奖赏相关行为的光遗传学控制的制作方法

奖赏相关行为的光遗传学控制的制作方法
【专利摘要】本文提供了通过使用用于控制伏隔核或纹状体的胆碱能中间神经元的极化状态的光反应性视蛋白来破坏个体的至少一种奖赏相关行为的组合物和方法。
【专利说明】奖赏相关行为的光遗传学控制
[0001] 相关申请案的交叉引用
[0002]本申请要求2010年11月5日提交的美国临时申请N0.61/410，692的优先权，其公开内容通过引用整体并入本文。
发明领域
[0003]本申请涉及包含在其质膜上表达光反应性视蛋白的动物细胞的组合物和使用所述组合物使留在伏隔核或背侧纹状体的微型回路中的胆碱能中间神经元选择性超极化以影响与动物的奖赏相关条件作用相关联的一种或多种行为的方法。
[0004]发明背景
[0005]物质滥用和依赖性是全世界所面临的重要社会问题。根据2008年世界毒品报告(World Drug Report2008)，约5%的世界人口使用非法药物并，且在0.6%的世界人口中，吸毒是一个问题。在美国，根据2006年物质滥用和精神健康服务管理局(Substance Abuseand Mental Health Services Administration, SAMHSA)的全美药物使用与健康调查，2360万12岁或以上的人需要对非法药物或酒精滥用问题的治疗(9.6%的12岁或以上的人)。其中，仅250万-10.8%需要治疗的人-在专业机构接受了治疗。物质滥用和依赖性导致全世界生产人力的巨大损失并且将在治疗援助、保险理赔和在预防和脱瘾项目方面的花费的成本强加于政府和社会。
[0006]光遗传学是甚至在自由活动的哺乳动物和其它动物体内，用于控制活组织靶细胞中的特定事件的遗传和光学方法的组合，时间精度(毫秒-时间尺度)需要与功能完整的生物系统保持同步。光遗传学的特点是将快速光反应性视蛋白通道或泵蛋白引入靶神经元细胞的质膜，靶神经元细胞允许对神经元膜电位在时间上精确的操纵，同时通过使用特异性靶向机制维持细胞类型分辨率。其中可用于研究神经系统功能的微生物视蛋白为氯视紫红质蛋白(NpHR)，用于促进照射时的膜超极化。短短几年内，光遗传学领域已增进了对哪些特定细胞类型有助于生物组织，例如体内神经回路的功能的基本科学理解。而且，在临床方面，光遗传学驱动的研究已经导致对为哺乳动物行为基础的神经学机制的深刻理解。
[0007]虽然有这些进展，对复杂人类行为例如物质滥用和依赖性(成瘾)的基础的神经生理学底物仍知之甚少，尽管有关于大脑特定区域在这些行为中所起的作用的新信息。例如，伏隔核(NAc)是形成腹侧纹状体主要部分的神经元的集合。认为NAc在奖赏、快乐、欢笑、成瘾、攻击、恐惧和安慰作用中起重要作用。乙酰胆碱是重要且受广泛研究的神经递质，其对多种受体和靶细胞起作用。一些体内药理学方法已经证实，奖赏学习行为需要NAc中的胆碱能传递。NAc中的胆碱能中间神经元特别有吸引力，因为它们构成少于1%的局部神经群，但是它们投射到整个NAc中并且提供其唯一已知的胆碱能输入。局部表达相关胆碱能受体，并且烟碱和毒蕈碱药理学激动剂可对中型多棘神经元(MSN，代表>95%的局部神经群并且构成NAc的输出)施加复杂影响。然而，胆碱能中间神经元对NAc生理学或奖赏相关行为的任一方面的净效应(如果有)未知。
[0008]因此，需要的是允许研究NAc中的胆碱能中间神经元在奖赏相关行为，例如物质依赖性中所起的因果作用的工具。理解为成瘾基础的神经通路可帮助发现并筛选药理学疗法以治疗有此类病症的患者，以及打开使用此类工具破坏吸毒成瘾的个体脑部中的这些行为的可能性。
[0009]在整个说明书中，引用了出版物(例如，科学论文)、专利申请、专利等，其全部通过引用整体并入本文。
[0010]发明概述[0011]本文提供了通过使用稳定表达的能够改变个体的伏隔核或纹状体的胆碱能中间神经元的膜极化状态的光反应性视蛋白破坏个体的奖赏相关行为的组合物和方法，其中伏隔核或纹状体的胆碱能中间神经元的膜极化状态的改变破坏了动物的一种或多种奖赏相关行为。在一些实施方案中，奖赏相关行为是成瘾相关行为。在其它实施方案中，成瘾相关行为是可卡因成瘾。
[0012]因此，在一些方面，本文提供了一种非人类动物，其包含在所述动物的伏隔核或纹状体中的胆碱能中间神经元的细胞膜上表达的光反应性视蛋白，其中当用光照射所述中间神经元时所述蛋白质对光起反应并且能够诱导所述中间神经元的膜超极化，其中照射所述蛋白质破坏所述动物的至少一种奖赏相关行为。
[0013]在其它方面，本文提供了一种包含所述伏隔核或所述纹状体的横截面的脑切片，其中光反应性视蛋白在胆碱能中间神经元的细胞膜上表达，其中当用光照射所述中间神经元时所述蛋白质对光起反应并且能够诱导所述中间神经元的膜超极化，其中照射所述蛋白质破坏奖赏相关的脑功能。
