含非复制性益生菌微生物的可勺性酸奶制备物的制作方法

含非复制性益生菌微生物的可勺性酸奶制备物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及可勺性酸奶组合物领域。特别地，本发明提供了包含非复制性益生菌微生物的可勺性酸奶组合物。这些非复制性益生菌微生物可以是例如，经热处理的具有生物活性的益生菌微生物。本发明还涉及通过这些非复制性益生菌微生物提供健康益处。
【专利说明】含非复制性益生菌微生物的可勺性酸奶制备物
[0001]本发明涉及可勺性酸奶组合物(spoonable yogurt composition)领域。特别地， 本发明提供了包含非复制性益生菌微生物的可勺性酸奶组合物。这些非复制性益生菌微生 物可以是例如经热处理的具有生物活性的益生菌微生物。本发明还涉及由这些非复制性益 生菌微生物提供的健康益处。
[0002]同时，益生菌的健康益处在本领域是公认的，例如由Blum等人在Curr Issues Intest Microbiol.2003Sep;4(2): 53-60中总结。通常，在共生制剂中益生菌与益生元一起 施用，所述共生制剂甚至具有增加的健康益处。
[0003]已知益生菌能与人类肠细胞粘着，并能排斥人类肠细胞上的病原菌。为了具有这 种活性，在产品中的益生菌被消耗之前，所述益生菌必须保持生活力。这是工业中的挑战， 并使得将益生菌加入到食品中是重要的。
[0004]特别地，对于在生产期间经加热的产品和/或在消费之前可能具有较长的储存时 间的产品，如货架稳定的产品，通常认为，在消费之前，确保产品中的益生菌保持生活力，此 外确保所述益生菌在到达肠道时也是存活的是困难的。
[0005]将期望得到这样的可勺性酸奶组合物，甚至能在较长的储存时间后，在用于益生 菌的临界条件下，所述可勺性酸奶组合物仍能递送益生菌的益处，并且制备简单。通过使用 天然成分来实现该目的将是优选的，所述天然成分对于施用者是安全的(没有副作用)，并 且使用当今工业技术水平可以容易地将所述天然成分掺入到可勺性酸奶组合物中。
[0006]还期望的是提供包含具有改进的免疫增强作用的益生菌的组合物。
[0007]还期望的是提供包含具有改进的抗炎效应的益生菌的组合物。
[0008]本发明人已经处理了该需求。因此，本发明的目的是提高技术发展水平，并提供可 以满足上述需求的可勺性酸奶组合物。
[0009]本发明人惊奇地发现，通过独立权利要求的主题，他们可以实现该目的。从属权利 要求进一步发展了本发明的思想。
[0010]因此，本发明人提供了包含非复制性益生菌微生物的可勺性酸奶组合物。
[0011]可勺性酸奶可以是凝固型酸奶或搅拌型酸奶。搅拌型酸奶例如以淡味的、不加糖 的、加糖的或者调味的制备物形式存在。根据本发明可勺性酸奶可以是低脂的或无脂的或 者含奶油的。所述可勺性酸奶可以包含水果制备物。凝固型酸奶还可以以水果位于底物的 凝固形式存在。
[0012]将非复制性益生菌微生物加入到产品中的一个优点是，与存活的益生菌不同，如 果存在于产品中，所述非复制性益生菌微生物不会影响纤维的质地，使得组合物的口感不 会随着时间而改变。
[0013]此外，本发明人能够显示，非复制性益生菌可以提供益生菌的健康益处，甚至可以 具有改进的益处。
[0014]因此，保持益生菌在最终产品中存活，并且确保它们活着到达肠中的复杂方法似 乎是不必要的。此外，在可勺性酸奶组合物中使用非复制性益生菌还允许在一种制备物中 具有益生菌和益生元，而在制备和储存产品期间不存在不希望的过早破坏纤维的风险。[0015]本发明的可勺性酸奶组合物中非复制性微生物的量可以相当于每份约 106-1012cfu。
[0016]显而易见，非复制性微生物不会形成菌落；因此，将该术语理解为从104-1012cfu/g 的复制性细菌获得的非复制性微生物的量。这包括灭活的、无生活力的或死的或以碎片如 DNA或细胞壁或胞质化合物存在的微生物。换句话说，组合物包含的微生物的数量用该数 量的微生物的菌落形成能力(cfu)表述，就好像全部微生物是存活的，而不考虑事实上它 们是非复制的如灭活的或者死的、碎片化的或者这些状态的任一个或者全部的混合。可勺 性酸奶由标准化的全脂乳、部分脱脂乳、浓缩脱脂乳、奶油和无脂奶粉的混合物制成。备选 地，可以通过在真空锅中去除约15%-约20%的水来部分地浓缩乳。优选的是补充具有无脂 奶粉的非脂乳固体(MSNF)。酸奶中的乳脂水平是从无脂酸奶少于约0.5%至正常酸奶最低
3.2%的范围。MSNF优选地为至少8.25%。
[0017]为了修饰酸奶的某些性质，可以加入多种成分。为了使酸奶更甜，可以加入大约7% 的蔗糖(糖)。为了降低酸奶的热量，可以使用人造甜味剂如阿斯巴甜或糖精。可以加入奶 油以提供更光滑细腻的质地。可以通过包含稳定剂如食物淀粉、明胶、豆角胶、瓜尔豆胶和 果胶，来改善酸奶的浓稠度和贮存稳定性。可勺性酸奶组合物可以例如包含约0.3-0.5重 量％的果胶。
[0018]可勺性酸奶组合物可以在寒冷条件下储存。寒冷条件通常具有2V -15°C，优选地 40C _8°C的范围内的温度。
[0019]可勺性酸奶组合物还可以在环境条件下储存。环境条件通常具有16°C-25°C，优 选地8°C _23°C的范围内的温度。在环境条件下保持益生菌存活延长的时间尤其具有挑战 性。因此，特别是对于待储存在环境温度下的可勺性酸奶组合物，添加非复制性益生菌微生 物是赋予产品另外的健康益处的可能方式。
[0020]可勺性酸奶组合物还可以包含益生元。
