北美猪繁殖与呼吸综合征(pprs)病毒及其应用的制作方法

北美猪繁殖与呼吸综合征(pprs)病毒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了包含对感染性RNA序列进行编码的DNA序列的分离多核苷酸分子，所述感染性RNA序列编码经遗传修饰的北美PRRS病毒，还提供了制备所述多核苷酸分子和相关的多肽、多核苷酸和各种组分的方法。此外，还提供了包含所述遗传修饰的病毒和多核苷酸的疫苗以及区分天然受感染动物和经疫苗接种的动物的诊断试剂盒。
【专利说明】北美猪繁殖与呼吸综合征(PPRS)病毒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于动物健康领域，并针对正极性RNA病毒、新型RNA病毒及其经修饰的活性形式的感染性cDNA克隆体，以及使用此类cDNA克隆体的疫苗(具体为猪疫苗)的构建。
【背景技术】
[0002]猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的特征在于母猪与初产母猪中的流产、死产和其他繁殖问题以及幼猪的呼吸道疾病。病原体是PRRS病毒(PRRSV)，该病毒是套式病毒目动脉炎病毒科的成员。套式病毒是具有由正极性RNA的单链组成的基因组的具包膜病毒。正链RNA病毒的基因组RNA满足储存和表达遗传信息的双重作用。在套式病毒的复制和转录中不涉及DNA。非结构性蛋白作为大的多聚蛋白从套式病毒的基因组RNA被直接翻译并随后由病毒蛋白酶切割为不同的功能蛋白。从所述基因组合成了 3’同末端成套的亚基因组RNA(SgRNA)，且其用作用于结构蛋白的翻译的信使RNA。因此，套式病毒基因组RNA的繁殖是基因组复制和SgRNA合成的组合过程。[0003]二十世纪八十年代晚期，该病毒的两种不同基因型几乎同时出现，一种在北美，另一种在欧洲。PRRS病毒现在几乎在所有产猪的国家流行，并被认为是在经济上最重要的影响全球猪肉工业的疾病之一。另外，在中国和周边国家已经分离出了高毒性的基因型，且这些基因型通常与北美基因型相关。
[0004]虽然对PRRSV的生物学的理解取得了重大进展，然而对该病毒的控制仍然很难。对农场的动物进行疫苗接种已被证实非常没有效果。PRRS通常在经免疫的畜群中重新出现，并且大多数在农场的PRRSV疫苗接种活动最终都未能控制该疾病。
[0005]不受理论限制，猪受野生型PRRSV的感染或者用该病原体的活减毒形式对猪进行的疫苗接种遗憾地仅会引发非中和性抗体的大量产生。在此时期内，例如，仅产生有限量的分泌干扰素(IFN)-Y的细胞。因此，PRRSV似乎固有地刺激不平衡的由一贯充足的体液(基于抗体的)免疫所辨别的免疫应答，以及可变且有限但具有潜在保护性的T辅助(Th) I样IFN-Y应答。PRRSV感染的最可能促成适应性免疫的不平衡发展的一个特征在于缺乏适当的天然免疫应答。通常，受病毒感染的细胞分泌I型干扰素“IFN”(包括IFN-α和IFN-β )，其保护邻近细胞不受感染。另外，所释放的I型IFN与幼稚T细胞亚组相互作用以促进其向分泌病毒特异性II型IFN(IFN-Y)的细胞转化。相比之下，猪对于PRRSV接触的IFN-α应答近乎不存在。据预期，这种病原体对IFN-α生成的无效率的刺激会对宿主的适应性免疫应答的性质产生显著影响，因为IFN-α会上调IFN-Y基因表达。因此，前一细胞因子控制促进适应性免疫的发展的主导途径，即T细胞介导的IFN- Y应答和峰期抗病毒免疫防御。
[0006]就此而言，已逐渐明晰的是，病毒感染的天然免疫和适应性免疫之间通过特定类型的树突细胞而出现可能的联系，所述树突细胞能够产生大量的I型干扰素且在T细胞功能的极化中起到关键性作用。具体地，一种出现不太频繁但重要的树突细胞(浆细胞样树突细胞(roc))，也称作天然IFN-α/β生成细胞)借助其导致幼稚T细胞分化为IFN-y分泌细胞的能力而在抗病毒免疫中起着重大作用。虽然罕见，但PDC是极为强力的IFN- α生成者，每个细胞能够响应于病毒而产生3pg至IOpg的IFN- α。相比之下，在单个细胞的基础上，单核细胞产生低5倍至10倍的IFN- α。此前对猪TOC的表型和某些生物学性质已经有所描述(Summerfield等,2003，Immunologyll0:440)。近期研究已经确定，PRRSV 不会刺激猪 PDC 分泌 IFN- a (Calzada 等，2010, Veterinary Immunology andImmunopathologyl35:20)。
[0007]这一事实结合下述观察结果强调了 IFN-α在猪受PRRSV病毒感染期间起到的关键性作用，所述观察结果表明，据发现在疫苗接种时从外部添加的IFN-α会改善PRRSV特异性 IFN- Y 应答的强度(ff.A.Meier 等，Vet.1mmunol.1mmunopath.102,第 299-314页，2004)。既然IFN-α对保护性免疫的发展具有显然的重大作用，重要的是确定不同的PRRS病毒储液刺激和/或抑制IFN- α产生的能力。因此，存在对于针对PRRS进行保护的新型和改良的经修饰的活疫苗的迫切需要。如下文所述，显而易见的是，源自新型感染性cDNA克隆体pCMV-S-P129-PK等的病毒具有与野生型Ρ129病毒或两种可商购的经修饰的活PRRS疫苗不同的表型。不受限于理论，本发明提供了可促进基于细胞的针对所述病毒的免疫应答的疫苗，并且限定了新一代的有效PRRS疫苗。

【发明内容】

[0008]在第一实施方式中，本发明提供了一种分离的多核苷酸分子，其包括对编码北美PRRS病毒的感染性RNA分子进行编码的DNA序列，所述PRRS病毒经过遗传修饰从而其作为疫苗可引发猪类动物中针对该PRRS病毒的有效免疫保护性应答。在某些方面，本发明提供了如本文所描述的包括 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4 和 SEQ IDNO:6的DNA序列，或具有与该DNA序列的至少70%同一性、优选与之80%的同一性、且更优选与之85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的序列。
[0009]在某些实施方式中，本发明提供了一种质粒，该质粒包含本文所述的分离的多核苷酸分子和能够在合适的宿主 细胞中转录所述多核苷酸分子的启动子。在另一个实施方式中，本文的质粒的北美或中国PRRS编码序列还对一种以上的可检测的异源性抗原表位进行编码。本发明提供了包括本文所述的质粒的经转染的宿主细胞。
[0010]在另一方面，本发明提供了用于保护猪类动物不受PRRS病毒感染的疫苗。所述疫苗可以包括由感染性RNA分子编码的北美或中国PRRS病毒，所述感染性RNA分子或质粒各自由本文所述的分离的多核苷酸分子所编码。在再一方面，所述疫苗包含包括本文的多核苷酸的病毒载体。本文所述的疫苗可以可选地包含兽医学应用可接受的疫苗载剂。在一个重要方面，与野生型P129PRRS病毒相比，所述疫苗具有降低的干扰素α抑制效应(参见ATCC203488, 203489,美国专利第 6，500，662 号)。
[0011]在一个实施方式中，本发明提供了一种诊断试剂盒，其包含将受PRRS病毒野生株天然感染的猪类动物与用本文所述的经修饰的活疫苗接种过的猪类动物区分开(所谓DIVA测试)的多核苷酸分子。
[0012]在其他实施方式中，本发明提供了保护猪类动物不受PRRS病毒毒株感染的方法，其包括对动物施用免疫原性保护量的本文所述权利要求的疫苗。
[0013]本发明的其它和优选的实施方式包括:分离的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS)或编码其的多核苷酸序列，其中由ORFla编码的蛋白选自包含任意以下氨基酸序列的那些蛋白，其中据信下划线的残基为新颖的=AMANVYd (SEQ ID NO:9) ；IGHNAVM(SEQ ID NO: 12)；TVPDGNC(SEQ ID NO:15) ；CffWYLFD(SEQ ID NO:18) ；HGVHGKY(SEQ ID NO:21) ；AAKVDQY(SEQID NO:24) ；PSATOTS(SEQ ID NO:27) ；LNSLLSK(SEQ ID NO:30) ；APMCQDE(SEQ ID NO:33)；CAPTGMD(SEQ ID NO:36) ；PKVAKVS(SEQ ID NO:39) ；AGEIVGV(SEQ ID NO:42) ；ADFNPEK(SEQID NO:45) JPQTPILGR(SEQ ID N0:48)。在本发明的另一个优选实施方式中，本发明提供了分离的北美或中国PRRS，其在由ORFla编码的蛋白内含有任何的上文所鉴定序列，包括这些经鉴定的序列的任何组合(2、3、4…至多17)。
[0014]本发明还提供了一种分离的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS)，其中该病毒的由ORFla编码的蛋白选自含有以下任一项的那些氨基酸序列:AMV(见SEQ ID NO:9) ;HMA(见SEQ ID NO: 12) ;P2G(见 SEQ ID NO: 15) ;WIL(见 SEQ ID NO: 18) (见 SEQ ID NO:21)；KYD(见 SEQ ID NO:24) ;AJ:D(见 SEQ ID NO:27) ;SLL(见 SEQ ID NO:30) ;M￡Q(见 SEQ IDNO:33) ;P:￡G(见 SEQ ID NO:36) ;VM(见 SEQ ID NO:39) ;EIV(见 SEQ ID NO:42) ;FMP(见SEQ ID NO:45) JPPIL(见SEQ ID N0:48)，包括这些经鉴定的序列的任何组合(2、3、4…至多 17)。
[0015]在另一个优选实施方式中，本发明提供了一种分离的北美或中国PRRS，其中不论编码病毒的多核苷酸或由其编码的蛋白中的任何位点的任何其它特定的核苷酸或氨基酸序列位置的身份(identity)为何，ORFla病毒蛋白都含有:
[0016](a)处于指定序列中的任意以下特定氨基酸，
[0017]氨基酸序列AP(见SEQ ID NO:9)内的氨基酸N ；
[0018]氨基酸序列HM(见SEQ ID NO: 12)内的氨基酸N ；
`[0019]氨基酸序列PQG(见SEQ ID NO: 15)内的氨基酸D ；
[0020]氨基酸序列WIL(见SEQ ID NO: 18)内的氨基酸Y ；
[0021]氨基酸序列VHG (见SEQ ID N0:21)内的氨基酸H;
[0022]氨基酸序列KYD (SEQ ID NO: 24)内的氨基酸V;
[0023]氨基酸序列AID(见SEQ ID NO:27)内的氨基酸T ；
[0024]氨基酸序列SLL(见SEQ ID NO:30)内的氨基酸L ；
[0025]氨基酸序列M￡Q(见SEQ ID NO:33)内的氨基酸C ；
[0026]氨基酸序列PIG(见SEQ ID NO:36)内的氨基酸T ；
[0027]氨基酸序列VAK (见SEQ ID NO: 39)内的氨基酸A ；
[0028]氨基酸序列EIV(见SEQ ID NO:42)内的氨基酸I ;
[0029]氨基酸序列FNP (见SEQ ID NO:45)内的氨基酸N ;和
[0030]氨基酸序列PIL(见SEQ ID NO:48)内的氨基酸I，包括这些经鉴定的序列的任何组合(2、3、4…至多17)，或者
[0031](b)在任何其它北美或中国PRRS病毒的指定的3残基ORFla肽序列(与上文指定的3残基序列对应)中含有所述特定的下划线的单个氨基酸，考虑到所述其它特定的3残基氨基酸序列可能显示出一个或两个额外的氨基酸序列变化，但仍认为其与上文指定的序列对应。出于本发明该实施方式的目的，“对应”是指相关序列可以如Henikoff等，PiocNatl.Acad.Sc1.，USA, 89，10915-10919，1992 中所述利用 BLOSUM 算法来优化比对。[0032]在本发明的再一个优选实施方式中，提供了分离的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS)，其中该病毒的由ORFla编码的蛋白具有包含变异(a)、(b)、(c)和(d)中的一种或多种的氨基酸序列，其中每种所述变异定义如下:
[0033]变异(a)，
[0034]氨基酸序列AP(见SEQ ID NO:9)内的氨基酸N ；
[0035]氨基酸序列HM(见SEQ ID NO: 12)内的氨基酸N ；
[0036]氨基酸序列PQG(见SEQ ID NO: 15)内的氨基酸D ；
[0037]氨基酸序列WIL(见SEQ ID NO: 18)内的氨基酸Y ；
[0038]氨基酸序列VHG (见SEQ ID NO: 21)内的氨基酸H，或者变异(a)的任何子集；
[0039]变异(b)，
[0040]氨基酸序列KYD (SEQ ID NO: 24)内的氨基酸V;
[0041 ] 氨基酸序列AID (见SEQ ID NO: 27)内的氨基酸T ；
[0042]氨基酸序列SLL(见SEQ ID NO:30)内的氨基酸L ；
[0043]氨基酸序列M￡Q (见SEQ ID NO: 33)内的氨基酸C，或者变异(b)的任何子集；
[0044]变异(c)，
[0045]氨基酸序列PIG(见SEQ ID NO:36)内的氨基酸T ；
[0046]氨基酸序列VAK (见SEQ ID NO: 39)内的氨基酸A，或者变异(C)的任何子集；和
[0047]变异(d)，
[0048]氨基酸序列EIV(见SEQ ID NO:42)内的氨基酸I ;
[0049]氨基酸序列FNP (见SEQ ID NO:45)内的氨基酸N ；
[0050]氨基酸序列PIL(见SEQ ID NO:48)内的氨基酸I，或者变异⑷的任何子集。
[0051]此类PRRS病毒还可以包含变异(a)中所鉴定的五种氨基酸序列中的两种以上、和/或变异(b)中所鉴定的四种氨基酸序列中的两种以上、和/或变异(C)中所鉴定的两种氨基酸序列和/或变异(d)中所鉴定的三种氨基酸序列中的两种以上。
[0052]本发明还提供了一种质粒,该质粒能够直接转染合适的宿主细胞并从如此转染的合适宿主细胞表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PPRS)，所述质粒包括:(a)对编码PPRS病毒的感染性RNA分子进行编码的DNA序列，和(b)能够转录所述感染性RNA分子的启动子，其中由所述病毒的ORFla编码的蛋白具有含有以下的氨基酸序列:
