专利名称：用10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤治疗甲氨蝶呤抗性病症的方法
用10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤治疗甲氨蝶呤抗性病症的方法
背景技术：
甲氨蝶呤(methotrexate，也称为“MTX”)作为组合化学疗法方案的一部分用于治疗多种癌症。它是包括急性淋巴母细胞性白血病在内的多种赘生性病症的治疗剂。甲氨蝶呤还用作一些自体免疫性疾病的治疗剂，所述自体免疫性疾病包括重症肌无力、多肌炎、皮肌炎、包涵体肌炎、强直性脊柱炎、克罗恩氏病(Crohn' s disease)、牛皮癣、脓疱性牛皮癣、牛皮癣性关节炎、类风湿性关节炎、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener' s granulomatosis)和硬皮病。10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤(包括“10-炔丙基-ΙΟ-dAM”、“普拉曲沙(pralatrexate) ”、“外消旋 PDX，，、“ (2S) _2_[ [4_[ (IRS) _1_[ (2，4- 二氨基蝶啶 _6_ 基)甲基]丁 _3_炔基]苯甲酰基]氨基]戍二酸”、“(2RS) _2_[ [4_[ (IRS) _1_[ (2，4-二氨基蝶 啶-6-基)甲基]丁-3-炔基]苯甲酰基]氨基]戊二酸”和“PDX”)是已经过测试并且发现适用于治疗癌症的化合物。10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤已得到美国食品药物管理局(U. S. Food and Drug Administration, FDA)批准作为复发性和难治性周围T细胞淋巴瘤的治疗剂。同时还在对10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤在淋巴瘤、肺癌、膀胱癌和乳癌中的使用进行研究。10-块丙基-10-去氮杂氨基蝶呤最初由DeGraw等，"Synthesis andAntitumorActivity of 10-Propargyl-10-deazaaminopterin, " J. Med. Chem. 36:2228-2231 (1993)公开并且显示可充当酶二氢叶酸还原酶(“DHFR”)的抑制剂和充当鼠类L1210淋巴细胞性白血病细胞系的生长抑制剂。另外，使用鼠类E0771乳腺肿瘤模型也得到关于该化合物的抗肿瘤性质的一些结果。美国专利号6，028，071和PCT公布号WO 1998/02163公开了高度纯化的10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤组合物在异种移植物模型中进行测试时具有对抗人肿瘤的功效。利用10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤进行的后续研究已显示其在单独使用和与其它治疗剂组合时都是有用的。举例来说，Sirotnak等，Clinical Cancer Research,第6卷，3705-3712 (2000)报道了共同施用10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤与丙磺舒(probenecid, cMOAT/MRP样质膜ATP酶的一种抑制剂)会大大增强10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤对抗人实体肿瘤的功效。已显示，10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤和10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤与钼基化学治疗剂的组合对间皮瘤是有效的。(Khokar等，Clin.Cancer Res. 7:3199-3205 (2001))。与吉西他滨(gemcitabine, Gem)共同施用以治疗淋巴瘤已公开在W0/2005/117892中。美国专利号6，323，205中公开了 10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤与紫杉酚的组合是有效的。还已显示，10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤有效用于治疗T细胞淋巴瘤，参见美国专利号7，622，470。其它研究已显示一种通过测定由样本表达的还原型叶酸载体-I蛋白(RFC-I)的量来评估淋巴瘤对用10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤治疗的敏感性的方法，其中所表达RFC-I的水平较高指示对10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤的敏感性较高，公开于PCT公布号WO 2005/117892中。
10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤被称为抗叶酸剂/抗代谢物。叶酸通路在细胞生长和增殖中起关键作用(Appling, 1991 ；0din等，2003)。叶酸(叶酸盐)通过还原型叶酸载体I (RFC-I)进入细胞，由叶酰聚谷氨酸合成酶(FPGS)聚谷氨酸化，并且被还原成二氢叶酸，二氢叶酸进一步由二氢叶酸还原酶(DHFR)转化成四氢叶酸(THF)。此通路中所涉及的不同酶和转运体是一类重要的细胞毒性剂(即抗叶酸剂)的靶标。甲氨蝶呤是此类别的第一药剂之一并且首先被用于治疗儿童期急性淋巴母细胞性白血病(Farber等，1948)。从那以后，甲氨蝶呤被广泛地用于血液系统和实体癌症，并且已合理设计出了多代新型抗叶酸剂以利用叶酸通路的多个方面(例如，用于结肠直肠癌的雷替曲塞(raltitrexed) (Cocconi等，1998)和用于恶性胸膜间皮瘤(Vogelzang等，2003)与非小细胞肺癌(NSCLC) (Hanna等，2004)的培美曲塞(pemetrexed))。在大多数肿瘤细胞中，RFC-1介导叶酸类似物的内化。一旦进入细胞，这些类似物就结合二氢叶酸还原酶(DHFR)，由此消耗嘌呤和胸苷生物合成所需要的细胞内还原型叶酸池，或者这些类似物将在与DHFR结合之前就被代谢成聚谷氨酸盐。聚谷氨酸化由叶酰基-聚谷氨酸合成酶(FPGS)催化。叶酰基-聚谷氨酸水解酶(FPGH，也称为Y-谷氨酰基水解酶[GGH])介导这些细胞内聚谷氨酸化的抗叶酸剂的裂解并且因此介导其后续清除。胸苷酸合成酶(TS)和甘氨酰胺核糖核苷酸甲酰基转移酶 (GARFT)也在叶酸代谢中涉及作为“再循环”酶(因此直接影响可用于DNA合成的核苷酸池)。甲氨蝶呤是一种抗叶酸剂。基于对细胞系的测试，认为10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤与甲氨蝶呤具有类似的细胞毒性型态，10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤的效力经常是甲氨蝶呤的3倍至19倍。甲氨蝶呤抗性通常因为DHFR基因的突变和扩增而发生。存在细胞可能获得针对此叶酸拮抗剂的作用的免疫力的三种已知途径。