专利名称：用于检测和测定绿原酸的抗体、方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及小分子半抗原的抗体及其制备方法与应用，特别是涉及绿原酸及其衍生物的抗体及其制备方法与应用。
背景技术：
本发明涉及用于检测和定量绿原酸的方法和试剂盒，以及其中使用的半抗原、免疫原、偶联物(conjugate)和抗体。
其中"检测"是指定性分析物质是否存在。其中"测定"是指对物质进行定量分析。
绿原酸(Chlorogenic acid，以下简称CA),分子式C16H1809，分子量354.30，是由咖啡酸(Caffeic acid)与奎尼酸(Quinic acid， l-羟基六氢没食子酸)生成的缩酚酸，异名咖啡鞣酸，系统名1， 3， 4， 5-四羟基环己烷羧酸-(3， 4-二羟基肉桂酸酯)，化学名3-0-咖啡酰奎尼酸(3-0-caffeoylquinic acid)。
中药或中药复方是一个复杂的巨系统，其中的化学成分具有结构多样性和复杂性的特点。揭示中药或中药复方化学成分在体内靶器官的分布，细胞或亚细胞定位，以及体内分布的动态变化，时量一时效关系等，是阐明中药或中药复方作用耙点以及作用机理的关键环节。绿原酸作为抗菌解毒、消炎利胆的主要有效成分，是金银花、杜仲、忍冬藤、鱼腥草、茵陈、栀子、清开灵注射液等药材和中成药，在药典或国家标准中规定的定性和定量的指标成分。
从相关文献可知，针对绿原酸的定性与定量，目前建立了多种检测和测定分析方法，如薄层层析法、HPLC法，HPLC-MS法等。其中最常用的方法是高效液相色谱法。但含绿原酸的生物样品(包括血浆、尿、唾液等)含有大量的影响含量测定的蛋白质及内源性物质；同时绿原酸可能呈结合状态，必须经过处理，排除内源性杂质和代谢物的干扰，使结合状态的绿原酸游离后才能测定；同时还需要浓縮以满足仪器检测灵敏度的要求，处理程序复杂，费时费力；同时由于绿原酸进入体内后，组织中的分布是极其微量的，即使经过富集，进行含量测定仍是极其困难的。另外，对于绿原酸在靶器官和组织中分布，以及细胞和亚细胞定位的研究，需要通过免疫组织化学和western-blot等方法，但由于缺乏绿原酸的抗体，阻碍了此方面的研究。因此，有必要开发出一种用于检侧和测定生物样品中绿原酸的方法，对阐明相关药材或复方的作用机理，以及其体内分布和代谢研究，将具有特别的价值。
发明内容
本发明的半抗原绿原酸可提供确定的结构性抗原决定部位，但是它本身并不具备免疫原性，因此必须要偶联到适宜的赋予抗原性的载体物质上，这样所形成的免疫原才会在注射到宿主动物体内后诱发免疫应答。因此，本发明提供一种如下结构的免疫原-
o
其中R是0至6个碳的烷基桥(连接半抗原与载体物质的桥)，优选R = 0，即Pl直接与绿原 羰基碳原子结合，或R是C1-C6取代或未取代的、直链或支链的、饱和或不饱和的亚烷基， 更优选R是C1-C4未取代的、直链的、饱和的亚垸基。
Pl是赋予抗原性的载体物质。载体物质选自蛋白质、蛋白质片合成的多肽或半合成的多 肽。其中蛋白质、蛋白质片段选自白蛋白、血清蛋白、球蛋白、目镜蛋白和脂蛋白，优选为 牛血清白蛋白、卵清蛋白、牛丙种球蛋白、甲状腺素结合球蛋白、锁眼形血蓝蛋白(keyhole limpet haemocyanin， KLH)，更优选自锁眼形血蓝蛋白或牛血清蛋白(BAS)。合成多肽或 半合成多肽是具有足够数量的可利用氨基的合成聚氨基酸，优选多聚赖氨酸。合成或天然聚 合物是带有反应官能基的聚合物材料，特别是能够结合到半抗原产生免疫原的碳水化合物、 酵母或多糖。
半抗原的制备本发明描述了半抗原绿原酸在羧基处或任一羟基处与赋予抗原性的载体 物质发生的偶联作用，产生免疫原。为了让半抗原的结构特征充分暴露，可在-C00H位点上 接上一个连接臂。据此以绿原酸为起始原料，同时以氯化亚枫，氨基丁酸或氨基己酸等为原 料，经过二步反应，合成了半抗原2和3。产物2和3纯化后分别经质谱(MS)和核磁共振 氢谱和碳谱(1丽MR和13CNMR)确证。
