专利名称：基于包囊在脂质体中的海葵溶细胞素的疫苗组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及应用于人类健康的生物技术的领域。特别地，本发明涉及基于脂质体的用于皮下以及肌内使用的疫苗载体 ，所述脂质体包含海葵溶细胞素(Sticholysin)并且增强特异于抗原的细胞免疫应答，该疫苗载体在癌症的免疫疗法和在由细胞内病原体引起的疾病的治疗中是有用的。
现有技术很久以来就知道脂质体囊泡的免疫佐剂能力。存在于在免疫接种中和在疫苗设计中使用脂质体方面的合理性基于其在抗原呈递细胞(APC)中释放抗原分子并刺激免疫应答的能力。脂质体作为免疫佐剂的最主要的优点概括如下(i)模拟病原体将大量抗原运输至APC的能力，(ii)将抗原与免疫刺激分子一起共包囊的可能性，(iii)在以更大功效为目的来修饰其物理化学特性方面的灵活性，和(iv)其是生物可降解的和非毒性的这一事实(Leserman, Journal of Liposome Research, 2004，14(3&4)，175-189)。疫苗学领域中的一个挑战是增强特异于抗原的由⑶8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)介导的细胞免疫应答，这与由细胞内病原体和肿瘤细胞诱导的疾病的预防和治疗相关。月旨质体囊泡可以增强CTL应答但并非总是有效。已设计了各种不同的基于脂质体囊泡的策略，以便使该功能更高效；它的实例为对于内体的酸性PH敏感的脂质体，阳离子脂质体，将免疫调节剂例如CpG和细菌来源的成孔性毒素包含在内。尽管有着各种各样的出版物，但这些策略中的一些在诱导有效的细胞免疫应答方面具有有限的成功或者存在缺点，因此在其应用之前需要更好的设计。将病毒膜蛋白整合到脂质体膜中以便促进在酸性pH或蛋白酶解加工的条件下的膜融合，已成为用于开发疫苗载体的另一个选择。这些称为病毒体(virosome)的囊泡不仅被用作亲代病毒疫苗，而且还被利用作为用于结合或包囊至病毒体的疫苗抗原的载体(Zurbriggen，Vaccine, 200314; 21 (9-10) :921_4)。已知具有首字母缩写IRIV(免疫增强性重建流感病毒体(immunopotentiating reconstituted influenza virosomes))的病毒体颗粒(其包含流感病毒的包膜的蛋白质和脂质)是该策略的最好代表，并且构成针对甲型肝炎的疫苗的那篇专利(专利号US5，565，203)的基础。但是，该疫苗制备物被设计为增强针对甲型肝炎病毒的中和抗体的应答。将灭活的和高度纯的甲型肝炎病毒固定在病毒体膜中有利于来自典型的MHCII途径的肽的加工和呈递，这由于在APC中病毒体膜和内体膜的融合过程而造成(Gliick 和 \V’inti，Dev Biol(Basel), 2000, 103，189-97)。所描述的证据表明，抗原-病毒体的物理联合在免疫佐剂性中是重要的(Zurbriggen等人，Progr. in LipidRes. , 2000, 39 (I), 3-18 ；Amacker 等人，Int TmmunoI. , 2005, 17 (6), 695-704)。Schumacher 等人(Vaccine22:714-723，2004)报告，IRIV 也能够增强由细胞介导的免疫应答。特别地,Schumacher等人证明了其在体外诱导CTL中的佐剂活性。该能力主要依赖于对于病毒蛋白质特异的CD4+T细胞反应性的刺激。然而，虽然将病毒体作为佐剂进行使用具有许多优点例如低毒性和高免疫原性，但在目前的病毒体技术中的问题之一是不存在用于有效地包囊溶质(例如，对于诱导CTL应答所必需的蛋白质)的方法。在产生病毒体所处的脂质浓度(大约ImM的脂质)下，并且假定其直径为大约200nm，少于1%的水相最终被包囊在病毒体内(Schoen等人，J. Liposome Res. , 3:767-792，1993)。这些特征显著地降低了病毒体将抗原或基因释放至细胞的效率。