细胞中甲氨蝶呤的浓度可通过将该药物移进和移出细胞的转运系统的改变而减少。举例来说，如果细胞借以吸收甲氨蝶呤的转运体的数量减少，那么将会在细胞中存在较少甲氨蝶呤。此外，细胞中药物的浓度可以由聚谷氨酸化和代谢作用的速率改变来调控。当药物的聚谷氨酸化较慢或者代谢较快时，其可能更易于从细胞中除去，从而降低其在细胞中的浓度和活性。DHFR基因的扩增引起所存在DHFR的量增加并且已显示与对甲氨蝶呤治疗的反应降低有关。甲氨蝶呤必须与DHFR结合方能阻止DHFR的活性。如果遗传改变以减少甲氨蝶呤结合的方式改变DHFR的结合区，那么DHFR可能继续活化叶酸并且治疗的有效性将降低。所有这些结果都与对甲氨蝶呤的抗性增加有关。甲氨蝶呤抗性可能快速获得并且可以导致治疗失败。因此，克服获得性甲氨蝶呤抗性的方法将是有用的。发明概述在一个实施方案中，本发明包括一种治疗个体的甲氨蝶呤抗性病症的方法。此方法可包括向所述个体施用有效量的包含10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤或它的药学上可接受的盐的组合物。在另一个实施方案中，本发明包括一种治疗需要甲氨蝶呤抗性瘤形成治疗的个体的方法，其中所述方法包括向所述个体施用有效量的10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤或它的药学上可接受的盐。在一些实施方案中，所述病症为癌症。在其它实施方案中，所述病症为炎症性病症。在一个实施方案中，组合物被配制用于静脉内施用。在另一个实施方案中，组合物被配制用于口服施用。附图简述图I示出适用于制备10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤的合成方案；图2示出10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤和其它叶酸抑制剂对所测试的15种癌细胞系的敏感性；图3示出当用10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤或甲氨蝶呤处理时，未处理、经过10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤适应(DU-PDX)和经过甲氨蝶呤适应(DU-MTX)的DU-145细胞的IC5tl ；图4示出当用10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤或甲氨蝶呤处理时，未处理、经过 10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤适应(HEP-PDX)和经过甲氨蝶呤适应(HEP-MTX)的HEP2细胞的IC5tl ；图5示出10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤抗性细胞系中叶酸基因的相对mRNA表达；图 6 示出 DU145 和 HEP2 敏感性以及 DU-PDX、DU-MTX, HEP-PDX 和 HEP-MTX 10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤和甲氨蝶呤抗性细胞系中的DHFR蛋白的蛋白质印迹； 图 7 示出 DU145 和 HEP2 敏感性以及 DU-PDX、DU-MTX, HEP-PDX 和 HEP-MTX 10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤和甲氨蝶呤抗性细胞系中的DHFR的mRNA表达。发明详述癌症患者中与疗法有关的一个持续问题是对疗法的反应的个体差异和肿瘤内导致化学疗法抗性的遗传改变。化学疗法涉及施用通常靶向快速分裂的细胞的药物。多种化学治疗药物干扰细胞分裂之前的DNA复制，所述药物包括抗叶酸剂。尽管化学治疗剂已有许多进步，但癌细胞，尤其是晚期癌症的遗传不稳定性导致了药物抗性癌症的高发生率。在本发明中，由DU145(前列腺)和HEP2 (头颈部)癌细胞系产生具有获得性甲氨蝶呤和10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤抗性的细胞系。对10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤的抗性为亲本细胞的200倍以上的同时，具有获得性10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤抗性的DU-PDX和HEP-PDX细胞对甲氨蝶呤展示出交叉抗性；DU_MTX和HEP-MTX细胞仍对10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤展不出显著的敏感性。观察到对10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤与对甲氨蝶呤的获得性抗性的机制不同。获得性10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤抗性在DU-PDX与HEP-PDX细胞系中与RFClmRNA表达显著减少有关，另外，还观察到MDRlmRNA表达少量增加。本发明还显示在10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤抗性细胞中FPGS mRNA表达稍有减少，表明了聚谷氨酸化在10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤抗性中的作用。三十年前进行的研究发现，获得性甲氨蝶呤抗性的常见机制是DHFR基因扩增和由此而引起的酶过度表达(由Assaraf2007 ；Chen等，1995评述)。因此，在以逐渐递增浓度的甲氨蝶呤选择所培养的肿瘤细胞系时，获得性抗叶酸剂抗性经常归因于DHFR基因扩增。实际上，在本发明中，具有获得性甲氨蝶呤抗性的细胞系HEP-MTX展示出与它的亲本对应物相比，DHFR蛋白表达显著增加，表明在此模型中可能有DHFR基因扩增。此种蛋白质增加未在10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤抗性细胞系中观察至IJ。这些发现结果表明在这些细胞系中甲氨蝶呤抗性与10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤抗性的分子机制不同。如果癌症的生长速率由于与治疗剂接触而与它在不与治疗剂接触的情况下的生长相比受到抑制，那么所述癌症对所述治疗剂“有反应”或对治疗有“良好反应”。癌症的生长可以多种方式测量，例如可以测量肿瘤的尺寸或适于所述肿瘤类型的肿瘤标记的表达。这些标准定义了所测量的反应的类型以及疾病进展时间的表征，疾病进展时间是肿瘤对治疗剂的敏感性的另一个重要的量度。对10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤具有反应性的特性是一种可变的特性，其中不同的癌症在不同的条件下对给定的治疗剂显示出不同水平的“反应性”。另外，反应性的量度可以使用除肿瘤生长尺寸以外的其它标准来评估，包括患者生活品质、转移程度等。此外，临床预后标记和变量可以在适用情况下进行评估。