[0014]在一些方面，本文提供了一种破坏个体的奖赏相关行为的方法，包括:向所述个体施用编码光反应性视蛋白的多核苷酸，其中所述光反应性视蛋白在所述个体的伏隔核或纹状体中的胆碱能中间神经元的细胞膜上表达，并且当用光照射所述中间神经元时所述蛋白质对光起反应并且能够诱导所述中间神经元的膜超极化，从而用光活化所述蛋白质破坏个体的至少一种奖赏相关行为。在一些实施方案中，向所述个体的伏隔核或纹状体施用所述多核苷酸。
[0015]在其它方面，本文提供了一种治疗个体药物成瘾的方法，包括:向所述个体施用编码光反应性视蛋白的多核苷酸，其中所述光反应性视蛋白在所述个体的伏隔核或纹状体中的胆碱能中间神经元的细胞膜上表达，并且当用光照射所述中间神经元时所述蛋白质对光起反应并且能够使所述中间神经元超极化，从而用光活化所述蛋白质破坏所述个体的奖赏相关行为，其中所述个体不再需要服药。在一些实施方案中，向所述个体的伏隔核或纹状体施用所述多核苷酸。
[0016]本公开的各方面涉及对如本文所述活动物的加强行为的控制或表征。虽然本公开不一定限于这些情况，但是可通过使用这些和其它情况讨论实例，了解本发明的各个方面。
[0017]本公开的实施方案涉及与享乐和/或加强行为相关联的特别靶向回路。更特殊的实施方案涉及对神经回路的时空控制以鉴定与奖赏记忆、快感缺失、成瘾和/或加强行为相关联且相对应的特定回路靶标之间的关联。
[0018]本公开的特定实施方案涉及对与自然奖赏相关行为和/或奖赏学习有牵连的结构，包括但不限于伏隔核(NAc)或背侧纹状体中的靶细胞的抑制。在特定实例中，对NAc中特定胆碱能神经元的靶向尤其非常适合破坏这些胆碱能神经元对乙酰胆碱的释放。已经发现，此类神经抑制可对靶向神经抑制有效，可减少或消除对其它行为，例如食欲的或厌恶反应的加强的不良影响。本公开的各方面涉及特定于时间、空间和/或细胞类型的刺激。在某些实施方案中，使用牵涉光反应性视蛋白在神经回路细胞中的表达的光遗传学系统进行这种抑制。在其它实施方案中，可使用直接电刺激进行抑制。还有其它实施方案允许使用时间上精确的医药品。
[0019]附图简述
[0020]考虑到下列描述和附图可更加充分地理解各个示例实施方案，其中:
[0021]图1描绘了 NAc的ChAT中间神经元中ChR2和eNpHR3.0的特异性、膜靶向和功能性。(A)将 Cre-依赖型 AAV (表达 eNpHR3.Ο-eYFP 或 ChR2 (H134R) -eYFP)注射至 NAc 的中间部分。(B)注射切片的共聚焦图像证明经4’，6’-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)共染色，eYFP表达与ChAT抗体的共同定位。(C)91.3± 1.3%表达YFP的神经元也染有ChAT抗体(n=418) ；93.5 ±2.8%染有ChAT抗体的神经元也表达YFP (n=413)。误差线指SEM0 (D)高倍放大视图显示了经ChAT抗体共染色的eNphR3.Ο-eYFP(左)和ChR2_eYFP(右)的膜定位。(E)表达ChR2-eYFP的ChAT神经元中电流注入诱导的膜电位变化。VM=-48mV。电流阶跃:-60, -20、+20pA。(F)表达 eNpHR3.Ο-eYFP 的 ChAT 神经元中由 Is 的 580-nm 光诱导的膜电位变化(峰值超极化:_103mV)。VM=-49mV。(插图)种群平均峰值超极化(平均值土SEM:-83.8± 11.9mV ；n=4)。(G)表达 ChR2_eYFP 的 ChAT 神经元中 470-nm 脉冲序列引起的连续动作电位(脉冲宽度5ms ；10Hz)。(H)表达ChR2_eYFP的ChAT神经元中，在不同刺激频率下产生动作电位的平均成功概率(n=4 ;平均值土SEM ;470-nm脉冲序列，脉冲宽度5-ms)。
[0022]图2描绘ChAT中间神经元的光遗传学光活化增加了抑制电流的频率而抑制了 MSN尖峰化。(A)于脑切片中用蓝光(470nm)活化经ChR2_eYFP转导的ChAT神经元，并且在MSN附近(eYFP-细胞)为全细胞膜片钳制。(B)(左)在ChAT神经元中表达ChR2_eYFP的切片的MSN中观察到自发突触电流。(中)突触电流的频率响应于470-nm光脉冲(脉冲宽度5-ms ；10Hz)增大。(右)这些电流被GABAA受体拮抗剂SR-95531 (5mM)阻断并且因此被视为IPSC。2，3- 二羟基-6-硝基-7-磺酰胺基苯并[f]喹喔啉_2，3- 二酮(NBQX) (5mM)和(RS) -3- (2-羧基哌嗪-4-基)-丙基-1-膦酸(RS-CPP) (5 μ Μ)存在于所有实验中。