最近在专利申请号US20100015214中公开的用于克服该限制并产生关于CD8+T细胞的免疫原性制备物的策略基于空病毒体与载体(优选地，脂质体)(其包囊有所述抗原)的组合。US20100015214描述了关于病毒体的反式佐剂(trans-a djuvant)效应,尽管这些颗粒和所述脂质体并不展现出任何的彼此之间的物理相互作用。在发表于J Liposome Res.，2008，18 (I)，1-19中的Lanio等人的文章之中，对于rhEGF，描述了通过脱水-再水化的方法获得(DRV)并且由以I: I的摩尔比的饱和磷脂酰胆碱(PC) (二棕榈酰磷脂酰胆碱，DPPC)和胆固醇(Cho)构成的脂质体的较高的包囊-保留效率，相比于包含不饱和PC和Cho的那些而言。事实上，DRV的获得方法产生了具有多个双层的囊泡，其对于各种各样的可溶性溶质具有高的包囊/保留效率。Lanio等人证明了这些 囊泡的免疫佐剂特性，其用于增强针对rhEGF的在数量上和在质量上优异的抗体应答。在由人Ivarez等人所作并发表在Toxicon, 2009, 54(8) : 1135-47中的综述之中，概述了由加勒比海海葵(向日葵列指海葵)(Stichodactyla helianthus)这种海洋无脊椎动物产生并被作者命名为海葵溶细胞素(St)I和II (StI/II)的两种蛋白质的结构和功能特征。这些是属于海葵孔蛋白(Actinoporin)这一蛋白质家族(仅在海葵中发现的真核生物来源的独特的PFT类别)的成孔性毒素(PFT,pore-forming toxin)。与该家族的其他成员一样，St是具有高的等电点(>9. 5)的碱性蛋白质，其具有大约20kDa的分子量，在其氨基酸序列中缺乏半胱氨酸残基，并且偏好包含鞘磷脂(SM)的膜。St以可溶性形式产生，但可以容易地与不同的细胞膜和模型膜系统相联合从而形成直径为2nm的孔，这可能通过四个单体的N-末端的a螺旋的相互作用。这两个事件(联合和孔形成)均依赖于膜的物理-化学特性。在发表于Toxicon, 2007，49:68-81中的Martinez等人的文章之中，描述了 SM和Cho的存在对于通过StII的在膜中的“结合-孔形成”的重要性。膜的相态影响StII与这些结构的联合。根据由Martinez等人在Revista BiologIa, 2002, 16，2:85-93中所发表的文章，该毒素与DPPC和SM的膜可逆地联合，并且具有非常低的渗透能力。尽管已详尽地报告了细菌来源的成孔性毒素用于诱导特异于抗原的CTL应答的免疫调节特性，这通过使用各种不同的策略，包括将其在脂质体中进行运载，如在由Dietrich 等人和由 Mor6n 等人分别在 TRENDS in Microbiology, 2001, Vol. 9No. 1,23-28 和TRENDS in Immunology, 2004，Vol. 25No. 2，92-97中所作的综述之中所概述的那样；但根本没有提及在功能上同源的且源自海洋真核生物的毒素。从将其应用于肿瘤疾病的免疫治疗的观点看，所希望的是拥有新的疫苗组合物，其能够诱导特异于抗原的细胞免疫应答并且具有比包含细菌毒素的那些组合物更少的侵袭性。发明简述令人惊讶地，本发明的作者发现，当以包囊在脂质体-St疫苗制剂(其具有所描述的毒素的任何变体(包括不展示出孔形成或裂解活性的那些))中的形式通过皮下(SC)或肌内(im)途径施用抗原时，诱导出比在使用聚肌胞苷酸(PIC)(其在现有技术中被认为是CTL应答的出色的增强剂)的阳性对照组中所观察到的高得多的靶细胞裂解百分比，而不改变抗体水平和Thl/Th2混合应答(其由该脂质体抗原所诱导)。这表明了脂质体-St系统产生针对蛋白质抗原的细胞应答以及体液应答的潜力，这一点对于以疫苗为目的的该制剂的使用是重要的。本发明的目标是疫苗载体，其基于DPPC和Cho的脂质体制备物，在所述脂质体制备物中将称为St的毒素与蛋白质抗原一起进行共包囊。本发明的目标还是那些DPPC和Cho的脂质体制备物，在所述脂质体制备物中将称为St的毒素的突变体(例如StIWlllC和StIfflllCirrev)与蛋白质抗原一起进行共包囊。