专利名称：修饰的单结构域抗原结合分子及其应用的制作方法
修饰的单结构域抗原结合分子及其应用本申请要求于2010年7月16日提交的美国临时申请号61/365，307的优先权，该优先权申请的内容通过引用结合于此。背景肿瘤坏死因子a (TNFa)是一种主要由巨噬细胞和单核细胞产生的分泌的和膜结合的促炎性细胞因子。TNFa的合成在各种慢性自身免疫炎性疾病中被上调，所述慢性自身免疫炎性疾病如类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、溃瘍性结肠炎(ulcerativecolitis)、局限性肠炎(Crohn' s Disease)及其他。TNF a表达为三聚体跨膜蛋白，其可以被TNF a转化酶(TACE)蛋白水解切割，从而释放其可溶形式。两种形式的TNFa均与TNF受体(TNFR) I和TNFR2相互作用。概述本发明涉及修饰的单结构域抗原结合分子(jingle domain antigen bindingmolecules，在本文中还称为“SDAB分子”)。所述修饰的SDAB分子可以包含一个或多个与一种或多种靶标相互作用(例如 ，与之结合)的单抗原结合结构域。在一个实施方案中，所述修饰的SDAB分子的一个或多个单抗原结合结构域与肿瘤坏死因子a (TNFa)结合。所述SDAB分子可以被修饰，从而增加其体内生物特性。例如，所述SDAB分子可以被修饰，从而与未修饰的SDAB分子相比改善下述中的一种或多种:增加的半衰期；减少的免疫原性；或改善至少一种药动学/药效学(PK/PD)参数。在一个实施方案中，所述修饰的SDAB分子包含一种或多种聚合物分子，诸如聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物。所述修饰的SDAB分子是有用的，例如，用于施用给受试者，例如人。本发明还公开了制备所述修饰的SDAB分子的方法，和使用所述修饰的SDAB分子治疗或预防例如TNF a -相关病症的方法。因此，在一个方面中，本发明描述一种修饰的SDAB分子，所述分子包括:(i)与一种或多种靶标(例如，TNFa )相互作用(例如，与之结合)的一个或多个单抗原结合结构域；(ii)连接体(例如，非肽连接体和/或肽连接体)；和(iii) 一个或多个聚合物分子，诸如聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物。在一个实施方案中，所述SDAB分子的连接体是非肽连接体。在某些实施方案中，可以通过与第二结构部分(例如，聚合物分子)缔合，例如，共价或非共价缔合，而修饰所述SDAB分子。例如，所述SDAB分子可以共价连接适当的药用聚合物，诸如聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物(诸如甲氧基聚(乙二醇)或mPEG)。在一个实施方案中，所述修饰的SDAB分子包括一个或多个单结合结构域。例如，所述SDAB分子可以包括这样的多肽(例如，单链多肽)或由这样的多肽(例如，单链多肽)组成，所述多肽包含至少一个免疫球蛋白可变结构域(包括一个、两个或三个互补决定区(CDRs) )。SDAB分子的实例包括天然缺乏轻链的分子(例如，VHH、纳米抗体或骆驼科动物来源的抗体)。所述SDAB分子可以来源于骆驼科动物或从骆驼科动物获得，所述骆驼科动物诸如骆骑(camel)、美洲骑(llama)、单峰骆骑(dromedary)、羊骑(alpaca)和栗色羊马它(guanaco)。在其他实施方案中，所述SDAB分子可以包括一种或多种单结构域分子，其包括但不限于，其他天然存在的单结构域分子(例如，鲨鱼单结构域多肽(IgNAR))和单结构域构架(例如，纤连蛋白构架)。