(C)对于这种MSN的IPSC频率的时程，显示了光脉冲(蓝色虚线条)和SR-95531 (黑色线条)的作用。(D)光照期间IPSC频率根据相对于光脉冲(η=6)的时间增大的平均百分比(标准化为熄灭期间的平均百分比)。蓝色虚线指光脉冲开始；误差线表示SEM。(E)光脉冲使IPSC频率增大525.8±154.3%(η=6，Ρ=0.01，配对双尾t检验)，而自发IPSC的平均幅度变化21.3±28.9%(P>0.05)。(F)在体内使光极(与钨电极连接的光纤)立体定位于ChAT细胞中表达ChR2-eYFP的NAc中。(G)(上)受蓝光刺激抑 制的分离单元的电压跟踪。(中)显示了相同单元对5次重复光刺激的反应的光栅图，每个动作电位用一个点表示。(下)随时间推移相同单元的放电率的平均值和SEM。(H)受光刺激抑制的部位相比受光刺激激发的部位的分数。(I)受光抑制(左；n=13/16)或激发(右；n=3/16)的部位对光刺激的反应的时程的种群总结。实线表示部位上根据时间的平均放电率；每个点表示单独部位的平均放电率。所有放电率均标准化为光刺激之前的平均速率。(F-1)光刺激的持续时间，IOs ;脉冲持续时间，5ms ;波长，470nm ;频率，10Hz。用虚线表示光刺激的时期。[0023]图3描绘ChAT中间神经元的光遗传学光抑制增强了体内MSN尖峰化。(A)(上)通过eNpHR3.0对ChAT中间神经元的光遗传学光抑制激发的分离单元的电压跟踪(从体内NAc记录)。(中)显示了相同单元对5次重复光刺激的反应的光栅图，每个动作电位用一个点表示。(下)随时间推移相同单元的放电率的平均值和SEM。(B)小波分析揭示根据频率和时间，与(A)中相同的单元的尖峰化功率(5次重复的平均值)。(C)受光刺激抑制的部位相比受光刺激激发的部位的分数。(D)与(A)相同，对于受光刺激抑制的单元而言。
(E)受光抑制(左；n=13/17)或激发(右；n=4/17)的部位对光刺激的反应的时程的种群总结。实线表示部位上根据时间的平均放电率；每个点表示单独部位的平均放电率。所有放电率均标准化为光刺激之前的平均值。(A-E)光刺激的持续时间，15s (持续光照)；波长，560nm。用柱表不光刺激的时期。
[0024]图4描绘ChAT中间神经元可在切片中用可卡因活化并且为体内可卡因条件作用所需。㈧应用可卡因浴(5 μ M)10min后，ChAT神经元中自发动作电位的频率增大。ACSF，人工脑脊髓液。(B)对于这种ChAT神经元，随时间推移的放电率。水平灰色柱，可卡因的应用；垂直点线，可卡因 应用IOmin后，(A)和(C)中详细说明了时间点。(C)种群数据，说明了可卡因诱导的ChAT神经元中放电的增加，比较了基线放电率(可卡因应用2.5min前的平均值)与可卡因输注后的速率(可卡因开始后10至12.5min之间的平均值；灰色柱，接受了可卡因的细胞；白色柱，仅接受了 ACSF的对照细胞；P〈0.005，可卡因前后，对可卡因处理组的配对双尾t检验；P〈0.05，比较可卡因或媒介物后，可卡因与对照细胞的非配对双尾t检验)。(D)有双光纤插入的双侧插管系统的示意图，以说明NAc的中间部分。(左侧插图)对(H)中使用的所有小鼠的插管轨迹的端点。(右侧插图)注射了 Cre依赖型eNpHR3.0-eYFP的ChAT:: Cre+小鼠的NAc中的eYFP表达。(E)可卡因CPP (H)的条件作用范例。经腹腔内用可卡因(20mg/kg)，连同用eNpHR3.0进行ChAT细胞抑制(波长:590nm)条件化小鼠。
(F)来自在可卡因条件作用后试验当天(第3天)代表性ChAT::Cre+和ChAT::Cre_小鼠的跟踪数据。在前一天(第2天)，小鼠已经在左侧腔室内接受了可卡因，而在右侧腔室内接受了盐水。ChAT::Cre_小鼠(而非ChAT::Cre+小鼠)表现出对条件化腔室的偏爱。(G)(左)可卡因CPP(用可卡因和光条件化)第3天与第I天中，在条件化腔室内时间的倍数变化。ChAT::Cre+和ChAT::Cre_同窝小鼠的比较；在两种情况中均注射有Cre依赖型eNpHR3.0 (η=IO 只 ChAT::Cre+，n=12 只 ChAT::Cre_ ;对于双尾 t 检验而言，P〈0.01 ;3 个同期组群)。(右)单独用光条件作用第3天与第I天中，在条件化腔室内时间的倍数变化(无可卡因；n=9只ChAT::Cre+, n=7只ChAT::Cre ;对于双尾t检验而言，P>0.05 ；3个同期组群)。误差线指SEM。n.s.，不显著。(H)注射了病毒(Cre依赖型eNpHR3.0)和经光刺激的ChAT:: Cre+ 和 ChAT:: Cre_ 小鼠在野外的速度(n=10 只 ChAT:: Cre+, n=10 只 ChAT:: Cre_ ;对于双尾t检验而言，P>0.05 ；3个同期组群)。(I)在野外的跟踪长度与(H)相同(n=10只ChAT::Cre+, n=10只ChAT::Cre_ ;对于双尾t检验而言，Ρ>0.05 ；3个同期组群)。(J)在野外中央的时间与⑶相同(n=10只ChAT::Cre+, n=10只ChAT::Cre ;对于双尾t检验而言，Ρ>0.05 ；3 个同期组群)。(A-J) *Ρ〈0.05 ;**Ρ〈0.01 ;_Ρ〈0.005。