[0021]“益生元”指的是促进益生菌在肠中生长的食物物质。益生元在胃中和/或肠的 上段不被分解并且在摄食它们的人的胃肠道中不被吸收，但是它们被胃肠道微生物区系和 / 或益生菌发酵。例如 Glenn R.Gibson 和 Marcel B.Roberfroid, Dietary Modulation of the Human Colonic Microbiota:1ntroducing the Concept of Prebiotics, J.Nutr.1995125:1401-1412 中定义了益生元。
[0022]根据本发明可以使用的益生元没有特别地限制并且包括促进益生菌在肠中生长 的所有食物物质。优选地，它们可以选自包含果糖、半乳糖、甘露糖的寡糖；膳食纤维，特别 是可溶性纤维、大豆纤维；菊粉或者它们的混合物。优选的益生元是低聚果糖(FOS)、低聚 半乳糖(IOS)、低聚异麦芽糖、低聚木糖、大豆低聚糖、葡萄糖基蔗糖(GS)、乳蔗糖(LS)、乳 酮糖(LA)、帕拉金糖(palatinose)低聚糖(PAO)、低聚麦芽糖(MOS)、树胶和/或其水解产 物、果胶和/或其水解产物。
[0023]益生元的一般实例是低聚果糖和菊粉。
[0024]在根据本发明的可勺性酸奶组合物中的益生元数量取决于其促进乳酸菌生长的 能力。
[0025]可勺性酸奶组合物可以包含的益生菌的量例如相应于每克至少IO3Cfu益生元，优 选地IO4至107cfu/g益生元的量。[0026]本发明人惊奇的看到，例如在免疫增强效应方面和/或在抗炎效应方面，非复制 性益生菌微生物比复制性益生菌微生物更有效。
[0027]该现象是令人惊奇的，因为益生菌通常被定义为“当以足够的量施用时赋予 宿主健康益处的活的微生物”(FA0/WH0指南)。大量出版的文献涉及活的益生菌。另 夕卜，一些研究调查了非复制性细菌传递的健康益处并且大部分益生菌表明例如通过 热处理引起的益生菌的灭活导致它们据说的健康益处的丧失(Rachmilewitz, D.， 等人，2004，Gastroenterologyl26:520-528;Castagliuolo,等人，2005，FEMS Immunol.Med.Microbiol.43: 197-204 ; Gi 11，H.S.和 K.J.Rutherfurd, 2001, Br.J.Nutr.86:285-289;Kaila, M.，等人，1995, Arch.Dis.Child72:51-53.)。一些研究表明灭 活的益生菌可保留一些健康效应(Rachmilewitz, D.,等人，2004, Gastroenterologyl26:5 20-528;Gill, H.S.和K.J.Rutherfurd, 2001，Br.J.Nutr.86:285-289)，但是显然，在本领域 认为活的益生菌更有效。
[0028]“非复制性”益生菌微生物包括已经受到热处理的益生菌。这包括灭活的、死的、无 生活力的和/或以碎片如DNA、代谢物、胞质化合物和/或细胞壁物质存在的微生物。
[0029]“非复制性”指的是通过经典的平板接种方法可以检测的无生活力的细胞和/或 菌落形成单位。在微生物书中概述了这些经典的平板接种方法:James Monroe Jay, Martin J.Loessner，David A.Golden.2005.Modern food microbiology.7th edition, Springer Science, New York, N.Y.790p。通常地,存活细胞的缺失可以按照以下显示:用不同浓度细 菌制备物(“非复制”的样品)接种并且在适合的条件(有氧和/或厌氧空气中持续至少24 小时)下培育后，在琼脂平板上没有可见的菌落或者在液体生长培养基中没有增加的浊度。
[0030]为本发明的目的将益生菌定义为“对宿主的健康或者安康有有益作用的微生物细 胞制剂或者微生物细胞组分”(Salminen S，Ouwehand A.Benno Y.等人“Probiotics:how should they be defined” Trends Food Sc1.Technol.1999:10107-10)。
[0031]本发明的组合物包含足够至少部分产生健康益处的量的益生菌微生物和/或非 复制性益生菌微生物。将足够实现该目的的量定义为“治疗有效剂量”。用于该目的的有效 量将取决于本领域技术人员已知的很多因素如消费者的体重和一般健康状况以及食品基 质的影响。
[0032]在预防应用中，根据本发明的组合物以一定量施用给易感染病症或者处在该病症 的风险中的消费者，所述量足够至少部分地降低患上这种病症的风险。这种量被定义为“预 防有效剂量”。再次，该精确量取决于很多因素如消费者的健康状况和体重以及食品基质的影响。
[0033]本领域技术人员将能适当地调节治疗有效剂量和/或预防有效剂量。
[0034]一般本发明的组合物含有治疗有效剂量和/或预防有效剂量的非复制性益生菌 微生物。
[0035]通常，治疗有效剂量和/或预防有效剂量在每日剂量约0.005mg -1OOOmg非复制 性益生菌微生物范围内。
[0036]优选地，非复制性益生菌微生物以相当于IO4至109cfu/g干组合物的量，更优选地 以相当于IO5至109cfu/g干组合物的量存在。
[0037]益生菌可以通过本领域已知的任何方法成为非复制性的。[0038]使益生菌菌株成为非复制性益生菌的如今可得到的技术通常是热处理、Y -照射、 紫外线或者使用化学试剂(福尔马林、多聚甲醛)。
[0039]就数值的量而言，例如，经“短时间高温”处理的非复制性微生物可以以相当于IO4 至IO12当量cfu/g的干组合物的量存在于组合物中。
[0040]优选地使用在食品工业中在工业环境下相对容易应用的技术来使益生菌成为非 复制性益生菌。