[0053](I)氨基酸序列AMV(见SEQ ID NO:9)内的氨基酸N ；
[0054]氨基酸序列HM(见SEQ ID NO: 12)内的氨基酸N ；
[0055]氨基酸序列PQG(见SEQ ID NO: 15)内的氨基酸D ；
[0056]氨基酸序列WIL(见SEQ ID NO: 18)内的氨基酸Y ；
[0057]氨基酸序列VHG (见SEQ ID NO: 21)内的氨基酸H，或者其任何子集；和/或
[0058](2)氨基酸序列KYD (SEQ ID NO: 24)内的氨基酸V ；
[0059]氨基酸序列AID(见SEQ ID NO:27)内的氨基酸T ；
[0060]氨基酸序列SLL(见SEQ ID NO:30)内的氨基酸L ；
[0061]氨基酸序列M￡Q (见SEQ ID NO: 33)内的氨基酸C，或者其任何子集；和/或
[0062](3)氨基酸序列PJG (B SEQ ID NO: 36)内的氨基酸T ；
[0063]氨基酸序列VAK (见SEQ ID NO: 39)内的氨基酸A，或者其任何子集；和/或[0064](4)氨基酸序列EIV(B SEQ ID NO:42)内的氨基酸I ；
[0065]氨基酸序列FNP (见SEQ ID NO:45)内的氨基酸N ；
[0066]氨基酸序列PIL (见SEQ ID NO: 48)内的氨基酸I，或者其任何子集。
[0067]可以理解，ORFla编码包含蛋白酶功能的多聚蛋白，而ORFlb编码包含复制酶(RNA聚合酶)和螺旋酶功能的多聚蛋白。关于由PRRS的各种ORF(开放阅读框)编码的蛋白的功能的额外信息可见于例如美国专利第7，132，106号。关于0RF7和其它开放阅读框的功能也参见美国专利第7，544，362号。在本领域中可以理解的是，ORFl编码的蛋白据预期具有额外的已知和未知的功能，而可用于本发明的实践中的新型氨基酸变化不限于通过其对于ORFl编码的蛋白的任意一种特定功能的效应。
[0068]在其它优选实施方式中，所述质粒包含启动子,该启动子是能允许在所祀向的真核细胞中的DNA启动的真核启动子,或能引导所述质粒的体外转录的原核启动子或噬菌体启动子。类似地，本发明提供了产生PRRS病毒的方法，该方法包括用合适的质粒转染适合的宿主细胞和获得由转染的细胞产生的PRRS病毒。
[0069]因此，在一个特定和优选的实施方式中，本发明提供了分离的多核苷酸分子，其包括对编码北美PRRS病毒的感染性RNA分子进行编码的DNA序列，其中所述DNA序列选自由以下组成的组:
[0070](a) SEQ ID NO: 6 ;
[0071](b)与(a)的DNA序列具有至少85%同一性的序列，其中由病毒的ORFla编码的蛋白具有包含以下的氨基酸序列: [0072]来自组(b)(1)的
[0073]氨基酸序列AP(见SEQ ID NO:9)内的氨基酸N ；
[0074]氨基酸序列HM(见SEQ ID NO: 12)内的氨基酸N ；
[0075]氨基酸序列PQG(见SEQ ID NO: 15)内的氨基酸D ；
[0076]氨基酸序列WIL(见SEQ ID NO: 18)内的氨基酸Y ；
[0077]氨基酸序列VHG (见SEQ ID NO: 21)内的氨基酸H，或者其任何子集；和/或
[0078]来自组(b)(2)的
[0079]氨基酸序列KYD (SEQ ID NO: 24)内的氨基酸V;
[0080]氨基酸序列AID(见SEQ ID NO:27)内的氨基酸T ；
[0081 ] 氨基酸序列SLL (见SEQ ID NO: 30)内的氨基酸L ；
[0082]氨基酸序列M￡Q (见SEQ ID NO: 33)内的氨基酸C，或者其任何子集；和/或
[0083]来自组(b)(3)的
[0084]氨基酸序列PIG(见SEQ ID NO:36)内的氨基酸T ；
[0085]氨基酸序列VAK (见SEQ ID NO: 39)内的氨基酸A，或者其任何子集；和/或
[0086]来自组(b)(4)的
[0087]氨基酸序列EIV(见SEQ ID NO:42)内的氨基酸I ;
[0088]氨基酸序列FNP (见SEQ ID NO:45)内的氨基酸N ；
[0089]氨基酸序列PIL(见SEQ ID NO:48)内的氨基酸I，或者其任何子集；和
[0090](c)在高度严格条件下与(a)或(b)的DNA序列的互补物(complement)杂交的DNA序列，包括在65°C的0.5M NaHPO4,7%SDSUmM EDTA中杂交以过滤结合的DNA，和在68°C的 0.1SSC/0.1%SDS 中洗涤。
[0091]本发明还提供了用多核苷酸分子转染的宿主细胞，还提供了保护猪类动物不受PRRS病毒感染的疫苗，所述疫苗包含以下部分和适合兽医学应用的载剂:(a)由如上所述的多核苷酸分子编码的经遗传修饰的北美PRRS病毒、或(b)所述感染性分子、或(c)形式为质粒的所述多核苷酸分子、或(d)包含所述多核苷酸分子的病毒载体，其中所述PRRS病毒能够引发针对PRRS病毒的感染的有效免疫保护应答，其量能有效产生针对感染的免疫保护。
[0092]本发明还提供了对应于以下的RNA多核苷酸序列(即通过具有互补的碱基编码序列而对应):
[0093](a) SEQ ID NO: 6 的 DNA 序列；
[0094](b)与(a)的DNA序列具有至少85%同一性的序列，其中由其ORFla编码的蛋白具有包含以下任一项和以下任一项的任何组合的氨基酸序列:
[0095]氨基酸序列AP(见SEQ ID NO:9)内的氨基酸N ；
[0096]氨基酸序列HM(见SEQ ID NO: 12)内的氨基酸N ；
[0097]氨基酸序列PQG(见SEQ ID NO: 15)内的氨基酸D ；
[0098]氨基酸序列WIL(见SEQ ID NO: 18)内的氨基酸Y ；
[0099]氨基酸序列VHG(见SEQ ID NO: 21)内的氨基酸H ；
[0100]氨基酸序列KYD (SEQ I`D NO: 24)内的氨基酸V;
[0101 ] 氨基酸序列AID (见SEQ ID NO: 27)内的氨基酸T ；
[0102]氨基酸序列SLL (见SEQ ID NO: 30)内的氨基酸L ；
[0103]氨基酸序列M￡Q (见SEQ ID NO: 33)内的氨基酸C ；
[0104]氨基酸序列PIG (见SEQ ID NO: 36)内的氨基酸T ；
[0105]氨基酸序列VAK (见SEQ ID NO: 39)内的氨基酸A ；
[0106]氨基酸序列EIV(见SEQ ID NO:42)内的氨基酸I ;
[0107]氨基酸序列FNP (见SEQ ID NO:45)内的氨基酸N ;和
[0108]氨基酸序列PIL (见SEQ ID NO: 20)内的氨基酸I，或
[0109](c)在高度严格条件下与(a)或(b)的DNA序列的互补物杂交的DNA序列，包括在65 V的0.5M NaHP04、7%SDS、ImM EDTA中杂交以过滤结合的DNA，和在68 V的0.1SSC/0.1%SDS 中洗涤。
[0110]因此，本发明还提供了诊断试剂盒，所述试剂盒包含将受PRRS病毒野生株天然感染的猪类动物与用本发明的疫苗接种过的猪类动物区分开的多核苷酸分子，所述疫苗(病毒)优选表现出与野生型P129PRRS病毒(SEQ ID NO:5)相比降低的干扰素α抑制效应。
【专利附图】

【附图说明】
[0111]表1显示出感染性cDNA克隆体和通过转染至ΡΚ-9细胞衍生出的对应病毒。
[0112]表2显示了野生型PRRS病毒P129和适合在细胞培养物中生长的衍生物的干扰素α抑制效应。
[0113]表3描述了野生型PRRS病毒Ρ129及其适合在表达⑶163的ΡΚ-9细胞中生长的经遗传工程化的衍生物的干扰素α抑制效应。[0114]表4 显示了 P129-PK-FL 和 P129-PK_d43/44 病毒与野生型 P129 病毒和 PRRSIngelvac疫苗相比降低的干扰素α抑制效应。
[0115]表5描绘了用于评估疫苗病毒的安全性和效率而进行的研究的设计。
[0116]表6通过基因组位置显示出Ρ129第O代和P129-PK-FL第17代之间的所有核苷
酸差异和所产生的氨基酸差异。
[0117]表7通过病毒蛋白显示出的Ρ129第O代和P129-PK-FL第17代之间的核苷酸和
氨基酸差异的总结。
[0118]表8通过基因组位置显示出在感染性cDNA克隆体pCMV_S_P129和PCMV-S-P129-PK17-FL所发现的PRRSV基因组之间的所有核苷酸差异和所产生的氨基酸差
巳升。
[0119]表9和10显示出促成第52代病毒表型的氨基酸变化(SEQ ID N0:6)。
[0120]图1显示了疫苗接种后的直肠温度。
[0121]图2显示了用毒性PRRSV NADC20攻击后的直肠温度。
[0122]图3显示了疫苗接种后和攻击后的体重。
`[0123]图4显示了具有PRRS损伤的肺的攻击后百分比数据。
[0124]图5显示了对于所观察到的损伤严重性的攻击后肺评分(LAS)。
[0125]图6是描绘疫苗接种后和攻击后的血清中的抗PPRSV抗体水平(ELISA S/P比)的柱状图。
[0126]图7是攻击后血清中病毒载量的图示(PAM细胞上的log TCID50/ml)。
[0127]图8是为获得本文披露的包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6的疫苗所采用的方法的图示。
[0128]序列说明
[0129]SEQ ID NO:1 提供了 P129-PK-FL 第 17 代完整基因组。
[0130]SEQ ID NO:2 提供了 P129-PK_d43/44 第 17 代完整基因组。
[0131]SEQ ID NO: 3 提供了 P129-PK-FL 第 24 代完整基因组。
[0132]SEQ ID NO:4 提供了 P129-PK_d43/44 第 34 代完整基因组。
[0133]SEQ ID NO:5提供了 P129第O代完整基因组。
[0134]SEQ ID NO: 6提供了 P129第52代完整基因组。
【具体实施方式】
[0135]如本说明书和所附权利要求书中所用，除非上下文明确相反地指出，单数形式“一个”、“这个”和“那个”包括复数指代物。因此，例如，“这种方法”的指代包括了本文所述的类型的一种或多种方法和/或步骤，这在阅读本公开等之后将对本领域技术人员变得显而易见。
[0136]除非另外限定，本文所用的所有科技术语具有与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可以使用与本文所述的那些方法和材料相似或相当的任何方法和材料，现在将对优选的方法和材料进行说明。
[0137]除非具体地相反指出，本发明的实践将采用落入本领域技术的毒理学、免疫学、微生物学、分子生物学和充足DNA技术的常规方法，出于说明目的下文对这些方法的许多进行了描述。这些技术在文献中进行了充分的解释说明。参见例如，SambiOOk等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual (第 2 版,1989) ；Maniatis 等，MolecularCloning:A Laboratory Manual(1982) ；DNA Cloning:A Practical Approach,第 I和 II卷(D.Glover 编著)；01igonucleotide Synthesis (N.Gait 编著，1984) ；Nucleic AcidHybridization(B.Hames&S.Higgins 编著，1985) !Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins 编著,1984) ；Animal Cell Culture (R.Freshney 编著,1986) ；Perbal, APractical Guide to Molecular Cloning (1984)。
[0138]“北美PRRS病毒”是指具有与北美PRRS病毒分离株相关的遗传特征的任何PRRS病毒，例如但不限于大约在二十世纪九十年代早期在美国首次分离出的PRRS病毒(参见例如，Collins, J.E.等，1992，J.Vet.Diagn.1nvest.4:117-126);北美 PRRS 病毒分离株MN-1b (Kwang, J.等，1994, J.Vet.Diagn.1nvest.6:293-296) ;PRRS 的 Quebec LAF_exp91毒株(Mardassi, H.等，1995，Arch.Virol.140:1405-1418);和北美 PRRS 病毒分离株VR2385 (Meng, X.-J 等，1994，J.Gen.Virol.75:1795-1801)。遗传特征是指由北美 PRRS 病毒毒株所共享的基因组核苷酸序列相似性和氨基酸序列相似性。中国PRRS病毒毒株通常表现出与北美毒株的约80%至93%的核苷酸序列相似性。
[0139]“欧洲PRRS病毒”是指具有与在1991年左右在欧洲首次分离出的PRRS病毒相关的遗传特征的PRRS病毒的任何毒株(参见例如Wensvoort，G.等，1991，Vet.Q.13:121-130)。“欧洲PRRS病毒”在本领域中有时也被称为“Lelystad病毒”。
[0140]出于本发明的目的，“有效免疫保护应答”、“免疫保护”和类似术语是指针对病原体的一个或多个抗原表位以 便在经疫苗接种的动物中针对病原体感染进行保护的免疫应答。出于本发明的目的，针对病原体感染的保护不仅包括绝对的避免感染，也包括在经疫苗接种的动物中，与未经疫苗注射的受感染动物相比，病原体感染的程度或速率的任何可检测的降低，或者疾病严重性或因病原体感染所造成的任何症状或病况的任何可检测的减少。在此前未受病原体感染的动物和/或在疫苗接种时未受病原体感染的动物中，可以诱导有效的免疫保护应答。在疫苗 接种时已经受病原体感染的动物中，也可以诱导有效的免疫保护应答。
[0141]如果经遗传修饰的PRRS病毒比未经修饰的亲本毒株的毒性低，则该经遗传修饰的PRRS病毒是“减毒”病毒。如果毒株显示出在决定疾病严重性的一种或多种参数上显示出统计显著性的减小，则该毒株是“毒性更低”的。这类参数可以包括病毒血症水平、发烧、呼吸窘迫严重性、繁殖症状严重性或者肺损伤的数目或严重性等。