[0025]图5描绘了对切片中和体内ChAT中间神经元的光遗传学光活化。(A):对与图2Β中相同的MSN的15次电流跟踪的覆盖图，每次跟踪与光脉冲对齐。一些IPSC并未时间锁定为光脉冲，而许多IPSC受光脉冲开始后~8ms的潜伏期时间锁定。(B):相同神经元根据相对于光脉冲的时间的IPSC发生率。空心柱对应光刺激期间记录的IPSC数量；灰色柱对应基线期间(光刺激之前)使用相同时间校准记录的IPSC数量。对于该神经元而言，除更加突出的同步增加外，IPSC频率的不同步增强明显。(C):图2D的比例尺重设图，展示了光照相对于熄灭期间，IPSC频率根据相对于光脉冲的时间增大的种群平均百分比(n=6)。在种群中，除更加突出的同步增加外，IPSC频率的不同步增强明显。图A-C的脉冲参数:470nm，5ms脉冲持续时间，10Hz。(D):来自体内记录的电压跟踪，显示了在IOHz (上)而非IOOHz (下；470nm光；总刺激持续时间IOs)跟踪脉冲蓝光光刺激的群峰电位(推测由表达ChR2的ChAT细胞产生)。
[0026]图6描绘ChAT神经元抑制破坏可卡因CPP，而在可卡因缺乏时不影响CPP。(A):可卡因CPP，数据与图4G相同(左图)，但是绘制为差异而非倍数变化。左侧:条件作用之后与条件作用之前，在经可卡因条件化的腔室内的时间差。(n=10只ChAT::Cre+, n=12只ChAT::Cre-;对于双尾t检验而言，p〈.01 ；3个同期组群)。右侧:条件作用之后与条件作用之前对经可卡因条件化的腔室的偏爱差异，其中将偏爱定义为在条件化腔室与未条件化腔室中消耗时间的差异。(n=10只ChAT::Cre+,n=12只ChAT::Cre-;对于双尾t检验而言，ρ〈.01 ;3个同期组群)。(B):无可卡因的CPP，数据与图4G相同(右图)并且数据呈现与A相同。(对于两个图而言，η=9只ChAT::Cre+,n=7只ChAT::Cre-;对于双尾t检验而言，P〉.05;3个同期组群)。
[0027]图7描绘烟碱受体拮抗作用使在MSN中记录到的ChAT中间神经元产生的IPSC减少。㈧:代表性IPSC在无光、光脉冲(470nm，10HZ，5ms脉冲宽度)和具有10 μ M美加明的相同光脉冲的条件下从急性切片制剂中的典型MSN中扫过。(B):与A相同在光呈现之前，经光呈现和光和美加明或媒介物从一群MSNS记录到的IPSC的总结图。IPSC频率从
3.4+/-1.3Hz光稳定性增长到 10.1+/-1.2Ηζ (ρ〈0.05 ；η=7,配对t检验)，而美加明使这种增长减少到5.1+/-1.8Hz(与相同细胞内单独的光相比，配对t检验，p〈0.05 ;与媒介物对照相比，n=5,非配对t检验，ρ〈.05,)。
[0028]图8描绘了在一定可卡因-CPP参数范围内对ChAT中间神经元的调节。(A):eNpHR3.0介导的对ChAT中间神经元的抑制期间，可卡因CPP的剂量反应曲线。对于腹腔内20mg/kg的标准奖赏剂量而言，可卡因CPP在ChAT::Cre+小鼠体内显著减少(ρ〈.01)，但是在认为产生焦虑或不充足的其它浓度下不显著减少(590nm光，持续光照；见下文的表2)。(B):ChR2对ChAT神经元的刺激并未推动自身的位置偏爱。(470nm光，5ms脉冲宽度，每30s中IOs的IOHz刺激；η=4, ρ>0.05双尾t检验)。(C):在IOHz下用ChR2刺激ChAT神经元不会显著调节腹腔内10mg/kg可卡因的可卡因位置偏爱。(470nm光，5ms脉冲宽度，可卡因条件作用期间持续IOHz刺激；ChAT::Cre+ n=6, ChAT::Cre_ n=6 ；p>0.05双尾t检验)。(D):在IOHz下用ChR2刺激ChAT神经元不会显著调节腹腔内20mg/kg可卡因的可卡因位置偏爱。(470nm光,5ms脉冲宽度,可卡因条件作用期间稳定IOHz刺激；ChAT::Cre+n=4, ChAT:: Cre- n=3 ；p>0.05 双尾 t 检验)。