在另一个方面，本发明的目标还是用于诱导强有力的对于所讨论的抗原特异的 CTL应答的疫苗组合物，其基于所述疫苗载体，并且包含所述毒素以及所连同的抗原且通过皮下或肌内途径进行施用。本发明的目标还是所描述的疫苗组合物用于加强患有病理学状态的患者的免疫应答的用途，所述病理学状态选自癌症和由细胞内病原体引起的感染性疾病，所述疫苗组合物基于所述疫苗载体，并且包含所述毒素以及所连同的抗原且通过皮下或肌内途径进行施用。在另一个方面，本发明的目标还是用于治疗需要加强其免疫应答的患者的方法，其中通过皮下或肌内途径来施用疫苗组合物，所述疫苗组合物基于所述疫苗载体，并且包含毒素St或其突变体以及所连同的对于所述病理学状况来说重要的抗原。另外，本发明还涉及由所述疫苗组合物所提供的针对表达该抗原的肿瘤细胞的攻击的保护作用，从而降低肿瘤出现的百分比并提高携带肿瘤的受试者的存活。因此，本发明的目标还是与该抗原相关的疾病出现的预防方法。发明详述作为本发明目标的疫苗载体基于以1:1的摩尔比的DPPC = Cho的DRV脂质体的水性分散体，所述DRV脂质体包囊有St以及所连同的抗原，并且任选地可以包含其他与水可混溶的、非毒性的、非刺激性的且不引起囊泡去稳定化的共溶剂，例如通常在可注射的药物组合物中使用的那些，例如糖、聚乙二醇等。本发明的脂质体制备物通过脱水-再水化方法来获得，且由以1:1的摩尔比的DPPC和Cho构成，并且共包囊有一些St变体或其可逆地无活性的突变体以及一起的抗原；其中所述疫苗组合物能够增强特异于该抗原的并针对肿瘤细胞攻击的保护性的CTL免疫应答。在本发明的一个实施方案中，所述疫苗组合物包含蛋白质OVA作为抗原，但其中所述抗原可以为与病理学状态相关的任何蛋白质或多肽，对于所述病理学状态，从治疗的观点来看，诱导针对所述蛋白质抗原的特异性CTL免疫应答是重要的。例如，该抗原可以是与癌症相关的蛋白质或多肽，与AIDS相关的蛋白质或多肽，或者与结核病相关的蛋白质或多肽。本发明中所描述的脂质体通过由Kirby和Gregoriadis在Biotechnology, 1984，2，979-984中所描述的脱水-再水化技术来获得，这些是具有被数个脂质双层包围的内部水相的囊泡，其特征在于不稳定的分子(例如，蛋白质性质的抗原和免疫调节剂)的包囊和保留的高效率。旋转蒸发以1:1的摩尔比的DPPC和Cho的氯仿溶液，并在真空中保持30分钟。在高于DPPC的相变温度(Tc)的温度(T>45°C)下用去离子水使脂质水化。通过超声和静止的循环或者通过经过孔大小为IOOnm的聚碳酸酯膜的挤出，将所得的多层囊泡(MLV)的悬浮液转变为SUV或LUV(分别为小单层囊泡和大单层囊泡)。按照16-64 V- mo I的脂质:I. 8-7nmol的抗原和0. 5_2nmol的St这样的脂质:蛋白质比例，将所获得的囊泡与蛋白质溶液相混合，并冻干20-24小时。用去离子水并且通过在等于或高于45°C的温度下搅拌30分钟来进行再水化。通过用磷酸缓冲盐水(PBS)pH7. 4(NaC1136mmol/
I,KH2PO4L 47mmol/l, Na2HP049. 55mmol/l, KC12. 68mmol/l)进行洗涤和随后在 IOOOOg 下离心15分钟来去除未被包囊入脂质体中的物料。所述制备物对于各种不同的St变体达到了在50%左右变动的包囊效率，并且以在PBS中的悬浮液在4°C下储存一个月后具有70%的保
&3甶o