如果癌症的生长速率由于与诸如10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤的治疗剂接触而在与它在不与所述治疗剂接触的情况下的生长相比时未受到抑制或受到极低程度的抑 制，那么所述癌症对于所述治疗剂“无反应”或具有“较差反应”，或对治疗存在较差反应。如上所述，癌症的生长可以多种方式测量，例如，可以测量肿瘤的尺寸或适于所述肿瘤类型的肿瘤标记的表达。对治疗剂无反应的特性是一种高度可变的特性，其中不同的癌症在不同的条件下对给定的治疗剂显示出不同水平的“无反应性”。另外，无反应性的量度可以使用除肿瘤生长尺寸以外的其它标准来评估，包括患者生活品质、转移程度等。此外，临床预后标记和变量可以在适用情况下进行评估。这种无反应性或较差反应性癌症可能无反应或最初有反应，但后来获得了抗性。抗性或无反应性可针对其它更敏感的癌症或肿瘤细胞系或针对相同类型的癌症或肿瘤细胞系进行测量。这些类型的癌症也可以称为对特定化学治疗剂具有“抗性”的癌症，如甲氨蝶呤抗性癌症可能最初对甲氨蝶呤具有抗性，或者可能在用甲氨蝶呤或另一种化学治疗剂进行的一次治疗过程或多次治疗过程中获得了对甲氨蝶呤的抗性。所述抗性可能是由叶酸通路蛋白、叶酸输入通路之一中的蛋白质的一处突变或多处突变所致，或者由与对甲氨蝶呤的反应相关的任何其它蛋白质所致。因此，在一个实施方案中，本发明包括一种治疗个体的甲氨蝶呤抗性病症的方法，其中所述方法包括向所述个体施用有效量的10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤和它的药学上可接受的盐。肿瘤获得对原先对它们具有毒性的药物作用的抗性的能力可以产生抗性。这种获得性抗性可能由染色体破坏引起。渗透性降低是固有抗性的常见形式。药物的变更或者失活也许是药物抗性的最常见机制。药物抗性还可能由其所作用的目标位点改变引起。诸如癌症的病症获得甲氨蝶呤抗性的情形可通过主治医师或本领域的其他技术人员进行评价来确定，并且包括治疗时病症消退或静止，接着在一定时间的治疗期后病症进展。已观察至IJ，在包括癌症在内的许多病症中，多种病症对治疗表现出获得性抗性。因此在另一个实施方案中，本发明涉及一种治疗在用甲氨蝶呤治疗期间获得了甲氨蝶呤抗性的叶酸通路依赖性疾病或恶性肿瘤的方法，所述方法包括施用治疗有效量的包含10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤或它的药学上可接受的盐的组合物。“治疗”可以意指使用疗法来预防或抑制进一步肿瘤生长，以及引起肿瘤收缩，和提供更长的存活时间。治疗还意图包括预防肿瘤转移。如果癌症或肿瘤的至少一种症状(如由反应性/无反应性、进展时间或本领域中所已知和本文中所描述的指标所确定)得到减轻、终止、减缓、最小化或抑制，那么所述肿瘤“受到抑制”或“得到治疗”。如本文所进一步描述，按照使用治疗方案(例如10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤)进行的治疗肿瘤的任何症状(身体或其它方面)的任何改善都在本发明的范围内。因此，一般来说，本文所使用的术语“治疗”意指减轻症状、在暂时或永久的基础上消除癌症或炎症性病症的病因、减缓症状的出现和/或病症的进展，或者预防疾病(即，防治性治疗)。接受防治性治疗的受试者一般为由于例如遗传易感性、饮食、暴露于致病原、暴露于病原体等而有癌症或炎症性病状风险的哺乳动物。在本发明的一个实施方案中，用于本发明方法的组合物可以包括10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤，包括“高度纯化”的10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤，和10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤的非对映体。如本发明说明书和其权利要求书中所用，“高度纯化”的组合物含有大致上不含会干扰10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤的抗肿瘤活性的其它叶酸衍生物(尤其是10-去氮杂氨基蝶呤)的10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤。本发明范围内的组合物可以包括用于将10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤配制成适用于治疗用途的剂量单位形式的载体或赋形剂，以及另外的非叶酸治疗剂。10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤在碳10 (ClO)和碳19 (C19)位置含有不对称中·心。在一个实施方案中，10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤包括ClO手性中心R构型与S构型的约I: I外消旋混合物，和彡98. 0%的C19手性中心的S型非对映体。10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤包括ClO非对映体I3DX-IOa [S构型]化学名称(2S) -2- [ [4- [ (IS)-I-[ (2，4- 二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁 -3-炔基]苯甲酰基]氨基]戊二酸，和rox-iob [R构型]化学名称(2S)-2-[[4-[(lR)-l-[(2，4-二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁 _3_炔基]苯甲酰基]氨基]戊二酸。10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤可以使用DeGraw等的美国专利号5，354，751的实施例7中公开的方法合成，所述美国专利涉及制造10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤并且以引用方式整体并入本文。10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤还可通过美国专利号6，028，071，尤其实施例I中呈现的方法来合成，所述美国专利以引用方式并入本文。为了产生10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤的非对映体，可如本文和其它处所教导合成10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤，并且最终产物或较早中间产物随后可以被用作起始物质来分离ClO非对映体。或者，可以采用手性合成，其中由多种起始物质中的任一种直接制备大致上纯的PDX-IOa和/或rox-10b。可以采用本领域中已知的用于分离对映体或非对映体的手性柱来分离最终10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤或较早中间体的非对映体。适用于分离非对映体的手性柱包括可从日本的大赛璐化学工业株式会社(Daicel ChemicalIndustries Ltd.，Japan)获得的手性柱CHIRALPAK AD，使用乙醇作为流动相。在一些实施方案中，叶酸通路依赖性疾病或病症是癌症。在其它实施方案中，叶酸通路依赖性疾病或病症是炎症性病症。在一些实施方案中，癌症或炎症性病症是最初对甲氨蝶呤至少在一定程度上敏感，然后获得甲氨蝶呤抗性的病症。确定叶酸通路疾病或病症是否对甲氨蝶呤具有固有或获得性抗性的方法可由本领域的技术人员确定，并且可以包括诸如培养或获得相关细胞(如来自患者的肿瘤细胞)并且测定与对甲氨蝶呤的抗性和/或敏感性相关的各种叶酸通路酶的表达水平的方法。另一所述方法为测定和/或监测患者对甲氨蝶呤治疗的反应以揭示固有或获得性抗性。可对相关细胞进行基因型分析或表型分析以测定指示甲氨蝶呤抗性的标记的相对表达。
