 152 5218~5329 (1994)(描述了通过嫁接 Z-DNA-结合抗体的重链CDR3 区域使scFv能够结合)；以及Xu和Davis，Immunity 13 :37_45 (2000)(描述了重链CDR的 多样性足以允许除此之外是相同的IgM分子在各种半抗原和蛋白质抗原之间进行区分)。 也参见美国专利号 6，951，646,6, 914，128,6, 090，382,6, 818，216,6, 156，313,6, 827，925、 5，833，943,5, 762，905和5，760，185，其描述了通过单CDR结构域定义的专利抗体。上述每 一参考文献都全文弓I入作为参考。因此，在某些方面，本发明提供包含一个或多个来自非人抗体诸如小鼠或大鼠抗 体的重链和/或轻链CDR3结构域的单克隆抗体，其中该单克隆抗体能够与B7-H4特异性 结合。在某些实施方案中，这些本发明的包含一个或多个来自非人抗体的重链和/或轻链 CDR3结构域的抗体与相应的亲本非人抗体(a)能够竞争结合；(b)保留功能特性；(c)结合 相同的表位；和/或(d)具有类似的结合亲和力。在其它方面，本发明提供包含一个或 个来自第一人抗体(例如，诸如从非人动物获得的人抗体)的重链和/或轻链CDR3结构域的单克隆抗体，其中该第一人抗体能够与 B7-H4特异性结合，并且其中来自该第一人抗体的CDR3结构域代替了缺乏对B7-H4的结合 特异性的人抗体中的CDR3结构域，从而产生能够与B7-H4特异性结合的第二人抗体。在 一些实施方案中，本发明的包含一个或多个来自第一人抗体的重链和/或轻链⑶R3结构域 的抗体与相应的亲本第一人抗体(a)能够竞争结合；(b)保留功能特性；(c)结合相同的表 位；和/或(d)具有类似的结合亲和力。具有特定种系序列的抗体在某些实施方案中，本发明的抗体包含来自特定种系重链免疫球蛋白基因的重链 可变区和/或来自特定种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。例如，在一个优选实施方案中，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合 部分，其包含产生自或衍生自人VH 4-34基因的重链可变区，其中该抗体与B7-H4特异性结 合。在另一优选实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含 产生自或衍生自人Vh 3-53基因的重链可变区，其中该抗体与B7-H4特异性结合。在另一优选实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分或 片段，其包含产生自或衍生自组合的人Vh 3-9/D3-10/JH6b基因的重链可变区，其中该抗体 与B7-H4特异性结合。在另一优选实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分， 其包含产生自或衍生自人Vk A27基因的轻链可变区，其中该抗体与B7-H4特异性结合。在另一优选实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分或 片段，其包含产生自或衍生自组合的人Vk L6/JK1基因的轻链可变区，其中该抗体与B7-H4 特异性结合。在另一优选实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分， 其中该抗体(a)包含产生自或衍生自AVh 4_34基因、人Vh 3_53基因或组合的人Vh 3-9/ D3-10/JH6b基因(所述基因分别编码SEQ ID NO :51、52和53所示的氨基酸序列)的重链 可变区；(b)包含产生自或衍生自AVk A27基因或组合的AVk L6/JK1基因(所述基因分 别编码SEQ ID NO 54和55所示的氨基酸序列)的轻链可变区；且(c)该抗体与B7-H4、一般为人B7-H4特异性结合。分别具有Vh 4-34和Vk A27的 Vh和Vk的抗体的实例是IGll和13D12。分别具有Vh 3-53和Vk A27的Vh和Vk的抗体的 实例是2A7和2F9。分别具有Vh 3-9/D3_10/JH6b和Vk L6/JK1的Vh和Vk的抗体的实例是 12E1。如在本文中所使用的那样，如果一种人抗体的可变区是从使用人种系免疫球蛋白 基因的系统中获得的，则该人抗体包含“产生自”或“衍生自，，特定种系序列的重链或轻链 可变区。