通过使用由Lanio等人在Toxicon, 2001, 39, 187-94中所描述的方法，从加勒比海海葵中分离和纯化出了毒素StI和StII。分别根据由Pazos等人在 Toxicon, 2006, 48, 1083-1094 中和由 Pent6n 等人在 Protein Eng DesSel. 2011, 24, 485-493中所描述的方法，获得了重组海葵溶细胞素I (rStl)和rStl的突变体，StI WlllCo在本发明的疫苗载体中，所使用的St的浓度在0.25-1 ii M的范围内，并且将其与在1-3. 5uM的浓度范围内的抗原一起在具有16-64mM的总脂质浓度范围的脂质体悬浮液中进行共包囊。优选地，本发明的疫苗载体包含0. 3-0. 4nmol的St的量，其与l_2nmol抗原一起于在200 u L的体积中具有20 u mol总脂质的脂质体悬浮液中进行共包囊。对于在本发明中所提及的疫苗所采用的剂量范围为lnmol-2nmol (50_100iig)的抗原，通过皮下或肌内途径。作为本发明目标的疫苗组合物的基本特征是，除了所描述的那些之外，没有其他免疫佐剂。如前面已经解释的，从现有技术中已知包囊在脂质体囊泡中的细菌来源的成孔性毒素能够增强CTL应答，但知道在人中使用基于细菌来源的毒素的疫苗组合物所具有的副作用；然而，本发明的作者出人意料地发现，非细菌的毒素能够具有同样的免疫刺激效应。此外，本发明的作者实现了使毒素的孔形成活性与其刺激CTL应答的效应相脱离，这为该疫苗载体在人中的临床使用提供了巨大的优点。通过在本发明的疫苗载体中使用与抗原共包囊入脂质体中的StIWlllCimv或热灭活的StII这些分子实体而获得的结果使得能够证明，在通过脂质体-St制剂的对于特异于抗原的CTL免疫应答的增强与这些蛋白质在膜中形成孔的能力之间不存在绝对的依存性。从C57BL/6小鼠的骨髓中分离的并在体外暴露于StII的树突细胞(DC)的成熟试验证明了该蛋白质(不仅以其活性变体的形式，而且以热灭活的形式)诱导DC激活的能力，与在相似条件下用LPS (阳性对照)所观察到的相当。通过溶血活性试验和荷载有羧基荧光素(CF)的LUV的渗透试验(如由Martinez等人在Toxicon, 2001, 39，1547-1560中所描述的)来评价St在膜中形成孔的能力。通过包囊有CF的DPPC: Cho (1:1)的脂质体囊泡的渗透试验证明了，St不展示出渗透活性，与在由蛋黄磷脂酰胆碱和SM (I: I)构成的囊泡(阳性对照)中所观察到的相比。通过溶血活性试验和在作为还原剂的2-巯基乙醇(2-ME)存在和不存在下的SDS-PAGE 电泳(如由 Pent6n 等人在 Protein Eng Des Sel. 2011，24，485-493 中所描述的)，验证了突变体StIWlllC形成通过二硫键而稳定化的无活性的二聚体。二聚体结构不能在作为模型细胞的红细胞中形成孔，这是其不与膜相联合的结果。建立了用于获得StIWlllC的不可逆二聚体种类(StIWlllCinev)的方法，其基于通过与2-ME (0. lmol/1) 一起进行温育来使StIWlllC还原，通过在I3D-IO柱中的过滤来去除该还原剂，和在4°C下以1:1或2:1的“StIWlllC单体BMH”摩尔比使StIWlllC单体与同双功能试剂双(马来酰亚胺)己烷(BMH)立即温育2小时。通过在还原剂存在下在Superdex75HR10/30柱中的凝胶过滤色谱法来纯化StIWlllCilTev。通过在还原条件下的SDS-PAGE来验证不可逆二聚体的获得和其纯度。以94%的纯度获得了不可逆二聚体，其中只有6%的污染性的可逆二聚体。通过溶血活性试验验证了不存在功能活性。
根据由Martinez等人在Toxicon, 2001, 39, 1547-1560中所描述的方法,通过热处理来进行StII的不可逆的灭活，并且通过溶血活性试验而检查出了在膜中形成孔的能力的完全丧失。与其增强体内抗原特异性细胞毒性免疫应答和抗肿瘤免疫力(在预防情景下)的能力相关的在脂质体-St颗粒系统中各种不同的St分子种类的免疫调节特性，可以通过使用抗原OVA和E. G7肿瘤细胞系，在C57BL/6品系的小鼠的实验模型中进行测量，所述E. G7 肿瘤细胞系是用 OVA 的互补 DNA pAc-neo-OVA (Moore 等人，Cell, 1988，54:777-85)转染的鼠类胸腺瘤EL-4的亚克隆(Kusmartsev和Gabrilovich, J LeukocBiol.，2003, 74:186-96)，并且获自“美国典型培养物保藏中心”(ATCC，VA) 本发明的作者还发现，用包含抗原的脂质体-St疫苗载体进行的预防接种诱导了比通过不包含StII的脂质体所产生的更高的抗肿瘤保护作用。这些结果证明，当使用蛋白质抗原时，脂质体-St系统对于诱导在功能上稳固的且保护性的抗肿瘤应答来说是有效的，而无需其他佐剂。反过来，在联合疗法中使用该制备物可以进一步增强其抗肿瘤效应。在下面的实施例中，包括了比较实验细节，其使得能够检验在使用作为本发明目标的疫苗组合物时诱导体内抗原特异性细胞毒性免疫应答和抗肿瘤免疫力(在预防情景下)的免疫效力，相对于不是脂质体的和不包含St的其他制剂而言。