[0041]例如，可以使益生菌成为非复制的，并可以将其作为非复制性益生菌加入到可勺 性酸奶组合物中。
[0042]今天市场上包含益生菌的大部分产品在它们的生产中是经热处理的。因此，方便 的是能对益生菌与生产的产品一起进行热处理或者至少以相似的方式处理，同时益生菌保 留或者改进它们的有益性质或者甚至获得对于消费者新的有益性质。
[0043]因此，还可以将益生菌以存活的形式加入到可勺性酸奶组合物中，并且在可勺性 酸奶的正常生产方法中，在热处理步骤期间可以使所述益生菌成为非复制的。
[0044]然而，在文献中通过热处理失活益生菌微生物通常与益生菌活性的至少部分损失 相关联。本发明人现在惊奇的发现，例如通过热处理使益生菌微生物成为非复制性益生菌 不会导致益生菌健康益处的损失，而是相反-可以增强现存的健康益处并且甚至产生新的 健康益处。
[0045]因此，本发明的一个实施方案是可勺性酸奶组合物，其中所述非复制性益生菌微 生物通过热处理成为非复制性的益生菌。
[0046]这种热处理可以在至少71.5° C进行至少I秒。
[0047]可以使用长期热处理或者短期热处理。
[0048]今天在工业规模上，通常优选的是短期热处理，如UHT样的热处理。该类型的热处 理减少了细菌负荷，并且减少了加工时间，因此减少了营养的破坏。
[0049]本发明人第一次证实经高温短时间热处理的益生菌微生物显示抗炎免疫谱而不 管它们起始的性质如何。特别地，通过该热处理发展了新的抗炎谱或增强了现存的抗炎谱。
[0050]因此通过使用对应于通常工业可应用的热处理的特定的热处理参数可能产生具 有抗炎免疫谱的非复制性益生菌微生物，即使该非复制性益生菌微生物的活的对应物不是 抗炎菌株。
[0051]因此，例如热处理可以是在约71.5-150° C下约1-120秒的高温处理。高温处理 可以是高温/短时间(HTST)处理或者超高温(UHT)处理。
[0052]益生菌微生物可以在约71.5-150° C下进行约1-120秒的短期高温处理。
[0053]更优选地，微生物可以在约90-140° C，例如90° -120° C下进行约1_30秒的短
期高温处理。
[0054]这种高温处理使微生物至少部分成为非复制性的。
[0055]高温处理可以在正常大气压下进行，但也可以在高压下进行。典型的压力范围是I 至50巴，优选I至10巴，更优选2至5巴。显然，如果益生菌在液体或者固体培养基中进 行热处理，当加热时，压力是优选的。因此应用的理想压力将取决于提供微生物的组合物的 性质和使用的温度。
[0056]高温处理可以在约71.5-150° C，优选地约90-120 ° C，甚至更优选地约120-140° C的温度范围内进行。
[0057]高温处理可以在约1-120秒，优选地约1-30秒，甚至更优选地约5-15秒的短期 内进行。
[0058]该给定的时间范围指的是益生菌微生物在给定的温度下进行的时间。注意取决于 提供微生物的组合物的性质和量并且取决于使用的加热设备的结构，热应用的时间可以不 同。
[0059]然而，通常用高温短时间(HTST)处理、巴氏瞬间灭菌法或者超高温(UHT)处理处 理本发明的组合物和/或微生物。
[0060]UHT处理是超高温处理或者超热处理(都简写为UHT)，所述UHT处理涉及在超 过135° C(275° F)的温度下通过短时间约1-10秒的加热使组合物至少部分灭菌，超过 135° C的温度是灭活奶中细菌孢子需要的温度。例如，用超过135° C的温度的方式加工 奶允许在必要的保持时间(2-5秒)内降低细菌负荷，使得能够连续流动操作。
[0061]有两种主要类型的UHT系统:直接和间接系统。在直接系统中，通过蒸汽注射或者 蒸汽注入处理产品，然而在间接系统中，使用板式热交换器、管式热交换器或者刮面式换热 器对产品进行热处理。UHT系统的组合可应用于产品制备方法中的任一步骤或者多个步骤。
[0062]HTST处理定义如下(高温/短时间):设计的巴氏消毒法实现了 5个数量级的减 少:灭活奶中存活微生物数目的99.9999%。认为该处理足够破坏几乎全部的酵母、霉菌和 常见的腐败细菌并且也保证足够破坏常见致病性热抗性生物。在HTST方法中将奶加热到 71.7° C(161° F)持续 15-20 秒。
[0063]巴氏瞬间灭菌法是易腐饮料如水果和蔬菜汁、啤酒和乳制品的热巴氏消毒法。它 在产品装入容器之前进行以杀死腐败微生物从而使产品更安全并且延长它们的货架期。当 液体在71.5° C(160° F)至74° C(165° F)的温度下进行约15至30秒的处理时，液体 在可控的持续流中移动。
[0064]对于本发明的目的，术语“短时间高温处理”将包括例如高温短时间(HTST)处理、 UHT处理、和巴氏瞬间灭菌法。
[0065]因为这样的热处理提供了具有改进的抗炎谱的非复制性益生菌，本发明的组合物 可用于预防或治疗炎症病症。
[0066]使用本发明的组合物可以治疗或者预防的炎症病症不受特别的限制。例如，炎症 病症可以选自急性炎症，如脓毒；烧伤；以及慢性炎症如炎性肠病，例如克隆病、溃疡性结 肠炎、隐窝炎、坏死性肠结肠炎；皮肤炎症，如紫外线或者化学诱导的皮肤炎症、湿疹、反应 性皮肤；易激肠综合症；眼炎症；变态反应；哮喘以及它们的组合。
[0067]如果使用长期热处理使益生菌微生物成为非复制微生物，这种热处理可以在约 70-150° C的温度范围进行约3分钟-2小时，优选地在80-140° C的范围进行5分钟-40 分钟。
[0068]尽管本领域一般性教导了通过长期热处理成为非复制的细菌在发挥它们的益生 菌性质方面一般没有活细胞有效，但是本发明人能证实经热处理的益生菌比它们活的对应 物更好地刺激免疫系统。