在另一个实施方案中，所述修饰的SDAB分子是包含一个或多个单抗原结合结构域的单链多肽。所述SDAB分子可以例如，在相同或不同的表位结合相同的靶标，或结合不同的靶标。SDAB分子的单抗原结合结构域可以具有相同或不同的氨基酸序列。在一些实施方案中，SDAB分子是单价的或多价的(例如，二价、三价或四价)。在其他实施方案中，SDAB分子是单特异性的或多特异性的(例如，双特异性、三特异性或四特异性)。所述SDAB分子可以包含一个或多个单抗原结合结构域，所述结构域可以是重组的、CDR-嫁接的、人源化的、骆骑源化的、去免疫的(de-1mmunized)和/或体外产生的(例如，通过曬菌体展示选择的)。例如，SDAB分子可以是单链融合多肽，包含与一种或多种靶抗原结合的一个、两个、三个、四个或更多个单抗原结合结构域。典型地，靶抗原是哺乳动物蛋白，例如，人蛋白。在一个实施方案中，靶抗原是TNF a，例如，人TNF a。
在一个示例性的实施方案中，所述修饰的SDAB分子是一种二价分子，其包含与靶抗原(例如，TNFa )结合的两种单抗原结合结构域(例如，两个骆驼科动物可变区)的单链多肽融合体(fusion)。所述修饰的SDAB分子的单抗原结合结构域从N端到C端可以按下述顺序排列:结合TNFa的单抗原结合结构域_(任选地连接基团，例如，肽连接体)_结合TNFa的单抗原结合结构域-一个或多个聚合物分子。在一个实施方案中，所述单抗原结合结构域与靶抗原上相同的表位结合(例如，使用相同或不同的单抗原结合结构域)。在其他实施方案中，SDAB分子的单抗原结合结构域结合相同或不同靶标上的不同的表位。应该理解，本发明包括两个、三个、四个或更多个针对一种或多种靶标的单抗原结合结构域的任意顺序或组合。在其他实施方案中，所述修饰的SDAB分子的两个、三个、四个或更多个单结构域分子用或不用连接基团缔合(例如，融合)为遗传或多肽融合体。所述连接基团可以是本领域技术人员知晓的任意连接基团。例如，所述连接基团可以是长度为I至100个原子的生物相容的聚合物。所述连接基团可以是肽或非肽连接体。在一个实施方案中，所述连接基团是肽连接体，例如，其包括下述或由下述组成:聚甘氨酸、聚丝氨酸、聚赖氨酸、聚谷氨酰胺、聚异亮氨酸或聚精氨酸残基、或它们的组合。例如，聚甘氨酸或聚丝氨酸连接基团可以包括至少五个、七个、八个、九个、十个、十二个、十五个、二十个、三十个、三十五个和四十个甘氨酸和丝氨酸残基。可以使用的示例性的连接基团包括Gly-Ser重复，例如，至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或更多个重复的(Gly)3-Ser(SEQ ID NO:7)或(Gly)4_Ser (SEQID N0:8)重复。在一些实施方案中，连接基团具有下述序列=(Gly)4-Ser-(Gly)3-SeHSEQID NO:9)或((Gly)4-Ser)n (SEQ ID NO: 10)，其中n为4，5或6。在一个实施方案中，连接基团包括下述序列:((Gly)4-Ser)n(SEQ ID NO:10),其中n = 6。所述修饰的SDAB分子可以另外在单抗原结合结构域的C端包括连接基团(例如，在本文中称为“C端连接基团”)以促使SDAB与另一个结构部分(例如，载体分子、非肽连接体或结构部分)的连接。本文所述的任意连接基团可以用作C端连接基团。在一个实施方案中，使用一个或多个Gly-Ser重复；例如，使用(Gly)3-Ser或(Gly)4_Ser(SEQ ID NO:8)的一个或多个重复。在一个实施方案中，所述修饰的SDAB分子(在本文中称为"SDAB-01")包含下述或由下述组成:
图1所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，或与其基本上相同的氨基酸序列(例如，相对于图1所示的氨基酸序列，与其至少85^^90^^95%以上相同的氨基酸序列，或具有至多20，15，10，5，4，3，2，I个氨基酸变化(例如，缺失、插入或取代(例如，保守取代))的氨基酸序列)。编码SEQ ID NO:1的两个单抗原结合结构域的核苷酸序列提供为SEQ ID NO:6(见表12)。在其他实施方案中，所述修饰的SDAB包含由SEQ ID NO:6或与其基本上相同的核苷酸序列(例如，相对于SEQ ID NO:6的氨基酸序列，与其至少85%、90 %、95%以上相同的核苷酸序列，或具有至多60，45，30，15，12，9，6，3个核苷酸变化的核苷酸序列)编码的氨基酸序列或由这样的氨基酸序列组成。另外的单结构域分子的实例包括，但不限于，W02006/122786(通过引用结合于此)的表19中公开的氨基酸序列，并且其也在下表11中公开。在某些实施方案中，与TNFa结合的修饰的SDAB分子的至少一个单抗原结合结构域包含一个、两个或三个具有下述氨基酸序列的⑶Rs:DYWMY(SFQ ID NO:2)(⑶Rl)，EINTNGLITKYPDSVKG(SEQ ID NO:3) (CDR2)和 / 或 SPSGFN(SEQ ID NO:4) (CDR3)，或具有由于少于3、2或I个氨基酸取代(例如，保守取代)而与所述CDRs中之一不同的CDR。在其他实施方案中，所述单抗原结合结构域包含具有图1的约1-115位氨基酸的氨基酸序列、或基本上与其相同的氨基酸序列(例如，相对于图1所示的氨基酸序列，至少85^^90^^95%以上相同的氨基酸序列，或具有至多20，15，10，5，4，3，2，I个氨基酸变化(例如，缺失、插入或取代(例如，保守取代))的氨基酸序列)的可变区。在一些实施方案中，结合TNF a的SDAB分子具有图1所示的结合TNF a的单结构域抗体分子的一种或多种生物活性。例如，结合TNFa的SDAB分子结合与图1所示的结合TNFa的单结构域分子所识别的表位相同的表位或相似的表位(例如，结合以其三聚体形式存在的TNF a ;结合与TNF受体接触的TNF a位点；结合TNF a三聚体中的表位，所述表位包含在第一 TNF单体(单体A)上位置88的Gln,在位置90的Lys，在第二 TNF单体(单体B)上的位置146的Glu，或如W006/122786中公开的表位)。在其他实施方案中，结合TNF a的SDAB分子结合TNFa的N端。在其他实施方案中，结合TNF a的SDAB分子具有与W006/122786中公开的结合TNF a的单结构域分子相似的活性(例如，结合亲和力、解离常数、结合特异性、TNFa抑制活性)。其他实施方案中，所述结合TNFa的SDAB分子包括表11中公开的一种或多种SDAB分子，其也公开在W02006/122786中(其通过引用结合于此)。例如，所述结合TNFa的SDAB分子可以是W02006/122786的表9中公开的单价的、二价的或三价的结合TNF a的SDAB分子。示例性的结合TNFa的SDAB分子包括，但不限于，TNFl, TNF2, TNF3，及其人源化的形式(例如，TNF29, TNF30, TNF31, TNF32, TNF33)。单价结合TNFa的SDAB分子的另外的实例公开在W02006/122786的表8中。示例性的二价的结合TNF a的SDAB分子包括，但不限于，TNF55和TNF56，其包含通过肽连接体连接的两个TNF30SDAB分子，从而形成单融合多肽(在W02006/122786中公开)。二价的结合TNFa的SDAB分子的另外的实例公开在本文的表 11 中，或在 W02006/122786 的表 19 中公开为 TNF4, TNF5, TNF6, TNF7, TNF8)。在某些实施方案中，所述SDAB分子被修饰，从而包含一个或多个聚合物分子，诸如聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物。所述PEG分子(例如，PEG单体、其聚合物或衍生物)可以是直链的或支链的。在一个实施方案中，所述SDAB通过连接体结构部分(例如，非肽连接体)连接至一个或多个PEG分子。 在一些实施方案中,所述连接体是非肽连接体。在一个实施方案中，所述连接体由式⑴所示:
权利要求
1.一种修饰的单结构域抗原结合分子，其包含: (i)结合一种或多种靶标的一个或多个单抗原结合结构域； (ii)非肽连接体；和 (iii)一个或多个聚合物分子， 其中所述非肽连接体是式(I)的结构部分:
2.权利要求1的修饰的单结构域抗原结合分子，其中所述一个或多个聚合物分子包括聚(乙二醇)(PEG)单体或其衍生物。
3.权利要求2的修饰的单结构域抗原结合分子，其中所述PEG聚合物分子是支链的，并且所述PEG单体是甲氧基聚(乙二醇)(mPEG)或其衍生物。
4.权利要求3的修饰的单结构域抗原结合分子，其中所述PEG聚合物分子是选自由式(a) - (h)组成的组的支链PEG聚合物分子:
5.权利要求2-4的修饰的单结构域抗原结合分子，其中每个PEG聚合物结构部分独立地具有IKDa至IOOKDa的分子量。
6.权利要求5的修饰的单结构域抗原结合分子，其中每个PEG聚合物结构部分独立地具有IOKDa至50KDa的分子量。
7.权利要求5的修饰的单结构域抗原结合分子，其中每个PEG聚合物结构部分独立地具有选自由10KDa、20KDa、30KDa、40KDa和50KDa组成的组的分子量。
8.权利要求5的修饰的单结构域抗原结合分子，其中所述连接体和所述PEG聚合物分子具有选自由以下组成的组的结构:
9.权利要求8的修饰的单结构域抗原结合分子，其中所述连接体和所述PEG聚合物分子由下式表示:
10.权利要求1-9中任一项的修饰的单结构域抗原结合分子，其中至少一个所述单抗原结合结构域结合人TNF a。
11.权利要求1-10中任一项的修饰的单结构域抗原结合分子，其为单价的、二价的或三价的。
12.权利要求1-11中任一项的修饰的单结构域抗原结合分子，其为单特异性的、双特异性的或三特异性的。
13.权利要求1-12中任一项的修饰的单结构域抗原结合分子，其中一个或多个所述单抗原结合结构域是CDR-嫁接的、人源化的、骆驼源化的、去免疫的或是通过噬菌体展示选择的。
14.权利要求1-10中任一项的修饰的单结构域抗原结合分子，其为单链融合多肽，所述单链融合多肽从N端到C端以下述顺序包含:抗-TNF a单抗原结合结构域_(任选地，肽连接体)-抗-TNF a单抗原结合结构域-非肽连接体-一个或多个聚合物分子。
15.权利要求1-14中任一项的修饰的单结构域抗原结合分子，其中一个或多个所述单抗原结合结构域包含图2所示的氨基酸序列或与其至少85%相同的氨基酸序列。
16.权利要求14或15的修饰的单结构域抗原结合分子，其中一个或多个所述单抗原结合结构域包含三个CDR，所述CDR具有下述氨基酸序列:DYWMY(CDRl)，EINTNGLITKYPDSVKG(CDR2)和SPSGFN(CDR3)，或具有与所述CDR之一区别在于I个氨基酸取代的⑶R。
17.权利要求14-16中任一项的修饰的单结构域抗原结合分子，其中所述肽连接体包含至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或更多个(Gly)3-Ser或(Gly)4_Ser (SEQ IDNO:8)重复。
18.权利要求17的修饰的单结构域抗原结合分子，其由以下结构表示:
19.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-18中任一项所述的修饰的单结构域抗原结合分子和药用载体。