此类系统包括用目标抗原免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠，或者用目标 抗原筛查展示在噬菌体上的人免疫球蛋白基因文库。“产生自”或“衍生自”人种系免疫球 蛋白序列的人抗体可以这样鉴定将该人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸 序列进行比较，并且选择在序列上最接近于该人抗体序列(即有最高％同一性)的人种系 免疫球蛋白序列。“产生自”或“衍生自”特定人种系免疫球蛋白序列的人抗体与该种系序列相比可能包含氨基酸差异，例如由于天然存在的体细胞突变或定点突变的有意引入而导 致的氨基酸差异。但是，选择的人抗体在氨基酸序列上与人种系免疫球蛋白基因编码的氨 基酸序列通常至少90%同一，并且含有当与其它物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如 鼠种系序列)相比较时确认该人抗体属于人类抗体的氨基酸残基。在某些情况下，人抗体 在氨基酸序列上与该种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列可以至少95%、或者甚至至少 96 %、97 %、98 %或99 %同一。一般地，衍生自特定人种系序列的人抗体展示出与该人种系 免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列有不超过10个氨基酸的差异。在某些情况中，该人抗体 可能展示出与该种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列有不超过5个、或者甚至不超过4、 3、2或1个氨基酸的差异。同源抗体在另一实施方案中，本发明的抗体包含这样的重链和轻链可变区，其中所述的重 链和轻链可变区包含与本文所述优选抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且其中该抗 体保留了本发明抗B7-H4抗体的所期望的功能特性。例如，本发明提供包含单克隆抗体或其结合部分的抗体-配偶体分子缀合物，其 中所述的抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中(a)该重链可变区包含与选自SEQ ID NO 1、2、3、4和5的氨基酸序列至少80%同 源的氨基酸序列；(b)该轻链可变区包含与选自SEQ ID NO :6、7、8、9和10的氨基酸序列至少80% 同源的氨基酸序列；(c)该抗体以1 X ICT7M或更低的Kd与人B7-H4结合；(d)该抗体与用B7-H4转染的人CHO细胞结合；和/或(e)当缀合至细胞毒素时，该抗体在体内抑制表达B7-H4的肿瘤细胞的肿瘤生长。在多个实施方案中，该抗体例如可以是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在另外的实施方案中，V1^P/或八氨基酸序列可以与上述序列85%、90%、95%、 96%、97%、98%或99%同源。具有与上述序列的Vh和Vl区高度(即80%或更高)同源的 Vh和&区的抗体可以如下获得诱变(例如定点诱变或PCR介导的诱变)编码SEQ ID NO 41、42、43、44、45、46、47、48、49和50的核酸分子，然后用本文描述的功能测定法测试所编 码的经改变抗体所保留的功能(即以上(c)、(d)和(e)所述的功能)。如本文所使用的，两个氨基酸序列之间的百分同源性等同于两个序列之间的百分 同一性。考虑到为了两个序列之间进行最佳比对所需而引入的空位的数目和每个空位的长 度后，两个序列之间的百分同一性是这两个序列共有的同一位点的数目的函数(即％同源 性=相同位点的数目/位点的总数X100)。两个序列之间的序列比较和百分同一性的确定 可以如下面的非限制性实施例中所述用数学算法实现。两个氨基酸序列之间的百分同一性可以用已经整合入ALIGN程序(2. 0版本)中 的 E. Meyers 和 W. Miller (Comput. Appl. Biosci.，4 11-17 (1988))的算法来确定，其使用 PAM120权重残基表，12的空位长度罚分以及4的空位罚分。另外，两个氨基酸序列之间的百 分同一性也可以用已经整合入GCG软件包(可从http://WWW. gcg. com获得)的GAP程序中 的 Needleman 和 Wunsch (J. Mol. Biol. 48 :444_453 (1970))的算法来确定，其使用 Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，16、14、12、10、8、6或4的空位权重，和1、2、3、4、5或6的长度权重。