[0069]本发明也涉及包含益生菌微生物的组合物，所述益生菌微生物通过在至少约 70° C下至少约3分钟的热处理成为非复制的益生菌。[0070]通过体外免疫作图证实非复制性益生菌的免疫增强效果。使用的体外模型使用来自人外周血单核细胞(PBMCs)的细胞因子作图，并且在本领域中被接受为用于免疫调节化合物检测的标准模型(Schultz等人，2003，Journal of Dairy Research70，I 65-1 73;Tay 1r 等人,2006, Clinical and Experimental Allergy,36,1227-1235;Kekkonen 等人，2008，World Journal of Gastroenterology, 14, 1192-1203)。
[0071]一些作者/研究团队已经使用了体外的PBMC测定，例如根据它们的免疫谱，即它们的抗-或者促-炎症特征对益生菌分类(Kekkonen等人，2008，World Journal of Gastroenterology, 14, 1192-1203) ? 例如，在肠结肠炎的小鼠模型中已经显示该测定允许候选益生菌抗炎效应的预测(Foligne，B.，等人，2007, World J.Gastroenterol.13:236-243)。此外，在临床试验中该测定通常用作读出并且显示得到与临床结果一致的结果(Schultz等人，2003，Journal of Dairy Research70, 165-173;Taylor 等人,2006, Clinical and Experimental Allergy, 36，1227-1235)。
[0072]在过去的几十年中变应性疾病已经逐步增加并且如今被WHO认为是流行病。一般来说，认为免疫系统的Thl和Th2反应之间的不平衡导致对Th2介体产生的强烈的偏向， 引起变态反应。因此，可通过恢复免疫系统的Thl和Th2臂之间适当的平衡减轻、下调或者预防变态反应。这暗示了减轻Th2反应或者至少暂时地增强Thl反应的必要性。后者将是免疫增强反应的特征，常伴随着例如IFNy，TNF-a和IL-12的更高水平(Kekkonen 等人，2008，World Journal of Gastroenterology, 14,1192-1203;Viljanen M.等人，2005，Allergy, 60，494-500)。
[0073]因此，本发明的可勺性酸奶组合物允许治疗或者预防涉及受损的免疫防御的病症。
[0074]因此，通过使用本发明的组合物可以治疗或者预防的与受损的免疫防御相关的病症不受特别地限制。
[0075]例如，所述病症可以选自感染，特别是细菌、病毒、真菌和/或寄生虫的感染；吞噬细胞缺失；低到严重的免疫抑制水平，如通过应激或者免疫抑制药物、化学疗法或者放射疗法诱导的那些；免疫活性降低的免疫系统的天然状态，如新生儿的免疫系统；变态反应；以及它们的组合。
[0076]本发明描述的可勺性酸奶组合物允许增强幼儿对疫苗特别是口服疫苗的应答。
[0077]非复制微生物的任何量将是有效的。然而，通常优选地，至少90%，优选地至少 95%，更优选地至少98%，最优选地至少99%，理想地99.9%，最理想地全部益生菌是非复制的。
[0078]在本发明的一个实施方案中，所有微生物是非复制的。
[0079]因此，在本发明的组合物中，至少90%，优选地至少95%，更优选地至少98%，最优选地至少99%，理想地99.9%，最理想地全部益生菌可以是非复制的。
[0080]所有益生菌微生物可用于本发明的目的。
[0081]例如，益生菌微生物可以选自双歧杆菌属、乳杆菌属、丙酸杆菌属或者它们的组合，例如长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、乳双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilu)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、类干酿乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、约汉逊氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、乳乳球菌(Lactococcus lactis)、 嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、乳乳球菌(Lactococcus lactis)、二丁酮乳 球菌(Lactococcus diacetylactis)、乳脂乳球菌(Lactococcus cremoris)、保加利亚乳杆 菌(Lactobacillus bulgaricus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳杆菌 (Lactobacillus delbrueckii)、大肠杆菌(Escherichia coli)和 / 或它们的混合物。
[0082]根据本发明的组合物可以例如包含益生菌微生物，所述益生菌微生物选自长双歧 杆菌NCC3001、长双歧杆菌NCC2705、短双歧杆菌NCC2950、乳双歧杆菌NCC2818、约汉逊氏乳 杆菌LaU类干酪乳杆菌NCC2461、鼠李糖乳杆菌NCC4007、路氏乳杆菌DSM17938、路氏乳杆 菌ATCC55730、嗜热链球菌NCC2019、嗜热链球菌NCC2059、干酪乳杆菌NCC4006、嗜酸乳杆菌 NCC3009、干酪乳杆菌ACA-DC6002(NCC1825)、大肠杆菌Nissle、保加利亚乳杆菌NCC15、乳 乳球菌NCC2287或它们的组合。