[0142]“能支持PRRS病毒复制的宿主细胞”是指在受本发明的病毒感染时能够产生感染性PRRS的细胞。此类细胞包括单核细胞/巨噬细胞谱系的猪细胞(如猪齿槽巨噬细胞及衍生物)、MA-104猴肾细胞及衍生物(如MARC-145细胞)以及用PRRS病毒的受体转染的细胞。术语“能支持PRRS病毒复制的宿主细胞”也可以包括活猪体内的细胞。
[0143]本文所用的“开放阅读框”或“0RF”是指没有接入性(intervening)终止密码子而对特定PRRS病毒蛋白进行编码所需的最小核苷酸序列。
[0144]“猪”和“豕”在本文中互换使用，并指代作为猪科成员的任何动物，例如，家猪。除非另外指明，本文所用的术语“PRRS病毒”是指北美或欧洲PRRS病毒的任何毒株。
[0145]“PRRS”涵盖了由PRRS病毒感染所致的猪的疾病症状。此类症状的实例包括但不限于:发烧、怀孕雌性的流产、呼吸窘迫、肺损伤、丧失食欲和幼猪的死亡。如本文所用，“不能产生PRRSl^ PRRS病毒是指能感染猪但不会产生与猪PRRS感染通常相关的任何疾病症状的病毒。
[0146]本文所用的PRRSV “N蛋白”或“0RF7”被定义为由PRRS病毒的欧洲和北美两者基因型的0RF7所编码的多肽。目前已知的N蛋白的特定同种型的实例有由Genbank登录号PRU87392所报道的北美PRRS原型分离株VR2322的123氨基酸多肽，以及Genbank登录号A26843所报道的欧洲原型PRRS分离株Lelystad的128残基N蛋白。
[0147]“PRRSV N蛋白NLS-1区”或“PRRSV 0RF7NLS-1区”是指含有4个连续碱性氨基酸(赖氨酸或精氨酸)或者3个碱性碱基和组氨酸或脯氨酸的"pat4"或"nucl"核定位信号(Nakai&Kanehisa, 1992 ；Rowland&Yoo, 2003),其大约位于成熟N蛋白的前15个N端残基内。举例而言，VR2332NLS-1区序列是KRKK且位于9至12位残基,而Lelystad分离株序列是KKKK且位于N蛋白的10至13位残基。
[0148]“PRRSV N蛋白NLS-2区”或“PRRSV 0RF7NLS-2区”是指N蛋白内的第二核定位信号，其可以采取两种形式之一。在北美PRRS病毒中，NLS-2具有本发明人称为“pat8”基序的模式，其以脯氨酸开头并且在接下来的3个残基内接续着5残基序列，该5残基序列在5个残基中至少含有3个碱性残基(K或R) (〃pat7〃或〃nuc2〃基序的略微修饰形式，如Nakai&Kanehisa, 1992 ；Rowland&Yoo, 2003所述)。举例而言，此类残基位于北美PRRSV分离株VR2332的N蛋白41-47位残基处，且由序列Ρ...Κ表示。在欧洲PRRS病毒中，NLS-2具有"pat4"或"nucl"基序，其为4个碱性氨基酸或者3个与组氨酸或脯氨酸相关的碱性残基的连续段(Nakai & Kanehisa, 1992 ；Rowland & Yoo, 2003)。欧洲 PRRSV 分离株 Lelystad的NLS-2位于47-50位残基处，且由序列K…K表不。
[0149]“PRRSV N蛋白NoLS区”或“PRRSV 0RF7NoLS区”是指总长度约为32个氨基酸且在其氨基末端附近引入NLS-2区`的核定位信号。举例而言，VR2332的NoLS区序列位于41-72位残基处，且由序列P…R表示(Rowland&Yoo, 2003),而对应的Lelystad分离株序列位于42-73位残基处，且由序列P…R表示。
[0150]“转染的宿主细胞”是指如美国专利第5，600，662号所述的在用PRRS病毒RNA转染时能够产生至少第一轮的PRRS病毒粒子的几乎任何宿主细胞。
[0151]出于本发明的目的，“感染性DNA分子”是编码支持从合适的宿主细胞复制、转录和翻译成功能性病毒粒子的必要要素的DNA分子。类似地，“分离的多核苷酸分子”是指包含从其天然存在状态(如果存在)被纯化至任何可检测的程度的本发明的多核苷酸分子的物质组合物。
[0152]出于本发明的目的，第二多核苷酸分子(RNA或DNA)与第一多核苷酸分子的核苷酸序列“同源”，或具有与所述第一多核苷酸分子的“同一性”，其中，基于遗传密码的简并性，第二多核苷酸分子的核苷酸序列与第一多核苷酸分子的核苷酸序列编码相同的多聚氨基酸，或者其中第二多核苷酸分子编码与第一多核苷酸分子的核苷酸序列所编码的多聚氨基酸足够相似的多聚氨基酸以便可用于实践本发明。同源多核苷酸序列也称为正义链和反义链，且在所有情形也指与任何此类链的互补物。出于本发明的目的，多核苷酸分子可用在本发明的实践中，因此是同源的或具有同一性，其中其可用作诊断探针以检测受感染的猪的液体或组织样品中PRRS病毒或病毒多核苷酸才存在(例如，通过标准杂交或扩增技术)。通常，如果基于BLASTN算法(美国国家生物技术信息中心，另称为美国国家卫生局的NCBI (Bethesda, Maryland, USA)),第二多核苷酸分子的核苷酸序列具有与第一多核苷酸分子的核苷酸序列至少约70%的核苷酸序列同一'I"生，则其与第一多核苷酸分子的核苷酸序列同源。在根据本发明的事件的计算的具体实例中，参考BLASTP2.2.6[TatuSova TA和 TL Madden, “BLAST2sequences_a new tool for comparing protein and nucleotidesequences.，，(1999)FEMS Microbiol Lett.174:247-250]。简言之，利用空位开放罚分为
10、空位扩展罚分为0.1和Henikoff和Henikoff的“blosum62”评分矩阵来对两个氨基酸序列进行比对以便优化比对评分(Proc.Nat.Acad.Sc1.USA89:10915-10919.1992)。然后如下计算百分比同一性:相同匹配的总数XlOO/除以较长序列的长度加上引入较长序列中以便比对两条序列的空位数。
[0153]优选地，同源性核苷酸序列具有至少约75%的核苷酸序列同一性，进而更优选为至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和99%的核苷酸序列同一性。由于遗传密码具有简并性，同源性核苷酸序列可以包含任意数目的“沉默”碱基变化，即仍可编码相同的氨基酸的核苷酸取代。
[0154]同源性核苷酸序列也可以含有非沉默突变，即会导致所编码的多聚氨基酸中的氨基酸差异的碱基取代、缺失或添加，只要所述序列保持与第一核苷酸序列所编码的多聚氨基酸至少约70%的同一性或者可用于实践本发明即可。就此而言，可以进行某些通常认为不会使整体的蛋白功能失活的保守氨基酸取代:例如就带正电荷的氨基酸而言(反之亦然)，赖氨酸、精氨酸和组氨酸；就带负电荷的氨基酸而言(反之亦然)，天冬氨酸和谷氨酸；且就中性带电的氨基酸的某些组而言(在所有情形中反之亦然)，(I)丙氨酸和丝氨酸，
(2)天冬酰胺、谷氨酰胺和组氨酸，(3)半胱氨酸和丝氨酸，(4)甘氨酸和脯氨酸，(5)异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸，(6)甲硫氨`酸、亮氨酸和异亮氨酸，(7)苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸和酪氨酸，⑶丝氨酸和苏氨酸，(9)色氨酸和酪氨酸，(10)和例如酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。氨基酸可以根据物理性质和对二级和三级蛋白质结构的贡献而进行划分。在本领域中，保守取代被认为是一个氨基酸由另一个具有相似性质的氨基酸所取代。示例性保守取代可以见于1997年3月13日公布的W097/09433的第10页(PCT/GB96/02197，1996年9月6日申请)。替代性地，保守性氨基酸可以如Lehninger (Biochemistry,第二版；WorthPublishers, Inc.NY:NY(1975), 71-77)所述分组。其它合适的保守性变化及其应用如下文所述。
[0155]同源性核苷酸序列可以通过核苷酸序列的比较(例如上述通过使用BLASTN)来确定。替代性地，同源性核苷酸序列可以通过在选定条件下的杂交来确定。例如，如果第二多核苷酸分子的核苷酸序列与SEQ ID N0:1的互补物在中等严格条件下杂交(例如在65°C的0.5M NaHP04、7%十二硫酸钠(SDS)、lmM EDTA中杂交以过滤结合的DNA，和在 42°C 的 0.2XSSC/0.1%SDS 中洗漆)(参见 Ausubel 等编著，Protocols in MolecularBiology, Wiley and Sons, 1994, 6.0.3-6.4.10)，或在会导致编码下文所述的 PRRS 病毒的序列的杂交的条件下杂交，则该第二多核苷酸分子的核苷酸序列与SEQ ID N0:1同源。杂交条件的修改可以根据经验确定，或基于探针的长度和它的鸟苷/胞苷(GC)碱基配对的百分比来准确计算。杂交条件可以如Sambrook等编著，Molecular Cloning:ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, NewYork(1989), 9.47-9.51 所述计算。
[0156]在另一个实施方式中，如果第二核苷酸序列与SEQ ID NO:1的互补物在本领域已知的高度严格条件下杂交(例如，在65°C的0.5MNaHP04、7%SDS、lmM EDTA中杂交以过滤结合的 DNA,和在 68°C 的 0.1 X SSC/0.1%SDS 中洗漆)(Ausebel 等，Current Protocols inMolecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York, 1989),则该第二核苷酸序列与SEQ ID NO:1 (或本发明的任何其他序列)同源。
[0157]此外应该理解，本发明的分离的多核苷酸分子和分离的RNA分子既包括合成的分子，也包括通过重组技术(例如，通过体外克隆和转录)而获得的分子。
[0158]可以使用本领域普通技术人员已知的重组技术(包括如本领域所已知地通过定点诱变或通过例如通过与化学诱变剂接触或放射接触来随机诱变)来使多核苷酸分子遗传突变。突变可以通过本领域已知的标准方法来进行，例如，如(例如,Meulenberg等,Adv.Exp.Med.Biol., 1998, 440:199-206)所述对感染性复本的定点诱变(参见例如Sambrook等(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 2 版,Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)
[0159]因此，本发明还提供了制备经遗传修饰的北美PRRS病毒的方法，该方法包括如上所述使对编码PRRS病毒的感染性RNA分子进行编码的DNA序列进行突变，和使用合适的表达体系表达经遗传修饰的PRRS病毒。可以使用本领域公知的合适的表达体系来从分离的多核苷酸分子表达经遗传修饰的PRRS病毒，在本申请中对其实例进行了描述。例如，分离的多核苷酸分子可以处于能够在合适宿主细胞中体外表达所编码的病毒的质粒的形式，如下文所进一步详述。
[0160]北美PRRSV N蛋白序列是高度保守的，且报道的序列彼此具有约93%至100%的同一性。北美和欧洲PRRSV N蛋白具有约57%至59%同一性，并且共享公共的结构基序。通常，当比较编码PRRS的序列和分离物时(对于特定的核苷酸或所编码的氨基酸可能编号不同)，通过鉴定所关注的PRRS毒株中的保守的特征性氨基酸并将其与参照毒株比对易于实现对正确区域的鉴定。
[0161]重组DNA技术包括针对在DNA水平修饰核酸的极为不同和强力的分子生物学技术，并使得在分子水平分析和修饰基因组成为可能。在这方面，如PRRS病毒等病毒由于其基因组的适中的尺寸而特别适于此类操作。然而，重组DNA技术尚不能直接应用于非逆转录病毒RNA病毒，因为这些病毒在其复制中不包括DNA中间体步骤。对于这些病毒，必须在可以对其基因组应用重组DNA技术前开发出感染性cDNA克隆体，以便产生经修饰的病毒。感染性克隆体可以通过构建所研究病毒的全长(基因组长度)cDNA (在此以RNA的DNA复本的广义使用，而不是以mRNA的DNA复本的严格意义使用)而衍生出，其后在用该全长cDNA转染的细胞中体内合成感染性转录本，不过转录本也可通过全长cDNA在具有原核启动子的质粒中在转录混合物的存在下体外转录而获得，或者使用包含完全病毒基因组的经连接的部分长度的cDNA片段而在体外获得。在所有情形中，转录的RNA携带着已被引入cDNA中的所有修饰，并且可以用来进一步使如此修饰的病毒传代。
[0162]欧洲PRRS病毒分离株或LeIystad病毒的感染性克隆体的制备如美国专利第6，268，199号所述，在此通过援引并入其全部内容。称为P129的北美PRRS病毒分离株(Lee等，2005 ；Yoo等，2004)的感染性cDNA克隆体的制备如美国专利第6，500, 662号所述，在此通过援引并入其全部内容。P129cDNA的序列公开在Genbank登录号AF494042和美国专利第6，500，662号中。本发明人的下述工作利用了此类感染性克隆体，在质粒的背景下，这些感染性克隆体由CMV立即早期启动子表达且被称为pCMV-S-P129，并且也公开于美国专利第6，500, 662号中。如美国专利第6，500, 662号中所述，存在适用于此处的其它质粒和
启动子。
[0163]如果知道所关注的任何开放阅读框的完整序列和所关注的氨基酸残基的位置，本领域普通技术人员仅需要翻阅密码子表来设计在所需的特定位置的变化。
[0164]密码子构成mRNA的核苷酸及其对应的cDNA分子中的三联体序列。密码子的特征在于:当存在于mRNA分子中时，尿嘧啶⑶碱基；当存在于DNA中时，胸腺嘧啶⑴碱基。多核苷酸中用于相同的氨基酸残基的密码子的简单变化不会改变所编码的多肽的序列或结构。显然，当语句声明特定的3核苷酸序列“编码”任何特定的氨基酸时，本领域普通技术人员将认为上述表提供了鉴定存疑的特定核苷酸的方法。举例而言，如果特定的3核苷酸序列编码赖氨酸，上表公开了两种可能的三联体序列是AAA和AAG。甘氨酸由GGA、GGC、GGT(RNA中为GGU)和GGG编码。为了在编码的蛋白中将赖氨酸变为甘氨酸残基，可以在编码核酸中将AAA或AAG三联体用GGA和GGC、GGT或GGG的任意替代。