在一个实施方案中，用于本发明的表型测定包括从患者获得肿瘤外植体，培养所述外植体的部分，从所述外植体培育出相关细胞的单层，使所述单层暴露于药物候选物，以及评估药物候选物改变肿瘤细胞表型的能力。本发明的基因型分析通过任何已知的方法来完成。优选方法包括将从患者获得的细胞的基因型或其部分与已知与一般或特定同所评价的治疗候选物相关的药物抗性有关的基因型进行比较。举例来说，患者细胞中存在已知或怀疑会赋予对治疗候选物的抗性的多态变体将会将所述候选物从针对所述细胞的潜在治疗剂中筛选出去。患者细胞的遗传特征通过下文所述的本领域已知的方法(例如测序、多态现象)进行测定。患者基因型对药物抗性的影响可通过参考将与抗性相关的已知突变或多态现象分类的遗传数据库或文库来确定。虽然不受任何机制束缚，但细胞中与对甲氨蝶呤的抗性或获得性抗性有关的突变的实例包括但不限于DHFR mRNA和/或蛋白质表达相对于敏感性细胞或相对于获得抗性之前的细胞有所增加。在一些实施方案中，癌症或炎症性病症对甲氨蝶呤具有获得性抗性。欲治疗的癌 症包括例如前列腺癌、乳癌、黑色素瘤、肺癌和T细胞淋巴瘤。对于T细胞淋巴瘤，存在多种适于使用本发明的非对映体治疗的病状，并且所述病状包括(a)淋巴母细胞性淋巴瘤，其中恶性肿瘤在来自胸腺的原始淋巴祖细胞中发生；(b)成熟或周围T细胞赘生物，包括T细胞前淋巴细胞性白血病、T细胞粒状淋巴细胞性白血病、侵袭性NK细胞白血病、皮肤T细胞淋巴瘤(蕈样肉芽肿/塞扎里综合症(Sezary syndrome))、退行性大细胞淋巴瘤、T细胞型、肠病型T细胞淋巴瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤(包括与HTLV-I相关者)和血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤，和皮下脂膜炎性T细胞淋巴瘤；以及(c)最初累及淋巴结副皮质区并且从未生长成真正的滤泡型态的周围T细胞淋巴瘤。欲治疗的其它癌症包括血液系统恶性肿瘤、头颈癌、胃肠道癌症、卵巢癌和骨肉瘤。 本文所用的术语“炎症性病症”是指由炎症引起或者症状包括炎症的任何病症。举例来说，由炎症引起的炎症性病症可以是败血性休克，并且症状包括炎症的炎症性病症可以是类风湿性关节炎。本发明的炎症性病症包括但不限于心血管疾病、类风湿性关节炎、多发性硬化症、克罗恩氏病、炎症性肠病、全身性红斑狼疮、多肌炎、败血性休克、移植物抗宿主疾病、哮喘、鼻炎、牛皮癣和湿疹。在一个实施方案中，欲治疗的炎症性病症包括类风湿性关节炎和青少年类风湿性关节炎。本文所用的术语“患者”或“哺乳动物”是指归类为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜和农畜，以及动物园或伴侣动物，如狗、马、猫、牛等。哺乳动物优选为人。用于本发明用途的10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤通常将如本领域中所已知以对正进行治疗的患者提供最有效的治疗(从功效和安全性的观点来看)的给药方案向患者施用。在进行本发明的治疗方法时，根据本发明用于甲氨蝶呤抗性病症和/或10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤敏感性癌症的10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤可以本领域中已知的任何有效方式施用，如通过口服、局部、静脉内、腹膜内、肌肉内、关节内、皮下、鼻内、目艮内、阴道、直肠、颅内或皮内途径，这取决于所治疗癌症的类型和开处方的医师基于例如公布的临床研究的结果所作出的医学判断。根据本发明用于甲氨蝶呤抗性病症和/或10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤敏感性癌症的10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤可以被配制成药物制剂的一部分。具体剂型将取决于施用方法，但可以包括片剂、胶囊、口服液和可注射溶液用于口服、静脉内、肌肉内、颅内或腹膜内施用等。剂量可表示为mg/m2。或者，剂量可通过本领域的技术人员可接受的任何方式表示为毫克/公斤体重。一种获得以毫克/公斤体重表示的等同剂量的方法包括应用转换因子O. 025mg/kg,对于普通人来说约等同于lmg/m2。根据此计算，150mg/m2的剂量约等同于约3. 75mg/kg0适用于治疗甲氨蝶呤抗性病症和/或10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤敏感性癌症的肿瘤学的剂量包括以下给药方案。在一个实施方案中，这些剂量是静脉内剂量。举例来说，每天每平方米体表面积约IOmg至120mg的剂量(每天每公斤体重约O. 25mg至3mg)为适当的。以下剂量也是适合的每周一次30mg/m2(约O. 75mg/kg)持续3周接着停药一周、每周一次30mg/m2(约O. 75mg/kg)持续6周接着停药一周，或按每周一次持续6周的时程逐渐递增10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤的剂量。适当时可基于患者耐受性和恶性肿瘤的类型使用较低剂量。当使用频率较低的施用时可利用较高剂量。因此，在一般意义上，10mg/m2至275mg/m2(约O. 25mg/kg至约6. 9mg/kg)的剂量适用于各种给药时程，例如约 100mg/m2至275mg/m2(约2. 5mg/kg至约6. 87mg/kg)之间每两周一次的剂量，和约10mg/m2至150mg/m2(约O. 25mg/kg至约3. 75mg/kg)之间或者更具体来说约10mg/m2与60mg/m2之间每周一次的剂量。使用与美国专利号6，323，205中所描述的方案类似的方案来确定适合剂量在本领域的技能范围内。在一个实施方案中，根据本发明用于甲氨蝶呤抗性病症和/或10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤敏感性癌症的10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤可以每剂约10mg/m2至约275mg/m2(约0. 25mg/kg至约6. 87mg/kg)的量施用。本发明的方法还包括按以下施用根据本发明用于甲氨蝶呤抗性病症和/或10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤敏感性癌症的10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤每周一次；所施用的剂量为约10mg/m2(0. 25mg/kg)或约30mg/m2 (0. 