实施例实施例I :使用天然StI或StII和作为抗原的蛋白质OVA的疫苗载体的细胞毒性和CTL应答的评价根据先前所描述的来制备基于脂质体的疫苗载体。在磷酸缓冲盐水(PBS) pH7. 4中，将作为模型抗原的OVA和St (St I或St II)以“ 10 ii mo I总脂质I. Inmo I OVA和0. 3nmo ISt”的比例共包囊在由DPPC和Cho (1:1的摩尔比)构成的DRV囊泡中。如此获得两种疫苗组合物疫苗组合物A DPPC:Cho (60 u mol的总脂质)的DRV脂质体，其包囊有6. 6nmol(50u g)的 OVA ；疫苗组合物B DPPC: Cho (60 u mol的总脂质)的DRV脂质体，其共包囊有6. 6nmol(50u g)的 OVA 和 I. 88nmol 的 StI 或 StII。选择15只体重为18_20g的雌性C57BL/6小鼠，并分成5个试验组，每组3只动物。
在第O、12、13和14天，用0. 2ml的磷酸缓冲盐水(PBS)通过皮下途径对第I组(阴性对照)进行接种。 在第12天，用22. 2nmol (lmg)的OVA以及所混合有的100 y g的聚肌胞苷酸(PIC) (TLR3的合成配体和CTL应答的典型诱导物)(Hamilton-WiIIiams等人，J.Immunol.，2005, 174:1159-63)通过皮下途径对第2组(阳性对照)进行接种；在第13和14天，使动物再次接受100 ii g的PIC。在第0和12天,用0. 2ml的疫苗组合物A (相当于I. Inmol或50 ii g的0VA)通过皮下途径对第3组进行接种。在第0和12天，用0. 2ml的疫苗组合物B (相当于I. Inmol或50 ii g的OVA和0. 3nmol或6. 25 y g的StI)通过皮下途径对第4组进行接种。在第0和12天，用0. 2ml的疫苗组合物B (相当于I. Inmol或50 ii g的OVA和 0. 3nmol或6. 25 y g的StII)通过皮下途径对第5组进行接种。在实验的第20天，将未经免疫接种的C57BL/6小鼠的肾细胞与两种浓度的羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺基酯(CFSE)(分别为0. 33和5i!m0l/l) —起进行温育；还将具有最高荧光强度的经标记的细胞与I U mol/1的在C57BL/6小鼠品系的MHC I单元型的背景下免疫显性的OVA肽(257-SIINFEKL-264) —起进行温育。然后，将经标记的细胞以1:1进行混合，并用在0. 2ml体积中的30 X IO6个混合细胞通过尾静脉对实验组1-5进行接种。在16小时后处死小鼠，并通过流式细胞术(FACS)来测定在最接近免疫接种位点的腹股沟淋巴结中靶细胞的裂解百分比。在图I中，显示了通过用共包囊有OVA和St的脂质体对小鼠进行免疫接种而在体内产生的细胞毒性。用包囊有St (StI或StII)的脂质体进行免疫接种的动物显示出在统计学上高于阳性对照组的特异于OVA的⑶8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。另外，仅包含OVA的脂质体也诱导在统计学上与该试验的典型阳性对照(PIC)相似的CTL应答。实施例2 :在蛋白质OVA模型中疫苗载体的抗肿瘤保护作用的诱导对于基于脂质体的疫苗，研究了其诱导抗肿瘤保护作用的能力。