另外地或者备选地，本发明的蛋白质序列可以进一步作为“查询序列”用于进 行公共数据库的检索，例如鉴定相关序列。此类检索可以用Altschul等(1990)J.Mol. Biol. 215 403-10的XBLAST程序(2. 0版本)进行。BLAST蛋白质检索可以用XBLAST程 序进行，得分=50，字长=3，以获得与本发明的抗体分子同源的氨基酸序列。为了获得 用于比较目的的空位比对，可以采用如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res. 25(17) 3389-3402所述的空位BLAST。当采用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用各自程序(例 如 XBLAST 和 NBLAST)的缺省参数。参见 http //www. ncbi. nlm. nih. gov。具有保守修饰的抗体在某些实施方案中，本发明的抗体包含含有⑶R1、⑶R2和⑶R3序列的重链可变区 和含有⑶R1、⑶R2和⑶R3序列的轻链可变区，其中这些⑶R序列中的一个或多个包含基于 本文所述优选抗体(例如1G11、2A7、2F9、12E1或13D12)的特定氨基酸序列或其保守修饰， 并且其中该抗体保留本发明抗B7-H4抗体的所需功能特性。因此，本发明提供一种包含单克隆抗体或其抗原结合部分的抗体-配偶体分子缀 合物，其中所述的抗体包含含有CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和含有CDR1、CDR2和 CDR3序列的轻链可变区，其中(a)该重链可变区CDR3序列包含选自SEQ ID NO :21、22、23、24和25的氨基酸序 列及其保守修饰的氨基酸序列；(b)该轻链可变区CDR3序列包含选自SEQ ID NO 36、37、38、39和40的氨基酸序 列及其保守修饰的氨基酸序列，(c)该抗体以1 X ICT7M或更低的Kd与人B7-H4结合；(d)该抗体与用B7-H4转染的人CHO细胞结合；和/或(e)当缀合至细胞毒素时，该抗体在体内抑制表达B7-H4的肿瘤细胞的肿瘤生长。在优选实施方案中，重链可变区CDR2序列包含选自SEQ ID NO :16、17、18、19和20 的氨基酸序列和其保守修饰的氨基酸序列；且轻链可变区CDR2序列包含选自SEQ ID NO 31、32、33、34和35的氨基酸序列和其保守修饰的氨基酸序列。在另一优选实施方案中，重 链可变区⑶Rl序列包含选自SEQ ID N0:ll、12、13、14和15的氨基酸序列和其保守修饰的 氨基酸序列；且轻链可变区⑶Rl序列包含选自SEQ ID NO :26、27、28、29和30的氨基酸序 列和其保守修饰的氨基酸序列。在多个实施方案中，抗体例如可以是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。本文使用的术语“保守的序列修饰”是指不会显著影响或改变含该氨基酸序列的 抗体的结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸替换、添加和缺失。可以通过本 领域公知的标准技术，诸如定点诱变和PCR介导的诱变，向本发明抗体中引入修饰。保守氨 基酸替换是其中将氨基酸残基替换为具有相似侧链的氨基酸残基的替换。具有相似侧链的 氨基酸残基的家族在本领域中已经定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨 酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰 胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨 酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、 异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本发明 抗体的CDR区内的一个或多个氨基酸残基可以被替换为来自相同侧链家族的其它氨基酸残基，并且可以检测改变的抗体所保留的功能。