75mg/kg);施用量为每剂约 10mg/m2 至约 150mg/m2(约 0. 25mg/kg 至约 3. 75mg/kg);每两周一次；以及所施用的剂量为约100mg/m2至约275mg/m2 (约2. 5mg/kg至约6. 9mg/kg)。在一个实施方案中，根据本发明用于甲氨蝶呤抗性病症和/或10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤敏感性癌症的10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤可以如下量施用约0. 25mg/kg与约4mg/kg之间的量；约0. 75mg/kg与约3mg/kg之间；约I. 0mg/kg与约2. 5mg/kg之间的量；约O. 25mg/kg或约O. 75mg/kg的量(或以体表面积(BSA)计的等同量)。10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤可与其它细胞毒性和抗肿瘤化合物组合使用，所述化合物包括长春花生物碱，如长春花碱、诺维本(navelbine)和长春地辛(vindesine);核苷酸类似物，如吉西他滨、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷；烷基化剂，如环磷酰胺(cyclophosphamide)或异环磷酰胺(ifosfamide)；顺钼(cisplatin)或卡钼(carboplatin)；甲酰四氢叶酸；紫杉烧，如紫杉醇(paclitaxel)或多西紫杉醇(docetaxel);抗CD20单克隆抗体，含有或不含放射性同位素；和抗生素，如阿霉素(doxorubicin)和丝裂霉素(mitomycin)。也可使用10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤与这些其它抗肿瘤剂中的多种或与生长因子抑制剂和抗血管生成剂的组合。10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤与其它药剂可同时施用，或者作为常用治疗方案的一部分组合利用，在所述治疗方案中10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤与一种或多种其它药剂在不同时间施用。举例来说，其它药剂可在相对于10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤施用之前、之后立即或之后一段时间(例如24小时)施用。因此，除非另外指定，否则出于本申请的目的，术语施用一般指同时施用或指药物按平行治疗方案中的任一顺序在所述药物之间有或无时间间隔的情况下依序施用。对于炎症性病症的治疗，10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤可以通过口服、肌肉内、静脉内、动脉内或鞘内途径给予。对于本领域的技术人员来说将存在其它途径。对于包括但不限于牛皮癣、类风湿性关节炎和/或青少年类风湿性关节炎在内的炎症性病症的治疗，剂量可包括以下。用于成人类风湿性关节炎或多关节型青少年类风湿性关节炎的本发明方法包括每周一次口服施用约Img至约30mg ;在一个实施方案中，每周一次施用约7. 5mg。其它剂量可包括每周一次给予10mg/m2。可逐渐调整剂量以达到最佳反应。在较高剂量下，如超过20mg/m2/wk,或O. 65mg/kg/wk至I. Omg/kg/wk,通过肌肉内或皮下给药可达成更好的吸收。适当的剂量还可包括每周7. 5mg,或者约O. 5mg与约IOmg之间的分次口服剂量；在一个实施方案中，剂量可为2. 5mg的分次口服剂量，以12小时的时间间隔持续三次给药，按每周一次的时程给予。剂量在它有效的情况下可以持续，并且包括持续长达两年和更长时 间的疗法。10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤适合与叶酸以及维生素B12补充剂组合使用以减少治疗的副作用。举例来说，可以用叶酸(开始一周每天lmg/m2，随后用10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤治疗，或者在不以体表面积(BSA)计的情况下每天口服(p.o.)lmg);和B12(每月lmg/m2，或者每8-10周肌肉内(I. M.)给予Img(不以BSA计)，或者每天口服Img(不以BSA计))对患者进行治疗。在一个实施方案中，根据本发明的10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤被配制用于口服施用。在另一个实施方案中，根据本发明的10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤被配制用于静脉内施用。10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤可以多种不同剂型施用。举例来说，10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤可以优选口服或胃肠外施用。10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤可与各种药学上可接受的惰性载体一起以片剂、胶囊、锭剂、药片、硬糖、粉末剂、喷雾剂、霜剂、油膏、栓剂、胶冻、凝胶、糊剂、洗剂、软膏、酏齐U、糖浆剂等形式施用。所述剂型的施用可以单次或多次给药进行。载体包括固体稀释剂或填充剂、无菌水性介质和各种无毒有机溶剂和其它载体。可以对口服药物组合物适当地进行甜化和/或调味。对于10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤的口服施用，将含有一种或两种活性剂的片剂与各种赋形剂(如微晶纤维素、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸二钙和甘氨酸)中的任一种以及各种崩解剂(如淀粉(且优选为玉米淀粉、马铃薯淀粉或木薯淀粉)、海藻酸和某些复合硅酸盐)连同造粒粘合剂(如聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、明胶和阿拉伯胶)进行组合。另外，润滑剂诸如硬脂酸镁、月桂基硫酸钠和滑石粉通常非常适用于压片的目的。还可采用类似类型的固体组合物作为明胶胶囊中的填充剂；在这方面优选的物质还包括乳糖(lactose)或乳糖(milk sugar)以及高分子量聚乙二醇。当希望含水混悬液和/或酏剂用于口服施用时，10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤可与各种甜味剂或调味剂、着色物质或染料，并且必要时与乳化剂和/或悬浮剂以及如水、乙醇、丙二醇、甘油和其各种类似组合的稀释剂进行组合。含有本发明的组合物的片剂可以通过压制或模制，任选地在一种或多种辅助成分或助剂存在下来制备。压制的片剂可以通过在适合的机器中压制任选地与粘合齐U、润滑剂、惰性稀释剂、表面活性剂或分散剂混合的呈自由流动形式(如粉末或颗粒)的活性成分来制备。模制的片剂可以通过在适合的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混合物来制备。各片剂优选含有约O. 