免疫原的合成本发明的半抗原和蛋白质载体的连接可使用本领域己知的任何连接方 式。例如但不限于碳二亚胺法(EDC )、戊二醛法等。采用碳二亚胺法制备缀合物和免疫原时， 是将0. 2毫摩尔的半抗原绿原酸溶解在N, N-二甲基甲酰胺中，加入1. 5当量的二环己基碳二 亚胺和3当量的N-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应过夜，离心，取上清液加入到10-20mg/mL 的牛血清蛋白碳酸盐缓冲溶液中，搅拌反应1-6小时，装入透析袋，分别用蒸馏水和0. Olmol/L 的PBS缓冲溶液透析3-5d，分装保存于-2(TC的冰箱中。
合成免疫原的分析方法为了确认载体物质上结合有适当的半抗原，在免疫前，使用紫 外分光度法或矩阵辅助紫外激光解析/电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)对每个免疫原进行评估。绿原酸免疫原反应物和产物的吸收峰相比(200nm-400nrn)，可判断是否偶合，并根据 反应物和产物的摩尔吸光系数计算偶联物与半抗原的比例。
使用voyager STR生物分光度测量方法研究站激光解析质谱与延迟萃取结合进行MALDI -TOF质谱e将每个要分析的等分试样在0. 1%的三氟乙酸水溶液中稀释制成lmg/ml的试样溶 液。使用芥子酸基质和牛血清白蛋白作为外标分析等分试样(luL)。
对于优选的载体物质，牛血清白蛋白或KLH而言，优选半抗原与蛋白质的结合比为6-15:
第二方面，免疫检测时需要将绿原酸与标记试剂进行偶合。因此，本发明提供一种如下 结构的偶合物； O
其中R是0至6个碳的烷基，P2是可检测的标记试剂，标记试剂选自酶、发光物质、放射性 物质或它们的混合物，更优选地标记试剂是过氧化物酶。最优选地标记试剂是辣根过氧化物 酶(HRP)。发光物质选自生物发光物质、化学发光物质或荧光物质。
偶合物的合成利用混合酸配法，但不限于此法，可以采用已知的其他偶合方法。将0. 25 毫摩尔半抗原绿原酸溶解在N,N-二甲基甲酰胺中，加入60uL正三丁胺和30uL氯甲酸丁酯， 室温下反应l-2小时，反应液加入到10-20mg/mL的卵清蛋白碳酸盐缓冲溶液中，搅拌反应 1-4小时，装入透析袋，分别用蒸馏水和0.01niol/L的PBS缓冲溶液透析3-5d，分装保存于 -20匸的冰箱中。
另一方面，本发明涉及对于本发明第一方面的免疫原产生的抗体，这些抗体能够至少与 一个绿原酸结构上的表位结合，优选与完整的绿原酸结构表位相结合，该抗体是多克隆的， 或是单克隆的，优选为单克隆抗体，且具有对绿原酸的特异性，并对于结构上相关的咖啡酰 基类化合物交叉的反应活性应低于10%，优选低于5%，更优选低于线，最优选低于0.5%。
免疫检测时要将该抗体固定在支撑底物上。优选地，该方法进一步包括将所述血清抗体 固定到支撑底物上，优选固体支持物，最优选聚苯乙烯固体支持物。
本发明进一步提供一种制备抗体的方法，该方法包含通过重复给予根据本发明的绿原酸的免疫原免疫动物，优选脊稚动物，最优选哺乳动物，并收集从免疫动物得到的血清的步骤。 另一方面，本发明包括在试样中检测或测定绿原酸的方法，该方法包括用本发明的偶合
物或其混合物和本发明的抗体或其混合物接触试样；检测或测定结合的缀合物的数量；并且
从标准曲线推断试样中绿原酸的存在或数量。
另一方面，本发明还描述了如何将针对这种免疫原产生的抗体用于开发可用来检测和测
定绿原酸的存在的通用分析方法和相应的试剂盒。本该试剂盒包括用本发明的偶合物或其混
合物和本发明的抗体或其混合物。该试剂盒可以任意地包括应用所述缀合物和所述抗体在试
样中检测或测定绿原酸的指导。优选地，试样是溶液，如生物流体。更优选地，试样是血清 或尿。在本发明的方法和试剂盒中，首选各自不同的交联剂(免疫原的和偶合物的)。
另一方面，本发明包括使用本发明的偶合物或其混合物和本发明的抗体或其混合物在试 验试样如生物流体中检测或测定绿原酸。