与本发明的抗B7-H4抗体结合相同表位的抗体在另一实施方案中，本发明提供与本发明的任意B7-H4单克隆抗体结合人B7-H4 上的相同表位的抗体(即能够与本发明的任意单克隆抗体交叉竞争结合B7-H4的抗体)。在 优选实施方案中，用于交叉竞争研究的参照抗体可以是单克隆抗体IGll (具有分别如SEQ ID NO :1和6所示的V1^Pt序列)，或单克隆抗体2A7(具有分别如SEQ ID NO :2和7所 示的Vh和\序列)，或单克隆抗体2F9 (具有分别如SEQ ID NO 3和8所示的Vh和\序 列)，或单克隆抗体12E1 (具有分别如SEQ ID NO 4和9所示的Vh和\序列)，或单克隆抗 体13D12(具有分别如SEQ ID NO :5和10所示的Vh和\序列)。此类交叉竞争抗体可以 根据它们在标准B7-H4结合测定法中与IG11、2A7、2F9、12E1或13D 12交叉竞争的能力来鉴 定。例如，可以利用BIAcore 系统分析、ELISA测定法或流式细胞分析来证明与本发明抗 体的交叉竞争。测试抗体抑制(例如)1G11、2A7、2F9、12E1或13D12与人B7-H4结合的能 力证明，该测试抗体可以与1G11、2A7、2F9、12E1或13D12竞争结合人B7-H4并因此与1G11、 2A7、2F9、12E1或13D12相同地结合人B7-H4上的相同表位。在优选实施方案中，结合与由 1G11、2A7、2F9、12E1或13D12所识别的人B7-H4上的相同表位的抗体是人单克隆抗体。工稈化抗体和修饰的抗体本发明的抗体进一步可以利用具有本文所公开的一种或多种Vh和/或\序列的 抗体作为起始材料来制备，以改造修饰的抗体，该修饰的抗体可具有与起始抗体不同的特 性。可以通过修饰一个或两个可变区(即％和/或VJ例如一个或多个⑶R区内和/或一 个或多个构架区内的一个或多个残基来改造抗体。另外地或备选地，可以通过修饰恒定区 内的残基来改造抗体，例如改变该抗体的效应功能。可以进行的一种类型的可变区改造是 CDR移植。抗体主要是通过位于六个重链和轻链互补决定区(OTR)中的氨基酸残基与靶抗 原相互作用。由于这个原因，⑶R内的氨基酸序列比⑶R外的序列在各个抗体之间更加多 样化。由于⑶R序列负责大多数抗体_抗原相互作用，因此通过构建如下的表达载体能够 表达模拟特定天然存在抗体的特性的重组抗体，其中所述的表达载体包括来自特定天然 存在抗体的CDR序列，该CDR序列被嫁接到来自具有不同特性的不同抗体的构架序列上 (参见，例如，Riechmann, L.等(1998)Nature 332 :323_327 Jones, P.等(1986)Nature 321 -.522-525 ；Queen, C.等(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 86 10029-10033 ；Winter 的美国专禾U 5，225，539 号，和 Queen 等的美国专利 5，530，101 ；5，585，089 ；5，693，762 和 6，180，370 号)。因此，本发明的另一个实施方案涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包 含含有⑶R1、⑶R2和⑶R3序列的重链可变区，该⑶R1、⑶R2和⑶R3序列分别包含选自SEQ ID NO :11、12、13、14 和 15，SEQ ID NO 16、17、18、19 和 20，和 SEQ ID NO :21、22、23、24 和 25的氨基酸序列，以及包含含有⑶R1、⑶R2和⑶R3序列的轻链可变区，该⑶R1、⑶R2和 CDR3 序列分别包含选自 SEQ ID NO :26、27、28、29 和 30，SEQ ID NO :31、32、33、34 和 35，和 SEQ ID NO :36、37、38、39和40的氨基酸序列。因此，此类抗体含有单克隆抗体1G11、2A7、 2F9、12E1或13D12的Vh和\⑶R序列，但是可能含有与这些抗体不同的构架序列。这些构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或发表的参考文献中获得。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在以下资源中发现 “VBase”人种系序列数据库(可从因特网上www, mrc-cpe. cam, ac. uk/vbase获得),以 及 Kabat, Ε. Α.