[0083]所有这些菌株按照布达佩斯条约保藏和/或可以通过商业途径得到。
[0084]按照布达佩斯条约已经保藏的菌株如下:
[0085]长双歧杆菌NCC3001:ATCC BAA-999
[0086]双歧杆菌NCC2705:CNCM 1-2618
[0087]短双歧杆菌NCC2950:CNCM 1-3865
[0088]乳双歧杆菌NCC2818:CNCM 1-3446
[0089]类干酪乳杆菌NCC2461: CNCM 1-2116
[0090]鼠李糖乳杆菌NCC4007: CGMCC1.3724
[0091]嗜热链球菌NCC2019:CNCM 1-1422
[0092]嗜热链球菌NCC2059:CNCM 1-4153
[0093]乳乳球菌NCC2287:CNCM 1-4154
[0094]干酪乳杆菌NCC4006:CNCM 1-1518
[0095]干酪乳杆菌NCC1825:ACA-DC6002
[0096]嗜酸乳杆菌NCC3009:ATCC700396
[0097]保加利亚乳杆菌NCC15: CNCM 1-1198
[0098]约汉逊氏乳杆菌La1:CNCM 1-1225
[0099]路氏乳杆菌DSM17938:DSM17938
[0100]路氏乳杆菌ATCC55730: ATCC55730
[0101]大肠杆菌Nisslel917:DSM6601
[0102]命名为ATCC的菌株保藏在ATCC专利保藏中心(ATCC Patent Depository), 10801University Blvd., Manassas, VA20110,美国。
[0103]命名为CNCM的菌株保藏在国立微生物保藏中心(COLLECTION NATIONALE DECULTURES DE MICROORGANISMESXCNCM),25rue du Docteur Roux，F-75724PARIS Cedexl5,法国。
[0104]命名为CGMCC的菌株保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center),微生物学研究所(Institute of Microbiology),中国科学院(Chinese Academy of Sciences),中关村(Zhongguancun)， P.0.Box2714，北京(Beijing) 100080，中国。
[0105]命名为ACA-DC的菌株保藏在希腊协调微生物保藏中心(GreekCoordinated Collections of Microorganisms),Dairy Laboratory, Department of Food Science and Technology, Agricultural University of Athens,75, Iera odos, Botanikos, Athens, 11855，希腊。
[0106]命名为DSM的菌株保藏在德国微生物菌种保藏中心(DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), Inhoffenstr.7B',38124Braunschweig,德国。
[0107]本领域的技术人员将理解他们可以自由组合本文描述的本发明的所有特征，而不 背离公开的本发明范围。
[0108]本发明其他的优点和特征从以下的实施例和附图中是明显的。
[0109]图1A和B显示用“短时间高温”处理的益生菌的抗炎免疫谱的增强。
[0110]图2显示非抗炎益生菌菌株经过“短时间高温”处理后成为抗炎的益生菌菌株，即 在体外展示显著的抗炎免疫谱。
[0111]图3A和B显示通过商业途径可得到的产品中使用的益生菌菌株，其经过“短时间 高温”处理后在体外展示增强的或者新的抗炎免疫谱。
[0112]图4A和B显示乳品起始菌株(即Lcl起始菌株)，其经过高温热处理后在体外展示 增强的或者新的抗炎免疫谱。
[0113]图5显示非抗炎益生菌菌株，其经过HTST处理后在体外展示抗炎免疫谱。
[0114]图6:PBMC 数据的主要成分分析(IL-12p40，IFN- y , TNF- a , IL-10)，所述 PBMC 数 据由活的和经热处理的(140° C15秒)益生菌和乳品起始菌株产生。每个点代表活的或经 热处理的一种菌株，所述菌株通过它的NCC号或者名称鉴定。
[0115]图7显示活的和受热处理的(85° C，20分钟)菌株的IL-12p40/IL-10比例。总 的来说，在85° C20分钟的热处理导致IL-12p40/IL-10比例的增加，该结果与本发明的“短 时间高温”处理的结果相反(图1、2、3、4和5)。
[0116]图8显示体外细胞因子分泌的增强，该细胞因子分泌来自受热处理的细菌刺激的 人 PBMCs。
[0117]图9显示在用盐水攻击的OVA敏化的小鼠(阴性对照)中，在用OVA攻击的OVA敏 化的小鼠(阳性对照)以及用OVA攻击并且用进行热处理的或者活的短双歧杆菌NCC2950 处理的OVA敏化小鼠中观察的腹泻强度的百分数。结果显示为腹泻强度的百分数(平均值 土SEM，从4次独立的实验计算)，100%的腹泻强度相应于阳性对照(敏化并且用变应原攻击 的)组中发生的症状。
[0118]实施例1:
[0119]方法学[0120]细菌制备:
[0121]活的益生菌在宿主免疫系统上传递的健康益处一般认为是菌株特异性的。在体外 (PBMC测定)诱导高水平IL-10和/或诱导低水平促炎细胞因子的益生菌在体内已经显示 是有效的抗炎菌株(Foligne, B.,等人，2007，World J.Gastroenterol.13:236-243)。