为了产生多克隆抗血清，将免疫原与Freund佐剂混合，并且将混合物注射入宿主动物体 内，如兔、羊、鼠、天竺鼠或马。进一步注射(加强)并取血清试样评价抗体滴度。3 但 达到最佳滴度时，随后将宿主动物放血得到适当体积的特异性的抗血清。要求的抗体纯化水 平视计划的应用而定。对于许多目的，根本不需要纯化，但是，在其它情况下，例如抗体固 定在固体载体上，纯化步骤能够除去不想要的物质和除去非特异性的结合。本发明特异性抗 体作为试剂在免疫试验中用于测定或检测生物流体中的绿原酸的试剂是有用的。
单克隆抗体的制备本发明所述单克隆抗体是指获自基本上同源的抗体群的抗体，即组 成该群体的抗体个体都相同，除了可能存在少量可能的自发突变。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员己知的各种技术进行制备。例如，本发明完全 抗原，可被施用于动物以诱导单克隆抗体的产生。对于单克隆抗体，可利用杂交瘤技术来制 备或可用重组DNA法制备。骨髓瘤细胞可选鼠类的骨髓瘤细胞系，包括衍生自M0PC-21和 MPC-11小鼠肿瘤的骨髓瘤细胞系以及SP-2 、 NZO或X63-Ag8-653细胞，以及人骨髓瘤和小 鼠-人杂合骨髓瘤细胞系。
对杂交瘤细胞生长于其中的培养基进行分析以检测具有所需特异性的单克隆抗体的产 生，如通过体外结合分析，例如酶联免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA)。表达抗 体的细胞的位置可用FACS进行检测。然后，可将杂交瘤克隆通过有限稀释步骤形成亚克隆， 并通过标准方法生长。为了达到这一目的而使用的适合的培养基包括，例如，DMEM或 RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可在动物体内作为腹水瘤生长。
由亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中，通过常规的免疫球蛋白纯化工艺 适当地得到分离，这些纯化工艺为例如，蛋白A-琼脂糖法(protein A-S印harose)、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。
本发明的一个优选的方案中，抗绿原酸单克隆抗体采用Balb/C小鼠腹水生产单克隆抗体 的方法制备。将约106 -107杂交瘤细胞接种到致敏的小鼠腹腔内，2-4周内可见腹部明显胀大。 抽取腹水，经饱和硫酸按沉淀法粗提出IgG ，再将粗提的抗体经亲和层析柱(Protein G-S印hrose)纯化。
具体实施方式
实施例1 半抗原化合物1
金银花药材100g， 用95%乙醇或50%的乙醇水溶液，固液比均为1: 10，调节溶液的pH=3， 5(TC左右提取3次。合并提取液，浓縮至无醇味，4'C冰箱冷藏过夜，抽滤得上清液，将此上 清液加入聚酰胺树脂装于玻璃柱(400X10mra)中，至流出液变浑浊，依次用水、10%、 20%、 30%、 40%和50%乙醇水溶液(盐酸调节pH至4. 0左右)梯度洗脱，HPLC检测合并绿原酸含量大于60% 的洗脱液，浓縮后置于O'C冰箱中析晶，抽滤。上述晶体溶于适量水中，加于S印hadexLH-20 柱柱顶。层析条件为洗脱剂50。/。的丙酮水溶液(pH二4)、流速0.5mL/min。 HPLC检测，合并绿 原酸洗脱液，减压浓縮，冷冻干燥得绿原酸纯品。 实施例2
按氯化亚枫(S0Cl2)和绿原酸装入三口烧瓶中，在磁力搅拌下，加热回流反应lh，蒸馏除 去多余的氯化亚枫，即得产物氯化绿原酸。按投料比Y氨基丁酸CA=1.5:1，在三口烧瓶中 投入Y氨基丁酸，冰浴下加入适量NaOH溶液，搅拌溶解，溶解在二恶垸中，加入恒压滴液漏 斗中，分五次滴加此溶液，随后补加适量NaOH溶液，使反应液pH值维持在8-10，加毕，继 续在0-4。C反应5h 。升至室温，用浓盐酸调节反应液pH值至4.0左右，用乙酸乙酯提取， 合并乙酸乙酯提取液，用水洗，无水硫酸钠干燥，浓縮得到固体物，经硅胶柱层析纯化得半 抗原四垸基化绿原酸。 实施例3