等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五 版，U. S. Department of Health and Human Services, NIH 出版号 94-61242 ;Tomlinson, I. M.等(1992) “The Repertoire of Human Germline VaSequences Reveals about Fifty Groups of Vh Segments with DifferentHypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227 776-798 ；禾口Cox, J. P. L.等(1994)“ADirectory of Human Germ—line Vh Segments Reveals a Strong Bias in theirUsage”Eur. J. Immunol. 24 :827_836 ；其内容均引入本文作为参 考。作为另一个例子，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在Genbank数据库中 发现。例如，在HCo7 HuMAb小鼠中发现的下列重链种系序列可以根据如下Genbank登录 号获得1-69 (NG_0010109、NT_024637 和 BC070333)、3-33 (NG_0010109 和 NT_024637)和 3-7(NG_0010109*NT_024637)。作为另一个例子，在HCol2 HuMAb小鼠中发现的以下重链 种系序列可以根据如下Genbank登录号获得1_69 (NG_0010109、NT_024637和BC070333)、 5-51(NG_0010109 和 NT_024637)、4-34(NG_0010109 和 NT_024637)、3_30. 3(CAJ556644)和 (AJ406678)。人重链和轻链种系序列的另一来源是可从IMGT(http://imgt. cines. fr)获 得的人免疫球蛋白基因数据库。使用一种被称为缺口 BLAST的序列相似性检索方法将抗体蛋白质序列与编译 的蛋白质序列数据库进行比较(Altschul等人.(1997)Nucleic Acids Research 25: 3389-3402)，该方法是本领域技术人员公知的。BLAST是一种启发式算法，其中抗体序列和 数据库序列之间统计学显著的比对可能含有所比对的字的高评分的区段对(HSP)。延伸或 修剪无法提高其评分的区段对被称为命中(hit)。简要地说，翻译VBASE来源的核苷酸序 列(http://vbase. mrc-cpe. cam. ac. uk/vbase 1/1 ist2. php),保留介于 FRl 禾口 FR3 构架区 之间并且包含FRl和FR3构架区的区域。数据库序列的平均长度为98个残基。除去在蛋 白质全长上完全匹配的重复序列。使用除了低复杂性过滤器(关闭)以外采用缺省标准 参数的blastp程序，以及BL0SUM62的取代矩阵，对蛋白质进行BLAST检索，过滤前5个产 生序列匹配的命中。以全部6个阅读框翻译核苷酸序列，在数据库序列的匹配区段中不含 终止密码子的阅读框被认为是潜在的命中。随后用BLAST程序tblastx进行验证，该程序 以全部6个阅读框翻译抗体序列，并且将这些翻译与以全部6个框架动态翻译的VBASE核 苷酸序列进行比较。可与如上所述的VBASE类似地检索其它人种系序列数据库，诸如可从 IMGT(http://imgt. cines. fr)获得的数据库。同一性是抗体序列与蛋白质数据库之间在序列全长上完全氨基酸匹配。阳性(同 一性+替换匹配)不是同一，而是由BL0SUM62取代矩阵引导的氨基酸替换。如果抗体序列 以相同的同一性与两个数据库序列匹配，则阳性最强的命中被确定为匹配序列命中。用于本发明抗体的优选构架序列是在结构上类似于由所选择的本发明抗体使用 的构架序列，例如，类似于本发明优选的单克隆抗体使用的Vh 4-34构架序列(SEQ ID N0 51)和/ 或 Vh 3-53 构架序歹Ij (SEQ ID NO 52)和/ 或 Vh 3-9/D3_10/JH6b 构架序列(SEQ ID NO 53)和/或Vk A27构架序列(SEQ ID NO 54)和/或组合的Vk L6/JK1构架序列(SEQ ID NO 55)。Vh CDRl、CDR 2和CDR 3序列和Vk CDRl、CDR 2和CDR3序列可以被嫁接到与 该构架序列的来源种系免疫球蛋白基因具有同一序列的构架区上，或者CDR序列可以被嫁接到与该种系序列相比含有一个或多个突变的构架区上。