[0029]图9描绘eNphR3.0对ChAT中间神经元的抑制并未削弱情境或听觉暗示的恐惧条件作用。(A):在标准情境恐惧条件作用范例中量化了耗时冻结百分比。“基线”指在首次音调冲击配对前30s。“立即”指紧接第二次(和最后一次)音调冲击配对后的30s。“情境”指冻结于条件作用期后当天相同的情境。ChAT::Cre+小鼠表现出立即和情境冻结增强。(n=9 只 ChAT:: Cre+ ；n=8 只 ChAT:: Cre-;双尾 t 检验；比较 ChAT:: Cre+ 和 ChAT:: Cre-的立即和情境冻结，P〈.05)。(B):听觉暗示的恐惧条件作用范例的耗时冻结百分比。“音调前”指音调开始前新情境中的2.5min ;“音调”指音调期间的2.5min (n=9只ChAT:: Cre+ ；n=8只ChAT:: Cre-;双尾 t 检验；比较 ChAT:: Cre+ 和 ChAT:: Cre-, p>.05)。
[0030]图10描绘了控制伏隔核(NAc)或背侧纹状体的系统，与本公开的实施方案一致。
[0031]图11描绘了控制乙酰胆碱释放的流程图，与本公开的实施方案一致。
[0032]发明详述
[0033]本发明尤其提供了通过选择性改变伏隔核或背侧纹状体的胆碱能中间神经元细胞的膜电位破坏个体的奖赏相关行为的组合物和方法。本发明基于发明人发现用光反应性视蛋白离子泵蛋白选择性超极化伏隔核的胆碱能中间神经元细胞破坏了药物成瘾动物模型追求奖赏的行为。
[0034]虽然本公开可具有各种修改和替代形式，但是在图中已经以举例的方式示出了其细节并将进行详细描述。然而，应理解，目的不是将本公开限于描述的特定实施方案。相反，目的是包括属于本公开范围内的所有修改、等效物和替代方案，包括权利要求中定义的各个方面。
[0035]通用技术
[0036]除非另外指出，本发明的实践将采用本领域技术人员众所周知的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学、免疫学、生理学和病理生理学药物成瘾和奖赏相关行为的常规技术。文献中充分说明了此类技术，例如Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第 2 版(Sambrook 等，1989)和 Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第 3 版(Sambrook 和 .Russel, 2001),(本文共同称为 “Sambrook”)；CurrentProtocols in Molecular Biology (F.M.Ausubel 等编辑，1987,包括 2001 全年的增刊)；PCR:The Polymerase Chain Reaction, (Mullis 等编辑，1994) ;Harlow 和 Lane(1988)Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York;Harlowand Lane(1999)Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, NY(本文共同称为“Harlow 和 Lane，，)，Beaucage等编辑，Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, John ffiley&Sons, Inc., NewYork, 2000), Handbook of Experimental Immunology,第 4 版(D.M.Weir&C.C.Blackwell编辑，Blackwell Science Inc., 1987)；和 Gene Transfer Vectors for MammalianCells (J.M.Miller&M.P.Calos 编辑，1987)。其它有用参考包括 Harrison 的 Principlesof Internal Medicine (McGraw Hill ;J.1sseleacher 等编辑)和 Addiction ResearchMethods, (Miller 等编辑,2010 ；ffiley-Blackwell, United Kingdom)。
[0037]定义
[0038]如本文所使用，“奖赏相关行为”是加强行为的过程-在执行行为后立即或不久之后通过刺激物的递送或出现以时常愉悦的反应形式增加特殊行为的速率、可能性或强度的事情。奖赏相关行为可包括但不限于获取食物、性行为、赌博行为和/或药物相关的成瘾行为。