20.权利要求19的药物组合物，其还包含选自以下中的一种或多种的第二试剂:细胞因子抑制剂，生长因子抑制剂，免疫抑制剂，抗炎剂，代谢抑制剂，酶抑制剂，细胞毒性剂或细胞生长抑制剂。
21.一种改善受试者中的炎性或自身免疫性病症的方法，所述方法包括:以使TNF a相关病症的一种或多种症状减轻的量，给所述受试者施用权利要求1-18中任一项所述的修饰的单结构域抗原结合分子。
22.权利要求21的方法，所述方法还包括:与所述修饰的单结构域抗原结合分子联合施用第二试剂，其中所述第二试剂选自以下中的一种或多种:细胞因子抑制剂，生长因子抑制剂，免疫抑制剂，抗炎剂，代谢抑制剂，酶抑制剂，细胞毒性剂或细胞生长抑制剂。
23.权利要求21或22的方法，其中所述TNFa-相关病症选自以下中的一种或多种:类风湿性关节炎(RA)，关节炎性病症，银屑病关节炎，多关节青少年特发性关节炎(JIA)，强直性脊柱炎(AS)，银屑病，溃疡性结肠炎，局限性肠炎，炎性肠病，或多发性硬化病。
24.权利要求23的方法，其中所述修饰的单结构域抗原结合分子或第二试剂通过皮下、血管内、肌内或腹膜内注射或通过吸入被施用给所述受试者。
25.—种评估修饰的单结构域抗原结合分子的方法，所述方法包括: 将权利要求1-18中任一项所述的修饰的SDAB分子施用给受试者；和 评估所述修饰的SDAB分子的一种或多种药动学/药效学(PK/PD)参数。
26.—种评估或选择修饰的单结构域抗原结合分子的方法，所述方法包括: 提供施用给受试者的权利要求1-18中任一项所述的修饰的SDAB分子在受试者中的至少一个PK/H)参数的检测值；和 将所提供的检测值与至少一个参照值比较，从而评估或选择所述修饰的SDAB分子。
27.权利要求25或26的方法，所述方法还包括:提供包含所述修饰的SDAB分子的样品；并且在捕获检测测定中检测所述样品。
28.权利要求25-27中任一项的方法，其中所评估的PK/H)参数选自以下中的一种或多种:所述修饰的SDAB分子的体内浓度(例如，在血液、血清、血浆和/或组织中的浓度)；所述修饰的SDAB分子的清除率(CL);所述修饰的SDAB分子的稳定-容积分布(Vdss);所述修饰的SDAB分子的半衰期(t1/2);所述修饰的SDAB分子的生物利用度；所述修饰的SDAB分子的剂量标准化的最大血液、血清或血浆浓度；所述修饰的SDAB分子的剂量标准化的暴露；或所述修饰的SDAB分子的组织与血清的比率。
29.一种用于评估修饰的单结构域结合分子的捕获检测测定法，所述测定法包括提供:固定到固体支持物上的靶标；和一种试剂，所述试剂与修饰的单结构域抗原结合分子的蛋白或聚合物结构部分结合，以检测结合的修饰的单结构域抗原结合分子-靶标复合物。
30.一种试剂盒或制品，其包括装置、注射器或小瓶，所述装置、注射器或小瓶包含权利要求1-17中任一项的修饰的单结构域结合分子，并且任选地包括使用说明书。
31.一种制备修饰的单结构域结合分子的方法，所述方法包括: 提供单结构域结合分子； 使所述单结构域结合分子与式(I)的非肽连接体在形成至少一个化学键的条件下接触:
全文摘要
本发明涉及修饰的单结构域抗原结合分子，例如，SDAB分子，特别是结合TNFa的SDAB分子。本发明还公开了制备本发明所述的修饰的单结构域抗原结合分子的方法和使用本发明所述的修饰的单结构域抗原结合分子治疗例如TNFa-相关病症的方法。
文档编号A61K39/395GK103119062SQ201180044867
公开日2013年5月22日 申请日期2011年7月6日 优先权日2010年7月16日
发明者马丁·黑根, 斯特凡娜·于贝尔·奥兰德, 尤利娅·武格迈施特, 徐鑫 申请人:埃博灵克斯股份有限公司