05mg至约IOg活性成分并且各药囊或胶囊优选含有约O. 05mg至约IOg活性成分；片剂同样可适当地含有每粒片剂约2. 5mg活性成分或每粒片剂约7. 5mg0对于10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤的胃肠外施用，可以采用溶液，以及包含活性剂或其相应水溶性盐的无菌水溶液。所述无菌水溶液优选经过适当缓冲，并且还优选用例如足量生理盐水或葡萄糖赋予等渗性。这些特定水溶液尤其适于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内注射的目的。油性溶液适于关节内、肌肉内和皮下注射的目的。所有这些溶液在无菌条件下的制备都可通过本领域的技术人员熟知的标准药学技术容易地完成。出于兽医学的目的，活性剂可以使用任何形式和通过上文描述的任何途径单独或一起向动物施用。在一个优选的实施方案中，10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤以胶囊、大 丸剂(bolus)、片剂、液体药液形式、通过注射或作为植入物施用。作为替代方案，10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤可以与动物饲料一起施用，并且出于此目的，可制备浓缩的饲料添加剂或预混物用于正常动物饲料。根据标准兽医学规范以常规方式制备所述制剂。本发明还包括一种治疗需要甲氨蝶呤抗性瘤形成治疗的个体的方法，其中所述方法包括向所述个体施用有效量的10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤和它的药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的盐”是指由药学上可接受的无毒碱或酸制备的盐。当本发明的化合物呈酸性时，它的相应盐可以常规地由药学上可接受的无毒碱(包括无机碱和有机碱)制备。由所述无毒碱产生的盐包括铝盐、铵盐、钙盐、铜盐(铜盐和亚铜盐)、铁盐、亚铁盐、锂盐、镁盐、锰盐(锰盐和亚锰盐)、钾盐、钠盐、锌盐以及类似盐。特别优选者是铵盐、钙盐、镁盐、钾盐和钠盐。在一个实施方案中，盐是盐酸盐。由药学上可接受的有机无毒碱产生的盐还包括伯胺、仲胺和叔胺以及环状胺和取代胺(如天然存在的和合成的取代胺)的盐。可以形成盐的其它药学上可接受的有机无毒碱包括离子交换树脂，如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、N'，N' - 二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙氨基乙醇、2-二甲氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、还原葡糖胺、葡糖胺、组氨酸、海巴明(hydrabamine)、异丙胺、赖氨酸、甲基还原葡糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、聚胺树脂、普鲁卡因(procaine)、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、缓血酸胺等。除上述常用剂型外，10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤(包括其各组分的药学上可接受的盐、酯、溶剂合物和多晶型物)还可以通过控制释放方式和/或递送装置施用。除非另外指出，否则本发明说明书与权利要求书中所用的表示成分、尺寸、反应条件等的量的所有数值应理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。在本申请和权利要求书中，除非另外特别说明，否则单数的使用包括复数。另外，除非另外说明，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括(including) ”以及其它形式(如“包括(includes)”和“包括(included)”)的使用不具限制性。同样，除非另外特别说明，否则如“要素”或“组分”的术语涵盖包含一个单元的要素和组分以及包含超过一个单元的要素和组分。
本发明在某种程度上基于展示了具有获得性甲氨蝶呤抗性的细胞将仍保留对普拉曲沙的敏感性，而获得了普拉曲沙抗性的细胞也将获得甲氨蝶呤抗性的数据。对于普拉曲沙敏感性的预测遗传因素，由DU145 (前列腺)和HEP2 (头颈部)癌细胞系产生对所述药物具有获得性抗性的两个细胞系。在对普拉曲沙的抗性为亲本细胞的200倍以上的同时，DU-PDX和HEP-PDX对甲氨蝶呤展示出部分交叉抗性。普拉曲沙获得性抗性与RFC-I表达减少和MDRl表达增加有关。Fotoohi等(2009)描述了在甲氨蝶呤抗性细胞中RFC-I的mRNA水平下调超过两倍的抗叶酸剂抗性白血病细胞系，强调了内流转运在抗叶酸剂抗性中的重要作用。类似的数据在早先由Jansen(1998)、Rothen(2004)和Ifergan(2003)使用其它甲氨蝶呤抗性细胞模型获得。MDRl表达增加似乎并未在所观察到的获得性普拉曲沙抗性中起作用，这是因为抑制MDRl并未恢复普拉曲沙敏感性。已显示，FPGS活性降低在人白血病CCRF-CEM细胞中与获得性甲氨蝶呤抗性有关(Mauritz，2002)。在一项研究中，在普拉曲沙抗性细胞中观察到FPGS表达稍有减少，表明了聚谷氨酸化在普拉曲沙抗性中的作用。三十年前进行的研究发现，获得性甲氨蝶呤抗性的另一个常见机制是DHFR基因扩增和由此而引起的酶过度表达(由Assaraf 2007 ；Chen等，1995评述)。在此研究中，具有获得性甲氨蝶呤抗性的细胞系HEP-MTX展示出DHFRmRNA和蛋白质表达与它的亲本对应物相比显著·增加。在普拉曲沙抗性细胞系中未观察到DHFR表达增加。这些发现结果表明在这些细胞系中甲氨蝶呤抗性与普拉曲沙抗性的分子机制不同。因此，本发明显示，令人惊奇的是，对甲氨蝶呤具有抗性的细胞系对普拉曲沙并不具有抗性和/或对普拉曲沙保留了高得多的原始敏感性。本发明的其它目标、优点和新型特征对于本领域的技术人员来说在研究以下实施例后将变得显而易见，所述实施例不意图具有限制性。另外，如上所述的和如以下权利要求书部分中所要求的本发明的各种实施方案和方面各自将在以下实施例中找到实验支持。