[0039]“药物相关的成瘾行为”是由强迫性物质使用产生的行为并且特征在于，对所述物质的明显依赖性。成瘾相关行为的症状是(i)与药物使用的压倒性牵连，(?)其供给稳固，和(iii)停止服药后复发的可能性高。
[0040]如本文所提到，术语“药物”或“麻醉剂”旨在包括类鸦片(例如鸦片和海洛因)、去氧麻黄喊、可卡因(苯甲酸甲基爱网宁)、克他命(ketamine)、MDMA(3, 4-亚甲二氧基去氧麻黄碱；也称为“摇头丸(Ecstasy) ”)、麦角酸二乙酰胺(LSD)或大麻素(cannabinoid)。另外，麻醉剂旨在包括酒精、烟碱或任何其它管制物质。
[0041]“个体”是包括人类在内的哺乳动物。哺乳动物包括但不限于家畜、运动动物、宠物、灵长类动物、小鼠和大鼠。个体还包括伴侣动物，包括但不限于狗和猫。在一些方面，个体为非人类动物，例如哺乳动物。另一方面，个体为人类。
[0042]如本文所使用，药物、化合物或药物组合物的“有效剂量”或“有效量”是足以实现有益或预期结果的量。对于预防性使用，有益或预期结果包括例如以下的结果:消除或降低风险，减轻严重程度，或延迟所述疾病的发作，包括所述疾病的生物化学、组织学和/或行为科学症状，其并发症和所述疾病发展期间呈现的中间病理表型。对于治疗性使用，有益或预期结果包括临床结果，例如减少由所述疾病产生的一种或多种症状，提高患有所述疾病的人的生活质量，降低治疗所述疾病所需的其它药剂的剂量，例如经由靶向增强另一种药剂的作用，延迟所述疾病的进展，和/或延长生存期。为了本发明的目的，药物、化合物或药物组合物的有效剂量是足以直接或间接实现预防或治疗处理的量。正如临床环境下理解的一样，药物、化合物或药物组合物的有效剂量可能或可能不连同另一种药物、化合物或药物组合物一起达到。因此，在施用一种或多种治疗剂的情况下可考虑“有效剂量”，并且如果连同一种或多种其它试剂，可能或实现所需结果，可考虑给予有效量的单一试剂。
[0043]如本文所使用，“治疗”是获得有益或预期结果，包括优选临床结果的方法。为了本发明的目的，有益或预期结果包括但不限于以下的一种或多种:减少由所述疾病产生的症状，提高患有所述疾病的人的生活质量，减少治疗所述疾病所需的其它药剂的剂量，延迟所述疾病的发展，和/或延长个体的生存期。
[0044]如本文所使用，除非另外指出，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数个指示物。
[0045]该说明书各处给出的每个最大数值限制旨在包括每个较低数值限制，好像本文确切地写出此类较低数值限制一样。该说明书各处给出的每个最小数值限制将包括每个较高数值限制，好像本文确切地写出此类较高数值限制一样。该说明书各处给出的每个数值范围将包括属于此类更广泛的数值范围内的每个更窄的数值范围，好像本文确切地写出此类更窄的数值范围。
[0046]伏隔核
[0047]伏隔核(NAc),也称为阿肯伯氏核(accumbens nucleus)或伏膈核(nucleusaccumbens septi),是形成腹侧纹状体主要部分的神经元的集合。认为NAc在奖赏、快乐、欢笑、成瘾、攻击、恐惧和安慰作用中起重要作用。伏隔核中发现的主要神经元细胞类型是中型多棘神经元(MSN)。这些神经元产生的神经递质为Y-氨基丁酸(GABA)，中枢神经系统的主要抑制神经递质之一。MSN也是伏隔核的主要透射或输出神经元。虽然伏隔核中95%的神经元为中型多棘GABA能透射神经元，但是还发现其它神经元类型，例如大无棘胆碱能中间神经元，其包含在大脑该区域中的~1%细胞。
[0048]乙酰胆碱(ACh)是一类最后被称为神经递质的生化试剂的首先发现的成员。在中枢神经系统中，ACh对于各种身体机能很重要，例如感觉和运动处理、睡眠、伤害感受、心情、压力反应、注意力、觉醒、记忆、动机和奖赏。在NAc中还发现另一种神经递质，多巴胺(DA)并且其释放是介导刺激性药物的奖赏效应的关键事件(Sofuoglu和Mooney，2009，CNSDrugs, 20(11):939-952)。胆碱能中间神经元在伏隔核中释放ACh。可通过根据受刺激的受体亚型可为激发性或抑制性的胆碱能药和多巴胺能药控制调节MSN的活性:D1多巴胺能药和MlmAChR为激发性，而D2多巴胺能药和M4mAChR为抑制性(Calabresi等，LancetNeurol., 2006, 5 (I I): 974-83) 0胆碱能中间神经元接受来自腹侧被盖区(VTA)的多巴胺能输入和主要来自前额皮质、海马和杏仁核的谷氨酸能输入(Sofuoglu和Mooney，2009，CNSDrugs, 20(11):939-952)。不受理论约束，据认为胆碱能中间神经元上这种DA和谷氨酸会聚可提供DA介导的将与谷氨酸介导的学习和情境信息相关联的奖赏机制(Berlanga等，Neuroscience.2003; 120 (4): 1149-56)。因此，据信胆碱能中间神经元调节将奖赏信号翻译为情境适当的行为。