为此，选择了 60只体重为18_20g的雌性C57BL/6小鼠，并分成3个试验组，每组20只动物。在第0和12天，用0. 2ml的磷酸缓冲盐水(PBS)通过肌内途径对第I组(阴性对照)进行接种。在第0和12天，用0. 2ml的在实施例I中所描述的疫苗组合物A(相当于I. Inmol或50 y g的0VA)通过肌内途径对第2组进行接种。在第0和12天，用0. 2ml的在实施例I中所描述的疫苗组合物B(相当于I. Inmol或50 ii g的OVA和0. 3nmol或6. 25 y g的StII)通过肌内途径对第3组进行接种。在第19天，用3 X IO5个E.G7肿瘤细胞系的细胞通过皮下途径攻击所有第I至3组(0. 2ml)。从第0天开始分别对待所述动物，并且每周三次测定下列参数肿瘤体积、进展时间和存活。所获得的结果如下进展时间进展时间是这样的参数，其评估从接种时刻开始测量的、至在每只个体动物中出现肿瘤时所经过的时间。对于在实验结束时未形成肿瘤的小鼠，认为进展时间为60天。在进展时间延长方面的影响是对于针对癌症的疫苗来说非常希望的参数。根据在图2A中所观察到的，用在实施例I中所描述的且为本发明目标的疫苗组合物B制剂进行疫苗接种的第3组动物显示出最优秀的结果。 存活该参数评价疫苗接种增加在用表达OVA的肿瘤细胞(E. G7)进行攻击后经免疫接种的动物生存的时间的能力。该参数以天进行测量，并且具有相对的特征，因为是将其与未处理的动物的存活进行比较。用于查验存活比较的统计学显著性的选择验证为时序(Log-Rank)检验。在图2B中清楚地显示，用在实施例I中所描述的且为本发明目标的疫苗组合物B进行疫苗接种的第3组动物是在肿瘤接种后存活最长时间的那些。实施例3 =St的突变体的溶血活性在红细胞的膜中孔的形成产生胶体渗透压休克，其因此造成细胞的裂解。因此，孔蛋白(porin)的孔形成活性可以通过其溶血活性(HA)来进行评价，所述溶血活性以实验方式通过由细胞裂解所产生的红细胞悬浮液的表观吸光度(X =600nm)的降低来测定。在该试验中，将StIWlllC的不可逆地无活性的二聚体(StIWlllCteev)的HA与可逆的二聚变体StIWlllC的HA进行比较，在还原条件(2-MEO. lmol/1)和非还原条件下，对于在该试验中相对较高的蛋白质浓度(0. 151111101/1)，如果与由4丨131^2等人在Toxicon, 2009，54 (8) : 1135-47中所报告的StI/Stll的HA进行比较。在图3中所显示的溶血动力学表明，StIWlllCteev在非还原条件下是无活性的。在还原条件下，StIWlllCteevM示出比完全经还原的和未还原的StIWlllC低的裂解活性。实施例4 :灭活的StII的孔形成能力的评价通过溶血活性试验来评价经过在80°C下加热2小时而不可逆地灭活的StII在膜中形成孔的能力的丧失。在图4中看出了灭活的StII的溶血活性的完全缺乏，与具有活性的蛋白质相比较。实施例5 :疫苗载体对于DC成熟的影响在具有5%C02的室中在37°C下24小时，在20ii g多粘菌素B (pmxB，通过结合至LPS的脂质A部分而中和内毒素的生物学活性的试剂)存在或不存在下，在从暴露于具有活性的StII (0. Inmol或2 ii g)或通过热处理灭活的StII (4y g)的C57BL/6小鼠的骨髓获得的细胞中评价由StII诱导的DC成熟。作为阳性对照，使用LPS(2iig)，和作为阴性对照，使用RPMI培养基+pmxB。将从小鼠骨髓中抽取的细胞以每孔600000个DC前体的数目(在RPMI培养基中)接种在6孔-平板中。在每个孔中添加10%胎牛血清(FBS)、400 u I GMCSF和RPMI，直至补足每孔3ml的体积。在图5中显示了指示DC激活的分子标志物(⑶80、⑶86和CD40)的百分比的增加，这是由于这些细胞在体外暴露于StII (以其具有活性的变体以及通过热处理灭活的变体)，并且所述结果与阳性对照的结果相当。实施例6 :使用St突变体和作为抗原的蛋白质OVA的疫苗载体的细胞毒性和CTL应答的评价在PBS pH7. 