实施例以下实施例仅出于说明的目的而提供并且不意图限制本发明的范围。实施例I :图I示出适用于制备10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤的合成方案。将60%NaH的油分散液(I. 06g，26. 5mmol)于18mL过筛脱水的THF中的混合物冷却到0°C。用升对酞酸二甲酯(5. 0g,24mmol.，图I中的化合物I)于无水THF(7mL)中的溶液处理冷混合物，并且将所述混合物在0°C下搅拌I小时。添加炔丙基溴(26. 4mmol)，并且将混合物在00°C下再搅拌I小时，然后在室温下搅拌16小时。用2.4mL 50%乙酸处理所得混合物，然后倾倒至240mL水中。用乙醚(2X150mL)萃取混合物。合并乙醚萃取物，经过Na2SO4干燥，并且浓缩成橙黄色油状物。进行硅胶(600mL 230-400筛目)色谱，用环己烷-EtOAc (8:1)洗脱，得到呈白色固体状的产物α-炔丙基升对酞酸二甲酯(化合物2) (4. 66)，通过TLC (环己烷-Et0Ac，3:l)显示所述产物为均质的。然而，对此产物获得的质谱数据显示其为想要的产物2与二炔丙基化化合物的混合物。没有检测到起始物质I。HPLC显示单炔丙基化产物与二炔丙基化产物的比率为约3: I。因为二炔丙基化产物不同于化合物1，不会在下一个反应步骤中产生不需要的副产物，所以此物质适于转化成化合物3。在用于在合成中继续反应的产物中不存在起始化合物I对于在转化获得最终产物期间避免连续形成ΙΟ-dAM是非常重要的，这是因为将ΙΟ-dAM从10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤中完全除去是非常困难的。通过将O. 36g 60%NaH(9mmol)的油分散液与IOmL无水DMF组合形成混合物并且将所述混合物冷却到0°C -5V。用第一反应的产物(化合物2) (2. 94g，12mmol)于IOmL无水DMF中的溶液逐滴处理冷混合物，然后在(TC下搅拌30分钟。冷却到-25 °C后，逐滴添加2,4, 二氨基-6-(溴甲基)-蝶啶氢溴酸盐-O. 22-丙醇(1.00g，2.9mmOl)于IOmL无水DMF中的溶液，同时使温度维持在接近_25°C。经过2小时的时间使搅拌过的混合物的温度上升至-KTC。再在-10°C下持续2小时后，使温度上升至20°C，在室温下继续搅拌超过2小时。然后通过添加固体CO2将反应物调节至pH 7。在真空中浓缩以除去溶剂后，将残余物与乙醚一起搅拌并且收集不溶于乙醚的物质，用水洗涤，并且在真空中干燥，得到1.49g粗产物。将此粗产物溶解于CHCl3-Me0H(10:l)中以便施加至硅胶管柱上。用相同的溶剂系统洗脱，得到10-炔丙基-10-甲氧羰基-4-脱氧-4-氨基-10-去氮杂蝶酸甲酯(化合物3)，根据TLC其为均质的，产率为40%(485mg)。将搅拌过的化合物3(400mg,0. 95mmol)于2_甲氧基乙醇(5mL)中的悬浮液用水 (5mL)，然后用10%氢氧化钠溶液(3.9mL)处理。在室温下搅拌混合物4小时，期间形成溶液。用乙酸将溶液调节至pH 8并且在高真空下浓缩。将所得残余物溶解于15mL水中并且酸化至PH 5. 5-5. 8，引起沉淀物形成。收集沉淀物，用水洗涤并且在真空中干燥，回收到340mg化合物4 (91%产率)。HPLC分析指示产物纯度为90%。通过在15mL DMSO中在115°C _120°C下加热10分钟使化合物4(330mg)脱去羧基。10分钟后进行HPLC测试，证实了转化基本上完成。通过在真空中蒸馏(40°C浴槽)除去DMS0。将残余物与O. 5NNa0H —起搅拌，得到澄清溶液。用IN HCl酸化至pH 5.0，得到呈黄色固体状的10-炔丙基-4-脱氧-4-氨基-10-去氮杂蝶酸(化合物5)，产率为70%。HPLC指示此阶段的产物纯度为90%。使用BOP试剂(六氟磷酸苯并三唑-I-基氧基三(二甲氨基)鱗(287mg，O. 65mmol,奥德里奇化学公司(Aldrich Chemical Co.))在含有三乙胺(148mg, I. 46mmol)的DMF (IOmL)中使化合物5 (225mg, O. 65mmol)与L-谷氨酸二甲酯盐酸盐(137mg，O. 65mmol)偶合。在20°C _25°C下搅拌混合物3小时，然后蒸发至干燥。将残余物与水一起搅拌并且收集水不溶性粗产物，并且在真空中干燥。通过硅胶色谱(用含有三乙胺(0.25体积%)的CHCl3-MeOH(10:1)洗脱)对粗产物(350mg)进行纯化，回收到165mg 10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤二甲酯(化合物6，50%产率)，根据TLC(CHCl3-MeC)H 5:1)其为均质的。将化合物6(165mg，0.326mmol)悬浮于添加有 O. 72mL (O. 72meq) IN NaOH 的 IOmL经过搅拌的MeOH中。在室温下持续搅拌直至在数小时后形成溶液为止。将溶液在20°C -25°C下保持8小时，然后用IOmL水稀释。在减压下蒸发除去甲醇，并且将浓缩了的水溶液在20°C-25°C下再留置24小时。然后，HPLC显示酯水解完成。用乙酸将澄清的水溶液酸化至PH 4.0，使得10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤以浅黄色固体形式沉淀出，收集、水洗并且在真空中干燥了的产物重122mg(79%产率)。通过元素分析、质子NMR和质谱进行的测定与指定的结构完全一致。HPLC分析指示纯度为98%并且确定所述产物不含10-去氮杂氨基蝶呤。在此情况下，10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤的量(如通过HPLC峰面积所测定)接近98%，并且处理软件未检测到对应于10-去氮杂氨基蝶呤的峰，尽管在此区域中存在少许基线波动。实施例2 为探究10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤对不同实体肿瘤类型的活性，研究了 15种人实体肿瘤细胞系对10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤的细胞毒性活性的敏感性。材料和方法细胞系一组人结肠癌(HT29、HCT116、C0L0205、HCC2998)、乳癌(MCF7、MDA-MB-435)、月市癌(H0P62、H0P92)、卵巢癌(0VCAR3、IGR0V1)、前列腺癌(DU145、PC3)和头颈癌(SCC61、HEP2、SQ20B)细胞系是购自ATCC(Rockville, MD)和美国国家癌症研究所(NationalCancerInstitute)保藏中心。在补充有10%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100单位πιΓ1青霉素(penicillin)和100 μ M πιΓ1链霉素(streptomycin)的RPMI培养基中将细胞培育成单层。 细胞毒性测定所产生的所有数据都是一式两份进行的三次单独实验的结果。使用如先前所述进行的MTT测定(Hansen，1989)来测定细胞活力。简单来说，将细胞以每孔2X IO3个细胞的密度接种在96孔板中。孵育细胞120小时，然后在37°C下添加0.4mg πιΓ1的MTT染料(3_[4，5- 二甲基噻唑-2-基]-2，5- 二苯基溴化四唑鎗盐，持续4小时。将单层悬浮于O. Iml DMSO中并且使用微板读数器测量560nm下的吸光度。阳性和阴性对照组分别包括具有未处理的细胞或含MTT而无细胞的培养基的孔。由线粒体脱氢酶催化黄色水溶性四唑鎗盐MTT转化成紫色不溶性甲臜，并且将所述转化用于估算活细胞的数目。将对应于未处理细胞的对照值视作100%并且经过处理的样品的活力表示为占对照组的百分比。IC5tl值测定为使细胞活力降低50%的浓度。为了进行单个药剂研究，接种细胞并且静置24小时，之后用递增浓度的10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤处理72小时。孵育后，将细胞回收至不含化合物的培养基中持续48小时，之后使用MTT测定来测定生长抑制作用。蛋白质印迹分析在含有50mM HEPES(pH 7.6)、150mM NaCl、l%Triton X_100、2mM 钒酸钠、IOOmMNaF和0. 4mg. πιΓ1苯甲基磺酰氟的缓冲液中使细胞溶解。