按实施例2的方法，用6—氨基己酸合成六烷基化绿原酸。 实施例4
将0. 2毫摩尔的半抗原绿原酸溶解在2mlN， N-二甲基甲酰胺中，加入1. 5当量的二环己 基碳二亚胺和3当量的N-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应过夜，离心，取上清液O. lml加入到 20mg/mL的牛血清蛋白碳酸盐缓冲溶液中，搅拌反应1_6小时，装入透析袋，分别用蒸馏水 和0. Olmol/L的PBS缓冲溶液透析3-5d，分装保存于-2(TC的冰箱中。 实施例5
8将0. 25毫摩尔半抗原绿原酸溶解在2mlN， N-二甲基甲酰胺中，加入60uL正三丁胺和30uL 氯甲酸丁酯，室温下反应1-2小时，反应液加入到10-20mg/mL的卵清蛋白碳酸盐缓冲溶液 中，搅拌反应1-4小时，装入透析袋，分别用蒸馏水和0. 01mol/L的PBS缓冲溶液透析3-5d， 分装保存于-2(TC的冰箱中。 实施例6
制备方法同实施例2 ，只是将KLH换成牛血清白蛋白(BSA)，制得CA-BSA全抗原120mg 。 实施例7
免疫原(CA-BSA、 CA-KLH)按常规方法各免疫了三只兔子。从加强免疫第二次开始，在 每次免疫后第8天于兔子耳缘静脉采血，血清经适当稀释后用间接ELISA测定效价。待第4次 免疫时，兔子获得了高效价的抗体，经纯化制成冻干粉后的效价分别为20000: 1。 实施例8
先将绿原酸抗原与弗氏佐剂乳化，用PBS将完全抗原CA—KLH配制成lmg/ral的溶液， 然后将完全抗原溶液与弗氏佐剂等体积混合，用高速震荡器震荡形成均匀乳浊液，将此乳浊 液用于动物的免疫。选择8周龄的小鼠进行注射免疫。取8周龄的健康Balb/C小鼠12只， 在第0天，每只腹腔注射完全弗氏佐剂乳化抗原100uL 。第14天，再对每只小鼠腹腔注射 不完全弗氏佐剂乳化抗原100uL 。第21天，以摘小鼠眼球法采血，用ELISA方法检测血清 中抗体效价(滴度)。第28天，再次腹腔注射不完全弗氏佐剂乳化抗原100uL 。在细胞融合 反应前一周，用100ug/100ul抗原生理盐水再次加强免疫。采血后经测定，所得抗血清效价 为l :64000。细胞融合操作3天后检查细胞融合情况，8天后加HT'完全培养基，每孔加入 lral。在12天间，就可以观察到杂交细胞的克隆。当克隆直径长到约lmm时，用CA-BSA包 被的酶联板来筛选出抗CA的杂交瘤细胞。筛选到的阳性克隆用有限稀释法进行克隆化，以 CA-BSA包被的ELISA法酶标板来筛选抗CA的特异性杂交瘤细胞。经五次克隆后，得到一株 能分泌专一性抗体的抗氯胺酮单克隆细胞。 实施例9
取实施例4中经过4次免疫的小鼠，用CA-BSA包被的酶联板测定抗血清的滴度。将包 被抗原以10ug/ml稀释于pH 9. 6的0. 05M碳酸盐缓冲液中，100ul /孔加入到96孔酶标板 于4。C过夜。弃去包被液后用1%明胶/ PBS在37。C下封闭2小时，然后用PBS-Tween-20洗 液洗板3遍，再加入稀释后的CA抗血清，置于37。C孵育1小时。用PBS-Tween-20洗液洗板 3遍，加入1:2000的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多抗，37'C孵育1小时后用 PBS-Tween-20洗液洗板3遍，加TMB/H202底物进行显色IOmin ，并用终止液(0. 1N硫酸) 终止显色。在450nm光波长下测定吸收值(OD)，与空白对照孔的OD均值比较，采用计量资料的t 检验，取P〈0.05的最低稀释度作为此抗体的效价。经比色测定，所得绿原酸抗血清的效价为 1:6400 。 实施例10