例如，已经发现，在某些情况中， 将构架区内的残基进行突变对于保持或增强抗体的抗原结合能力是有利的(参见，例如， Queen 等的美国专利 5，530，101 ；5，585，089 ；5，693，762 和 6，180，370)。另一种类型的可变区修饰是突变V1^P /或Vk CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基 酸残基，从而改善目标抗体的一种或多种结合特性(例如亲和力)。可以进行定点诱变或 PCR介导的诱变，以引入突变，对抗体结合或者其它目标功能特性的影响可以用本文所述和 实施例中提供的体外或体内试验来评价。一般地引入(如上文所述的)保守修饰。这些突 变可以是氨基酸替换、添加或缺失，但是一般是替换。而且，一般改变CDR区内的不超过1、 2、3、4或5个残基。因此，在另一个实施方案中，本发明提供包含抗B7-H4单克隆抗体或其抗原结果 部分的抗体-配偶体分子缀合物，其中所述的抗体包含含有以下的重链可变区(a)Vh CDRl 区，其包含选自SEQ ID NO :11、12、13、14和15的氨基酸序列，或与SEQ ID N0:ll、12、13、 14和15相比具有1、2、3、4或5个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(b) Vh CDR2区， 其包含选自SEQ ID NO 16、17、18、19和20的氨基酸序列，或与SEQ ID NO 16、17、18、19和 20相比具有1、2、3、4或5个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(c) Vh⑶R3区，其包含 选自 SEQ ID NO :21、22、23、24 和 25 的氨基酸序列，或与 SEQ ID NO :21、22、23、24 和 25 相 比具有1、2、3、4或5个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(d)VK CDRl区，其包含选自 SEQ ID NO 26、27、28、29 和 30 的氨基酸序列，或与 SEQ ID NO 26、27、28、29 和 30 相比具 有1、2、3、4或5个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(e)VK⑶R2区，其包含选自SEQ ID NO :31、32、33、34和35的氨基酸序列，或与SEQ ID NO :31、32、33、34和35相比具有1、 2、3、4或5个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；和(f)VK⑶R3区，其包含选自SEQ ID NO :36、37、38、39 和 40 的氨基酸序列，或与 SEQ ID NO :36、37、38、39 和 40 相比具有 1、2、3、 4或5个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列。本发明的工程化抗体包括例如为了改善抗体特性而对其Vh和/或Vk内的构架残 基进行了修饰的抗体。进行这样的构架修饰一般是为了降低抗体的免疫原性。例如，一种 方法是将一个或多个构架残基“回复突变”为相应的种系序列。更特别地，经历体细胞突变 的抗体可含有与衍生该抗体的种系序列不同的构架残基。通过比较抗体构架序列与衍生该 抗体的种系序列，可以鉴定这些残基。例如，对于1G11，Vh的氨基酸残基#71 (FR3内)是丙氨酸，而在相应的Vh 4-34种 系序列中该残基为缬氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，可以通过(例如)定点 诱变或PCR介导的诱变，将该体细胞突变“回复突变”为种系序列(例如，IGll的Vh&FR3 的残基#71可以从丙氨酸“回复突变”为缬氨酸)。这样“回复突变”的抗体也包括在本发 明中。另一个例子是，对于1G11，Vh的氨基酸残基#81 (FR3内)是精氨酸，而在相应的 Vh 4-34种系序列中该残基为赖氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，例如，可以将 IGll的Vh的FR3的残基#81从精氨酸“回复突变”为赖氨酸。