[0122]一些益生菌菌株用于研究受热处理的益生菌的抗炎性质。这些益生菌菌株是长双 歧杆菌NCC3001、长双歧杆菌NCC2705、短双歧杆菌NCC2950、乳双歧杆菌NCC2818、类干酪乳 杆菌NCC2461、鼠李糖乳杆菌NCC4007、干酪乳杆菌NCC4006、嗜酸乳杆菌NCC3009、干酪乳杆 菌ACA-DC6002 (NCC1825)以及大肠杆菌Nissle。也测试了一些起始培养菌株，其包括商业 上用于生产雀巢LcI发酵产品的一些菌株:嗜热链球菌NCC2019、嗜热链球菌NCC2059、保加 利亚乳杆菌NCC15和乳乳球菌NCC2287。
[0123]在5-15L生物反应器中用为每种菌株优化的条件培养细菌细胞。可以使用所有常 用的细菌生长培养基。本领域的技术人员已知这些培养基。当PH调节到5.5时，连续地加 入30%的碱溶液(NaOH或Ca (OH)2X适当时，通过向顶空充入CO2维持厌氧条件。在标准的 厌氧条件下培养大肠杆菌。
[0124]通过离心(5，OOOx g，4° C)收集细菌细胞并在适当体积的磷酸缓冲盐水(PBS)中 重悬浮以达到约109-101(lCfU/ml的终浓度。用15%的甘油将制备物的一部分冷冻于-80° C。 对细胞的另一部分通过如下条件进行热处理:
[0125]-超高温:通过间接热注射，在140°C持续15秒，
[0126]-高温短时间(HTST):通过间接热注射，在74°C，90° C和120° C分别持续15 秒，
[0127]-长时间低温(85°C，20分钟)，在水浴中。
[0128]热处理时，将样品冷冻于-80° C直至使用。
[0129]细菌制备物的体外免疫作图:
[0130]评估活的和受热处理的细菌制备物的免疫谱(即体外诱导来自人血细胞的特定细 胞因子分泌的能力)。从血液滤器分离人外周血单核细胞(PBMCs)。用细胞密度梯度分离后， 收集单核细胞并且用Hanks平衡盐溶液洗涤两次。然后用补充10%胎牛血清(Bioconcept， 巴黎，法国)、1%L-谷氨酰胺(Sigma)、1%青霉素/链霉素(Sigma)以及0.1%庆大霉素 (Sigma)的Iscove’s改良的Dulbecco’s培养基(IMDM, Sigma)重悬浮细胞。然后在48孔 板中将PBMCs(7xl05细胞/孔)与活的以及经热处理的细菌(相当于7xl06cfU/孔)共同 培养36小时。培养36小时后，在细胞因子测量之前将培养板冷冻并保存于-20° C。平行 地进行(即对相同批次的PBMCs进行相同的实验)活的细菌和它们受热处理的对应物的细胞 因子作图。
[0131]36小时的培育后，按照制造商的说明用ELISA(R&D DuoSet人IL-10，BD OptEIA 人IL12p40，BD OptEIA人TNF a，BD OptEIA人IFN- y)测定细胞培养上清液中的细 胞因子(IFN- y , IL-12p40, TNF-a 和 IL-10)水平。IFN-Y，IL_12p40 和 TNF-a 是促 炎细胞因子，而IL-10是有效的抗炎介体。结果表示成4个个体供体的平均值(pg/ ml)+/-SEM,并且代表每次实验用4个供体进行的2次单独实验的结果。计算每种菌株 的IL-12p40/IL-10比例作为体内抗炎效应的预测值(Foligne1B.,等人，2007，World J.Gastroenterol.13:236-243)。[0132]将通过ELISA (见上文)测定的每种菌株的数值细胞因子值传送至BioNumerics v5.10软件(Applied Maths, Sint-Martens-Latem,比利时)。对该组数据进行主要成分分 析(PCA，尺寸标注技术)。该分析包括减去这些特征上的均值以及除以这些特征上的方差。
[0133]结果
[0134]通过超高温(UHT)/高温短时间(HTST)样的处理产生的抗炎谱
[0135]对研究的益生菌菌株进行一系列的热处理(超高温(UHT)，高温短时间(HTST) 以及85° C下20分钟)并将它们的体外免疫谱与活细胞的免疫谱比较。当与人PBMC温 育时，活的微生物(益生菌和/或乳品起始培养物)诱导不同水平的细胞因子产生(图1， 2，3，4和5)。这些微生物的热处理以温度依赖的方式改变PBMC产生的细胞因子水平。 “短时间高温”处理(120° C或140° C15秒)产生具有抗炎免疫谱的非复制细菌(图 1，2，3和4)。实际上，经UHT样处理的菌株(140° C，15秒)诱导更少的促炎细胞因子 (TNF-a，IFN-y, IL-12p40)而维持或者诱导额外的IL-10产生(与活的对应物比较)。与活 细胞相比，任何经UHT样处理的菌株得到的IL-12p40/IL-10比例更低(图1，2，3和4)。对 于经HTST样处理，S卩进行120° C15秒(图1，2，3和4)，或74。C和90。C15秒(图5)热 处理的细菌，该观察结果也是有效的。热处理(UHT样或HTST样处理)对益生菌菌株(图1， 2，3和5)和乳品起始培养物(图4)的体外免疫谱具有相似的效应。PBMC数据的主要成分 分析揭示活的菌株全部沿着X轴散布，说明所述菌株在体外展示非常不同的免疫谱:促炎 细胞因子的从低(左侧)到高(右侧)的诱导物，所述PBMC数据由活的和经热处理(140° C， 15秒)的益生菌和乳品起始菌株产生。经热处理的菌株聚集在图的左侧，表明经热处理的 菌株诱导较少的促炎细胞因子(图6)。相比，在85° C热处理20分钟的细菌比活细胞诱导 更多的促炎细胞因子和更少的IL-10，得到更高的IL-12p40/IL-10比例(图7)。
[0136]UHT样和HTST样处理增强或者产生抗炎谱。