4中，将具有可逆的(StIWl11C)或不可逆的(StIWlIICinev)低的孔形成活性的StI的二聚变体和通过热处理灭活的StII的变体与抗原OVA —起以“10 u mol总脂质:1. InmolOVA:0. 3nmol StIWlllC、StIWlllCteev或通过热处理灭活的StII”的比例共包囊在DPPC = Cho (1:1)的脂质体中，并评价这些疫苗制备物在体内诱导OVA-特异性细胞毒活性的能力。在这些试验中，基本上使用在实施例I中所描述的疫苗组合物，在组合物B的情况下，使用不同的St变体。疫苗组合物A DPPC: Cho (60 u mol的总脂质)的DRV脂质体，其包囊有6. 6nmol的OVA。疫苗组合物B DPPC: Cho (60 u mol的总脂质)的DRV脂质体，其共包囊有6. 6nmol的 OVA 和 I. 875nmol 的 St(StIWlllC、StIWlllCteev、天然 StII 或通过热处理灭活的 StII)。在第一个试验中，选择12只体重为18-20g的雌性C57BL/6小鼠，并分成4个试验 组，每组3只动物。在第0和12天，用0. 2ml的PBS通过皮下途径对第I组(阴性对照)进行接种。在第0和12天，用0. 2ml的疫苗组合物B (相当于I. Inmol或50 ii g的OVA和0. 3nmol或6. 25 y g的天然StII)通过皮下途径对第2组(阳性对照)进行接种。在第0和12天，用0. 2ml的疫苗组合物B (相当于I. Inmol或50 ii g的OVA和0. 3nmol或6. 25 y g的StIWlllC)通过皮下途径对第3组进行接种。在第0和12天，用0. 2ml的疫苗组合物B (相当于I. Inmol或50 ii g的OVA和0. 3nmol或6. 25 y g的StIWlllCteev)通过皮下途径对第4组进行接种。在图6A中显示，在用包含具有低的孔形成活性的St变体的脂质体(LP/OVA+StlfflllC或LP/0VA+StIWlIICiraev)进行免疫接种的动物中，诱导了在统计学上与通过StII (当与OVA—起共包囊在脂质体中时)(LP/0VA+StII)所获得的细胞毒性应答相似的细胞毒性应答。对于其他试验，选择9只体重为18_20g的雌性C57BL/6小鼠，并分成3个试验组，每组3只动物。在第0和12天，用0. 2ml的磷酸缓冲盐水(PBS)通过皮下途径对第I组(阴性对照)进行接种。在第0和12天,用0. 2ml的疫苗组合物A (相当于I. Inmol或50 ii g的0VA)通过皮下途径对第2组进行接种。在第0和12天，用0. 2ml的疫苗组合物B (相当于I. Inmol或50 ii g的OVA和
0.3nmol或6. 25 y g的无活性的StII)通过皮下途径对第3组进行接种。图6B表明，用共包囊有OVA和通过热处理完全灭活的StII变体的脂质体进行免疫接种产生了这样的OVA-特异性细胞毒活性，其显著地高于通过仅包含抗原的脂质体所诱导的细胞毒活性并且与用包含天然StI/Stll的脂质体制剂所观察到的细胞毒活性相似。实验结果证明，作为本发明目标的脂质体疫苗(其将抗原与海葵溶细胞素的任一种变体一起，甚至与不展示出孔形成活性的那些变体一起进行共包囊)在体内CTL试验中诱导强有力的特异于抗原的CTL应答，其是稳固的和功能性的，并且比典型阳性对照(PIC)大得多。在预防情景下，脂质体-St制剂在所评价的组中增加了肿瘤植入成活的时间过程并且显著地增加了存活，相对于仅用PBS进行处理的那些而言。总之，用脂质体-St进行的疫苗接种显示出比用仅包含抗原的脂质体囊泡所观察到的那些更好的结果。
附图