[0165]如前所述，本发明针对提供PRRS的疫苗株，其中在所有应答中，由干扰素途径介导的对该病毒的宿主应答没有被下调。如下文所详细描述，存在在这方面有效的对病毒基因组的许多修饰，特别是如本文所公开的见于ORFla的那些修饰以及它们的组合。应该注意，也如本文所公开，相似的修饰点可见于PRRS基因组的其他开放阅读框中(参见表9)。
[0166]值得注意的是，某些对PRRS多核苷酸进行修饰以使PRRS病毒减毒的其它在先方法已经取得了成功，可能提供对疫苗应用的适用性，但所产生的减毒的确切原因尚未知晓。例如，已经公开通过使病毒`的核壳体或N蛋白(由0RF7编码)的NLS-2区、NoLS区或NES区突变或者缺失以便在开放阅读框7(0RF7)中包括有缺失，可使毒性PRRS病毒减毒。在另一方面，0RF7缺失处在编码核壳蛋白的核定位信号(NLS)的序列内。编码NLS的序列内的0RF7缺失可以包括在43-48位的一个或多个氨基酸的缺失，或在43位和/或44位的氨基酸的缺失。参见例如美国专利第7，544，362号，此处通过援引并入其全部公开内容。PRRSV的由0RF7编码的核壳体蛋白(N)是被磷酰化的小碱性蛋白(Wootton，Rowland和Yoo, 2002)并形成同源二聚体(Wootton和Yoo, 2003)。晶体结构已在近期确定(Doan和Dokland, 2003) 0 N蛋白在受感染细胞中似乎具有多重功能。除了形成其中包装了基因组RNA(该过程在细胞质中进行)的球形核壳结构之外，N蛋白的一部分被转运至核内并具体被转运至受感染细胞的核仁内。N蛋白的氨基酸序列含有两个核定位信号(NLS)、一个核仁定位信号(NoLS)和一个核输出信号(NES)，其分别促进向核和核仁内的转运以及从核的输出(Rowland 等，1999 ；Rowland 等，2003 ；Rowland 和 Yoo, 2003)。当在核仁中时，N 蛋白与小分子RNA相关蛋白(纤维蛋白)相互作用，并可以调节受感染细胞中的rRNA加工和核糖体生物发生，以利于病毒复制(Yoo等，2003)。这类病毒突变对于设计新型PRRS疫苗很有价值，不管是其单独本身或与其它减毒性突变的组合。在已被减毒的PRRS病毒的另一个实例中，采用了对ORFla的修饰。采用了对ORFla的非结构性蛋白2编码区中的661至752位氨基酸之间的抗原表位进行编码的DNA序列的缺失，参见美国专利第7，618，797号，此处通过援引并入其全部内容。[0167]对PRRS病毒的免疫生物学研究表明，PRRS病毒与TOC的相互作用值得检视。该细胞类型代表着人、小鼠、大鼠、猪和猴的外周血单个核细胞的0.2%至0.8%。尽管其罕有，该细胞是天然免疫系统的重要组成部分，并且能在病毒刺激后分泌丰富量的IFN-α。PDC通过IFN-α的分泌而在调节抗病毒的天然和适应性免疫中起主要作用，因为其促进天然杀伤细胞、B细胞和T细胞的功能。此外，由PDC所分泌的IFN- α促进猪单核细胞源树突细胞(MoDC)的成熟，从而导致MoDC呈递抗原和活化T细胞的能力提高。在病毒感染的较晚期，PDC分化为一类独特的成熟树突细胞，其直接调节T细胞的功能并引导T细胞分化为能够分泌IFN-Y的细胞，该细胞是针对包括PRRS病毒在内的病毒的抗病毒免疫的主要介导物。并不令人惊讶的是，存在已知会抑制PDC分泌IFN-α的能力的人病毒(诸如呼吸道合胞病毒和麻疫病毒)ο据信这种抑制效应在体液免疫应答的主导和作为受这些病毒感染的结果所观察到的相关免疫病理学中起作用，以及对宿主对于继生性细菌和病毒感染的易感性的增加起作用。
[0168]相比之下，野生型PRRSV分离株以及两种Ingelvac PRRS疫苗株(见下文实施例5及后文)抑制了纯化的猪PDC群体产生IFN-α的能力，同时新型P129-PK-FL和P129-PK-d43/44病毒储液(见下文)展示出对这种PDC功能的最小抑制效应甚至零抑制效应。这些观察的重要性部分地在于IFN-α在调节对于病毒的适应性免疫应答的发展中的重要性。因此，极为可能的是，源自最小IFN-a抑制性病毒的减毒病毒疫苗会引发强的抗病毒保护免疫应答。此前已证明，IFN-a对于Ingelvac PRRS MLV疫苗的佐剂效应诱导了病毒特异性的T细胞介导的IFN- Y应答，且由该疫苗所引发的病毒特异性的T细胞介导的IFN-Y应答的强度与在现场和实验室条件下针对病毒的保护性免疫具有正相关性。因此，虽然不受理论限制，可以合理地预期，由非IFN-α抑制性PRRSV所引发的细胞介导的免疫应答和保护性免疫的水平将显著地大于展示出野生型(IFN-a抑制性)表型的PRRSV分离株的细胞介导的免疫应答和保护性免疫水平。
[0169]参考本发明可以注 意到，P129-PK-FL病毒以及源自pCMV_S-P129_PK感染性cDNA克隆体的5缺失突变体丧失了抑制IFN-α产生的能力。因此，这种不寻常的表型不能仅仅归因于所述缺失，而必须至少部分地归因于在感染性克隆体的构建过程中逐渐固定下来的遗传改变。有意思的是，在PK-9细胞上连续传代63次的未经克隆的P129病毒保留了抑制IFN诱导的能力(表1)。对于在所有的源自感染性克隆体的病毒中可见的普通IFN表型的最可能的解释是，在感染性克隆体的产生过程中引入了一种或多种突变。这些突变可能在用来构建所述感染性克隆体的病毒RNA中已经存在(可能以低水平存在)。最终，所述突变可能在原始(第O代)病毒中已经存在，或者它们可能在使病毒在适应于在PK-9细胞上生长的16次传代的过程中产生并富集。可以排除所述克隆是PCR引起的误差或者克隆人工产物的结果的可能性。无论如何，造成IFN-a抑制功能的丧失的突变在感染性克隆体构建期间被逐渐“固定”，且可预期其将存在于从这种特定感染性克隆体衍生出的所有病毒中。
[0170]考虑到已知PRRSV由于病毒RNA依赖性RNA聚合酶的误差而易于产生随机的遗传多样性，存在造成改变的IFN-a抑制表型的突变预先存在于用来构建cDNA克隆体的病毒RNA中的可能性。病毒准种(quas1-species)由在体内病毒复制期间天然出现的紧密相关的遗传变体的异源性混合物构成。更为相关的是，在源自感染性cDNA克隆体的PRRSV的多次体外传代之后，观察到病毒准种。这值得注意，因为在此前进行的研究中的病毒基因组的起始群体由遗传同源性群体组成，而在细胞培养物中的传代过程中快速产生了序列多样性。在目前的研究中，由于在导致感染性克隆体的构建的16次PK-9传代之前，原始P129病毒尚未被克隆(生物学或分子克隆)，因此基因组异源性的水平本应更高。因此，似乎可行的是，从准种中机会性选择出可造成IFN- α抑制功能的丧失的PRRSV RNA变体，然后并入pCMV-S-P129-PK17-FL感染性cDNA克隆体中。考虑到所有的衍生性病毒都应该共享这种独特的生物学表型(该表型可能会证明对于开发有效的下一代PRRS疫苗很重要)，这些突变并入到感染性克隆体中可能会被认为具有偶然性。[0171]像PRRS病毒的其它毒株一样，野生型PRRS病毒毒株P129展现出对外周血单个核细胞(PBMC)和浆细胞样树突细胞(roc)产生干扰素(IFN)-α的能力的强抑制效应。另一方面，源自Ρ129的感染性cDNA克隆体(pCMV-S-P129-PK17-FL)的病毒展示出IFN-α抑制表型的显著减少。这种感染性克隆体从此前在表达⑶163的猪肾细胞系PK-9上在16次连续传代的过程中适应生长的病毒构建(参见美国专利第7，754，464号，通过援引并入其全部内容)。P129-PK-FL和P129-PK-d43/44的IFN-a抑制性表型的范围从低至可忽略，并且与两种Ingelvac PRRS修饰的活病毒疫苗株(两者都具有高度抑制性)所表现出的表型具有显著对比差异。这些结果表明，P129-PK-FL和P129-PK-d43/44病毒在生物学上不同于亲本低传代P129分离株、其它野生型PRRS病毒和所述两种Ingelvac PRRS病毒。对IFN- α抑制表型的减少的潜在后果和该表型变化的可能原因进行了讨论。
[0172]本发明的氨基酸修饰
[0173]根据本发明的实践，可以当场鉴定出新型PRRS分离株(不论是北美基因型还是中国基因型)，其在由ORFl编码的蛋白中的特定位置含有特定的氨基酸，并且对这些病毒赋予所需的表型。如上所述，作为替代，可以采用标准遗传程序来修饰所编码的ORFl蛋白的基因序列(并由此修饰氨基酸序列)，也产生了经修饰的北美和中国PRRS病毒，并且感染性克隆体和来自其的疫苗均提供所述表型。在优选实例中，所述表型包括但不限于，与野生型PRRS病毒相比降低的干扰素α抑制效应，和可选的在宿主动物(猪)中繁殖或保持而同时引发强健的免疫应答但几乎没有可检测到的病理状况的能力。
[0174]因此，在本发明的实践中，可以充当可用的起始点的北美PRRS毒株或分离株包括例如美国专利第6，500, 662号、第7,618, 797号、第7，691，389号、第7，132，106号、第6，773，908 号、第 7，264，957 号、第 5，695，766 号、第 5，476，778 号、第 5，846，805 号、第6，042，830号、第6，982，160 ;6，241，990号和第6，110，468号中所述的那些。就可以充当可用的起始点的中国PRRS毒株和分离株而言，参见例如关于TJM-92病毒的来自中国申请CN201633909 的已公布中国申请 CN200910091233.6。
[0175]结合下文的讨论，对于最常见的由DNA编码的氨基酸使用了国际公认的单字母和三字母命名:丙氨酸(Ala, A);精氨酸(Arg, R);天冬酰胺(Asn, N);天冬氨酸(Asp, D);半胱氨酸(Cys, C);谷氨酸Glu，E);谷氨酰胺(Gin, Q);甘氨酸(Gly, G);组氨酸(His1H);异亮氨酸(lie, I);亮氨酸(Leu，L);赖氨酸(Lys, K);甲硫氨酸(Met, M);苯丙氨酸(Phe, F);脯氨酸(Pro, P);丝氨酸(ser, S);苏氨酸(Thr, T);色氨酸(Trp, W);酪氨酸(Tyr, Y)和缬氨酸(Val，V)。
[0176]表9和10鉴定了所观察到的造成北美(和中国)PRRS的毒性减低的氨基酸变化，其与干扰素α活性的抑制减低相关，由此允许对于疫苗的更安全和强健的免疫应答。表鉴定了有关的ORFla内的高度优选的氨基酸修饰，并显示出这些突变如何随着从其它P129培养物的传代而出现(应该注意，对该过程的检视也有助于必要时用以构建(重建)具有本发明的任何氨基酸变化的编码DNA的诱变策略)。就此而言，最优选的ORFla的氨基酸改进(由P129第52代证实)包括:182位的天冬酰胺、189位的天冬酰胺、273位的酪氨酸、302位的组氨酸、665位的苏氨酸、943位的半胱氨酸、1429位的苏氨酸、1505位的丙氨酸、2410位的天冬酰胺，这也潜在地增加了许多糖基化机会并且可以进一步改变蛋白功能。
[0177]因此，本发明提供了分离的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS)，其中由ORFla编码的该病毒的蛋白选自含有以下任一项的那些氨基酸序列:
[0178]氨基酸序列AMAPYD (SEQ ID NO:9)内的氨基酸N ；
[0179]氨基酸序列IG_AVM(SEQ ID NO: 12)内的氨基酸N;
[0180]氨基酸序列TVP2GNC(SEQ ID NO: 15)内的氨基酸D ;
[0181]氨基酸序列CffffILFD (SEQ ID NO: 18)内的氨基酸Y;
[0182]氨基酸序列HGVHGKY(SEQ ID NO: 21)内的氨基酸H ；
[0183]氨基酸序列AAKYDQY (SEQ ID NO: 24)内的氨基酸V ；
[0184]氨基酸序列PSAIDTS (SEQ ID NO: 27)内的氨基酸T ；
[0185]氨基酸序列LNSLLSK(SEQ ID NO:30)内的氨基酸L ;
[0186]氨基酸序列APM￡QDE (SEQ ID NO: 33)内的氨基酸C ；
`[0187]氨基酸序列CAPIGMD (SEQ ID NO: 36)内的氨基酸T ；
[0188]氨基酸序列PKVAKVS (SEQ ID NO: 39)内的氨基酸A ；
[0189]氨基酸序列AGEIVGV (SEQ ID NO: 42)内的氨基酸I;
[0190]氨基酸序列ADFNPEK (SEQ ID NO: 45)内的氨基酸N;和
[0191]氨基酸序列QTPILGR(SEQ ID NO:48)内的氨基酸I。
[0192]更具体地，本发明提供了分离的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS)，其中该病毒的由ORFla编码的蛋白选自包含以下任一项的那些氨基酸序列:
[0193]氨基酸序列AP (见SEQ ID NO: 9)内的氨基酸N;
[0194]氨基酸序列HM(见SEQ ID NO: 12)内的氨基酸N ；
[0195]氨基酸序列PQG(见SEQ ID NO: 15)内的氨基酸D ；
[0196]氨基酸序列WIL(见SEQ ID NO: 18)内的氨基酸Y ；
[0197]氨基酸序列VHG (见SEQ ID N0:21)内的氨基酸H;
[0198]氨基酸序列KYD (SEQ ID NO: 24)内的氨基酸V ；
[0199]氨基酸序列AID (见SEQ ID NO: 27)内的氨基酸T ；
[0200]氨基酸序列SLL(见SEQ ID NO:30)内的氨基酸L ；
[0201 ] 氨基酸序列M￡Q (见SEQ ID NO: 33)内的氨基酸C ；
[0202]氨基酸序列PIG(见SEQ ID NO:36)内的氨基酸T ；
[0203]氨基酸序列VAK(见SEQ ID NO: 39)内的氨基酸A ；
[0204]氨基酸序列EIV(见SEQ ID NO:42)内的氨基酸I ;
[0205]氨基酸序列FNP (见SEQ ID NO:45)内的氨基酸N ;和
[0206]氨基酸序列PIL (见SEQ ID NO: 48)内的氨基酸I。
[0207]如上所述，存在许多已知的北美和中国PRRS的毒株和分离株，而新型毒株持续进化或被分离出。虽然在所有这些毒株间都存在高水平的氨基酸序列同源性，但本领域技术人员很容易认识到的确存在某些变异，而且确实可以利用这些差异和相似性来进一步改良所有疫苗株的表型性质。