[0049]常滥用的药物和自然奖赏参与改变NAc中神经递质的细胞外浓度的相互作用(DiChiara 和 Imperato, 1988，PNAS, 85(14):5274-8 ;Phaus, Curr Opin Neurobiol, 1999，9⑶:751-8)。而且，已经证实NAc的损害降低了各种刺激物和鸦片剂的奖赏效应(Kel sey等，BehavNeurosc1.，1989103 (6): 1327-34)。尽管如此，包括将麻醉剂直接微量输注至NAc中的实验已经提供了其在奖赏相关行为奖赏状态中起作用最有力的证据。例如，啮齿动物成瘾模型将容易地将麻醉剂，例如安非他明(amphetamine)(多巴胺释放剂)、可卡因(多巴胺再摄取抑制剂)和诺米芬辛(nomifensine)(多巴胺再摄取抑制剂)直接自我施用至NAc中，从而证明多巴胺在NAc中起重要作用以调苄基于奖赏和动机的行为(Carlezon和Thomas，Neuropharmaco1gy, 2009; 56 (增刊 I): 122-132)。
[0050]然而，NAc细胞本身响应于神经递质(如多巴胺)的输入在介导这些复杂哺乳动物行为，特别是关于奖赏相关行为，例如物质滥用和依赖性(成瘾)的行为中所起的作用仍不清楚。神经递质多巴胺和乙酰胆碱在通过NAc引起奖赏相关行为中所起的特定作用也未知。奖赏是加强行为的过程-出现时，引起行为的强度增强的事情。奖赏是描述个体归于物品、行为动作或内部物理状态的积极价值的操作概念。自然奖赏包括物种生存所必需的奖赏，例如进食、交配和搏斗。NAc已经与这些类型中的许多奖赏相关行为相关联，与药物成瘾、性成瘾和赌博成瘾一样多种多样。
[0051]光反应性视蛋白
[0052]本文提供了使个体伏隔核和纹状体中的胆碱能神经元选择性超极化以破坏个体至少一种奖赏相关行为的基于光遗传学的组合物和方法。光遗传学指甚至在自由活动的哺乳动物和其它动物体内，用于控制活组织靶细胞中的特定事件的遗传和光学方法的组合，时间精度(毫秒-时间尺度)需要与功能完整的生物系统保持同步。光遗传学需要将快速光反应性通道或泵蛋白引入靶神经元细胞的质膜，靶神经元细胞允许对神经元膜电位在时间上精确的操纵，同时通过使用特异性靶向机制维持细胞类型分辨率。
[0053] 可用于本发明的光反应性视蛋白包括通过光诱导神经元超极化的视蛋白和通过光诱导神经元去极化的视蛋白。以下表1和2中示出了视蛋白的实例。
[0054]表1示出了整个可见光谱中鉴定的抑制细胞活性的视蛋白:
[0055]
【权利要求】
1.一种非人类动物，其包含在所述动物的伏隔核或纹状体中的胆碱能中间神经元的细胞膜上表达的光反应性视蛋白，其中当用光照射所述中间神经元时所述蛋白质对光起反应并且能够诱导所述中间神经元的膜超极化，其中照射所述蛋白质破坏所述动物的至少一种奖赏相关行为。
2.根据权利要求1所述的非人类动物，其中所述光反应性视蛋白使所述胆碱能中间神经元的细胞膜超极化。
3.根据权利要求2所述的非人类动物，其中所述光反应性视蛋白选自NpHR、BR、AR和GtR3。
4.根据权利要求3所述的非人类动物，其中NpHR选自NpHR2.0、NpHR3.0和NpHR3.1。
5.根据权利要求1所述的非人类动物，其中所述奖赏相关行为是药物相关的成瘾行为。
6.根据权利要求5所述的非人类动物，其中所述药物为可卡因。
7.根据权利要求4所述的非人类动物，其中所述光反应性视蛋白包含与SEQID NO:1中所示序列至少95%相同的氨基酸序列。
8.一种包含所述伏隔核或所述纹状体的横截面的脑切片，其中光反应性视蛋白在胆碱能中间神经元的细胞膜上表达，其中当用光照射所述中间神经元时所述蛋白质对光起反应并且能够诱导所述中间神经元的膜超极化，其中照射所述蛋白质破坏奖赏相关的脑功能。
9.一种破坏个体的奖赏相关行为的方法，包括:向所述个体施用编码光反应性视蛋白的多核苷酸，其中所述光反应 性视蛋白在所述个体的伏隔核或纹状体中的胆碱能中间神经元的细胞膜上表达，并且当用光照射所述中间神经元时所述蛋白质对光起反应并且能够诱导所述中间神经元的膜超极化，从而用光活化所述蛋白质破坏个体的至少一种奖赏相关行为。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述多核苷酸为载体。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述载体为选自AAV载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、HSV载体和慢病毒载体的病毒载体。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述光反应性视蛋白使所述胆碱能中间神经元的细胞膜超极化。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述光反应性视蛋白选自NpHR、BR、AR和GtR3。