简述图I :显示了这样的图，该图呈现了在体内细胞毒性试验中，在经历了不同疫苗处理的实验动物中，荷载有OVA的免疫显性肽(SIINFEKL)并用CFSE进行标记的靶细胞的裂解百分比。每个点相应于一只动物的数据，并且该线相应于至少两个独立实验的平均值。不同的字母指示了根据Dunnett T3检验的在免疫接种组之间的统计学显著性(p〈0. 05)。图2A :显示了在三个经历了不同疫苗处理并且用表达OVA的肿瘤细胞攻击的实验动物组中没有肿瘤的动物的百分比。图2B :显示了这样的图，该图使得能够看出在所提及的3个组中在接种表达OVA的肿瘤细胞后的存活参数。不同的字母指示了根据时序检验的统计学显著性(P〈0. 05)。图3 :显示了在还原条件(存在2-ME)和非还原条件下由于StI的二聚变体(StIfflllC或StIWlllCteev)的作用而产生的红细胞悬浮液浊度的变化。
·
图4 :显示了经由天然StII (具有活性的蛋白质)或通过热处理灭活的StII的作用而引起的红细胞悬浮液浊度的丧失。图5 :显示了在内毒素的中和试剂(pmxB)存在或不存在下，由于在体外暴露于StII (以其具有活性的变体以及通过热处理灭活的变体)而引起的在树突细胞(DC)中分子标志物的表达的变化。图A : CD80的百分比。图B:CD86的百分比。图C CD40的百分比。图6 :显示了两张图，所述图呈现了在体内细胞毒性试验中，在经历了不同疫苗处理的实验动物中，荷载有OVA的免疫显性肽(SIINFEKL)并用CFSE进行标记的靶细胞的裂解百分比。每个点相应于一只动物的数据，并且该线相应于平均值。不同的字母指示了根据Tukey检验的在免疫接种组之间的统计学显著性(p〈0. 05)。图A :通过用共包囊有0VA、天然StII或者可逆的StI的二聚变体(StIWlllC)或不可逆地无活性的StI的二聚变体(StIWlllCimv)的脂质体进行免疫接种而获得的应答。图B :通过用共包囊有OVA和通过热处理灭活的StII的脂质体进行免疫接种而获得的应答。
权利要求
1.用于诱导细胞免疫应答的疫苗载体，其特征在于，其包括从加勒比海海葵获得的蛋白质与抗原一起包囊在脂质囊泡中。
2.权利要求I的疫苗载体，其特征在于，所述脂质囊泡包含以等摩尔比的DPPC和Cho。
3.权利要求I的疫苗载体，其特征在于，所述来自加勒比海海葵的蛋白质选自StII、StI及其变体。
4.权利要求3的疫苗载体，其特征在于，St毒素的变体选自StIWlllC、StIWlllCteev*通过热处理灭活的StII。
5.权利要求I的疫苗载体，其特征在于，所述抗原为与病理学状态相关的蛋白质或多肽，所述病理学状态选自癌症和由细胞内病原体引起的感染性疾病。
6.权利要求5的疫苗载体，其特征在于，所述抗原为与癌症相关的蛋白质或多肽。
7.权利要求5的疫苗载体，其特征在于，所述抗原为与AIDS相关的蛋白质或多肽。
8.权利要求5的疫苗载体，其特征在于，所述抗原为与结核病相关的蛋白质或多肽。
9.疫苗组合物，其特征在于，其包含权利要求I至9中任一项的疫苗载体，并且没有免疫佐剂。
10.权利要求9的疫苗组合物用于加强患有病理学状态的患者的免疫应答的用途，所述病理学状态选自癌症和由细胞内病原体引起的感染性疾病。
全文摘要
本发明涉及应用于人类健康的生物技术领域。在本发明中描述了用于皮下或肌内施用的疫苗载体，其中来自真核生物的毒素被包囊在具有多个脂质层的脂质体中，所述脂质体通过脱水/再水化的方法来获得，并且其脂质组成为以1∶1的摩尔比的二棕榈酰磷脂酰胆碱∶胆固醇。这些组合物不需要使用其他佐剂。所描述的组合物使得可能调节针对共包囊在包含该毒素的脂质体中的一种或多种抗原的特异性的CTL免疫应答。由于其所诱导的免疫应答的稳固性和功能性以及其免疫调节特性，本发明的疫苗载体具有相对于现有技术所描述的其他疫苗载体而言的优点。
文档编号A61K9/127GK102971011SQ201180033067
公开日2013年3月13日 申请日期2011年7月5日 优先权日2010年7月6日
发明者L·E·费尔南德斯莫利纳, M·E·拉尼奥鲁伊斯, R·J·拉沃尔德金塔纳, Y·克鲁斯莱亚尔, M·D·C·卢萨多洛伦索, C·梅萨帕迪略, C·M·阿尔瓦雷斯巴尔卡塞尔, I·F·帕索斯桑托斯, M·特胡卡马丁内斯, A·巴列加拉伊, M·E·阿隆索比奥斯卡, L·卡内特桑托斯 申请人:分子免疫中心