[0208]首先，就如上文(第17-18页)所直接指定的由SEQ ID NO限定的所有氨基酸基序而言，下划线的优选的氨基酸(如P129第52代所提供)通常即使相邻氨基酸已经从所指定的SEQ ID NO序列改变时也保持完全地有利。因此，就作为具体的代表例的AMAPYD (SEQID NO:9)而言，即使在其它此类毒株中已经因进化而发生了额外的改变并导致取代和/或缺失或添加，通常也可以检查来自任何北美或中国PRRS的对应的由ORFl所表达的蛋白序列，以找到对应的氨基酸基序。本领域技术人员可以理解的是，由P129第52代所证实的优选氨基酸变化应该因此也保持可操作性，即便是在整个氨基酸序列中的其它变化与第52代的指定氨基酸直接5’或3’相连。如果对比的氨基酸变化被认为是保守变化，则尤其是如此。因此，就AMAPYD (SEQ ID NO: 9)和后续其ANV而言，可以易于鉴定在另一 PRRS毒株的对比基序中，是否其中的缬氨酸被异亮氨酸或亮氨酸或任何其他残基所替代，或者是否某残基仅仅是缺失或者额外的残基被添加。现有许多计算机程序来鉴定比对并由此确定多肽序列基序是否对应，例如所谓的Blosum表(基于给定的百分比同一性水平)，参见
S.Henikoff 等,“Amino Acid Substitution matrices from protein blocks”, Proc NatlAcad Sci, USA, 89(22)，第 10915-10919 页，1992 年 11 月 15 日，也参见 A.L.Lehninger 等，Principles of Biochemistry, 2005, MacMillan and Company,第 4 版。保守性氨基酸变化也可基于共5组的分类而识别:巯基(Cys);芳香族(Phe、Tyr和Trp);碱性(Lys、Arg、His);脂肪族(Val, lieu, Leu, Met)和亲水性(Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gin、Asn、Ser 和Thr)。因此，在本发明的实践范围内，即使与指定位置相邻的其它氨基酸中的一个或多个被添加、缺失或取代，也可以对任何北美或中国PRRS编码核苷酸序列进行修饰以在合适和相应的位置引入对于P129第52代所指定的任何氨基酸变化。
[0209]另外，基于类似的原理，本领域技术人员应该认识到，一旦根据本发明的实践从对ORFla所鉴定出的特定的第52代的变化鉴定出优选的氨基酸，则也可以对任何此类第52代氨基酸使用保守替代，不论是在P129变体中或是有关任何其它北美或中国毒株，且所需的第52代表型基本得到保留。因此，作为代表例:就SU^SEQ ID NO:30内)而言，所指定的亮氨酸残基可以进一步被异亮氨酸、缬氨酸或甲硫氨酸替代j^FMP(SEQ ID NO:45内)而言，所指定的天冬酰胺可以由Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gin、Ser和Thr中的任一者替代；而就 VAK(见 SEQ ID NO: 39)而言，所指定的丙氨酸可以由 Asn、Pro、Gly、Glu、Asp、Gin、Ser和Thr中的任一者替代；等等，但易于认识到的是，本发明并未要求任何此类替代氨基酸在所指定的位置与原始鉴定出的独特的第52代氨基酸变化起到相同作用。当然，在本发明中也对根据任何其它已认可的模型的标准保守氨基酸变化的应用进行了实施。例如，并且在所有情形中反之亦然，Asp变为Glu且反之亦然，Asn变为Gin, Arg变为Lys, Ser变为Cys或Thr, Phe变为Tyr, Val变为Leu或lieu, Ala变为Gly等等。
[0210]此外，在本发明的实践范围内，虽然可以将任何的各个第52代氨基酸变化(如上文对ORFla所鉴定)有用地置于任何北美或中国PRRS中并具有所需的表型效应，还优选的是在最终构建体中包括进尽可能多的表9或表10的氨基酸选择，如通过由编码多核苷酸序列的适当修饰所提供的那样。因此，本发明的实践包括提供中国或北美PRRS病毒(和对应的编码多核苷酸)，该病毒提供均处于最终病毒序列中的2、3、4、5、6、7、8、9种乃至任何的17种所鉴定的第52代ORFla变化(表9)，以便将所有的总的所鉴定出的第52代氨基酸变化的任何特定的双重、三重甚至更高重的组合包括在内。当然，可以通过定点诱变、PCR和本领域公知的其它技术来将这些氨基酸变化引入所述病毒的对应的编码核苷酸序列中。
[0211]为展示特定的经遗传修饰的毒株被减毒，可以采用如下所述的实验。
[0212]在每次试验中每组包括至少10只初产母猪，其来自无PRRSV农场。动物经测试不带PRRS病毒特异性血清抗体，并且对PRRSV呈阴性。包括在试验中的所有动物都来自相同的来源和品种。动物在各组中的分配是随机的。[0213]通过在每个鼻孔鼻内施用Iml带IO5TCID5tl的PRRSV来在怀孕第90天进行攻击。对于每次测试设定有至少3组:一个P129攻击组；一个用于用可能已减毒的病毒攻击的测试组；和一个严格对照组。
[0214]当在整个研究时长内，严格对照组保持PRRSV阴性，并且与严格对照组相比，在P129攻击组中有至少25%不健康仔猪出生，则认为研究是有效的。
[0215]减毒(换言之，更低毒性)被定义为决定繁殖表现或其它症状的一种或多种参数的统计性显著的变化:
[0216]与受未经修饰的亲本毒株感染的组相比，在测试组中的至少下列参数中的一种显著减小，则表明减毒:
[0217]a)死胎的出现频率
[0218]b)在怀孕第112天当天或以前流产
[0219]c)木乃伊仔猪的数目
[0220]d)较不活泼和孱弱的仔猪数目
[0221]e)断奶前死亡
[0222]此外，优选的是，与受未经修饰的亲本毒株感染的组相比，在测试组中的至少下列参数中的一种显著增加:
[0223]f)对于每只母猪，断奶的仔猪数目
[0224]g)每只母猪产出的健康存活的仔猪的数目
[0225]替代性地，可以检验呼吸症状和PRRSV感染的其它症状以确立减毒。
[0226]减毒毒株对于疫苗的配制很有价值。本发明的疫苗如果对猪针对PRRS病毒感染进行保护，则其是有效的。如果在对一只或多只未受影响的猪施用疫苗后，采用生物纯的病毒分离株(例如，VR2385、VR2386、P129等)的随后攻击导致任何总变化或组织病理学变化(例如，肺中的损伤)和/或疾病症状的严重性减轻(与由所述分离株在未受保护的相似的猪中通常所导致的那些变化或症状相比(即，相对于适当的对照))，则该疫苗对猪针对PRRS病毒的感染提供了保护。更具体地，通过将本发明的疫苗施用于需要其的一只或多只合适的猪，然后在适当的时长(例如4周)后，用大的生物纯PRRSV分离株的样品(10(3_7)TCID⑸))攻击，可显示该疫苗有效。然后在约一周后从经攻击的猪抽取血样，然后尝试从血样分离出病毒。可分离出大量的病毒将表明疫苗可能无效，而分离出减少量的病毒(或无病毒)表明疫苗可能有效。
[0227]因此，可以对本发明的疫苗的有效性进行定量评估(即，与合适的对照组相比，固结肺组织(consolidated lung tissue)百分比的减小)或定性评估(例如,从血液分离出PRRSV、在肺中检测到PRRSV抗原、对扁桃体或淋巴节组织样品的免疫测试)。可以对猪繁殖与呼吸综合征的症状进行定量评估(例如，温度/发烧)或半定量评估(例如，一种或多种症状的存在或缺失，或者一种或多种症状的严重性的降低，诸如紫绀、肺炎、肺损伤等)。
[0228]未受影响的猪是未接触过猪繁殖与呼吸综合征病感染原的猪，或者已接触过猪繁殖与呼吸综合征病感染原但未显示出该疾病的症状的猪。受影响的猪是显示出PRRS症状或可从其分离出PRRSV的猪。
[0229]可以遵循公认常规来配制本发明的疫苗以包括可接受的动物(包括人(适用时))用载剂，诸如标准缓冲剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂和/或增溶剂，并且可以将疫苗配制来有助于持续释放。稀释剂包括水、盐水、右旋糖、乙醇和甘油等。等渗用添加剂包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇和乳糖等。稳定剂包括白蛋白等。其它合适的疫苗承载剂和添加剂(包括在配制修饰的活疫苗中特别有用的那些)是已知的或对于本领域技术人员显而易见的。参见例如，Remington’s Pharmaceutical Science,第 18 版，1990，Mack Publishing,本文通过援引并入其内容。
[0230]本发明的疫苗还可以包含一种或多种其它免疫调节性组分，诸如佐剂或细胞因子等。可用在本发明的疫苗中的佐剂的非限制性实例包括RIBI佐剂体系(RibiInc.，Hamilton, Mont.)、明帆、矿物凝胶(如氢氧化招凝胶)、水包油乳化液、油包水乳化液(例如，Freund完全和不完全佐剂)、嵌段共聚物CytRx, Atlanta, Ga.)、QS-21 (CambridgeBiotech Inc., Cambridge Mass.)>SAF-M(Chiron, Emeryville Calif.)>AMPHIGEN.RTM.佐剂、皂苷、Quil A或其它皂苷级分、单磷酰脂A以及阿夫立定(Avridine)脂-胺佐剂。可用在本发明的疫苗中的水包油乳化液的非限制性实例包括修饰的SEAM62和SEAM1/2制剂。修饰的 SEAM62 是含有 5% (v/v)角鲨烯(Sigma)、1% (v/v) SPAN.RTM.85 洗涤剂(ICISurfactants)、0.7%(v/v) TWEEN.RTM.80 洗漆剂(ICI Surfactants) >2.5%(v/v)乙醇、200pg/ml Quil A、100[mgr]g/ml胆固醇和0.5%(v/v)卵磷脂的水包油乳化液。修饰的SEAM1/2 是含有 5%(v/v)角鲨烯、1% (v/v) SPAN.RTM.85 洗涤剂、0.7%(v/v) Tween80 洗涤剂、
2.5%(v/v)乙醇、100.mu.g/ml Quil A和50.mu.g/ml胆固醇的水包油乳化液。其它可以包含在疫苗中的免疫调节剂包括例如一种或多种白细胞借宿、干扰素或其它已知的细胞因子。
[0231]可以可选地将本发明的疫苗配制用于持续释放本发明的病毒、感染性RNA分子、质粒或病毒载体。此类持续释放制剂的实例包括病毒、感染性RNA分子、质粒或病毒载体与生物相容性聚合物复合物(例如，聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物、甲基纤维素、透明质酸和胶原蛋白等)的组合。药物输送承载剂中的可降解聚合物的结构、选择和应用已经在一些出版物中进行了综述，包括A.Domb 等，1992，Polymers for Advanced Techno1gies3:279-292,本文通过援弓丨并入其内容。其它的关于药物制剂中的聚合物的选择和使用的指导可见于本领域已知的教科书中，例如 M.Chasin 和 R.Langer 编著，1990, "Biodegradable Polymersas Drug Delivery Systems^in:Drugs and the Pharmaceutical Sciences,第 45 卷，M.Dekker, N.Y.，在此也通过援引并入其内容。作为替代性选择，或者除此以外，可以将病毒、质粒或病毒载体微胶囊化以改善施用和效力。抗原微胶囊化方法是本领域内公知的，并且包括例如美国专利第3，137，631号、美国专利第3，959，457号、美国专利第4，205，060号、美国专利第4，606，940号、美国专利第4，744，933号、美国专利第5，132，117号和国际专利申请W095/28227中所述的技术，本文通过援引并入它们的内容。
[0232]脂质体也可用于提供病毒、质粒或病毒载体的持续释放。关于如何制备和利用脂质体制剂的详细内容可见于美国专利第4，016，100号、美国专利第4，452，747号、美国专利第4，921，706号、美国专利第4，927，637号、美国专利第4，944，948号、美国专利第5，008, 050号和美国专利第5，009, 956号等等，本文通过援引并入其全部内容。
[0233]任何上述疫苗的有效量可以通过常规方式来确定，从低剂量的病毒、病毒蛋白质粒或病毒载体开始，然后逐渐增加剂量同时监测效果。有效量可以在单次施用疫苗后获得，也可在多次施用疫苗后获得。在确定对于每只动物的最佳剂量时，可以考虑已知的因素。这些因素包括动物的物种、大小、年龄和一般状况以及动物中其它药物的存在等。优选地，在考虑了来自其它动物研究的结果后选择实际剂量(参见例如，下文的实施例2和3)。
[0234]一种检测是否已达到适当的免疫应答的方法是确定疫苗接种后动物中的血清转化和抗体滴度。优选地，疫苗接种的时机和加强接种的次数(如果有)将由医师或兽医师基于对所有相关因素(某些在上文已有描述)的分析来决定。
[0235]本发明的病毒、蛋白、感染性DNA分子、质粒或病毒载体的有效量可以使用已知技术并考虑进本领域普通技术人员能够确定的因素(例如，待接种的动物的体重)而确定。本发明的疫苗中的本发明的病毒的剂量的范围优选为约IO1Pfu至约109pfu(空斑形成单位)，更优选为约102pfu至约108pfu,且最优选为约103pfu至约107pfu。本发明的疫苗中的本发明的质粒的剂量的范围优选为约0.1mg至约IOOmg,更优选为约Img至约IOmg,再更优选为约IOmg至约lmg。本发明的疫苗中的本发明的感染性DNA分子的剂量的范围优选为约
0.1mg至约IOOmg,更优选为 约Img至约IOmg,再更优选为约IOmg至约lmg。本发明的疫苗中的本发明的病毒载体的剂量的范围优选为约IO1Pfu至约109pfu，更优选为约IO2Pfu至约108pfu，且最优选为约IO3Pfu至约107pfu。合适的剂量尺寸范围为约0.5ml至约10ml，且更优选为约Iml至约5ml。
[0236]根据本发明的实践，合适的病毒蛋白或肽疫苗的剂量的范围通常为I毫克/剂至50毫克/剂，或为可以通过标准方法来确定的更高的量，而佐剂的量可通过公认方法对于每种上述物质来确定。在涉及猪疫苗的本发明的优选实例中，动物的最佳的年龄目标为约I至21天，这在断奶前也可以对应于其它安排的疫苗接种(如针对猪肺炎支原体或PCV)。另外，优选的用于育种母猪的疫苗接种计划将包括类似的剂量，并具有每年再次接种的计划。