用等量的蛋白质(20 μ g-50 μ g/泳道)进行SDS-PAGE并且转移至硝化纤维素膜上。用抗裂解型PARP、抗裂解型胱天蛋白酶3、抗胱天蛋白酶9 (法国Saint Quentin Yvelines的赛信通生物试剂有限公司(Cell Signaling, Saint Quentin Yvelines, France))、抗 DHFR(法国的艾碧康公司(Abeam, France))、抗β-肌动蛋白(法国Saint-QuentinFallavier的西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich, Saint-QuentinFallavier, France))特异性一抗，随后用连接有过氧化物酶的二抗探测膜并且通过化学发光法进行显影。图2示出所测试的15种人癌细胞系对10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤的相对敏感性。发现9种细胞系对10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤的细胞毒性活性敏感(IC50<0. I μ Μ),而发现6种细胞系具有相对抗性(IC5(i>9 μ Μ)。单个药剂抗增殖作用。在如表I所展示的15种癌细胞系中检验普拉曲沙的抗增殖作用。时程实验显示，当细胞暴露于普拉曲沙72小时之时达到最佳抗增殖作用(
图1Α)。普拉曲沙的IC5tl的范围为O. Ol ±O. 002 μ M(针对前列腺癌细胞系PC3)至>350 μ M(针对MDA-MB-435细胞系)。有趣的是，观察到以下两组细胞系的IC5tl相差超过100倍一组包括PC3、SCC61、DU145、HT29、HOP62、SQ20B、HOP92、HEP2 和 IGROVl 细胞展示 IC5(l〈0. I μ M，而 Colo205、HCC2998、MCF7、HCTl 16、0VCAR3 和 MDA-MB-435 细胞显示 IC5tl 值 >9 μ M。将普拉曲沙的抗增殖作用与甲氨蝶呤和多种常用的抗代谢物(如培美曲塞、5-FU和5' -DFUR、活性卡培他滨(capecitabine)代谢物)的作用进行比较(图IB和表I)。普拉曲沙的IC5tl平均起来为对于甲氨蝶呤所观察到的IC5tl的近乎十分之一。这两种抗叶酸剂的细胞毒性特征在利用相同的两组不同的敏感性和抗性细胞系的情况下为类似的。普拉曲沙的细胞毒性特征不同于5-FU、5^ -DFUR和培美曲塞的细胞毒性特征，表明普拉曲沙与这些其它抗代谢物之间在代谢、作用机制和/或抗性方面存在差异。有趣的是，在普拉曲沙与培美曲塞(一种被认为主要是胸苷酸合成酶(TS)抑制剂的抗叶酸剂)之间观察到有限的交叉敏感性。叶酸转运和代谢中所涉及的基因的表达在该组癌细胞系中分析已知涉及于抗叶酸剂敏感性的基因的表达。通过qRT-PCR测定DHFR、FPGS, TS/TYMS(胸苷酸合成酶)、SCL19AI/RFC-1、GARFT(甘氨酰胺核糖核苷酸甲酰基转移酶)、SLC25A32 (线粒体叶酸转运体/载体)和ABC转运体BI (ABCB1或MDR1)mRNA表达(图3A)。所述细胞系表达不同水平的这些叶酸通路基因，但在普拉曲沙敏感性与TS、SCL19AI/RFC-1、GARFT, SLC25A32和MDRl的mRNA表达之间未发现明显相关性。普拉曲沙敏感性细胞表达的DHFR(普拉曲沙的一种靶标)水平相对高于“抗性”组,但并未达到统计显著性(P=O. 083，图3A)。普拉曲沙敏感性细胞表达的FPGS mRNA水平显著高于抗性细胞(t-检验，p=0. 002)。总之，发现FPGS mRNA表达与普拉曲沙敏感性(IC5tl)之间趋向于正相关(R2=O. 47，p〈0. 01)，表明聚谷氨酸化在普拉曲沙抗增殖活性中具有重要作用。为了确定叶酸转运体在普拉曲沙活性中的潜在作用，我们使9种普拉曲沙敏感性细胞系在药物暴露72小时后获得的IC5tl值与SCL19A1/RFC-1和SLC25A32的mRNA表达水平相关联(图3B)。表达高水平SCL19A1/RFC-1和SLC25A32mRNA的细胞展示出较高的普拉曲沙敏感性，表明SCL19A1/RFC-1和SLC25A32在普拉曲沙的细胞吸收方面具有潜在作用。 表I. 一组人癌细胞系在暴露于普拉曲沙、甲氨蝶呤、5-FU、5' -DFUR或培美曲塞72小时后的细胞毒性(IC50，μ Μ)。
细胞系*普拉曲沙甲氨蝶呤培美曲塞5-FUSt-PFilR
PO0.010.12.71.525
SCOSl0.0110.030.0151.23.2
DU1450.0150.30.048728ΗΤ290.020.220.023316 ΗΟΡ620.0230.150.02978380 SQ20B0.030.260.0251027 ΗΟΡ920,0310,60.0218135 ΗΕΡ20.050.250.186250 IGROVl0-08033300829
权利要求
1.一种治疗个体的甲氨蝶呤抗性病症的方法，其中所述方法包括向患有甲氨蝶呤抗性病症的所述个体施用药学有效量的包含10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤或它的药学上可接受的盐的组合物。
2.如权利要求I所述的方法，其中所述病症为癌症。
3.如权利要求2所述的方法，其中欲治疗的所述癌症为前列腺癌、T细胞淋巴瘤、乳癌、肺癌、血液系统恶性肿瘤、头颈癌、胃肠道癌症、卵巢癌和骨肉瘤。
4.如权利要求I所述的方法，其中所述病症为炎症性病症。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述炎症性病症为类风湿性关节炎。
6.如权利要求I所述的方法，其中所述组合物被配制用于口服施用。
7.如权利要求I所述的方法，其中所述组合物被配制用于静脉内施用。
8.一种治疗需要甲氨蝶呤抗性瘤形成治疗的个体的方法，其中所述方法包括向所述个体施用包含有效量的10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤或它的药学上可接受的盐的组合物。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述病症为癌症。
10.如权利要求9所述的方法，其中欲治疗的所述癌症为前列腺癌、T细胞淋巴瘤、乳癌、肺癌、血液系统恶性肿瘤、头颈癌、胃肠道癌症、卵巢癌和骨肉瘤。
11.如权利要求8所述的方法，其中所述病症为炎症性病症。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述炎症性病症为类风湿性关节炎。
13.如权利要求8所述的方法，其中所述组合物被配制用于口服施用。
14.如权利要求8所述的方法，其中所述组合物被配制用于静脉内施用。
15.如权利要求I所述的方法，其中所述甲氨蝶呤抗性病症为已获得对甲氨蝶呤的抗性的病症。
全文摘要
本发明涉及一种治疗个体的甲氨蝶呤抗性病症的方法，其中所述方法包括向所述个体施用有效量的10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤或它的药学上可接受的盐。
文档编号A61K31/495GK102984940SQ201180026765
公开日2013年3月20日 申请日期2011年6月2日 优先权日2010年6月2日
发明者G·J·普隆克 申请人:阿罗斯治疗公司