[0137]不管它们各自起始的免疫谱(活细胞)如何，经UHT和HTST处理的菌株展示了抗 炎谱。已知体内抗炎和体外展示抗炎谱的益生菌菌株(长双歧杆菌NCC3001、长双歧杆菌 NCC2705、短双歧杆菌NCC2950、乳双歧杆菌NCC2818)经“短时间高温”处理后在体外展示 增强的抗炎谱。如图1显示，经UHT样处理的双歧杆菌菌株的IL-12p40/IL-10比例比活的 对应物的IL-12p40/IL-10比例更低，因此经UHT样处理的样品显示改进的抗炎谱。更显 著地，为非抗炎活菌株也证实通过UHT样或HTST样处理产生抗炎谱。活的鼠李糖乳杆菌 NCC4007和类干酪乳杆菌NCC2461都在体外展示高的IL-12p40/IL_10比例(图2和5)。显 示这两种活的菌株不能提供针对小鼠中TNBS诱导的结肠炎的保护。经“短时间高温”处理 后(UHT或HTST)，鼠李糖乳杆菌NCC4007和类干酪乳杆菌NCC2461诱导的IL-12p40/IL_10 比例显著地降低，达到低至用双歧杆菌菌株得到的水平。这些低的IL-12p40/IL-10比例是 由于IL-12p40产生的低水平以及IL-10分泌没有改变(鼠李糖乳杆菌NCC4007)或者受到 显著诱导(类干酪乳杆菌NCC2461)(图2)。
[0138]因此:
[0139]-通过UHT样和HTST样的热处理可以增强活的微生物的抗炎谱(例如长双歧杆菌 NCC2705、长双歧杆菌NCC3001、短双歧杆菌NCC2950、乳双歧杆菌NCC2818)。
[0140]-通过UHT样和HTST样的热处理可以从非抗炎的活的微生物(例如，鼠李糖乳杆菌 NCC4007、类干酪乳杆菌NCC2461、乳品起始株嗜热链球菌NCC2019)产生抗炎谱。[0141]-证实从商业途径可得到的产品中分离的菌株(图3A&B)也具有抗炎谱，所述菌株 包括益生菌大肠杆菌菌株。
[0142]对于所有测试的益生菌和乳品起始菌株，例如乳杆菌、双岐杆菌和链球菌，UHT样 /HTST处理的影响是相似的。
[0143]将UHT样/HTST处理应用于体外展示不同的免疫谱的一些乳杆菌、双岐杆菌和链 球菌。所有这些菌株经过UHT样/HTST处理后比它们活的对应物(图1，2，3，4、5和6)诱导 更少的促炎细胞因子，表明UHT样/HTST处理对得到的非复制细菌的免疫性质的影响可以 推广至所有益生菌，特别是乳杆菌和双岐杆菌以及特定的大肠杆菌菌株，并且推广至所有 乳品起始培养物，特别是链球菌、乳球菌和乳杆菌。
[0144]实施例2:
[0145]方法学
[0146]细菌制备:
[0147]用五种益生菌菌株研究非复制性益生菌的免疫增强性质:3种双岐杆菌(长双歧 杆菌NCC3001、乳双歧杆菌NCC2818、短双歧杆菌NCC2950)和2种乳杆菌(类干酪乳杆菌 NCC2461、鼠李糖乳杆菌NCC4007)。
[0148]细菌细胞在MRS上以批次发酵的形式在37° C生长16_18小时，不控制pH。离 心细菌细胞(5，OOOx g，4° C)并且在用盐水稀释之前用磷酸缓冲盐水重悬浮细菌细胞以 达到约10E10cfu/ml的终浓度。长双歧杆菌NCC3001、乳双歧杆菌NCC2818、类干酪乳杆菌 NCC2461、鼠李糖乳杆菌NCC4007在水浴中85° C下热处理20分钟。短双歧杆菌NCC2950 在水浴中90° C下热处理30分钟。等分经热处理的细菌悬浮液，并且在使用之前将细菌悬 浮液冷冻保存于-80° C。活的细菌在使用之前在15%PBS-甘油中-80° C贮存。
[0149]细菌制备物的体外免疫作图:
[0150]评估活的和受热处理的细菌制备物的免疫谱(即体外诱导来自人血细胞的特异细 胞因子分泌的能力)。从血滤器中分离人外周血单核细胞(PBMCs)。用细胞密度梯度分离后， 收集单核细胞并且用Hanks平衡盐溶液洗涤两次。用补充10%胎牛血清(Bioconc印t，巴黎， 法国)、1%L-谷氨酰胺(Sigma)、1%青霉素/链霉素(Sigma)以及0.1%庆大霉素(Sigma) 的Iscove’ s改良的Dulbecco’ s培养基(MDM, Sigma)重悬细胞。然后在48孔板中将 PBMCs(7xl05细胞/孔)与活的以及经热处理的细菌(相当于7xl06cfu/孔)共同培养36 小时。检测活的和受热处理的细菌对PBMCs的效应，该PBMCs来自分入2次单独实验中的8 个个体供体。培养36小时后，在细胞因子测量之前将培养板冷冻并保持在-20° C。平行 进行(即相同的实验中在相同批次的PBMCs上)活的细菌和它们受热处理的对应物的细胞因 子作图。
[0151]按照制造商的说明，用ELISA(R&D DuoSet 人 IL-10, BD OptEIA 人 IL12p40, BD OptEIA人TNF a，BD OptEIA人IFN- y )测定培养36小时后细胞培养上清液中的细胞因子 (IFN- y，IL-12p40, TNF- a 和 IL-10)水平。IFN- y，IL_12p40 和 TNF- a 是促炎细胞因子， 而IL-10是重要的抗炎介体。结果表示成4个个体供体的平均值(pg/ml)+/-SEM，并且结果 代表2次单独实验(每次实验用4个供体进行)。
[0152]活的和经热处理的短双歧杆菌NCC2950在变应性腹泻的预防中的体内效应