融合效率分析用CFSE绿色荧光预标记的淋巴细胞显绿色，用PE标记的抗小鼠B220 单克隆抗体预标记的SPZ/0细胞显红色，两种细胞融合形成的杂交瘤细胞带有双色荧光。经 流式细胞仪测定分析双荧光细胞比例，用于反映融合效率。如图2所示，代表PE标记的抗 小鼠B220单克隆抗体预标记的SPZ/0 (骨髓瘤)细胞，代表CFSE绿色荧光预标记淋巴细 胞，代表带有双色荧光的杂交瘤细胞。本实验体系中脾细胞和SPZ/0的最初融合效率约为 45% ， ELISA法测定阳性率为15 % 。
权利要求
1、一种如下通式的免疫原其中R是0至6个碳的烷基桥(连接半抗原与载体物质的桥)，P1是赋予抗原性的载体物质。
2、 根据权利要求l的免疫原，R = 0，即？1直接与绿原酸羰基碳原子结合。
3、 根据权利要求l的免疫原，R是C1-C6取代或未取代的、直链或支链的、饱和或不饱和的 亚烷基。
4、 根据权利要求1或3的免疫原，R是C1-C4未取代的、直链的、饱和的亚垸基。
5、 根据权利要求l的免疫原，其中载体物质为蛋白质、蛋白质片段、合成或天然多肽或半合 成多肽、合成或天然聚合物。
6、 根据权利要求1或5的免疫原，其中蛋白质、蛋白质片段选自白蛋白、血清蛋白、球蛋白、 和脂蛋白。
7、 根据权利要求1或5的免疫原，其中蛋白质、蛋白质片段选自牛血清白蛋白、卵清蛋白、 牛丙种球蛋白、甲状腺素结合球蛋白、锁眼形血蓝蛋白(keyhole limpet haemocyanin， KLH) 等。
8、 根据权利要求1或5的免疫原，其中合成或天然多肽或半合成多肽是具有足够数量的可利 用氨基的合成聚氨基酸。
9、 根据权利要求1或5的免疫原，其中合成或天然聚合物选自碳水化合物、酵母或多糖。
10、 抗如权利要求1至9的免疫原的抗体，其中抗体能与完整的绿原酸中的至少一种结构性 抗原决定部位结合。
11、 如权利要求10的抗体，其中抗体固定在支持底物上，特别是聚苯乙烯固体支持物。
12、 制备如权利要求10或11中的抗体的方法，该方法包括将如权利要求1至9的免疫原重 复给予动物而使动物免疫，以及从免疫动物中收集所得到的血清抗体；以及利用免疫学上可 接受的细胞系与产生抗体的免疫动物单克隆细胞系融合后产生的细胞系，所制备的单克隆抗 体。
13、 如权利要求12的方法，其中该方法还包括将所述血清抗体固定在支持底物上。包括如权利要求l至3中任一项的半抗原与可检测到的标记物共价结合的偶联物。
14、 一种如下结构的偶合物<formula>formula see original document page 3</formula>其中R是0至6个碳的垸基，P2是可检测的标记试剂。
15、 根据权利要求14的偶合物，标记试剂选自酶、发光物质、放射性物质或它们的混合物。
16、 根据权利要求14或16的偶合物，标记试剂是过氧化物酶。
17、 根据权利要求16的偶合物，标记试剂是辣根过氧化物酶(HRP)。
18、 根据权利要求14或15的偶合物，发光物质是生物发光物质、化学发光物质或荧光物质。
19、 用于检测和定量样品中绿原酸的方法，该方法包括将供试样品和如权利要求14至18中 任一项的偶联物或其混合物，与如权利要求10或11的抗体或其混合物接触；检测或定量结 合的偶联物；以及从校准曲线中推出样品中绿原酸的存在或含量。
20、 用于检测和定量绿原酸的试剂盒，该试剂盒包括如权利要求14至18中任一项的偶联物 或其混合物，以及如权利要求10或11的抗体或其混合物。
全文摘要
本发明提供包括绿原酸或其衍生物的半抗原，与赋予抗原性的载体物质结合的前述半抗原的免疫原，与标记试剂结合的前述半抗原的偶联物(包被原)，以及抗前述免疫原的抗体，该抗体能与完整的绿原酸中的至少一种结构性抗原决定部位结合。本发明还提供用于检测或定量样品中绿原酸的方法和试剂盒，以及前述偶联物和前述抗体在检测或定量绿原酸中的用途。本发明对绿原酸具有特异性，可用于样品中检测绿原酸的存在和测定绿原酸的含量。
文档编号C07K14/76GK101486762SQ200810172700
公开日2009年7月22日 申请日期2008年11月13日 优先权日2008年1月18日
发明者任会明, 屈会化, 李翼飞, 杨爱玲, 王庆国, 蒋兴凯, 琰 赵 申请人:北京中医药大学