[0237]任何上述疫苗的有效量可以通过常规方式来确定，从低剂量的病毒、质粒或病毒载体开始，然后逐渐增加剂量同时监测效果。有效量可以在单次施用疫苗后获得，也可在多次施用疫苗后获得。在确定对于每只动物的最佳剂量时，可以考虑已知的因素。这些因素包括动物的物种、大小、年龄和一般状况以及动物中其它药物的存在等。优选地，在考虑了来自其它动物研究的结果后选择实际剂量。
[0238]一种检测是否已达到适当的免疫应答的方法是确定疫苗接种后动物中的血清转化和抗体滴度。优选地，疫苗接种的时机和加强接种的次数(如果有)将由医师或兽医师基于对所有相关因素(某些在上文已有描述)的分析来决定。
[0239]本发明的病毒、蛋白、感染性RNA分子、质粒或病毒载体的有效量可以使用已知技术并考虑进本领域普通技术人员能够确定的因素(例如，待接种的动物的体重)而确定。举例而言，疫苗可以经口服、胃肠外、皮内、皮下、肌内、鼻内或静脉内输送。口服输送可以涵盖例如将组合物添加至动物的饲料或饮料中。与疫苗剂量有关的因素包括例如，猪的体重和年龄。
[0240]本发明还提供了制备包含本文所述的PRRS病毒、感染性RNA分子、质粒或病毒载体的方法，所述方法包括将有效量的本发明的PRRS病毒、感染性RNA分子、质粒或病毒载体中的一种与对于药物或兽医学应用可接受的载剂组合。
[0241]另外，本发明的活减毒疫苗可以如美国专利第6，500, 662号所述进行修饰以编码异源性抗原表位，该抗原表位通过利用已知重组技术被插入PRRS病毒基因组。也参见美国专利第7，132，106号，通过援引并入其全部内容。可用作本发明的异源性抗原表位的抗原表位包括来自除PRRS病毒以外的其他猪病原体的抗原表位，包括但不限于来自选自以下的猪病原体的抗原表位:猪细小病毒、猪圆环病毒、猪轮状病毒、猪流感、伪狂犬病病毒、传染性胃肠炎病毒、猪呼吸道冠状病毒、猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、脑心肌炎病毒、猪副粘病毒、扭矩特诺病毒、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumonia)、猪放线杆菌(Actinobacillus suis)、炭疽芽抱杆菌(Bacillus anthraci)、支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica)、溶血梭状芽抱杆菌(Clostridium haemolyticum)、产气荚膜梭状芽胞杆菌(Clostridium perfringens)、破伤风杆菌(Clostridium tetani)、大肠杆菌(Escherichia coli)、红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)、钩端螺旋体(Leptospira spp.)、肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae)、猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)、猪滑液支原体(Mycoplasmahyosynovia)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonellacholeraesuis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、似马链球菌(Streptococcusequismilis)、和猪链球菌(Streptococcus suis)。对来自上述猪病原体的抗原表位进行编码的核苷酸序列是本领域中已知的并且可以获自互联网上的公共基因数据库，如来自(美国)国家生物信息技术中心的Genbank。
[0242]本发明的额`外特征和变化形式从本申请的整体内容(包括【具体实施方式】)将对本领域技术人员变得显而易见，而所有这些特征都应作为本发明的一部分。类似地，本文所述的特征也可以与也应作为本发明的一部分的其它实施方式再组合，不论这种特征的组合是否在上文作为本发明的一部分或实施方式而具体提及过。此外，仅有那些在本文描述为对本发明关键的限定应该被认为是限定；本发明的缺乏在本文中未被描述为关键性的限定的变化也应该作为本发明的一部分。显而易见，本发明可以以除前述说明和实施例中所具体描述之外的其它方式进行实践。
[0243]根据本发明的教导，可以对本发明进行许多改良和变化，且这些改良和变化因此落在本发明的范围内。
[0244]以下实施例目的在于对本发明进行说明而非限制本发明。
[0245]实施例
[0246]实施例1.PRRSV分离株P129对PK-9细胞的适应和减毒
[0247]1995年，在印第安纳州普渡大学动物疾病诊断实验室(Animal DiseaseDiagnostic Laboratory, Purdue University, IN)从病猪中分离出毒性 PRRS 分离株 P129。将来自该猪的血清样品在高健康状态猪中传代一次，以扩增血清和肺匀浆储液。从该血清和肺匀浆中提取病毒RNA，并将其用来确定P129第O代病毒的完整基因组共有序列。用随机六聚体使RNA首次启动(primed)并将其用于合成cDNA。利用高保真(校正)PCR在3条重复片中扩增基因组。将来自3次不同PCR反应(每条基因组片段)的PCR产物进行T/A克隆并用于DNA测序，易产生全长基因组共有序列(见SEQ ID NO:1)。
[0248]将含有P129第O代的用于DNA测序的相同猪血清的等分试样用来感染原始的猪肺泡巨噬细胞(PAM)细胞。将来自PAM感染的下一代病毒(第I代)过滤通过0.1微米注射过滤器并用来感染PK-9细胞。
[0249]PK-9细胞是通过用编码猪⑶163基因的缺失形式和抗新霉素基因的质粒稳定转染PK0809猪肾细胞系而衍生出的转基因细胞系。PK-9细胞系的构建和表征的细节已在此前得到描述。
[0250]来自PAM细胞的第I代病毒在PK-9细胞上生长的适应很困难，并且需要用多个平行世系进行数次尝试。通过利用对病毒核壳体蛋白特异的FITC缀合单克隆抗体(RuralTechnologies Inc, Brookings, SC)对复制物板孔(duplicate well)的免疫突光分析来监测感染。较早代产生少数小的病灶，但并未产生足够的无细胞病毒颗粒以启动新鲜单层的感染。伴随这些传代，用Accutase(胰蛋白酶替代物)处理受感染的单层并在添加或不添加未受感染的PK-9细胞的情况下将细胞重新接种至具有新鲜培养基的多个板孔中。在数次这样的传代后，一些世系显示出荧光病灶的出现频率和尺寸的明显增加。这些中的一些已获得了利用无细胞病毒液进行传代的能力。到第17代时(在PAM细胞上I代，PK-9细胞上16代)，利用来自此前传代的无细胞液体的稀释液，可以可靠地维持一个世系，并在数日内导致整个单层的感染。病毒不会在任何传代水平导致PK-9细胞上的细胞病变效应。从病毒第17代时受感染的PK-9细胞提取RNA，并将其用于构建感染性cDNA克隆体。
[0251]实施例2.P129-PK第17代的感染性cDNA克隆体的构建
[0252]利用如前文所述的主链质粒构建了 P129-PK第17代病毒的感染性cDNA克隆体。在3个重叠片段(在重叠区中具有天然存`在的独特限制性核酸内切酶位点)中通过逆转录和PCR对病毒基因组进行扩增。将来自3次不同的PCR反应的产物克隆和测序，并进行比对以产生每个基因组片段的共有序列。如果给定片段的3个克隆产物都与对该片段的共有序列所预测的氨基酸序列不匹配，则通过亚克隆和/或定点诱变对克隆物中的一个进行修饰，直到其与共有序列的预测氨基酸序列匹配为止。利用标准克隆技术和限制性核酸内切酶位点将3个基因组片段和质粒主链连接。所产生的全长克隆体称为PCMV-S-P129-PK17-FL，其在被转染至PK-9细胞时具有感染性。该感染性cDNA克隆体的序列在SEQ ID N0:2中给出。基因组与构建其的第17代病毒基本相同，具有真实末端，且缺乏与第17代的共有序列相关的任何插入或缺失。在该感染性cDNA克隆体的病毒基因组中不存在任何工程化的限制位点或其它靶向变化。
[0253]P129第O代的完整基因组共有序列与感染性克隆体pCMV-S-P129-PK17_FL的基因组序列之间的核苷酸和氨基酸差异分别列于表6中。表6包括了通过基因组位置示出的所有核苷酸差异和所产生的氨基酸差异。这些突变的子集造成从IFN抑制性(第O代)到IFN非抑制性(源自第17代感染性cDNA克隆体的所有病毒)的表型变化。表7总结了通过PRRSV开放阅读框(ORF)或非结构性蛋白(nsp)示出的核苷酸、氨基酸和非保守性氨基酸差异。出于表7的目的，以下氨基酸组被认为是保守性的那些氨基酸组:[K，R]、[D，E]、[L, I, V, A]和[S，T]。[0254]实施例3.P129-PK第17代中的缺失突变体
[0255]在感染性cDNA克隆体pCMV-S-P129-PK17_FL中工程化引入在基因组的两个区域的缺失，以产生5种经遗传修饰的感染性克隆体。
[0256]进行修饰的一个基因组区域是位于核壳体蛋白(由PRRSV 0RF7编码)的第41_47位氨基酸处的核定位序列(NLS)。进行了两种类型的缺失。这些缺失此前已经在另一种PRRSV感染性克隆体的背景下进行过说明。41至49位氨基酸残基的野生型序列为PG…KN。在突变体“d33/44”(也称为“PG-KS ”)中，43和44位赖氨酸残基缺失，而49位天冬酰胺残基变为丝氨酸。在突变体“d33/44/46” (也称为“PG—S-KS”)，中，43、44和46位赖氨酸残基缺失，而49位天冬酰胺残基变为丝氨酸。引入了这些缺失的源自pCMV-S-P129-PK17-FL的感染性克隆体分别为 pCMV-S-P129-PK17-d43/44 和 pCMV-S-P129-PK17_d43/44/46。参见美国专利第7, 544，362号。
[0257]进行修饰的第二个基因组区域处于ORFla内的nsp2的高度可变区中。此前已在另一种PRRSV感染性克隆体的背景下对一种131个氨基酸(393个核苷酸)的缺失进行了说明。引入了这种缺失的源自PCMV-S-P129-PK17-FL的感染性克隆体是pCMV-S-P129-PK17-nsp20
[0258]在pCMV-S-P129-PK17-FL主链内也产生了将NLS和nsp2缺失组合的感染性克隆体，且这些克隆体称为 pCMV-S-P129-PK17-nsp2-d43/44 和 pCMV-S-P129-PK17-nsp2_d43/44/46。
[0259]实施例4.PK-9细胞上的病毒产生和生长
[0260]将实施例3所述的6种感染性克隆体转染至PK-9细胞内，以产生表1所示的6种病毒。通过使用Lipofectamine2000将环形质粒直接转染至PK-9细胞内尔从这些感染性克隆体产生病毒。在转染后，将所回收的病毒在PK-9细胞上再次连续传代，以便进一步增加滴度并减低毒性。制备了储液以作为疫苗候选物用于体外测试和体内评估。在源自未经修饰的PCMV-S-P129-PK17-FL感染性克隆体的P129-PK17-FL病毒的情形中，对病毒进行培养直至达到从猪开始的总共52次传代。在第24代(SEQ ID NO: 3)和第52代(SEQ ID NO:6)对该病毒的完整基因组进行了测序。
[0261]实施例5.源自P129-PK第17代感染性cDNA克隆体的病毒具有降低的抑制IFN-a诱导的能力
[0262]病毒和细胞。使MARC-145和ST细胞在补充有5%胎牛血清(FBS)和抗生素(50 μ g/ml庆大霉素、100Π青霉素和100 μ g/ml链霉素)的改良Eagle培养基(MEM)中生长。猪肺泡巨噬细胞ZMAC-1细胞在补充有10%FBS的RPM1-1640中生长。TGE病毒毒株Purdue通过在改良的Eagle培养基中以0.01的多重性(multiplicity)感染汇流的ST细胞单层来制备。在I小时后除去病毒接种物并将细胞在37°C的5%C02气氛中在补充有2.5%FBS的MEM中温育。在观察到80%的细胞病变效果后，通过冷冻并融化细胞单层来使病毒释放。将TGE病毒储液在4°C和3500rpm离心15分钟，并在使用前储存于_80°C。病毒储液(来自PK-9细胞)如下:P129-PK-FL和P129-PK-dnsp2-d43/44/46处于第8/25代(从感染性克隆体计8代，从猪计为 25 代)。其它四种病毒(P129-PK-d43/44、P129-PK-d43/44/46、P129-PK-dnsp2和P129-PK-dnsp2-d43/44)处于第21/38代。通过在ZMAC-1细胞上进行单次传代来制备各种PRRS病毒的工作储液，例外的是，商购疫苗Ingelvac PRRS MLV和Ingelvac PRRS ATP根据制造商说明进行重建并直接用于注射。
[0263]猪PBMC的分离。用Hank氏液稀释新鲜的肝素化静脉血，并通过密度离心经Ficoll-Hypaquel077 (Sigma)梯度来分离PBMC。在Hank氏液中洗漆两次后，将细胞在带有L-谷氨酰胺(Mediatech)的RPMI培养基中重悬，所述RPMI培养基补充有5%胎牛血清(Gibco)、100U/ml青霉素、0.lmg/ml链霉素、ImM丙酮酸钠、I X非必需氨基酸(Mediatech)、100U/ml庆大霉素和250mM2-巯基乙醇(Sigma)。
[0264]猪浆细胞样树突细胞的纯化。如前所述(Calzada-Nova，已提交)进行猪浆细胞样树突细胞的纯化，且纯化基于这些细胞的⑶4和⑶172特征表达(Summerfield等，2003)。简言之，将新鲜猪PBMC悬浮在具有0.5BSA的PBS中，并用最优量的mAb识别性猪⑶172 (74-22-15，VMRD)标记。在洗涤一次后，使细胞与缀合至PE的山羊抗小鼠二抗(Southern Biotech)温育，并在洗涤后与FITC标记的抗CD4 (74-12-4，VMRD)温育。将PDC在反射细胞分选仪(iCyt)上进行分选，将分选门槛设定在CD47CD172<^￥。在分选后，通过重新分析验证细胞的纯度。在所有情形中，纯度大于95%。