这样“回复突变”的抗体也 包括在本发明中。另一个例子是，对于13D12，Vh的氨基酸残基#83 (FR3内)是天冬酰胺，而在相应 WVh 4-34种系序列中该残基为丝氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，例如，可以将13D12的Vh的FR3的残基#83从天冬酰胺“回复突变”为丝氨酸。这样“回复突变”的抗 体也包括在本发明中。另一个例子是，对于2A7，Vh的氨基酸残基#67 (FR3内)是缬氨酸，而在相应的Vh 3-53种系序列中该残基为苯丙氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，例如，可以将 2A7的Vh的FR3的残基#67从缬氨酸“回复突变”为苯丙氨酸。这样“回复突变”的抗体也 包括在本发明中。另一个例子是，对于2F9，Vh的氨基酸残基#28 (FRl内)是异亮氨酸，而在相应的 Vh 3-53种系序列中该残基为苏氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，例如，可以将 2F9的Vh的FRl的残基#28从异亮氨酸“回复突变”为苏氨酸。这样“回复突变”的抗体也 包括在本发明中。另一个例子是，对于12E1，Vh的氨基酸残基#23 (FRl内)是缬氨酸，而在相应的Vh 3-9种系序列中该残基为丙氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，例如，可以将12E1 的Vh的FRl的残基#23从缬氨酸“回复突变”为丙氨酸。这样“回复突变”的抗体也包括在 本发明中。另一个例子是，对于lGll，Vk的氨基酸残基#7(FR1内)是苯丙氨酸，而在相应的Vk A27种系序列中该残基为丝氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，例如，可以将IGll 的Vk的FRl的残基#7从苯丙氨酸“回复突变”为丝氨酸。这样“回复突变”的抗体也包括 在本发明中。另一个例子是，对于IGl 1，Vk的氨基酸残基#47 (FR2内)是缬氨酸，而在相应的Vk A27种系序列中该残基为亮氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，例如，可以将IGll 的Vk的FR2的残基#47从缬氨酸“回复突变”为亮氨酸。这样“回复突变”的抗体也包括在 本发明中。另一种类型的构架修饰包括对构架区内、或甚至在一个或多个⑶R区内的一个或 多个残基进行突变，以除去T细胞表位，从而降低该抗体的潜在的免疫原性。这一方法也被 称为“脱免疫”，并且在Carr等的美国专利公开号20030153043中详细记载。除了在构架区或CDR区内进行的修饰以外，或者作为它的替代方案，也可以将本 发明的抗体改造为在Fc区内包括修饰，一般是为了改变该抗体的一种或多种功能特性，诸 如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，也可以化学修饰 本发明的抗体(例如可将一个或多个化学部分连接到该抗体上)，或者修饰改变其糖基化， 同样以改变该抗体的一种或多种功能特性。这些实施方案中的每一个均在下文详细描述。 Fc区中残基的编号是Kabat的EU指数的编号。在一个实施方案中，修饰CHl的铰链区，使得该铰链区中半胱氨酸残基的数目改 变，例如增加或减少。该方法在Bodmer等的美国专利号5，677，425号中详细描述。改变 CHl铰链区中半胱氨酸的数目是为了(例如)促进轻链和重链的装配，或提高或降低抗体的 稳定性。在另一实施方案中，对抗体的Fc铰链区进行突变，以降低该抗体的生物半寿期。 更具体地，向Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区引入一个或多个氨基酸突变，使得相对 于天然Fc-铰链结构域与SpA的结合减弱了该抗体与葡萄球菌蛋白A(SpA)的结合。该方 法在Ward等的美国专利号6，165，745号中详细记载。