[0153]用变应性腹泻的小鼠模型检测短双歧杆菌NCC2950的Thl促进效应(Brandt E.B等人，JCI2003; 112(11):1666-1667)。雄性Balb/c小鼠在致敏(以14天的间隔经腹膜内注射两次卵白蛋白(OVA)和硫酸铝钾；第0天和第14天)后受到6次OVA的经口攻击(第27 天、29天、32天、34天、36天、39天)，导致暂时的临床症状(腹泻)和免疫参数的改变(总的 IgE的血浆浓度，OVA特异的IgE，小鼠肥大细胞蛋白酶1，即MMCP-1)。在OVA致敏之前4 天(第-3天、-2天、-1天、0天以及第11天、12天、13天和14天)以及在攻击时期中(第23 天至39天)通过管饲法施用活的或者在90° C热处理30分钟的短双歧杆菌NCC2950。使用约IO9菌落形成单位(cfu)或者当量cfu/小鼠的每日细菌剂量。
[0154]
[0155]经过热处理后诱导‘促炎’细胞因子的分泌
[0156]体外评估了经热处理的细菌菌株刺激人外周血单核细胞(PBMCs)的细胞因子分泌的能力。将经热处理的细菌刺激PBMCs时基于四种细胞因子的免疫谱与在相同的体外测定中活的细菌细胞诱导的免疫谱比较。
[0157]平板接种经热处理的制备物并且用于评估任何活菌计数的缺失。经热处理的细菌制备物在平板接种后没有产生任何菌落。
[0158]当用PBMCs温育时，活的益生菌诱导不同的和菌株依赖性的细胞因子产生水平 (图8)。与益生菌活的对应物比较，益生菌的热处理改变了 PBMCs产生的细胞因子水平。经热处理的细菌比它们活的对应物诱导更多的促炎细胞因子(TNF- a，IFN- y，IL_12p40)。相 t匕，与活细胞比较，经热处理的细菌诱导相似或者更低量的IL-10 (图8)。这些数据表明经热处理的细菌比它们活的对应物更能刺激免疫系统，并且因此更能加强弱化的免疫防御。 换句话说，体外数据说明受热处理后细菌菌株的增强的免疫增强效应。
[0159]为了说明经热处理的短双歧杆菌NCC2950 (与活细胞相比)对免疫系统的增强效应，在变应性腹泻的动物模型中测试了活的和经热处理的短双歧杆菌NCC2950 (菌株A)。
[0160]与阳性对照组比较，用经热处理的短双歧杆菌NCC2950处理后，腹泻强度明显地持续降低(41.1%±4.8)，然而用活的短双歧杆菌NCC2950处理后，腹泻强度只降低 20±28.3%。这些结果表明经热处理的短双歧杆菌NCC2950比它的活的对应物展示针对变应性腹泻增强的保护效应(图9)。
[0161]其他实施例:
[0162]可以使用标准技术制备待储存在寒冷温度(4_8°C)下的以下可勺性酸奶组合物:
[0163]
【权利要求】
1.可勺性酸奶组合物，其包含非复制性益生菌微生物。
2.根据权利要求1的可勺性酸奶组合物，其包含相当于每份约IO6至IO12Cfu的量的非 复制性益生菌微生物。
3.根据前述权利要求之一的可勺性酸奶组合物，其特征在于所述组合物待储存在寒冷 温度或者环境温度下。
4.根据前述权利要求之一的可勺性酸奶组合物，其进一步包含益生元，例如低聚果糖 和菊粉。
5.根据前述权利要求之一的可勺性酸奶组合物，其中所述益生菌微生物通过热处理， 优选地通过在至少71.5° C至少I秒的高温处理成为非复制性微生物。
6.根据权利要求7的可勺性酸奶组合物，其中所述热处理是在约71.5-150°C约 1-120秒的高温处理，并且优选地是高温/短时间(HTST)处理或者超高温(UHT)处理。
7.根据权利要求8的可勺性酸奶组合物，其用于炎性病症的预防或治疗。
8.根据权利要求7的可勺性酸奶组合物，其中所述热处理在约70-150°C的温度范围 内进行约3分钟至2小时，优选地在约80-140° C的温度范围内进行5分钟至40分钟。
9.根据权利要求10的可勺性酸奶组合物，其用于涉及受损的免疫防御的病症的预防 或治疗。
10.根据前述权利要求之一的可勺性酸奶组合物，其中至少90%，优选地至少95%，更优 选地至少98%，最优选地至少99%，理想地99.9%，最理想的全部所述益生菌是非复制性的。
11.根据前述权利要求之一的可勺性酸奶组合物，其中所述益生菌微生物选自双歧杆 菌属、乳杆菌属、丙酸杆菌属或者它们的组合，例如长双歧杆菌、乳双歧杆菌、动物双歧杆 菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、类干酪乳杆菌、唾 液乳杆菌、路氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、约汉逊氏乳杆菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌、乳乳球 菌、嗜热链球菌、乳乳球菌、二丁酮乳球菌、乳脂乳球菌、保加利亚乳杆菌、瑞士乳杆菌、德氏 乳杆菌、大肠杆菌和/或它们的混合物。
12.根据前述权利要求之一的可勺性酸奶组合物，其中所述益生菌微生物选自长双歧 杆菌NCC3001、长双歧杆菌NCC2705、短双歧杆菌NCC2950、乳双歧杆菌NCC2818、约汉逊氏乳 杆菌LaU类干酪乳杆菌NCC2461、鼠李糖乳杆菌NCC4007、路氏乳杆菌DSM17938、路氏乳杆 菌ATCC55730、嗜热链球菌NCC2019、嗜热链球菌NCC2059、干酪乳杆菌NCC4006、嗜酸乳杆菌 NCC3009、干酪乳杆菌ACA-DC6002(NCC1825)、大肠杆菌Nissle、保加利亚乳杆菌NCC15、乳 乳球菌NCC2287或它们的组合。
13.根据前述权利要求之一的可勺性酸奶组合物，其每日剂量含有约0.005mg -1OOOmg的非复制性微生物。
【文档编号】A61P29/00GK103582423SQ201180062783
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2011年11月10日 优先权日:2010年11月11日
【发明者】A·梅赛尼尔, G·普里乌特, S·努特恩 申请人:雀巢产品技术援助有限公司