[0265]用于测定细胞因子分泌的测试。用不同的刺激物刺激PBMC或PDC16小时(37°C，5%C02)，或者进行空白刺激。在温育后，使用用商购单克隆抗体(抗猪IFN-α mAb:K9和F17)制备的夹心ELISA对重叠着受刺激的细胞的培养基测试IFN-α的存在。简言之，通过在4°C过夜温育将 Inimulon II 板(Dynatech Inc.)用抗猪 IFN-a mAb Fl7 (PBL Laboratories)涂布，其后用补充有5%胎牛血清的RPMI培养基封闭。I小时后，弃去培养基，并将50微升待测上清液一式两份添加至测试孔。I小时温育后，将测试孔洗涤4次，然后依次与生物素标记的抗猪IFN-a mAb K9 (PBL Laboratories)、HRP缀合的抗生物素链霉素(ZymedLaboratories)和TMB底物(KPL)温育。用ELISA读板器确定光密度。
[0266]源自P129-PK第17代感染性cDNA的病毒缺乏抑制IFN- α诱导的能力。利用猪肺泡巨噬细胞系ZMAC-1从一`组4种PRRS野生型病毒分离株(P3412、P129、IND5、NADC20)制备病毒工作储液。还从已通过在PK-9、FK D4或MARC-145细胞中反复传代而适应在细胞培养物中生长的前两种野生型病毒的衍生物制备了另外的储液。4种野生型分离株中的3种(P129、IND5、NADC20)在ZMAC-1细胞容易且有效地生长至约107TCID5(l/ml的滴度，而P3412野生型分离株仅达到约IO5TCID5cZml的分离株。值得注意的是，在ZMAC-1细胞系中制备的P129病毒储液达到了比在病毒已对其适应的PK-9或MARC-145细胞中所获得的滴度高10倍的滴度。对这些病毒刺激PBMC的IFN-α分泌的能力的检测揭示出，除了一个例外(分离株Ρ3412克隆体C)，这些细胞在响应于其与任何受测PRRS病毒储液的接触时分泌极少量的IFN-α (<50pg)，这相比由相同的细胞由于与猪冠状病毒、传染性胃肠炎病毒(TGEv)的接触而产生的大量IFN-a分泌(17，540pg)可忽略不计。
[0267]PRRSV不仅无法刺激猪PBMC的IFN- α生产，还积极地抑制其生产。PRRSV储液的抑制效应通过测定PBMC响应于在存在或不存在PRRSV时与TGEv的接触而分泌的IFN- α的量来确定。如表2中所示，受测的所有4种野生型PRRS病毒分离株以及适应于细胞培养物的衍生物都展示出对PBMC对TGEv的IFN-a应答的强抑制效应(>80%)。进行了对一组源自感染性cDNA克隆体(pCMV-S-P129-PK17-FL)的病毒储液(包括全长P129-PK-FL病毒和几种遗传工程化的缺失突变体)的分析。如表3所示，相比之亲本野生型分离株P129(第I代)的强抑制效应(95%) ,P129-PK-FL病毒和所有缺失突变体展示出显著降低的抑制PBMC中TGEv的IFN-α诱导的能力。为进一步评估这些病毒的IFN-α表型，后续实验侧重于进行P129-PK-FL和P129-PK-d43/44病毒、亲本P129野生型毒株和/或产自BoehringerIngelheim 的两种修饰的活 PRRSV 疫苗(Ingelvac PRRS MLV 和 Ingelvac PRRS ATP)之间的直接比较。也测试了另外一种低传代参照分离株NVSL-14。如表4所示，在4次独立实验中，P129-PK-FL和P129-PK-d43/44展示出比亲本P129病毒、两种Ingelvac减毒毒株或参照毒株明显更低的IFN- α抑制效应。在一个情形中，与P129-PK-FL或P129-PK_d43/44病毒的共转染导致了对TGEv的IFN-α应答的显著提升。
[0268]表2中所示结果表明了野生型PRRS病毒和适应在细胞培养物中生长的衍生物的干扰素α抑制效应。所指定的PRRS病毒储液在ZMAC-1细胞中生长，并使用ZMAC-1细胞确定这些新生成的储液的滴度。猪外周血单个核细胞与所指定的PRRS病毒储液在存在或不存在TGE病毒时接触18小时后，通过ELISA确定培养物上清液中存在的IFN-a的量。*仅对TGEv的应答。
[0269]表3中所示结果表明了野生型PRRS病毒P129及其适应于在表达⑶163的PK-9细胞上生长的遗传工程化衍生物的干扰素α抑制效应。猪外周血单个核细胞(PBMC)与所指定的PRRS病毒储液在存在或不存在TGE病毒时接触18小时后，通过ELISA确定培养物上清液中存在的IFN-a的量。NA=不适用；*仅对TGEv的应答。
[0270]表4显示了 P129-PK-FL和P129-PK_d43/44病毒的干扰素α抑制效应与野生型P129病毒和PRRS Ingelvac疫苗相比降低。猪外周血单个核细胞(PBMC)与所指定的PRRS病毒储液在存在或不存在TGE病毒时接触18小时后，通过ELISA确定培养物上清液中存在的IFN- α的量。NA=不适用；*仅对TGEv的应答。
[0271]PBMC响应于其与TGEV的接触而分泌的大量IFN-α主要源于占PBMC群的0.3%的细胞亚群。这种出现频率低但很重要的细胞亚群由浆细胞样树突细胞(roc)组成，后者由于特征性类浆细胞形态学而得名。 为了进一步检验P129-PK-FL和P129-PK-d43/44病毒的IFN-a表型，进行了与上述那些实验类似的一系列实验，不同之处在于采用从PBMC新鲜分离的纯度大于95%的H)C。如图1所示，该系列实验证实，P129-PK-FL和P129-PK_d43/44病毒导致可忽略不计的对TGEV所产生的IFN-a诱导的抑制。此外，在一个实验中观察到PDC响应于P129-PK-FL和P129-PK_d43/44PRRS病毒而对TGEV介导的IFN- α诱导的显著增强效应。相比之下，Ingelvac PRRS MLV病毒展示出对IFN-α应答的强抑制效应，如图1所示。
[0272]实验部分所述的结果揭示，P129-PK-FL和P129-PK_d43/44PRRS病毒以及PCMV-S-P129-PK17-FL感染性cDNA克隆体的其他衍生物具有极大降低的抑制TGEV在受感染的PBMC或TOC细胞中对IFN-α诱导的能力。这与用野生型(低传代)PRRS病毒和用两种商购的经修饰的活病毒疫苗(Ingelvac PRRS MLV和Ingelvac PRRS ATP)观察到的IFN阻抑效应有显著地差异。考虑到这些细胞在介导针对病毒感染的天然免疫中起到的主要作用，所观察到的P129-PK-FL和P129-PK-d43/44病毒对PDC的这种重要功能的最小抑制具有潜在的重要性。
[0273]应该注意，本发明提供了适应在重组表达⑶163受体的容许细胞上生长的临床有效性商业疫苗病毒，且此类病毒和疫苗不依赖于历史上的“类人猿细胞”培养技术也未在任何时刻用该技术开发。具体参见美国专利第7，754，464号。[0274]实施例6.疫苗候选物的安全性和效力
[0275]为了评估疫苗针对PRRS的安全性和效力，在幼猪呼吸疾病模型中对源自PCMV-S-P129-PK17-FL感染性cDNA克隆体的病毒中的三种P129-PK-FL (第7/24代)、P129-PK-d43/44(第 17/34 代)和 P129-PK_d43/44/46 (第 17/34 代)进行了评估。这些病毒的来源如图8所示，且实验设计(治疗组)列在表5中。将低传代毒性PRRSV分离株NADC20用于在7周龄时(疫苗接种后4周)进行异源性攻击。对照治疗组包括空白疫苗和商购 PRRS 疫苗 Ingelvac MLV。
[0276]未处理(NT)组如下:NT1猪是监测源猪的健康状态的前哨。将其分开圈养并在PRRSV攻击前进行尸检。NT2猪是分开圈养在两栏经接种的猪之间的围栏中的接触对照，对于T02至T05每个治疗组共两只。NT3猪是每栏一只与经接种的猪一起圈养的接触对照，每个治疗组共两只(T01至T05)。仅将NT3猪分配至TOl组。
[0277]在接种后测定经接种疫苗的动物的直肠温度并与TOl (空白疫苗)治疗组对比。结果如图1所示。没有疫苗引起发烧。在整个接种后观测期，所有组平均小于104°C。
[0278]在攻击后测定猪的直肠温度。结果如图2所示。未经疫苗接种的TOl猪显示出大于104°C的持续发烧。相比之下，3种疫苗显著减少了攻击后发烧。P129-PK-FL在减少发烧方面最为有效。
[0279]在接种疫苗之前和之后记录动物的体重。结果如图3所示。在研究第I天(接种前)、第10天、第24天、第27天(攻击前)和第37天记录体重。在未接种的猪中，用毒性NADC20病毒进行攻击在10天观察期内几乎完全消除了体重增加。疫苗不同程度地抵消了这种效应。
[0280]在攻击后尸检中检查受攻击动物的肺。图4中显示了每只肺涉及损伤的百分比。TOl空白疫苗组平均有25.1%的肺损伤状况。疫苗不同程度地减少了肺损伤。P129-PK-FL最为有效，其将肺损伤状况减少至1.1%。
[0281]如图5所示，使用肺评分(LAS)对肺损伤的严重性进行评估。三种疫苗使LAS降低。P129-PK-FL使平均LAS从空白疫苗接种组中的1.63降低至0.14。
[0282]通过疫苗接种和攻击诱导了抗PRRSV血清抗体。在研究第27日和第37日测定了IDEXX ELISA S/P比。结果如图6所示。采用P129-PK-FL的接种诱导了最高的抗PRRS抗体水平。
[0283]在PAM细胞上对受攻击的猪的血清中的病毒血症进行滴定。结果(TCID5(l/mL)在图7中给出。P129-PK-FL在减少攻击后病毒血症方面最为有效。
[0284]虽然已参考上述实施例和附件(通过援引将其中的每一个的全部内容整体并入本文)对本发明进行了说明，可以理解的是，各种改良形式和变化形式也涵盖在本发明的主旨和范围内。因此，本发明仅被后附权利要求所限定。
[0285]实施例7.感染性cDNA克隆体PCMV-S-P129-PK17-FL从感染性cDNA克隆体PCMV-S-P129 的衍生
[0286]本发明的PRRSV感染性cDNA克隆体pCMV-S_P129-PK17_FL可以容易地由本领域普通技术人员利用定点诱变技术从此前所述的PRRSV感染性cDNA克隆体pCMV-S-P129衍生。PRRSV感染性cDNA克隆体pCMV-S-P129描述于美国专利第6，500，662号中，并以登录号203489保藏于ATCC。此外，该克隆体的PRRSV基因组的DNA序列可以以登录号AF494042获自Genbank(NCBI)数据库。定点诱变试剂盒可从许多供应商商购得到，并且能在大质粒的多个位点进行许多同时的核苷酸变化。此类试剂盒包括但不限于Change-1T?多突变点定点诱变试剂盒(Affymetrix/USB) >QuikChange Lightning多位点定点诱变试剂盒(Agilent Technologies-Stratagene Products)和 AMAP 多位点定点诱变试剂盒(MBLInternational)。
[0287]PRRSV感染性cDNA克隆体pCMV-S_P129 (可获自ATCC)与本发明的PRRSV感染性cDNA克隆体pCMV-S-P129-PK17-FL之间的核苷酸变化的列表见于表8。所有变化均在基因组的蛋白编码区。总共有74个核苷酸变化，其可使用74种诱变引物和利用商购定点诱变试剂盒的多重连续反应来引入PCMV-S-P129感染性克隆体中，从而产生序列与本文所述的PCMV-S-P129-PK17-FL相同的质粒分子。事实上，采用少于74种诱变引物也能得到相同的结果，因为可以使用单个诱变引物来改变处于彼此的50至60个核苷酸内的突变簇。例如，735位、750位和756位核苷酸可以使用单个诱变引物来改变，965位、992位和1009位核苷酸也是如此。因此，引物的数目被减少至约60。
[0288]在74种核苷酸变化中，大多数(42种)是同义的或“沉默的”，意味着它们编码相同的氨基酸。这些核苷酸变化不太可能对干扰素诱导或病毒的抑制表型产生可量度的影响。剩余的32种核苷酸变化是非同义的或“非沉默的”，并导致病毒蛋白中的氨基酸变化。这32种核苷酸变化据预测直接成为干扰素诱导/病毒抑制表型的原因，并应被改变以便将由感染性克隆体PCMV-S-P129编码的病毒转化为与感染性克隆体pCMV-S-P129-PK17-FL所编码的病毒所显示的相同的干扰素表型。这种变化将需要至多32种诱变引物，如果考虑到某些相关核苷酸的集簇，可以使用更少诱变引物。
[0289]实施例8.感染性cDNA克隆体pCMV-S-P129-PK17_FL的从头合成
[0290]作为定点诱变的替代方式，可以采用合适的5’和3’接头序列从头化学合成本发明的PRRS病毒基因组，并将其克隆至用于PRRS感染性cDNA克隆体pCMV_S_P129 (可获自ATCC，登录号203489)的质粒主链或类似的质粒主链中。长度大于50kb的基因(PRRSV基因组约为15.5kb)的定制合成作为商业服务可获自许多销售商，包括(但不限于):GenScript、DNA2.0和Bio Basic Inc。通过利用侧面包围基因组的5’ PacI和3’ SpeI限制性酶切位点来替换感染性克隆体PCMV-S-P129中的病毒基因组，将合成的病毒基因组直接克隆至PCMV-S载体内。为切割合成的基因组，将24核苷酸的延伸片段(5，-GCAGAGCTCGTTAATTAAACCGTC-基因组_3’，其包括下划线的PacI位点)嵌入合成的基因组的5’端，并将83核苷酸延伸片段(5’ -基因组
[0291 ] -AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATGCATATTTAAATCCCAAGCCGAATTCCAGCACACTGGCGGCCGTTACTAGTGAGCGGCCGC-3，,其包括下划线的SpeI位点)嵌入合成的基因组的3’端。在用PacI和SpeI切割质粒和合成的基因组后，将适当的片段纯化，用DNA连接酶进行连接，并转化至大肠杆菌内，以便利用本领域普通技术人员公知的标准克隆技术进行筛选和增殖。
[0292]生物材料的保藏
[0293]以下生物材料(见美国专利第6，500，662号)于1998年11月19日保藏于美国弗吉尼亚州的美国典型培养物保藏中心(ATCC) (10801University Blvd., Manassas,弗吉尼亚州，20110-2209，美国)，且分配以下登录号。
[0294]质粒pT7P129A，登录号 203488[0295]质粒pCMV-S_P129，登录号 203489
[0296]本文通过援引并入以下美国专利的完整文本和公开内容，其程度相当于完全地对其进行了描述:美国专利第6，500, 662号和美国专利第7，618，797号。