14.根据权利要求13所述的方法，其中NpHR选自NpHR2.0、NpHR3.0和NpHR3.1。
15.根据权利要求9所述的方法，其中所述奖赏相关行为是药物相关的成瘾行为。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述药物为可卡因。
17.根据权利要求9-16中任一项所述的方法，其中所述个体为人类。
18.根据权利要求9-16中任一项所述的方法，其中所述个体为非人类动物。
19.一种治疗个体药物成瘾的方法，包括:向所述个体施用编码光反应性视蛋白的多核苷酸，其中所述光反应性视蛋白在所述个体的伏隔核或纹状体中的胆碱能中间神经元的细胞膜上表达，并且当用光照射所述中间神经元时所述蛋白质对光起反应并且能够使所述中间神经元超极化，从而用光活化所述蛋白质破坏所述个体的至少一种奖赏相关行为并且所述个体不再需要服药。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述药物成瘾为可卡因成瘾。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述多核苷酸为载体。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述载体为选自AAV载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、HSV载体和慢病毒载体的病毒载体。
23.根据权利要求19-22中任一项所述的方法，其中所述个体为人类。
24.根据权利要求19-22中任一项所述的方法，其中所述个体为非人类动物。
25.一种方法，包括:提供配置用于靶向与自然奖赏相关行为和/或奖赏学习有牵连的结构的胆碱能神经元的刺激源；并且通过活化所述刺激源控制乙酰胆碱的释放。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述结构包括伏隔核和背侧纹状体中的至少一种。
27.根据权利要求25所述的方法，其中活化所述刺激源包括通过活化在胆碱能神经元中表达的光反应性视蛋白改变乙酰胆碱的释放。
28.根据权利要求25所述的方法，其中活化所述刺激源包括通过经由置于所述胆碱能神经元附近的一个或多个电极施加电脉冲改变乙酰胆碱的释放。
29.根据权利要求25所述的方法，其中活化所述刺激源包括通过在邻近所述胆碱能神经元的位置释放药物改变乙酰胆碱的释放。
30.根据权利要求25所述的方法，其中所述控制步骤包括用所述胆碱能神经元抑制乙酰胆碱的释放。
31.一种方法，包括:通过使伏隔核的胆碱能神经元暴露于物质评估所述物质的成瘾性质；并且在暴露于所述物质后监测所述伏隔核的胆碱能神经元的活性。
32.一种方法，包括:通过施加治疗，连同使伏隔核的胆碱能神经元暴露于所述物质评估所述治疗对成瘾物质的作用；并且在暴露于所述物质后监测所述伏隔核的胆碱能神经元的活性。
33.一种评估治疗对物质依赖性的作用的方法，所述方法包括:通过激发动物伏隔核的胆碱能神经元，同时对所述动物教导条件反应，人工诱导动物的物质依赖性；并且通过施加所述治疗评估所述治疗的作用，并且通过监测所述动物的条件反应评估所述治疗的应用。
34.—种系统,包括:一组胆碱能神经元；向所述胆碱能神经元组提供药物的药物递送设备；和评估所述胆碱能神经元组响应于向所述胆碱能神经元组提供的药物的活性的监测设备。
35.根据权利要求34所述的系统，其中所述胆碱能神经元组包括光反应性视蛋白，并且其中所述系统进一步包括通过活化所述光反应性视蛋白激发所述胆碱能神经元的光传输系统。
36.根据权利要求34所述的系统，其中将所述监测设备进一步配置为通过监测乙酰胆碱的释放评估所述胆碱能神经元组的活性。
【文档编号】A61N5/06GK103476456SQ201180063262
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2011年11月4日 优先权日:2010年11月5日
【发明者】K·戴瑟罗斯, I·威滕 申请人:斯坦福大学托管董事会