在另一实施方案中，修饰抗体以提高其生物半寿期。可以使用多种方法。例如，如 Ward的美国专利号6，277，375所述，可以引入一个或多个如下突变T252L、T254S、T256F。 备选地，如Presta等的美国专利号5，869，046和6，121，022所述，为了提高生物半寿期，该 抗体可以在CHl或Q区内进行改变，使之含有来自IgG Fc区CH2结构域的两个环的补救 受体结合表位。在还其它的实施方案中，通过将至少一个氨基酸残基替换为不同的氨基酸残基来 改变Fc区，以改变抗体的效应功能。例如，可以将选自氨基酸残基234、235、236、237、297、 318,320和322的一个或多个氨基酸替换为不同的氨基酸残基，使得该抗体对效应配体的 亲和力改变，但是保留亲本抗体的抗原结合能力。对其亲和力被改变的效应配体可以是，例 如，Fc受体或补体的Cl成分。这一方法在Winter等的美国专利号5，624，821和5，648，260 中更详细地描述。在另一个实例中，可以将选自氨基酸残基329、331和322的一个或多个氨基酸替 换为不同的氨基酸残基，使得该抗体具有经改变的Clq结合和/或降低或消除的补体依赖 性细胞毒性(⑶C)。该方法在Idusogie等的美国专利号6，194，551中更详细地描述。在另一个实例中，改变氨基酸位置231和239中的一个或多个氨基酸残基，从而改 变该抗体固定补体的能力。该方法在Bodmer等的PCT公开WO 94/29351中进一步描述。在还其它的实例中，为了提高抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或 提高抗体对Fc γ受体的亲和力，通过修饰一个或多个在下列位置处的氨基酸来修饰Fc区 238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、 285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、 324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、 398、414、416、419、430、434、435、437、438 或 439。该方法在 Presta 的 PCT 公开 WO 00/42072 中进一步描述。此外，已对人IgGl上对于Fc y RI、Fc y RII,FcyRIII和FcRn的结合位点进 行了作图，并且已经描述了具有改善的结合的变体(参见，Shields，R.L.等(2001) J.Biol. Chem. 276 :6591-6604)。位置 256、290、298、333、334 和 339 处的特定突变显示改善了与 FcyRIII的结合。另外，下列组合突变显示改善了与Fc YRIII结合T256A/S298A，S298A/ E333A, S298A/K224A 和 S298A/E333A/K334A。在再一个实施方案中，如美国临时专利申请号60/957，271 (其全文并入本文作为 参考)所描述的那样，通过引入半胱氨酸残基来修饰本发明的抗体的C端。此类修饰包括 但不限于在全长重链序列的C端处或在其附近替换现有的氨基酸残基，以及将包含半胱氨 酸的延长序列引入至全长重链序列的C端。在优选的实施方案中，包含半胱氨酸的延长序 列包含序列丙氨酸-丙氨酸-半胱氨酸(从N端至C端)。在优选的实施方案中，此类C端的半胱氨酸修饰的存在为配偶体分子的缀合提供 了位点，该配偶体分子诸如为治疗剂或标记物分子。特别地，由于C端半胱氨酸修饰，反应 性硫羟基的存在可以被用于利用以下详细描述的二硫化物接头来缀合配偶体分子。抗体 与配偶体分子以这一方式的缀合使得可以增强对所附着的特异位点的控制。此外，通过在 C端或在其附近引入该附着点，可优化缀合，使得它减少或者消除对该抗体的功能特性的干 扰，并且使得缀合制备物的简化分析以及质量控制成为可能。又在另一个实施方案中，修饰抗体的糖基化。例如，可以制备无糖基化的抗体(即该抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化(例如)以提高抗体对抗原的亲和力。这样的碳水 化合物修饰可以例如通过改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可以进 行一个或多个氨基酸替换，使一个或多个可变区构架糖基化位点消失，从而消除该位点处 的糖基化。这种无糖基化可以提高抗体对抗原的亲和力。这种方法在Co等的美国专利号 5，714，350和6，350，861中更详细地描述。改变糖基化的另外的方法描述在Hanai等的美 国专禾Ij 7，214，775 ；Presta 的美国专利号 6，737，056 ；Presta 的美国公开号 20070020260 ； Dickey 等的 PCT
发明者B·陈, C·拉奥-纳伊克, D·J·金, J·A·特雷特, J·M·卡尔达雷利 申请人:百时美施贵宝公司