[0297]表1
[0298]
【权利要求】
1.一种分离的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS)，其中该病毒的由ORFla编码的蛋白选自包含以下任一项的那些氨基酸序列: 氨基酸序列AMAMVYD (见SEQ ID NO: 9)内的氨基酸N; 氨基酸序列IGHMAVM(见SEQ ID NO: 12)内的氨基酸N ； 氨基酸序列TVP2GNC(见SEQ ID NO: 15)内的氨基酸D ； 氨基酸序列CffffILFD (见SEQ ID NO: 18)内的氨基酸Y ； 氨基酸序列HGVHGKY (见SEQ ID NO: 21)内的氨基酸H; 氨基酸序列AAKYDQY (SEQ ID NO: 24)内的氨基酸V; 氨基酸序列PSAIDTS(见SEQ ID NO:27)内的氨基酸T ； 氨基酸序列LNS认SK(见SEQ ID NO:30)内的氨基酸L ； 氨基酸序列APM￡QDE(见SEQ ID NO:33)内的氨基酸C ; 氨基酸序列CAPIGMD(见SEQ ID NO:36)内的氨基酸T ； 氨基酸序列PKVAKVS (见SEQ ID NO: 39)内的氨基酸A ； 氨基酸序列AGEIVGV(见SEQ ID NO:42)内的氨基酸I ； 氨基酸序列ADFMPEK (见SEQ ID NO: 45)内的氨基酸N;和 氨基酸序列QTPILGR(见SEQ ID NO:48)内的氨基酸I。
2.一种分离的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS)，其中该病毒的由ORFla编码的蛋白选自包含以下任一项的那些氨基酸序列: 氨基酸序列AMV(见SEQ ID NO:9)内的氨基酸N ； 氨基酸序列HMA(见SEQ ID NO: 12)内的氨基酸N ； 氨基酸序列P2G(见SEQ ID NO: 15)内的氨基酸D ; 氨基酸序列WIL(见SEQ ID NO: 18)内的氨基酸Y; 氨基酸序列VHG (见SEQ ID NO: 21)内的氨基酸H; 氨基酸序列KYD (SEQ ID NO: 24)内的氨基酸V; 氨基酸序列AID(见SEQ ID NO:27)内的氨基酸T ; 氨基酸序列(见SEQ ID NO:30)内的氨基酸L ； 氨基酸序列M￡Q(见SEQ ID NO:33)内的氨基酸C ; 氨基酸序列PIG(见SEQ ID NO:36)内的氨基酸T ； 氨基酸序列VAK(见SEQ ID NO: 39)内的氨基酸A ; 氨基酸序列EIV(见SEQ ID NO:42)内的氨基酸I ; 氨基酸序列FMP (见SEQ ID NO:45)内的氨基酸N ;和 氨基酸序列PIL(见SEQ ID NO:48)内的氨基酸I。
3.一种分离的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS)，其中该病毒的由ORFla编码的蛋白具有独立地包含变异(a)、(b)、(C)或(d)中的一种或多种的氨基酸序列，其中每种所述变异定义如下: 变异(a)， 氨基酸序列AMV(见SEQ ID NO:9)内的氨基酸N ； 氨基酸序列HMA(见SEQ ID NO: 12)内的氨基酸N ； 氨基酸序列PSG(见SEQ ID NO: 15)内的氨基酸D ;氨基酸序列WIL(见SEQ ID NO: 18)内的氨基酸Y; 氨基酸序列VHG (见SEQ ID NO: 21)内的氨基酸H，或者变异(a)的任何子集； 变异(b)， 氨基酸序列KYD (SEQ ID NO: 24)内的氨基酸V; 氨基酸序列AID(见SEQ ID NO:27)内的氨基酸T ; 氨基酸序列(见SEQ ID NO:30)内的氨基酸L ； 氨基酸序列MffKMSEQ ID NO: 33)内的氨基酸C，或者变异(b)的任何子集； 变异(c)， 氨基酸序列PIG(见SEQ ID NO:36)内的氨基酸T ； 氨基酸序列VAK (见SEQ ID NO: 39)内的氨基酸A，或者变异(c)的任何子集；和 变异⑷， 氨基酸序列EIV(见SEQ ID NO:42)内的氨基酸I ; 氨基酸序列FMP (见SEQ ID NO:45)内的氨基酸N ； 氨基酸序列PIL(见SEQ ID NO:48)内的氨基酸I，或者变异(d)的任何子集。
4.如权利要求3所述的分离的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS)，其包含权利要求3的变异(a)中所鉴定的五种氨基酸序列中的两种以上。
5.如权利要求3所述的分离的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS)，其包含权利要求3的变异(b)中所鉴定的四种氨基酸序列中的两种以上。
6.如权利要求3所述的分离的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS)，其包含权利要求3的变异(C)中所鉴定的两种氨基酸序列。
7.如权利要求3所述的分离的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS)，其包含权利要求3的变异(d)中所鉴定的三种氨基酸序列中的两种以上。
8.一种质粒，该质粒能够直接转染合适的宿主细胞并从如此转染的宿主细胞表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PPRS)，所述质粒包括:(a)对编码所述PPRS病毒的感染性RNA分子进行编码的DNA序列，和(b)能够转录所述感染性RNA分子的启动子，其中由所述病毒的ORFla编码的蛋白具有含有以下的氣基酸序列: (1)氨基酸序列ANV(见SEQ ID NO: 9)内的氨基酸N; 氨基酸序列HMA(见SEQ ID NO: 12)内的氨基酸N ； 氨基酸序列P2G(见SEQ ID NO: 15)内的氨基酸D ; 氨基酸序列WIL(见SEQ ID NO: 18)内的氨基酸Y; 氨基酸序列VHG (见SEQ ID NO: 21)内的氨基酸H，或者其任何子集；和/或 (2)氨基酸序列KYD(SEQ ID NO: 24)内的氨基酸V ； 氨基酸序列AID(见SEQ ID NO:27)内的氨基酸T ; 氨基酸序列(见SEQ ID NO:30)内的氨基酸L ； 氨基酸序列M￡Q (见SEQ ID NO: 33)内的氨基酸C，或者其任何子集；和/或 (3)氨基酸序列PIG(见SEQID NO: 36)内的氨基酸T ； 氨基酸序列VAK (见SEQ ID NO: 39)内的氨基酸A，或者其任何子集；和/或 (4)氨基酸序列EIV(见SEQID NO:42)内的氨基酸I ; 氨基酸序列FMP (见SEQ ID NO:45)内的氨基酸N ；氨基酸序列PIL(见SEQ ID NO:48)内的氨基酸I，或者其任何子集。
9.如权利要求8所述的质粒,其中所述启动子是能允许在所祀向的真核细胞中DNA启动的真核启动子。
10.如权利要求8所述的质粒，其中所述启动子是能引导所述质粒的体外转录的原核启动子或噬菌体启动子。
11.一种产生PRRS病毒的方法，该方法包括用权利要求8所述的质粒转染合适的宿主细胞和获得由转染的细胞产生的PRRS病毒。
12.—种产生PRRS病毒的方法，该方法包括转录权利要求10所述的质粒。
13.一种分离的多核苷酸分子，其包括对编码北美PRRS病毒的感染性RNA分子进行编码的DNA序列，其中所述DNA序列选自由以下组成的组:
(a)SEQID NO:6 ； (b)与(a)的DNA序列具有至少85%同一性的序列，其中由其ORFla编码的蛋白具有包含以下的氨基酸序列: (1)氨基酸序列ANV(见SEQ ID NO: 9)内的氨基酸N; 氨基酸序列HNA(见SEQ ID NO: 12)内的氨基酸N; 氨基酸序列I3DG(见SEQ ID NO: 15)内的氨基酸D ; 氨基酸序列WYL (见SEQ ID NO: 18)内的氨基酸Y; 氨基酸序列VHG (见SEQ ID NO: 21)内的氨基酸H，或者其任何子集；和/或 (2)氨基酸序列KVD(SEQ ID NO: 24)内的氨基酸V ； 氨基酸序列ATD(见SEQ ID NO:27)内的氨基酸T ; 氨基酸序列SLL(见SEQ ID NO:30)内的氨基酸L ; 氨基酸序列MCQ (见SEQ ID NO: 33)内的氨基酸C，或者其任何子集；和/或 (3)氨基酸序列PTG(见SEQID NO: 36)内的氨基酸T ; 氨基酸序列VAK (见SEQ ID NO: 39)内的氨基酸A，或者其任何子集；和/或 (4)氨基酸序列EIV(见SEQID NO:42)内的氨基酸I ; 氨基酸序列FNP (见SEQ ID NO:45)内的氨基酸N ； 氨基酸序列PIL(见SEQ ID NO:48)内的氨基酸I，或者其任何子集；和 (c)在高度严格条件下与(a)或(b)的DNA序列的互补物杂交的DNA序列，包括在65°C的 0.5M NaHPO4、7%SDS、ImM EDTA 中杂交以过滤结合的 DNA，和在 68°C 的 0.1SSC/0.1%SDS 中洗漆。
14.一种宿主细胞，该宿主细胞用权利要求13所述的多核苷酸分子转染。
15.一种用于针对PRRS病毒的感染对猪类动物进行保护的疫苗，该疫苗包含以下部分和适合兽医学应用的载剂:(a)由权利要求6所述的多核苷酸分子编码的经遗传修饰的北美PRRS病毒、(b)所述感染性分子、(c)形式为质粒的所述多核苷酸分子或(d)包含所述多核苷酸分子的病毒载体，其中所述PRRS病毒能够引发针对PRRS病毒的感染的有效免疫保护应答，其量能有效产生针对感染的免疫保护。
16.—种分离的多核苷酸分子，其包含编码PRRS病毒的核苷酸序列,其中所述核苷酸序列是对应于以下的RNA序列:
(a)SEQ ID NO: 6 的 DNA 序列；(b)与(a)的DNA序列具有至少85%同一性的序列，其中由其ORFla编码的蛋白具有包含以下的氨基酸序列: (1)氨基酸序列ANV(见SEQ ID NO: 9)内的氨基酸N; 氨基酸序列HMA(见SEQ ID NO: 12)内的氨基酸N ； 氨基酸序列P2G(见SEQ ID NO: 15)内的氨基酸D ; 氨基酸序列WIL(见SEQ ID NO: 18)内的氨基酸Y; 氨基酸序列VHG (见SEQ ID NO: 21)内的氨基酸H，或者其任何子集；和/或 (2)氨基酸序列KYD(SEQ ID NO: 24)内的氨基酸V ； 氨基酸序列ATD(见SEQ ID NO:27)内的氨基酸T ; 氨基酸序列SLL(见SEQ ID NO:30)内的氨基酸L ; 氨基酸序列MCQ (见SEQ ID NO: 33)内的氨基酸C，或者其任何子集；和/或 (3)氨基酸序列PIG(见 SEQID NO: 36)内的氨基酸T ； 氨基酸序列VAK (见SEQ ID NO: 39)内的氨基酸A，或者其任何子集；和/或 (4)氨基酸序列EIV(见SEQID NO:42)内的氨基酸I ; 氨基酸序列FNP (见SEQ ID NO:45)内的氨基酸N ； 氨基酸序列PIL(见SEQ ID NO:48)内的氨基酸I，或者其任何子集；或 (c)在高度严格条件下与(a)或(b)的DNA序列的互补物杂交的DNA序列，包括在65°C的 0.5M NaHPO4、7%SDS、ImM EDTA 中杂交以过滤结合的 DNA，和在 68°C 的 0.1SSC/0.1%SDS 中洗漆。
17.—种诊断试剂盒，其包含将受PRRS病毒野生株天然感染的猪类动物与用权利要求15的疫苗接种过的猪类动物区分开的多核苷酸分子。
18.如权利要求15所述的疫苗，其中与野生型P129PRRS病毒相比，所述疫苗具有降低的干扰素α抑制效应。
19.一种分离的多核苷酸,其包含选自以下的多核苷酸序列:
(a)SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID N0:4 和 SEQ ID NO:6 ； (b)(a)中任意序列的互补物； (C)在严格条件下与(a)或(b)的序列杂交的多核苷酸，所述严格条件被限定为在65 °C的0.5M NaHP04、7%SDS、ImM EDTA中杂交以过滤结合的DNA，和在68 V的0.1XSSC/0.1%SDS 中洗涤； (d)与(a)、(b)或(C)的多核苷酸具有至少70%同一'丨生的多核苷酸； (e)与(a)、(b)或(C)的多核苷酸具有至少80%同一性的多核苷酸； (f)与(a)、(b)或(C)的多核苷酸具有至少90%同一'丨生的多核苷酸； (g)与(a)、(b)或(C)的多核苷酸具有至少95%同一性的多核苷酸； (h)与(a)、(b)或(C)的多核苷酸具有至少99%同一'丨生的多核苷酸； 并且其中，在(a)至(h)的每种情形中的所述序列或其互补物编码ORFla表达的蛋白中的氨基酸，所述氨基酸选自 : 氨基酸序列AMV(见SEQ ID NO:9)内的氨基酸N ； 氨基酸序列HMA(见SEQ ID NO: 12)内的氨基酸N ； 氨基酸序列P2G(见SEQ ID NO: 15)内的氨基酸D ;氨基酸序列WIL(见SEQ ID NO: 18)内的氨基酸Y;氨基酸序列VHG (见SEQ ID NO: 21)内的氨基酸H;氨基酸序列KYD (SEQ ID NO: 24)内的氨基酸V;氨基酸序列AID(见SEQ ID NO:27)内的氨基酸T ;氨基酸序列(见SEQ ID NO:30)内的氨基酸L ；氨基酸序列M￡Q(见SEQ ID NO:33)内的氨基酸C ;氨基酸序列PIG(见SEQ ID NO:36)内的氨基酸T ；氨基酸序列VAK(见SEQ ID NO: 39)内的氨基酸A ;氨基酸序列EIV(见SEQ ID NO:42)内的氨基酸I ;氨基酸序列FMP (见SEQ ID NO:45)内的氨基酸N ;和氨基酸序列PIL(见SEQ ID NO:48)内的氨基酸I。
20.—种RNA多核苷酸分子,其为权利要`求19所述的任何DNA多核苷酸序列的互补物。
【文档编号】A61K39/12GK103517715SQ201180064674
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2011年11月9日 优先权日:2010年11月10日
【发明者】S-K.W.维尔奇, J.G.卡尔弗特, D.E.斯莱德 申请人:佐蒂斯有限责任公司